抗ErbB2抗体的制作方法

专利名称：抗ErbB2抗体的制作方法
背景技术：
发明领域本发明总体上涉及与ErbB2受体结合的抗体。更具体地，本发明涉及与ErbB2结构域1中的表位结合并通过细胞程序死亡作用诱导细胞死亡的抗ErbB2抗体。
相关技术领域描述调节细胞生长和分化的信号转导部分程度上受各种细胞蛋白磷酸化介导。蛋白酪氨酸激酶是一种涉及该过程的酶。据信，受体蛋白酪氨酸激酶通过配体刺激的胞内底物酪氨酸磷酸化来指导细胞生长。生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的Ⅰ类亚族包括erbB1基因编码的170kDa的表皮生长因子受体(EGFR)。erbB1与人恶性肿瘤有关。尤其是在乳房癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌中，发现该基因表达增加。现已评价了抗EGFR的单克隆抗体作为治疗剂在治疗这类恶性肿瘤中的效果。综述可见Baselga等，Pharmac.Ther.64:127-154(1994)。另外还可参见Masui等，Cancer Research 44:1002-1007(1984)。
Wu等J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)最近报道了抗EGFR单克隆抗体(mAb)225(竞争性地抑制EGF结合并阻断该受体的激活)能诱导高水平表达EGFR的人结肠癌细胞系DiFi经受G1细胞周期停滞和细胞程序死亡。加入IGF-1或高浓度胰岛素可以延迟单克隆抗体225诱导的细胞程序死亡，而加入IGF-1或胰岛素却不能使G1停滞逆转。
Ⅰ类亚族的第二个成员p185neu最初从化学治疗的大鼠成神经细胞瘤中鉴定为转化基因的产物。该编码蛋白跨膜区域中的一个点突变(缬胺酸变为谷氨酸)导致了原癌基因neu的活化形式。在乳房和卵巢癌发现neu的人同源物(称为erbB2或HER2)有扩增，并与预后不佳相关(Slamon等，Science,235:177-182(1987)；Slamon等，Science,244:707-712(1989))。因此，Slamon等在美国专利4,968,603中描述了测定肿瘤细胞中erbB2基因扩增或表达的各种诊断测试方法。迄今为止，关于人肿瘤还没有类似于neu原癌基因中点突变的报道。在其它癌(包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱癌)中也发现了erbB2过度表达(由于扩增而引起的经常性但非均一的表达)。参见其它文献，King等，Science,229:974(1985)；Yokota等，Lancet:1:765-767(1986)；Fukushigi等，Mol Cell Biol.,6:955-958(1986)；Geurin等，Oncogene Res.,3:21-31(1988)；Cohen等，Oncogene,4:81-88(1989)；Yonemura等，CancerRes.,51:1034(1991)；Borst等，Cynecol.Oncol.,38:364(1990)；Weiner等，Cancer Res.,50:421-425(1990)；Kern等，Cancer Res.,50:5184(1990)；Park等，Cancer Res.,49:6605(1989)；Zhau等，Mol.Carcinog.,3:354-357(1990)；Aasland等，Br.J.Cancer 57:358-363(1988)；Williams等，Pathiobiology 59:46-52(1991)；和McCann等，Cancer,65:88-92(1990)。
抗大鼠neu和人erbB2蛋白产物的抗体已有描述。Drebin等在Cell 41:695-706(1985)中提到了一种抗大鼠neu基因产物的IgG2a单克隆抗体。该抗体称为7.16.4，它使得B104-1-1细胞(用neu原癌基因转染的NIH-3T3细胞)上细胞表面的p185表达下调，并抑制这些细胞形成集落。Drebin等在699页中叙述道，该抗体在软琼脂中对neu转化的细胞有细胞静止作用而没有不可逆的胞毒效应。在Drebin等PNAS(USA)83:9129-9133(1986)中，7.16.4抗体表现出能抑制植入裸鼠中的neu转化的NIH-3T3细胞以及大鼠成神经细胞瘤细胞的致肿瘤生长。Drebin等在Oncogene 2:387-394(1988)中讨论了抗大鼠neu基因产物的一类抗体的生产方法。发现所有这些抗体对悬浮在软琼脂中的neu转化细胞的生长均有细胞静止作用。IgM,IgG2a和IgG2b同种型抗体能在补体存在下明显介导neu转化细胞的体外裂解，但是没有一种抗体能介导neu转化细胞的高水平的依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。Drebin等Oncogene 2:273-277(1988)报道了与p185分子上的两个不同区域反应的抗体混合物对植入裸鼠中的neu转化的NIH-3T3细胞有协同抗肿瘤作用。Myers等在Meth.Enzym.198:277-290(1991)中综述了抗neu抗体的生物效应。另可参见WO94/22478,1994年10月13日公开。
Hudziak等，Mol.Cell.Biol.9(3):1165-1172(1989)描述了一组抗ErbB2抗体的生产，该抗体用人乳房肿瘤细胞系SKBR3来作性质鉴定。SKBR3细胞在接触抗体后的细胞相对增殖可通过72小时后细胞单层的结晶紫染色来测定。通过该试验，测得抗体4D5有最大的抑制效果，它可抑制56％的细胞增殖。该组中的其它抗体(包括7C2和7F3)在该试验中降低细胞增殖的程度较低。Hudziak等归纳道，4D5抗体对SKBR3细胞的作用是细胞静止作用而非细胞毒性，因为在从培养基中除去抗体后SKBR3细胞恢复成接近正常的生长速度。另发现，抗体4D5使得p185erbB2过度表达的乳房肿瘤细胞系对于TNF-α胞毒效应敏感。另见WO89/06692,1989年7月27日公开。Hudziak等的文献中所讨论的抗ErbB2抗体在以下各文献中也有所表述Fendly等，Cancer Research 50:1550-1558(1990)；Kotts等，In Vitro 26(3):59A(1990)；Sarup等，Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepard等，J.Clin.Immunol.11(3):117-127(1991)；Kumar等，Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991)；Lewis等，Cancer Immunol.Immunother.37:255-263(1993)；Pietras等，Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitetta等，Cancer.Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowski等，J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)；Scott等，J.Biol.Chem.266:14300-5(1991)；和D’souza等，Proc.Natl.Acad.Sci.91:7202-7206(1994)。
Tagliabue等，Int.J.Cancer 47:933-937(1991)描述了两种抗体，它们是根据对过度表达ErbB2的肺腺癌细胞系(Calu-3)的反应性选出的。发现其中一种抗体(称为MGR3)可内化、诱导ErbB2磷酸化并在体外抑制肿瘤细胞生长。
McKenzie等Oncogene 4:543-548(1989)制得了一组有不同表位特异性的抗ErbB2抗体，其中包括命名为TA1的抗体。发现该TA1抗体能引起ErbB2胞吞作用的加速(参见Maier等，Cancer Res.51:5361-5369(1991))。Bacus等MolecularCarcinogenesis 3:350-362(1990)报道了TA1抗体诱导乳房癌细胞系AU-565(过度表达erbB2基因的细胞系)和MCF-7(不过度表达erbB2基因的细胞系)成熟。发现这些细胞的生长和获得成熟表型受到抑制，与ErbB2受体细胞表面水平的减少和细胞质中水平暂时升高有关。
Stancovski等PNAS(USA)88:8691-8695(1991)获得了一组抗ErbB2的抗体，将这些抗体腹膜内注射入裸鼠中，并评价其对erbB2基因过度表达所转化的鼠成纤维细胞肿瘤生长的作用。对于四种抗体检测到不同的肿瘤抑制水平，但是一种抗体(N28)却持续地刺激肿瘤生长。单克隆抗体N28明显诱导ErbB2受体磷酸化，而其它四种抗体通常表现出低的或不表现出磷酸化诱导活性。对于抗ErbB2抗体对SKBR3细胞增殖的作用也作了评价。在该SKBR3细胞增殖试验中，与对照相比，有两种抗体(N12和N29)降低了细胞增殖。评价各种抗体通过依赖于补体的细胞毒性(CDC)和依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)体外诱导细胞裂解的能力，该篇论文的作者归纳道，抗体的抑制功能并不是由CDC或ADCC所致。
Bacus等在Cancer Research 52:2580-2589(1992)中进一步对前文Bacus等(1990)和Srancovski等所述的抗体进行了性质鉴定。该鉴定延伸了Stancovski等的腹膜内研究，评价了给携带有过度表达人ErbB2的小鼠成纤维细胞的裸鼠静脉注射这些抗体后的作用。在他们的早期研工作中发现，N28促进肿瘤生长，而N12和N29则明显抑制表达ErbB2的细胞的生长。发现N24抗体也有部分肿瘤抑制作用。Bacus等还测试了抗体促进人乳房癌细胞系AU565和MDA-MB453(过度表达ErbB2)以及MCF-7(含有较少的此受体)中成熟表型的能力。Bacus等发现，肿瘤的体内抑制与细胞分化相关；肿瘤刺激性抗体N28对分化没有作用；N12、N29和N24对肿瘤的抑制作用与它们导的分化程度相关。
Xu等Int.J.Cancer 53:401-408(1993)评价了一组抗ErbB2抗体的表位结合特异性，及其抑制不依赖于贴壁和依赖于贴壁的SKBR3细胞生长(通过单个抗体和组合)、介导细胞表面ErbB2、以及抑制配体刺激的不依赖于贴壁生长的能力。另见WO94/00136,1994年1月6日公开，和Kasprzyk等，Cancer Research52:2771-2776(1992)关于抗ErbB2抗体的组合。另外，在Hancock等Cancer Res.51:4575-4580(1991)；Shawver等，Cancer Res.54:1367-1373(1994)；Arteaga等Cancer Res.54:3758-3765(1994)和Harwerth等J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992)中讨论了其它抗ErbB2抗体。
与erbB2相关的另一种基因(称为erbB3或HER3)也已有所描述。例如参见美国专利No.5,183,884和5,480,968。ErbB3是ErbB受体家族独特的成员，因为它只有很少或没有内源性酪氨酸激酶活性。然而，当ErbB3与ErbB2共表达时，形成了一个活性信号复合物，而抗ErbB2抗体能破坏该复合物(Sliwkowski等，J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994))。当与ErbB2共表达时，ErbB3对遗传调节蛋白(Heregulin)(HRG)的亲和力将升高。另见Levi等，Journal of Neuroscience15:1329-1340(1995)；Morrissey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1431-1435(1995)；和Lewis等，Cancer Res.56:1457-1465(1996)关于ErbB2-ErbB3蛋白复合物部分。
生长因子受体蛋白酪氨酸激酶Ⅰ类亚族还包括HER4/p180erbB4。参见欧洲专利申请No.599,274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993)；和Plowman等，Nature,366:473-475(1993).Plowman等发现HER4表达的增加与某些上皮来源的癌(包括乳腺腺癌)有关。该受体与ErbB3一样，和ErbB2形成了活性信号复合物(Carraway和Cantley,Cell 78:5-8(1994))。
调查ErbB2激活剂导致发现了遗传调节蛋白多肽家族。这些蛋白看来是通过单个基因另一种方式的剪接而产生的，在文献中它们称为神经调节蛋白(NRG)、Neu分化因子(NDF)、遗传调节蛋白(HRG)、胶质生长因子(GGF)和乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)。综述可见Groenen等，Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke,G.Molec.& Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等，Pharm.Rev.47:51-85(1995)。
发明概述本发明涉及、至少部分涉及这样一个惊人的发现即某些抗ErbB2抗体可通过细胞程序死亡作用来诱导过度表达ErbB2细胞(如BT474、SKBR3、SKOV3或Calu3细胞)的死亡。与Wu等，J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)中所述的细胞程序死亡性抗EGFR抗体相反，本文感兴趣的抗ErbB2抗体不会通过破坏自分泌环来诱导细胞程序死亡。本文中具有这些诱导细胞死亡性能的抗体通常与ErbB2的胞外结构域中的一个区域(如ErbB2结构域1中的表位)结合。较佳的，抗体会与本文所述的7C2和/或7F3抗体结合的ErbB2表位结合。
较佳的抗体是单克隆抗体，如人化抗体。特别感兴趣的抗体是除了具有上述性能外还能以至少约10nM(更佳的至少约为1nM)的亲和力与ErbB2受体结合的那些抗体。
在某些例子中，抗体被固定(例如共价连接)在固相中，例如用来亲合纯化受体或用于诊断试验。对于诊断应用，提供标记抗体(如与可检测标记连接的抗体)也许更为有利。
前述抗体可以组合物形式提供，该组合物包含抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。任选地，该组合物还可包含第二抗ErbB2抗体，尤其是与ErbB2受体上的与本文公开的7C2/7F3抗体结合表位不同表位结合的第二抗ErbB2抗体。在一个较佳的实例中，第二抗体是在细胞培养中50-100％地抑制SKBR3细胞生长的抗体(即4D5抗体及其功能等价物)。治疗用组合物应是无菌的，可冻干。
本发明还提供了编码前述抗体的分离的核酸分子，该核酸分子还可包含与其操作性相连的启动子；包含该核酸分子的表达载体，该核酸分子与该载体转化宿主细胞所能识别的控制序列操作性相连；包含该核酸分子的宿主细胞(如杂交瘤细胞系)；以及制备该抗体的方法，该方法包括培养包含核酸的细胞以表达抗ErbB2抗体，以及任选地，从宿主细胞培养(较佳的是宿主细胞培养基)中回收抗体。
本发明还提供了本文公开的抗ErbB2抗体的用途。例如，本发明提供了诱导细胞死亡的方法，该方法包括使过度表达ErbB2的细胞(如癌细胞)与本文所述的诱导细胞死亡有效量的抗ErbB2抗体接触。细胞可以是细胞培养中的细胞或在哺乳动物体内如患癌症的哺乳动物体内的细胞。本发明还提供了一种诱导过度表达ErbB2的细胞编程性细胞死亡的方法，该方法包括使细胞与本文所述的诱导细胞程序死亡有效量的外源抗ErbB2抗体接触。因此，本发明提供了一种治疗患ErbB2受体过度表达为特征的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括将本文公开的药学上有效量的抗ErbB2抗体给予哺乳动物。根据上述任一方法，还可使用另一种抗ErbB2抗体，尤其是其结合的ErbB2表位不同于本文公开的7C2/7F3抗体所结合表位的那些抗体(如不结合结构域1的那些抗体)。在一个实例中，第二抗体可在细胞培养中50-100％地抑制SKBR3细胞生长，并任选地与ErbB2上4D5结合的表位结合。
在下述实施例2中，发现促细胞程序死亡性(pro-apoptotic)抗体7C2几乎完全消除了全部培养的生长停滞细胞。因此，希望将本文公开的促细胞程序死亡性抗体与生长抑制剂结合用于上述体外和体内方法中。该实例中，通过在给予促细胞程序死亡性抗ErbB2抗体之前先给予生长抑制剂，可获得超高水平的细胞程序死亡。然而，也可考虑采用同时给药或首先给予抗ErbB2抗体。
本发明还提供了用于上述体内方法的产品，该产品包括盛放该抗ErbB2抗体的容器以及容器上的或附带的说明抗体可用来治疗ErbB2过度表达为特征的疾病(如癌)的标签。
另一方面，本发明提供了一种在体外或体内检测ErbB2的方法，该方法包括使抗体与怀疑含有ErbB2的细胞结合，并检测是否发生结合。因此，本发明提供了检测以ErbB2扩增表达为特征的肿瘤的测试方法，该方法包括使该细胞与本文公开的抗体接触，然后测定抗体与细胞的结合程度。用于该测试方法的抗体宜加以标记，它可以试剂盒形式提供，并附有该抗体检测ErbB2的使用说明书。本文的测试方法可以是体外测试(如ELISA测试)，或是体内测试。对于肿瘤的体内诊断，抗体最好与放射性同位素偶联，将其给予哺乳动物，然后通过外部扫描放射性来观察抗体与哺乳动物体内组织结合的程度。
附图简述

图1A和B分别显示了细胞程序死亡对细胞的效果以及测定该细胞程序死亡作用的方法。图1A显示了经历编程性细胞死亡(细胞程序死亡)的细胞发生的生理变化。图1B显示了磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内部小叶(leaflet)转运到细胞外部的过程。该PS转运过程是经历细胞程序死亡的细胞所特有的。膜联蛋白V与PS特异性结合，从而提供了检测细胞程序死亡的手段。
图2显示抗ErbB2抗体的表位特异性。MAb用来阻断7C2与BT474细胞的结合。BT474细胞(0.5×106)预先用或不用50μg抗ErbB2抗体处理(冰上15分钟)，洗涤两次，重悬在0.1ml 1％FBS/PBS中，与偶联了7C2抗体的5μg异硫氰酸荧光素(FITC)一同培育(冰上15分钟)。培育后，用1％FBS/PBS洗涤细胞悬液两次，除去未结合的荧光色素，用1％多聚甲醛/PBS固定，然后用流式细胞仪分析。
图3A-D示出了抗ErbB2抗体对过度表达ErbB2的人乳房癌细胞的作用。在收获时有正常膜功能的细胞(“活”细胞)排斥DNA染料7AAD，在膜通透化后，该细胞被Hoechst优先染色。分析这些细胞，揭示了细胞周期中G0/G1阶段(主峰)和S-G2-M阶段(用双箭头表示)中的典型的细胞DNA分布图(最右组)。在中间一组中，箭头所指的细胞群表示死亡的细胞，其中一些细胞在收获时有异常的通透性，且其核DNA已降解。使4×104BT474细胞/毫升在含有同种型匹配对照Ig(图3A)、1μg单克隆4D5(图3B)、50μg单克隆7C2(图3C)或1μg4D5抗体+50μg7C2抗体(图3D)的培养液中培育72小时。中间组显示了死亡细胞的百分数(7AAD荧光素对Hoechst荧光素)，右侧组中显示了细胞周期的S、G2和M阶段中活细胞的百分数(Hoechst荧光素对细胞计数)。左侧组显示了通过前向和右向光散射仪测得的细胞大小。
图4A和B揭示了4D5和7C2抗体对BT474细胞中的DNA合成和存活率的附加效果。显示了两个试验结果平均值±标准误差。在图4A中，用4D5(0.05μg/ml)和/或7C2(50μg/ml)处理8×103细胞/0.2毫升/孔72小时，最后12小时加入1μCi[3H]胸苷进行脉冲(一式三份)。在图4B中，为测定细胞存活率，获得细胞总数，并通过FACS分析来测定存活率。7C2以及7C2加上4D5这两种处理的标准偏差非常小(1×103细胞)，图中不能看到。
图5A-F显示了抗ErbB2单克隆抗体7C2和4D5在BT474乳房肿瘤细胞中诱导细胞程序死亡的情况。图5A、5C和5E显示了前向散射(FS，细胞大小的一个指标)对log FITC(表示膜联蛋白V结合)的图谱。图5B、D和F是logFITC对log碘化丙锭(propidium iodine,PI)的4象限图，膜联蛋白V-阳性细胞的百分数显示在象限4中，膜联蛋白V/PI阳性细胞的百分数显示在象限2中。未经处理的细胞表现出均匀的大小和荧光信号(画出的圆圈内)，并有85％存活(图5A)。除了表现出较低的膜联蛋白V结合性，这些细胞还不吸收PI，这说明膜完整性没有改变。用10μg/ml单克隆抗体7C2处理3天，使得活细胞百分数降低(降低至25.3％，图5E)，以及几乎整个细胞群体都变成更小的、FITC阳性细胞群体(图5E)。如图5F所示，单克隆抗体7C2使膜联蛋白V阳性/PI阳性细胞百分数增高7-8倍，这表明有编程性细胞死亡。抗增殖的单克隆抗体4D5诱导了较小程度的细胞程序死亡(比对照高2.5倍，图5C和D)。
图6显示了单克隆抗体7C2的作用是剂量依赖性的。通过膜联蛋白V阳性和PI阳性细胞数目的增加测定，发现单克隆抗体7C2在0.1μg/ml的浓度下能明显地诱导BT474乳房肿瘤细胞内细胞程序死亡，且该作用在1μg/ml浓度时达到最大。
图7A和B分别是单克隆抗体7C2在BT474和SKBR3乳房肿瘤细胞中诱导细胞程序死亡的时间进程。用10μg/ml单克隆抗体7C2处理BT474细胞(图7A)和SKBR3细胞(图7B)，在处理开始后最初15分钟时，活细胞(膜联蛋白阴性和PI阴性的细胞)百分数就已降低，且在24小时内达到最大。BT474细胞系比SKBR3细胞对单克隆抗体7C2的促细胞程序死亡作用更敏感。
图8A-E显示了不同细胞系对抗ErbB2单克隆抗体的反应。使BT474、SKBR3和MCF7乳房肿瘤细胞系以及正常的人乳房上皮细胞(HMEC)(分别为图8A-D)与抗ErbB2的单克隆抗体4D5、3H4、7F3、7C2、2H11、3E8和7D3、人化的突变型单克隆抗体4D5(hu4D5)或同种匹配不相关对照单克隆抗体1766一起培育。用10μg/ml单克隆抗体浓度处理3天。收集2-9个不同试验的数据，并表示成膜联蛋白V结合细胞相对于对照细胞的平均增长倍数(±标准误差)。BT474乳房肿瘤细胞对单克隆抗体7C2和4D5的反应在图5中已有描述(分别为对照的9倍和2.5倍)。在用单克隆抗体7C2处理后，在SKBR3乳房肿瘤细胞系(ErbB2表达水平与BT474细胞一样高)中，也发生了诱导细胞程序死亡(对于单克隆抗体4D5，程度较低)。此外，单克隆抗体7F3在BT474和SKBR3细胞系中均能诱导细胞程序死亡。而ErbB2表达水平正常的MCF7乳房肿瘤细胞系以及HMEC，在用抗ErbB2单克隆抗体处理后，均显示膜联蛋白V结合没有改变。这些结果表明，ErbB2的过度表达是响应抗ErbB2单克隆抗体所必需的。在图8E中，测试了过度表达ErbB2的非小(non-small)细胞肺癌细胞系Calu3中受抗ErbB2单克隆抗体诱导的细胞程序死亡。用7C2或7F3处理均使得膜联蛋白V的结合增强。
图9A-I显示了单克隆抗体7C2和4D5对细胞周期进程和细胞死亡的作用。未经处理的BT474细胞主要是膜联蛋白阴性和PI阴性的(图9A，象限3)，并表现出正常的细胞周期DNA直方图(图9B和C)。用10μg/ml单克隆抗体4D5处理的细胞表现出PI吸收以及膜联蛋白V-FITC结合有一定的增强(图9D，象限2)。在细胞周期进程上有最显著的效果，单克隆抗体4D5几乎完全除去了S阶段的细胞百分数(图9E和F)。单克隆抗体7C2在BT474中诱导出显著量的细胞死亡(通过PI吸收和膜联蛋白V-FITC结合测得)(图9G，象限2)。细胞周期分析表明有近(sub)G0/G1或亚二倍体群体存在(图9I)(这是发生细胞程序死亡的细胞的特征)，该细胞表现出高水平的膜联蛋白V结合(图9H，象限1)。
图10A-F是图9A-I的DNA直方图的曲线拟合分析结果，其表现为，用单克隆抗体7C2处理后S阶段中的细胞百分数(52％)稍有变化(与对照细胞(S阶段的61％细胞)相比)，但是对单克隆抗体4D5反应的S阶段的细胞数却大幅度降低(降低至6％)(分别在图10C、A和B中)。分析细胞程序死亡的细胞群体(9A、D和G的象限2中的膜联蛋白V/PI阳性细胞)，揭示了S阶段细胞的百分数与总细胞群体之间没有差别(图10D对照=55％；图10E单克隆抗体4D5=7％；图10F单克隆抗体7C2=56％)。而且，G0/G1和G2/M阶段没有变化(比较图10A和D、B和E、C和F)，这说明细胞退出细胞周期的所有阶段，且单克隆抗体诱导的编程性细胞死亡对细胞周期没有特异性。
图11A和B显示出单克隆抗体7C2诱导的细胞程序死亡通过生长停滞而得以增强。除细胞周期研究数据外，通过时间推移视频记录还发现，经单克隆抗体7C2处理过的部分细胞继续增殖，而其它一些则经历细胞程序死亡。因此，进行试验以确定细胞生长受抑制是否会增强单克隆抗体7C2的促细胞程序死亡活性。使BT474细胞脱离血清培养3天，以诱导生长停滞，然后用10μg/ml单克隆抗体7C2或4D5处理3天，分析存活率(膜联蛋白V-FITC结合和PI吸收)以及细胞周期效应。脱离血清(培养在添加0.1％FBS的培养液中)有效地减少了增殖，这可从S阶段细胞的百分数从33％(在10％FBS中)降低至10％(图11A)来看出。而先前的生长停滞却不再增强单克隆抗体4D5的强抗增殖活性。在单克隆抗体7C2处理的细胞中，脱离和未脱离血清的S阶段细胞的比例与对照相同。图11B表明血清饥饿不会对未经处理细胞的存活率产生不利影响。然而，在脱离血清一段时间后用10μg/ml单克隆抗体4D5处理BT474细胞却会使存活率降低至55％。而且，用10μg/ml单克隆抗体7C2处理生长停滞的细胞能几乎完全消除整个培养，因为膜联蛋白V阴性和PI阴性细胞的百分数降低至10％。
图12用下划线示出了ErbB2结构域1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。粗体氨基酸表示单克隆抗体7C2和7F3识别的表位位置(经缺失图谱测得)，即“7C2/7F3表位”(SEQ ID NO:2)。
图13显示了ErbB2胞外结构域的表位作图，它通过截短突变体分析和定点诱变(Nakamura等，J.of Virology 67(10):6179-6191(1993年10月)；Renz等，J.Cell.biol.125(6):1395-1406(1994年6月))来测得。促细胞程序死亡性单克隆抗体7C2和7F3结合受体N端的表位，而抗增殖的单克隆抗体4D5和3H4却结合在跨膜结构域附近。用聚合酶链反应技术从cDNA制得各种ErbB2-ECD截短或点突变。ErbB2突变体在哺乳动物表达质粒中被表达成gD融合蛋白。该表达质粒采用巨细胞病毒启动子/增强子以及位于插入cDNA下游的SV40终止子和聚腺苷酸化信号。将质粒DNA转染人293S细胞中。转染1天后，使细胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸、含有1％透析过的胎牛血清和25μCi各种35S甲硫氨酸和35S半胱氨酸的低葡萄糖DMEM中通过新陈代谢进行标记过夜。收集上清，在上清液中加入ErbB2单克隆抗体或对照抗体，4℃培育2-4小时。使复合物沉淀，施加到10-20％Tricine SDS梯度凝胶上，在100V下电泳。将凝胶电泳印迹到膜上并通过放射自显影来分析。
图14A-E表示抗ErbB2单克隆抗体的作用对表位有特异性。为了确定抗ErbB2单克隆抗体抗增殖或促细胞程序死亡的效果是否与表位特异性有关，用4种不同的单克隆抗体处理BT474细胞3天，用Hoechst33342染色，进行细胞周期分析。单克隆抗体是7C2和7F3，它们与ErbB2胞外结构域上的氨基酸22-53(SEQ ID NO:2)结合(分别在图14B和C中)；4D5，它与残基529-625(SEQ IDNO:4)结合(图14D)；和3H4，它与氨基酸541-599(SEQ ID NO:3)结合(图14E)。7C2和7F3均能诱导出细胞程序死亡(分别为细胞群体的60.5％和53.4％)，但是与未经处理的细胞(52.5％；图14A)相比，它们却不会降低S阶段细胞的比例(分别为64.9％和58.7％)。相反，单克隆抗体4D5和3H4结合毗邻ErbB2跨膜区，它们表现出强效的抗增殖活性(％S分别为5.4和10.5，对照的S为52.5％)，但是在促进编程性细胞死亡方面却不如7C2或7F3那样有效(细胞程序性死亡％为4D5=41.9,3H4=26.3，对照为15.8％)。
图15表示如实施例3那样测得的抗HER2单克隆抗体7C2在SKOV3卵巢癌细胞系中诱导细胞程序死亡的情况。
图16表示，当在抗HER2单克隆抗体4D5之前先给予抗HER2单克隆抗体7C2时，抗HER2单克隆抗体的组合处理结果增强了BT474乳房肿瘤细胞的细胞程序死亡(见实施例3)。
图17表示，如实施例4中所述，单独或组合给予抗HER2单克隆抗体对裸鼠中BT474M1异种移植物的平均肿瘤体积(mm3)±标准误差的影响。每周给予抗体2次，从第6天开始。
较佳实施例详述Ⅰ．定义除非另有特指，本文所用术语“ErbB2”指人ErbB2蛋白，“erbB2”指人erbB2基因。人erbB2基因和ErbB2蛋白在例如Semba等PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等Nature319:230-234(1986)(Genebank登录号X03363)中有所描述。ErbB2包含四个结构域(结构域1-4)。“结构域1”在ErbB2胞外间结构域的氨基端，如本文图12所示。另见Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1746-1750(1993)。
术语“表位7C2/7F3”是ErbB2胞外结构域N端上与7C2和/或7F3抗体(两者均保藏于ATCC，见下文)结合的区域。为了筛选与7C2/7F3表位结合的抗体，可采用如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,EdHarlow和David Lane(1988)所述的常规的交叉封闭试验。或者，可用表位作图(见下文实施例2)来确定抗体是否与ErbB2上的7C2/7F3表位(即ErbB2中大约残基22至53区域(SEQ ID NO:2)中的任何一个或多个残基)结合。
“表位4D5”是ErbB2胞外结构域中与抗体4D5(ATCC CRL10463)结合的区域。该表位毗邻ErbB2的跨膜区。为筛选与4D5表位结合的抗体，可采用如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)所述的常规的交叉封闭试验。或者，可作表位作图(见下文实施例2)，以确定抗体是否与ErbB2的4D5表位(即大约残基529，如约561至625(SEQID NO:4)残基区域内的任何一个或多个残基)结合。
术语“诱导细胞死亡”指抗体使活细胞变成不能存活的能力。这里的“细胞”是表达ErbB2受体的细胞，尤其是过度表达ErbB2受体的细胞。与同组织类型的非癌细胞相比，过度表达ErbB2的细胞具有明显高出正常的ErbB2水平。较佳的，该细胞是癌细胞，如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰或膀胱的癌细胞。在体外，细胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。细胞的体外死亡可在没有补体和免疫效应细胞存在下测得，以区别依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)或依赖于补体的细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。这样，可用热灭活血清(即没有补体)和没有免疫效应细胞存在下，来测试细胞死亡。为了确定抗体是否能诱导细胞死亡，通过碘化丙锭(PI)(见下文实施例2)、台盼蓝(参见，Moore等，Cytotechnology 17:1-11(1995))或7AAD(见下文实施例1)的吸收相对于未经处理细胞来评价膜完整性丧失程度。较佳的诱导细胞死亡的抗体是在“BT474细胞中的PI吸收试验(见下文)”中能诱导PI吸收的那些抗体。
术语“诱导细胞程序死亡”指抗体诱导编程性细胞死亡的能力，它通过与膜联蛋白V的结合、DNA片段化、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞裂解和/或形成膜泡囊(称为细胞程序死亡体(apoptotic body))来确定。见本文图1A和B。细胞是过度表达ErbB2受体的细胞。“细胞”宜为肿瘤细胞，如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰或膀胱的癌细胞。在体外，细胞可以是SKBR3、BT474、Calu3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。可以用各种方法来评价与细胞程序死亡相关的细胞活动。例如，可通过膜联蛋白结合来测定磷脂酰丝氨酸(PS)的转运(见下文实施例2)；可通过DNA梯来评价DNA片段化，如实施例2所述；通过评价亚二倍体细胞中的任何增长，可以评价胞核/染色质凝聚与DNA片段化。诱导细胞程序死亡的抗体最好是，在“采用BT474细胞的膜联蛋白结合试验中”(见下文)，与未经处理细胞相比，能诱导出约2至50倍(较佳的为5至50倍，更佳的约10-50倍)的膜联蛋白结合的抗体。
有时，促细胞程序死亡性抗体是封闭HRG结合/激活ErbB2/ErbB3复合物的抗体(如7F3抗体)。在其它场合，抗体是不明显封闭HRG激活ErbB2/ErbB3受体复合物的抗体(如7C2)。另外，抗体可以象7C2那样，在诱导细胞程序死亡的同时，不会大大减少S阶段的细胞百分数(如图10中所测定的，只使这些细胞百分数相对于对照减少约0-10％)。
感兴趣的抗体可以象7C2那样，它能与人ErbB2特异性结合，且不会与其它蛋白(如erbB1、erbB3和/或erbB4基因编码的蛋白)发生显著的交叉反应。有时，抗体可能不与大鼠neu蛋白(如Schecter等，Nature 312:513(1984)和Drebin等，Nature 312:545-548(1984)中所述的)发生明显的交叉反应。在该实例中，此抗体与这些蛋白结合(如与内源性受体的细胞表面结合)的程度将低于10％(经荧光素激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测得)。
本文所用的术语“遗传调节蛋白(HRG)”指激活ErbB2-ErbB3和ErbB2-ErbB4蛋白复合物(即在结合到其上时诱导复合物中酪氨酸残基磷酸化)的多肽。该术语中包括的各种遗传调节蛋白多肽公开在(例如)Holmes等Science,256:1205-1210(1992)；WO92/20798；Wen等，Mol.Cell.Biol.,14(3):1990-1919(1994)；和Marchionni等，Nature,362:312-318(1993)。该术语包括有生物活性的片段和/或天然存在的HRG多肽的变体，如其EGF样结构域片段(如HRGβ1177-244)。
术语“ErbB2-ErbB3蛋白复合物”和“ErbB2-ErbB4蛋白复合物”是ErbB2受体分别与ErbB3受体或ErbB4受体非共价关联的寡聚物。当表达这些受体的细胞接触HRG时形成了该复合物，它可通过免疫沉淀来分离获得，可用SDS-PAGE(如Sliwkowski等，J.Biol Chem.,269(20):14661-14665(1994)所述)来分析。
“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的抗体样分子。例如，淋巴系统可产生低水平的后一类多肽，而骨髓瘤可产生水平有所提高的多肽。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个不变区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有不变区；轻链的不变区与重链的第一个不变区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIHPubl.No.91-3242,Vol.I,647-669页(1991))。不变区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab′)2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由一个重链和一个轻链可变区紧密非共价关联的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚物表面上确定了抗原结合位点。6个CDR共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半只包含对抗原有特异性的三个CDR)也能识别并结合抗原，只是其亲和力比整个结合位点低。
Fab片段还含有轻链的不变区和重链的第一个不变区(CH1)。通过在重链CH1区的羧基端加入几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)，可使Fab片段之间互不相同。Fab′-SH在这里被命名为Fab′，其中不变区的半胱氨酸残基携带了一个游离的巯基。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab′片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其不变区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。
根据其重链不变区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链不变区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
术语“抗体”具有最广泛的含义，其具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)，以及具有所需生物活性的抗体片段。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，较佳的是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；二抗体(diabody)；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的有利之处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。“单克隆抗体”也可用例如Clackson等，Nature,352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与该特定动物抗体的对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类或亚类，而链的其余部分则与另一动物抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类或亚类)以及该抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
“人化”形式的非人(如小鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv,Fab,Fab′,F(ab′)2或抗体的其它抗原结合序列)，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)中的受者互补决定区(CDR)残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗体)的CDR残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)被对应的非人残基代替。另外，人化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于导人的CDR或构架序列中的残基。作这些修饰能进一步提高和最大化抗体的性能。通常，人化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人化抗体最好还包括免疫球蛋白不变区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc部分。更详细的情况可参见Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等，Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。人化抗体包括PRIMATIZEDTM抗体，其中抗体的抗原结合区可从通过感兴趣抗原免疫接种猕猴制得的抗体中衍生获得。
“单链Fv”或＂sFv＂抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区在多肽单链中。较佳的，Fv多肽还包括VH和VL区间的多肽接头，该接头可使sFv形成结合抗原所需的结构。关于sFv综述可见Pluckthun在The Pharmacology ofMonoclonal antibodies,113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,NewYork,269-315页(1994)。
术语“二抗体”指有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接成相同的多肽链(VH-VL)。采用一个短得无法使同一链上两个区间产生配对的接头，使区域与另一链中的互补区配对，形成了两个抗原结合位点。二抗体在例如EP404,096；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更详细的描述。
“分离”的抗体是已被鉴定并从其天然环境组成中分离和/或回收获得的抗体。其天然环境中的污染成分是能干扰抗体诊断或治疗应用的物质，它可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶解物。在较佳的实例中，抗体将被纯化成(1)含有超过95％(重量)的抗体(经Lowery方法测得)，最佳的为大于99％(重量)；(2)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基(用转杯式测序仪测得)；或(3)在还原或非还原的条件下、经SDS-PAGE以考马斯亮蓝或更佳的银染法测得是均一的。分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，因为抗体天然环境中的至少一种成分不存在。然而，分离的抗体通常可用至少一种纯化步骤制得。
本文所用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4)Fc区的一种表位，它负责提高IgG分子的体内血清半衰期。
“治疗”指治疗和预防措施。那些需要治疗的对象是已经患有疾病以及有待预防疾病的对象。
需要治疗的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的任何动物，包括人家用和农场、动物园、运动场动物，或小动物，如狗、马、猫、奶牛等。较佳的哺乳动物是人。
“疾病”是受益于抗ErbB2抗体治疗的任何疾病。这包括慢性和急性疾病，包括使哺乳动物易患有问题疾病的那些病理性疾病。本文待治疗的非限制性疾病例子包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴恶性肿瘤；神经、胶质、星形胶质、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质和囊胚腔疾病和炎症、血管生成和免疫疾病。
术语“癌”和“癌的”指哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理疾病。癌的例子包括(但不局限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌、肠胃癌、胰癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各类头部和颈部癌。
本文所用的术语“细胞毒性试剂”指能抑制或防止细胞功能和/或破坏细胞的物质。该术语包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物的酶活性毒素或其片段。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学物质。化疗剂的例子包括阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、硫替哌、白清安、细胞毒素(Cytoxin)、紫衫醇、Toxotere、氨甲碟呤、顺式铂氨、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、博来霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春花新碱、Vinorelbine、卡铂(Carboplatin)、表鬼臼毒素噻吩糖苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基碟呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯波霉素(见美国专利No.4,675,187)、苯丙氨酸氮芥和其它相关的氮芥子类。本定义中还包括调节或抑制激素作用于肿瘤的激素剂，如三苯氧胺和onapristone。
本文所用的术语“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞(尤其是过度表达ErbB2的癌细胞)生长的化合物或组合物。因此生长抑制剂可明显减少S阶段中过度表达ErbB2的细胞百分数。生长抑制剂例子包括阻断细胞周期进展(S阶段以外处)的试剂，如诱导G1停滞和M阶段停滞的试剂。典型的M阶段阻断剂包括长春花碱类(长春花新碱和长春花碱)、紫衫醇和拓扑Ⅱ型抑制剂如阿霉素、道诺红霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和博来霉素。使G1停滞的那些试剂也将溢出(spillover)到S阶段停滞，例如DNA烷基化试剂如三苯氧胺、强的松、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺式铂氨、氨甲碟呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。进一步的信息可在The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel编辑，Chapter 1，名称为“Cell cycle regulation,oncogens,and antineoplastic drugs”,Murakami等，(WB Saunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页。4D5抗体(及其功能等价物)也可用于此目的。
术语“细胞因子”是由一类细胞释放的、作为胞间介体作用于另一细胞的蛋白的遗传术语。这些细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素(如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺素(TSH)和促黄体素(LH))、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子α和β、米勒抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(如NGF-8)、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子(osteoinductive factor)、干扰素(如干扰素α、β和γ)、集落刺激因子(CSF)(如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF))、白细胞介素(IL)(如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12)、肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β、以及其它多肽因子(包括LIF和盒配体(KL,kit ligand))。本文所用的术语细胞因子包括天然的或来自重组细胞的蛋白以及有天然序列细胞因子的生物活性等价物。
本文所用的术语“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生物形式，它对肿瘤细胞的毒性比亲代药物低，并能通过酶来激活或转变成更具活性的亲代形式。例如参见，Wilman,＂Prodrugs in Cancer Chemotherapy＂biochemical SocietyTransactions,14,pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，＂Prodrugs:AChemical Approach to Targeted Drug Delivery＂,Directed Drug Delivery,Borchardt等，(编辑)，pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括(但不局限于)含磷酸酯的前体药物、含硫代磷酸酯的前体药物、含硫酸酯的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含β-内酰胺的前体药物、含有任意取代的苯氧乙酰胺的前体药物或含有任意取代的苯基乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶、和能转变成更具胞毒性游离药物的其它5-氟尿嘧啶前体药物。可衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物例子包括(但不局限于)上述那些化疗剂。
本文所用的术语“标记(物)”指一种可检测的化合物或组合物，它与抗体直接或间接偶联，从而产生了“标记的”抗体。标记可通过其本身而被检测(如放射性同位素标记或荧光标记)，或当标记是酶标记时，它可以催化底物化合物或组合物发生化学变化，而此种变化可检测到。
“固相”指本发明抗体可以粘附的非水性基质。本文中固相例子包括部分或全部由玻璃(如孔径控制的玻璃)、多糖(如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些例子中，根据上下文，固相可包括测试板的孔；在其它的例子中，它可以是纯化柱(如亲和层析柱)。该术语也包括如美国专利No.4,275,149中公开的分散颗粒的不连续固相。
“脂质体”是由各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的用来将药物(如本文公开的抗ErbB2抗体，以及任选的化疗剂)传递给哺乳动物的小泡。脂质体组分通常以双层形式排列，这与生物膜的脂类排列方式类似。“分离的”核酸分子是已被鉴定的核酸分子，该核酸分子已从至少一种核酸分子污染物(污染物与核酸分子通常存在于抗体核酸的天然来源中)中分离出来。分离的核酸分子的形式与其天然发现的形式不同。因此，可以区分分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸分子。然而，当核酸分子在不同于天然细胞的染色体位置上时，分离的核酸分子也包括细胞含有的、通常表达抗体的核酸分子。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达操作性相连的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核细胞的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、以及核糖体结合位点。已知真核细胞可采用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列置成功能性相关时，则核酸是“操作性相连的”。例如，如果它被表达成参与多肽分泌的前蛋白原(preprotein)时，则前序列(presequense)或分泌性前导序列的DNA与多肽的DNA操作性相连；如果它影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列操作性相连；或者，如果它的位置能够促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列操作性相连。较佳的，“操作性相连”宜指相连的DNA序列是毗邻的，在分泌性前导序列情况下，是毗邻的并在读码状态(reading phase)下。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成性寡核苷酸衔接子或接头。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，所有这些命名均包括子代。因此，术语“转化体”或“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养(不论传代多少次)。也应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上不精确相同。其包括了在原始转化细胞中筛选出具有相同功能或生物活性的突变型子代。当采用不同的命名时，可以从上下文中明显看出。
Ⅱ．发明实施方式A．抗体制备下面将描述有关生产本发明所要求的抗体的典型技术方案。用来生产抗体的ErbB2抗原可以是，例如，可溶形式的ErbB2胞外结构域；诸如结构域l或其部分(如包含7C2或7F3表位的部分)的肽。或者，可用在细胞表面表达ErbB2的细胞(如被转化以过度表达ErbB2的NIH-3T3细胞，见下文实施例1和2；或癌细胞系，如SKBR3细胞，见Stancovski等，PNAS(USA)88:8691-8695(1991))来生产抗体。可用来生产抗体的其它形式的ErbB2是本领域技术人员明显可知的。
(ⅰ)多克隆抗体最好是通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关的抗原和佐剂，在动物体内产生多克隆抗体。利用双功能或衍生化试剂(例如磺基琥珀酰亚胺马来酰亚胺苯甲氧酯(通过半胱氨酸残基来偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烷基))，可以将相关的抗原与在待免疫接种动物中有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂)偶联起来。
用抗原、免疫原性偶联物或衍生物对动物免疫接种，方法是混合例如100μg或5μg蛋白或偶联物(分别对兔或小鼠)和3体积的Freund完全佐剂，将此溶液皮内注射入多处部位。1个月后，将在Freund完全佐剂中的肽或偶联物以原先量的1/5至1/10加强注射入皮下多处部位。7至14天后，对动物取血，测定血清的抗体滴度。继续加强接种动物直至滴度平稳。动物最好是用相同抗原的、但与不同蛋白和/或通过不同交联剂偶联的偶联物来加强接种。偶联物也可在重组细胞培养中制成融合蛋白。另外，凝聚剂(如明矾)也适用于增强免疫应答。
(ⅱ)单克隆抗体单克隆抗体可从一类基本均一的抗体获得，即群体中包含的各个抗体是相同的，除了可能存在的少量天然发生的突变外。因此，修饰语“单克隆”表示了抗体的特征是它不是无联系抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，如上所述来免疫接种小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)，以诱导淋巴细胞，而淋巴细胞发产生或能产生特异性结合免疫接种用蛋白的抗体。或者，淋巴细胞可在体外受免疫。然后用合适的融合剂(如聚乙二醇)来融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
将这样制得的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中，使其生长，该培养基中最好含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基中通常加入了次黄嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制了HGPRT缺陷型细胞的生长。
较佳的骨髓瘤细胞是能有效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定而高水平产生抗体、且对诸如HAT培养基之类的培养基敏感的那些细胞。其中较佳的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，如从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(购自SalkInstitute Cell Distribution Center.San Diego,California USA)衍生的细胞系和SP-2或X63-Ag8-653细胞(购自American Type Culture Collection,Rockville,MarylandUSA)。另外，用来生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也已有所描述(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal antibodyProduction Techniques and Applications,pp51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤生长的培养液中有无针对抗原的单克隆抗体产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性宜通过免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定了能产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，通过有限稀释步骤来亚克隆该克隆，并用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))使该亚克隆生长。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤形式在动物体内生长。
用常规的免疫球蛋白纯化步骤(如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，将亚克隆细胞分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水体液或血清中分离出来。
很容易分离获得编码单克隆抗体的DNA并用常规步骤对其测序(例如，用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的较佳来源。一旦分离出后，可将DNA放入表达载体中，然后将该载体转染到宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文献包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthum,Immunol.Res.,130:151-188(1992)。
在另一个实例中，可以从采用McCafferty等，Nature,348:552-554(1990)所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离获得抗体或抗体片段。Clackson等，Nature,352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库来分离小鼠和人抗体。以后的出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology,10:779-783(1992))、以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc。Acids.Res.,21:2265-2266(1993))，来生产高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些方法是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的变化方案。
也可对DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链不变区的编码序列来代替同源的小鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或使非免疫球蛋白多肽的编码序列的部分或全部与免疫球蛋白编码序列共价连接。
通常，这些非免疫球蛋白多肽取代了抗体的不变区，或者它们取代了抗体中一个抗原结合位点的可变区，产生了一个嵌合的二价抗体，该抗体包含了对一个抗原有特异性的抗原结合位点和对不同抗原有特异性的另一个抗原结合位点。
(ⅲ)人化的以及人抗体人化非人抗体的方法是本领域中熟知的。人化的抗体中宜导入一个或多个非人源氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，它们通常取自“导入”可变区。人化可基本上根据Winter及其合作者(Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988)所述的方法，用啮齿类CDR或CDR序列来取代入抗体的对应序列。因此，这些“人化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上不到一个完整的人可变区被非人动物的对应序列取代。在实践中，人化抗体通常是人抗体中一些CDR残基以及可能还有一些FR残基被啮齿类抗体中类似部位的残基取代。
选择人轻链和重链可变区用来制备人化抗体对于降低抗原性来说是非常重要的。根据所谓的“最佳配合”方法，用已知人可变区序列的整个文库来筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后，采用最接近啮齿类的人序列作为人化抗体的构架区(FR)(Sims等，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法采用得自所有人抗体轻链或重链特定亚组共有序列的特定构架区。同一构架区可用于几个不同的人化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等，J.Immnol.,151:2623(1993))。
更重要的是，抗体的人化应保留对抗原的高亲和力以及其它有利的生物性能。为达到这一目的，制备人化抗体的一个较佳的方法是，利用亲代序列和人化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念上(conceptual)的人化抗体。免疫球蛋白的三维模型是本领域技术人员通常能获得的和熟知的。可得到能描述和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。观察这些显示结果，就能分析残基在候选免疫球蛋白序列中可能起到的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。这样，就能从供者抗体中选择FR残基并将其组合，再将该序列输入受者中，从而获得所需的抗体特性(如对靶抗原的亲和力提高)。通常，CDR残基直接和基本完全影响到抗原结合。
或者，现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它能经免疫接种在没有内源性免疫球蛋白产生时产生人抗体的全部组成成份。例如，已经描述了嵌合种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失会完全抑制内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因排列转移到这些种系突变型小鼠中能使其在抗原侵染时产生人抗体。例如参见，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.,7:33(1993)。人抗体也可从噬菌体展示文库中获得(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。
(ⅳ)抗体片段制备抗体片段的各种技术已经发展起来。在传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白消化来获得的(例如参见，Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等，Science,229:81(1985))。然而，现在这些片段可用重组宿主细胞来直接制得。例如，如上所述，抗体片段可从抗体噬菌体文库中分离获得。或者，可从大肠杆菌中直接回收得到Fab′-SH片段，并使其化学交联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可直接从重组宿主细胞培养中分离获得。制备抗体片段的其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。在一个实例中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185。
(ⅴ)双特异性抗体双特异性抗体是对至少两个不同表位有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可以与ErbB2蛋白的两个不同的表位结合。例如，一个臂可以与ErbB2结构域1中的表位(如7C2/7F3表位)结合，另一个可以与不同的ErbB2表位(如4D5表位)结合。其它此类抗体可以将ErbB2结合位点与EGFR、ErbB3和/或ErbB4结合位点组合起来。或者，抗ErbB2臂可以与结合白细胞上触发分子(如T细胞受体分子CD2或CD3或IgG(FcyR)的Fc受体(如FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16)))的臂组合，以使细胞防御机制集中于表达ErbB2的细胞上。双特异性抗体也可用来使细胞毒性试剂局限于表达ErbB2的细胞。这些抗体具有ErbB2结合臂和细胞毒性试剂(如皂草素、抗干扰素α、长春花生物碱、蓖麻蛋白A链、氨甲碟呤或放射活性同位素半抗原)结合臂。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是该领域中已知的。制备全长双特异性抗体的传统方法是根据两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对共同表达(Millstein等，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四杂交物)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常采用亲和层析方法，这是相当费力的，且产物得率很低。WO93/08829以及Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)公开了类似的方法。
根据不同的方法，使具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗体结合位点)与免疫球蛋白不变区序列融合。最好与免疫球蛋白重链不变区一起融合，至少包括部分铰链区、CH2和CH3区。最好是至少在一个融合物中有含轻链结合所需位点的第一重链不变区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入分离的表达载体中，并且共同转染入合适的宿主生物体中。在构建时采用不相等比例的三种多肽链来提供最优得率的实例中，这为调节三个多肽片段相互比例提供了更大的灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等比率表达导致高产率，或比例无关紧要时，可以将两个或所有三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个较佳实例中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称的结构有利于将所需的双特异性抗体从不需要的免疫球蛋白链组合物中分离出来，由于免疫球蛋白轻链只在双特异性分子的一半中，因此很容易分离。该方法公开在WO94/04690中。制备双特异性抗体的更详细的情况例如可参见Suresh等，Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一种方法，一对抗体分子间的界面可被工程改造成使得从重组细胞培养中回收获得的异二聚物达到最大的百分数。较佳的界面至少包含抗体不变区CH3结构域的一部分。在该方法中，第一抗体分子界面上的一个或多个氨基酸小侧链被较大的侧链(如酪氨酸或色氨酸)代替。通过用较小的侧链(如丙氨酸或苏氨酸)来代替大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上形成与(第一抗体中的)大侧链大小相同或相似的补偿“空穴”。这样就使得异二聚物的得率高于其它不需要的产物(如均二聚物)。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联”的抗体。例如，异偶联物中的一个抗体可以与亲和素偶联，另一个可以与生物素偶联。例如，已有建议用这种抗体来使免疫系统细胞靶向不希望的细胞(美国专利No.4,676,980)以及用来治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。异偶联抗体可用任何方便的交联方法来制得。合适的交联剂是本领域中已知的，美国专利No.4,676,980中公开了这些交联剂以及许多交联技术。
从抗体片段来制备双特异性抗体的方法在文献中也已有所描述。例如，可通过化学键来制备双特异性抗体。Brennan等，Science,229:81(1985)描述了这样一种方法，其中将完整的抗体蛋白水解断裂成F(ab′)2片段。在二巯基复合试剂亚砷酸钠存在下还原这些片段，使连位二巯基稳定，从而防止分子间形成二硫键。然后将产生的Fab′片段转变成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过巯基乙胺还原将一个Fab′-TNB衍生物重新转变成Fab′-巯基。再与另一个Fab′-TNB衍生物等分子量混合形成双特异性抗体。制得的双特异性抗体可用作酶选择性固定的试剂。
最近的进展实现了从大肠杆菌中直接回收获得可化学交联形成双特异性抗体的Fab′-SH片段。Shalaby等，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了人化双特异性抗体F(ab′)2全部分子的制备过程。使各Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，然后在体外进行定向化学交联，形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能结合过度表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，并触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳房肿瘤靶的裂解活性。
关于直接从重组细胞培养制备和分离双特异性抗体片段的各种方法已有描述。例如，利用亮氨酸拉链可制得双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合，使Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两个不同抗体的Fab′部分连接。在铰链区还原抗体均二聚物，形成单体，然后重新氧化形成抗体异二聚物。该方法也可用来制备抗体均二聚物。Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中描述的“二抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了另一种机理。片段包括了通过一个接头将重链可变区(VH)连接到轻链可变区(VL)，该接头非常短，使得同一链上的两个功能域之间不能发生配对。因此，一个片段上的VH和VL功能域被迫与另一片段上的互补VL和VH功能域配对，从而形成了两个抗原结合位点。采用单链Fv(scFv)二聚物来制备双特异性抗体片段的另一种策略也已有报道。见Grubber等，J.Immunol.,152:5368(1994)。
也可考虑采用有超过两价的抗体。例如，可制得三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。
(ⅵ)筛选所需性能的抗体上面描述了制备抗体的方法。现在挑选具有本文所述性能的那些抗体。
为了选择诱导细胞死亡的抗体，例如以PI、台盼蓝或7AAD吸收所表明的那样，相对于对照对膜完整性的损失进行了评价。较佳的测试方法是“采用BT474细胞的PI吸收试验”。根据该测试方法，将BT474细胞(可从美国典型培养物保藏中心(Rochville,MD)获得)培育在Dulbecco改进的Eagle培养基(添加了10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L谷氨酰胺的Ham F-12(50∶50))中。(这样，该试验在没有补体和免疫效应细胞存在下进行)。将BT474细胞以每碟3×106个的密度接种到100×20mm碟中，使其粘附过。然后除去培养基，代之以单独的新鲜培养基或含有10μg/ml合适单克隆抗体的培养基。培育细胞3天。在每次处理后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶消化来脱附。然后，4℃、1200rpm离心细胞5分钟，将沉淀物重悬在3ml冰冷Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)中，等分入35mm盖有滤网的12×75试管中(每管1ml,3管为一处理组)以去除细胞凝聚块。然后在试管中加入PI(10μg/ml)。用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。选择诱导大量细胞死亡(经PI吸收测得)的那些抗体。
为了选择诱导细胞程序死亡的抗体，如下述实施例2所述的，可采用“利用BT474细胞的膜联蛋白结合试验”。如前段中所述的那样，培养BT474细胞并接种到碟中。然后除去培养基，代之以单独的新鲜培养基或含10μg/ml单克隆抗体的培养基。培育3天后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶消化来脱附。然后离心细胞，重悬于Ca2+结合缓冲液中，并如上所述等分入试管中进行细胞死亡试验。然后在试管中加入经标记的膜联蛋白(如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。选择诱导出膜联蛋白结合高水平(与对照相比)的那些抗体作为诱导细胞程序死亡的抗体。
除了前一段中所述的膜联蛋白结合试验外，还可用“利用BT474细胞的DNA染色试验”。为了进行该试验，将经前两段中所述感兴趣抗体处理的BT474细胞在9μg/ml HOECHST33342TM中37℃培养2小时，然后用MODFIT LTTM软件(Verity Software House)在EPICS ELITETM流式细胞计数仪(Coulter Corporation)上分析。诱导细胞程序死亡的细胞百分数变化(比未处理细胞(高达100％细胞程序死亡)高2倍或更高(较佳的为3倍或更高))的抗体可被选作采用该试验的促细胞程序死亡性抗体。
为了筛选与感兴趣抗体结合的ErbB2表位结合的抗体，可采用如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和DavidLane(1988)所述的常规的交叉封闭试验。或者，可用实施例2所述的表位作图。
为了鉴定在细胞培养中50-100％地抑制SKBR3细胞生长的抗ErbB2抗体，进行WO89/06692中所述的SKBR3试验。根据该试验，使SKBR3细胞在F12和DMEM培养基(添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素)的混合物(1∶1)中生长。在35mm细胞培养碟中接种20,000个SKBR3细胞(2ml/35mm碟)。每个碟中加入了2.5μg/ml抗ErbB2抗体。6天后，用COULTERTM电子细胞计数仪来计数细胞数目与未处理细胞比较。选择50-100％地抑制SKBR3细胞生长的那些抗体，并按需与细胞程序死亡性抗体组合使用。
(ⅶ)效应物功能的工程改造在效应物功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强抗体在治疗(例如)癌时的效果。例如，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的均二聚抗体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤能力和依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可如Wolff等Cancer Research 53:2560-2565(1993)描述的那样，用异二聚功能性交联剂来制备抗肿瘤活性增强的均二聚抗体。或者，可将抗体工程改造成具有双Fc区，从而可能增强补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3:219-230(1989)。
(ⅷ)免疫偶联物本发明还涉及包含与细胞毒性试剂偶联的本文所述抗体的免疫偶联物，细胞毒性试剂例如是化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射活性同位素(即放射偶联物)。
用来制备此类免疫偶联物的化疗剂在上文已有描述。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿浓杆菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、α-八叠球菌、Aleurites fordii蛋白、diathin蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPⅠ、PAPⅡ和PAP-S)、momordica charantia抑制剂、麻枫树毒素、巴豆毒素、sapaonariaofficinalis抑制剂、gelonin、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。各种放射性核素可用来制备放射性偶联的抗ErbB2抗体。例子包括212Bi,131I,131In,90Y和186Re。
抗体与细胞毒性试剂的偶联物可用各种双功能蛋白偶联剂制得，偶联剂例如是N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane,IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二叠氮化合物(如二(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、二重氮化合物(如二(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可根据Vitetta等Science 238:1098(1987)所述的制备蓖麻毒蛋白的免疫毒素。C14标记的1-异硫氰酸基苯基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用来偶联放射性核苷酸与抗体的典型的螯合剂。见WO94/11026。
在另一个实例中，抗体可以与“受体”(如链亲和素)偶联，以用来预先靶向肿瘤，其中将抗体-受体偶联物给予患者，然后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，再给予与细胞毒性试剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲和素)。
(ⅸ)免疫脂质体本文公开的抗ErbB2抗体也可制成免疫脂质体。含有该抗体的脂质体的制备方法是本领域中已知的，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和4,544,545。美国专利No.5,013,556中公开了循环时间增加的脂质体。
特别有用的脂质体可通过反向蒸发方法从包含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物制得。将脂质体挤压通过限定孔径的滤膜，获得有所需直径的脂质体。本发明的抗体Fab′片段可如Martin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述的那样通过二硫键互换反应与脂质体偶联。脂质体中可以任选地含有化疗剂(如阿霉素)。见Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
(ⅹ)依赖于抗体的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)通过将抗体与激活前体药物的酶(能将前体药物(如肽基化疗剂，见WO81/01145)转变成有活性的抗癌药)偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT。例如参见WO88/07378和美国专利No.4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶联物的酶成分包括可作用于前体药物将其转变成更具活性和细胞毒性形式的酶。
用于本发明方法的酶包括(但不局限于)用于将含磷酸酯的前体药物转变成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前体药物转变成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性5-氟胞嘧啶转变成抗癌药物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脱酰胺酶；用于将含肽前体药物转变成游离药物的蛋白酶，如锯齿(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转变含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前体药物转变成游离药物的糖类断裂酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转变成游离药物的β-内酰胺酶；以及用于将经苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的胺基氮分别转变成游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用具有酶活性的抗体(也称为抗体酶(abzyme))将本发明的前体药物转变成游离的、有活性的药物(例如参见，Massey,Nature 328:457-458(1987))。抗体-抗体酶偶联物可如本文所述的那样来制备，以将抗体酶递送至肿瘤细胞群中。
利用本领域已知的技术(如用上述的异双功能交联剂)使本发明的酶与抗ErbB2抗体共价结合。或者，利用本领域中熟知的重组DNA技术(例如参见Neuberger等，Nature,312:604-608(1984))，可以构建出融合蛋白，它包含至少本发明抗体的抗原结合区和与之相连的本发明酶的至少一个功能活性部分。
(ⅹⅰ)抗体补救性受体结合表位融合在本发明的某些实例中，希望采用抗体片段而不是完整的抗体，例如来提高肿瘤穿透(penetration)。在这种情况下，希望对抗体片段进行修饰，以提高其血清半衰期。例如，这可通过在抗体片段中掺入补救受体结合表位(例如，通过抗体片段中合适区域内的突变，或通过在肽尾端中掺入表位，然后依靠DNA或肽合成融合入抗体片段末端或中部)来实现。
制备体内半衰期提高的这种抗体变体的系统性方法包括以下几步。首先是鉴定IgG分子Fc区的补救受体结合表位的序列和构型。一旦确定了该表位，就可将感兴趣的抗体序列修饰使包括经鉴定的结合表位序列及构型。在序列发生突变后，测试抗体变体，看其半衰期是否比原来的抗体长。如果在测试时抗体变体没有较长的体内半衰期，则再一次将其序列改变使包括经鉴定结合表位的序列和构型。测试变化后的抗体是否有较长的体内半衰期，继续该过程直至获得具有较长的体内半衰期的分子。
这样掺入感兴趣抗体的补救受体结合表位是上述任何合适的表位，其特征取决于(例如)被修饰的抗体类型。该转移应使感兴趣的抗体仍然具有本文所述的生物活性。
较佳的，表位宜构成一个区域，其中来自Fc区的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置上。更佳的是，Fc区中一个或两个环的三个或多个残基被转移。还要佳的是，表位取自(例如IgG的)Fc区中CH2区，并被转移到抗体CH1、CH3或VH区、或一个以上的此类区域中。或者，表位取自Fc区的CH2区，并被转移到抗体片段的CL区或VL区或这两者中。
在一个最佳的实例中，补救受体结合表位包含序列(5′到3′):PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:5)，还任选地包括选自HQSLGTQ(SEQ ID NO:6)、HQNLSDGK(SEQID NO:7)、HQNISDGK(SEQ ID NO:8)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:9)的序列，尤其当抗体片段是Fab或(Fab′)2时。在另一个最佳实例中，补救受体结合表位是含有下述序列(5′到3′):HQNLSDGK(SEQ ID NO:7)、HQNISDGK(SEQ ID NO:8)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:9)和序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:5)的多肽。
B．载体、宿主细胞和重组方法本发明还提供了编码本文公开的抗体的分离的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用来制备该抗体的重组方法。例如，根据WO96/07321(1996年3月14日公开)的描述，除了抗体的重组生产外，编码本文所述抗体的核酸可用来抑制细胞表面的ErbB2蛋白表达。例如，抗体可以是表达载体(如病毒或质粒载体)中提供的单链Fv片段，该载体被导入细胞中以在胞内结合ErbB2蛋白，从而诱导细胞死亡。
抗体的重组生产方法是，分离获得编码抗体的核酸并插入可复制的载体中以便进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA很容易用常规步骤(如，利用能特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。可采用许多种载体。载体组件最好包括(但不局限于)下列中的一种或多种信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(ⅰ)信号序列组件本发明的抗ErbB2抗体不仅可以通过重组方法直接制得，还可以从其与异源多肽(最好是信号序列，或成熟蛋白或多肽的N端有特异性断裂位点的其它多肽)的融合多肽来制得。所选的异源信号序列最好是能被宿主细胞识别和加工(如被信号肽酶断裂)的序列。由于原核细胞不能识别和加工天然的抗ErbB2抗体信号序列，所以用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素Ⅱ前导序列的原核生物信号序列来代替信号序列。对于酵母菌分泌，天然的信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母菌属和克鲁维酵母属α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、C.albicans葡糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中描述的信号来取代天然的信号序列。在哺乳动物细胞表达时，哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列(如单纯疱疹gD信号)是可行的。
将该前体区域的DNA与读框中编码抗ErbB2抗体的DNA相连。
(ⅱ)复制起点组件表达和克隆载体均含有能使该载体在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。较佳的，在克隆载体中，该序列是能使载体不依赖宿主染色体DNA独立复制的序列，它包括复制起点或自主复制序列。这些序列对于各种细菌、酵母和病毒来说是熟知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒(复制)起点适用于酵母，各种病毒(复制)起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。较佳的，哺乳动物表达载体(通常可用SV40起点，这仅仅是因为它含有早期启动子)不需要复制起点组件。
(ⅲ)选择基因组件表达和克隆载体可以含有选择基因(也称为可选择标记物)。典型的选择基因编码出的蛋白(a)提供了对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素、新霉素、氨甲碟呤或四环素)的抵抗力；(b)弥补了营养缺陷型；或(c)提供了不能从复合培养基获得的关键的营养物，如编码杆菌所需的D-丙氨酸消旋酶的基因。
筛选方案的一个例子采用药物来使宿主细胞生长停滞。用异源基因成功转化的那些细胞产生了抵抗药物的蛋白，从而在筛选方案中存活下来。这些结构域选择所采用的药物例子是新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适用于哺乳动物的可选择标记物的另一个例子是能鉴定感受态细胞吸收抗ErbB2抗体核酸的那些标记物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白Ⅰ和Ⅱ(较佳的是灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，将所有转化体培养在含氨甲碟呤(Mtx，一种DHFR的竞争性佶抗物)的培养基中，可首先鉴定出DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺失的中国仓鼠(CHO)细胞系。
或者，使细胞在含有针对可选择标记物的选择剂(如氨基糖苷抗生素，如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中生长，可选择出转化或共转化了编码抗ErbB2抗体、野生型DHFR蛋白和其它可选择标记物(如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主细胞)。见美国专利No.4,965,199。
用于酵母的合适的选择基因是酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature,282:39(1979))。trp1基因为不能在色氨酸中生长的突变型酵母菌株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标记物。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中的trp1损毁为在没有色氨酸存在下生长时检测转化提供了有效的环境。同样，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可用已知携带Leu2基因的质粒来弥补。
此外，从1.6μm环化质粒pKD1获得的载体可用来转化克鲁维酵母属酵母。另外，已经报道了在K.lactis中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统(Van denBerg,Bio/Technology,8:135(1990))。利用工业菌株克鲁维酵母属来分泌成熟的重组人血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体也已被公开。Fleer等，Bio/Technology,9:968-975(1991)。
(ⅳ)启动子组件表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并与抗ErbB2抗体核酸操作性相连的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖酶启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交的启动子如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是适用的。用于细菌系统的启动子还含有与编码抗ErbB2抗体的DNA操作性相连的Shine-Dalgarno(SD)序列。
真核细胞的启动子序列也是已知的。基本上所有的真核基因在转录起始位点上游约25-30碱基处有富含AT的区域。在许多基因的转录起始点上游70至80个碱基出发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是在编码序列的3′端加入polyA尾区的信号。所有这些序列均能适当地插入真核表达载体中。
用于酵母宿主细胞的合适的启动子序列例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶(如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。
其它酵母启动子(是可诱导的启动子，其额外优点是转录受生长条件的控制)是下述酶的启动子区是醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮新陈代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和利用麦芽糖和半乳糖的酶。用于酵母表达的合适的载体和启动子在EP73,657中有进一步的描述。酵母增强子还可与酵母启动子一起使用。
通过从病毒基因组获得的启动子(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最佳的猴病毒40(SV40))、异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热休克启动子，可以控制载体在哺乳动物宿主细胞中转录抗ErbB2抗体，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。
可方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子，作为另含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地获得作为HindⅢE限制性片段。美国专利No.4,419,446中公开了用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中描述了该系统另一种改进方案。另见Reyes等，Nature,297:598-601(1982)关于人β-干扰素cDNA在小鼠细胞中、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下的表达。另外，Rous肉瘤病毒的长末端序列可用作启动子。
(ⅴ)增强子元件组件在载体中插入增强子序列通常能增强编码本发明抗ErbB2抗体的DNA在高级真核细胞的转录。现已从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)知道了许多增强子序列。但是，通常采用的是真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起始区(bp100-270)晚期侧(late side)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始区晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。另见Yaniv,Nature,97:17-18(1982)关于激活真核启动子的增强子元件部分。增强子可剪接入载体中抗ErbB2抗体编码序列的5′或3′位上，但是较佳的是在启动子的5′位。
(ⅵ)转录终止组件用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞生物的带核细胞)的表达载体还含有转录终止和mRNA稳定化所需的序列。这些序列通常从真核或病毒DNA或cDNA的5′端(有时是3′)非翻译区获得。这些区域含有的核苷酸节段转录成编码抗ErbB2抗体mRNA非翻译部分的聚腺苷酸化片段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见WO94/11026和本文公开的表达载体。
(ⅶ)宿主细胞的选择及转化用于克隆或表达本文所述的载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高级真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括真细菌类，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科如埃希氏杆菌属(如，大肠杆菌、肠杆菌、欧文氏菌属、克雷伯氏杆菌属)、沙门氏菌属(如，鼠伤寒沙门氏菌属)、沙雷氏菌属(如，粘质沙雷氏菌属)、志贺氏菌属，和杆菌属(如枯草芽胞杆菌和藓样芽胞杆菌(如DD266,710,1989年4月12日公开的藓样芽胞杆菌4IP))、假单胞菌(如绿脓假单胞菌)和链霉菌。一个较佳的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31446)，但是其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31537)和大肠杆菌W3110(ATCC27325)也是适用的。这些例子只用于描述，没有限制性。
除了原核细胞外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于用作抗ErbB2抗体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(即常见的面包酵母)是低级真核宿主生物中最为常用的。然而，这里通常可得到和采用其它许多种、属和菌株，如Schizosaccharomyces pombe；克鲁维酵母属宿主，如K.lactis,K.fragilis(ATCC12424),K.Bulgaricus(ATCC 16045),K.wickeramii(ATCC 24178),K.waltii(ATCC56500),K.drosophilarum(ATCC 36906),K.thermotolerans和K.marxianus；yarrowia(EP402,226)；Pichia pastoris(EP 183,070)；念珠菌属；Trichodermareesia(EP 244,234)；粗糙链孢霉；Schwanniomyces如Schwanniomycesoccidentalis；和丝状真菌如链孢霉属、青霉菌属、Tolypocladium和曲霉属宿主(如构巢曲霉和黑曲霉)。
用于表达糖基化抗ErbB2抗体的合适宿主细胞从多细胞生物获得。无脊椎细胞的例子包括植物和昆虫的细胞。各种杆状病毒株和变体和来自宿主如草地蛾、埃及伊蚊、白纹伊蚊、黑尾果蝇和家蚕的相应的允许昆虫细胞已被鉴定。用于转染的各种病毒株(例如，苜蓿丫纹蛾NPV的L-1变体和家蚕的Bm-5株)可从出版物中获得，这些病毒可用作本发明中所述的病毒，尤其可用于黑尾果蝇细胞的转染。
也可用棉、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养作为宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，且脊椎动物细胞在培养中的繁殖(组织培养)已经成为常规手段。有用的哺乳动物宿主细胞系例子是SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胎肾细胞系(293或在悬浮培养中生长的293亚克隆细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠足细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；水牛大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCCCCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.sci.,383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞生产抗ErbB2抗体，并将宿主细胞培养在常规的营养培养基中，培养基经适当变化以适合诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
(ⅷ)培养宿主细胞用来生产本发明抗ErbB2抗体的宿主细胞可在各种培养基中培养。商业上可获得的培养基如Ham′s F10(Sigma)、极限必需培养(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM,Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.,58:44(1979),Barnes等，Anal.Biochem.,102:255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任一培养基可用作(本发明)宿主细胞的培养基。所有这些培养基中可以按需添加入激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药)、微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)以及葡萄糖或等价能源。另外也可加入本领域技术人员已知的合适浓度的任何必需补充物。培养条件，如温度、pH等，与前述选择宿主细胞表达时所用条件一样，这对本领域技术人员来说是明显了解的。
(ⅸ)抗ErbB2抗体的纯化当采用重组技术时，抗体可产生在细胞内(周质空间内)或被直接分泌到培养基中。如果抗体产生在细胞内，则第一步是(例如)通过离心或超离心来除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分泌人大肠杆菌周质空间抗体的分离方法。简言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下冻融细胞浆状物约30分钟。离心除去细胞碎片。若抗体被分泌到培养基中，则最好首先用商业上购得的蛋白浓缩滤膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)来浓缩该表达系统的上清液。在前述任何步骤中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶抑制剂(如PMSF)，还可加入抗生素来防止外来污染物的生长。
例如，可用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞中制得的抗体组合物，其中亲和层析是较佳的纯化方法。蛋白A作为亲和配体的合适程度取决于抗体中任何免疫球蛋白Fc区的动物种类和同种型。蛋白A可用来纯化以人γ1、γ2或γ4重链为基础的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，建议采用蛋白G(Guss等，EMBO J.5:15671575(1986))。用作亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但是也可采用其它基质。机械上稳定的基质(如孔径控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)能达到比琼脂糖更快的流速，操作时间更短。当抗体包含CH3区时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)可用于纯化。根据待回收抗体的不同，还可采用其它蛋白纯化方法，如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反向HPLC、硅胶色谱、阴离子或阳离子树脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM层析、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化后，可对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，采用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，最好是在低盐浓度(如约0-0.25M盐)下进行。
C．药物制剂将有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制成冻干制剂或水性溶液形式的抗体治疗剂并保藏(Remington′s PharmaceuticalSciences,16版，Osol,A.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对于受者没有毒性，并包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其它有机酸缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲季胺、苯扎氯胺、苄索氯胺；苯酚、丁基或苄基醇；对羟苯甲酸烷酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；金属配合物(如Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还可含有受治疗特定适应征所需的一种或多种活性化合物，尤其是具有补充活性且相互间没有不利影响的那些化合物。例如，在一个制剂中，还希望提供与EGFR、ErbB2(如与ErbB2上不同表位结合的抗体)、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。或者，另外此组合物还可包含细胞毒性试剂、细胞因子或生长抑制剂。这些分子能以有效实现目的的剂量组合。
活性组分还可包裹在(例如)通过团聚技术或界面聚合制得的微胶囊中，例如分别在羟甲基纤维素或明胶微束和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微珠、微乳剂(microemulsion)、纳颗粒和纳胶囊)或巨乳剂(macroemulsion)中。这些技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16版，Osol,A.Ed(1980)中。
用于体内给药的制剂必须无菌。这很容易通过无菌滤膜过滤来实现。
可以制得缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物半渗透基质，其中基质是成形制品，如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)或聚(乙烯醇))、多抗甲素化物(polyactin)(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不能降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯组成的可注射的微珠)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合物能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃水分下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代-二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿度程度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。
D．抗体非治疗应用本发明的抗体可用作亲和纯化试剂。在该方法中，抗体用本领域已知的方法固定在固相(如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定的抗体与含待纯化ErbB2蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，除去样品中(除与固定抗体结合的ErbB2蛋白外)基本上所有的物质。最后，用另一合适的溶剂(如甘氨酸缓冲液pH5.0)洗涤，将ErbB2蛋白从抗体上释放下来。
抗ErbB2抗体也可用于检测ErbB2蛋白的诊断试验中，例如检测ErbB2在具体细胞、组织或血清中的表达。因此，抗体可用于人恶性肿瘤的检测(例如参见，美国专利5,183,884)。
对于诊断性应用，抗体通常用可检测物质作标记。可采用各种标记，它们宜分成下列几类(a)放射性同位素，如35S、15C、125I、3H和131I。抗体可根据(例如)CurrentProtocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等编辑，Wiley-Interscience,NewYork,Pubs.,(1991)中所述的方法用放射性同位素作标记，放射活性可用闪烁计数来测定。
(b)荧光标记，例如可采用稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和Texas红。例如可采用Current Protocolsin Immunology(同上)所述的方法来偶联荧光标记和抗体。荧光可用荧光计来定量分析。
(c)可采用各种酶-底物标记，美国专利No.4,275,149综述了其中的一些标记。酶最好能催化显色底物的化学变化可用各种方法来测定。例如，酶可以催化底物，使其发生能用分光光度计来测定的颜色变化。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量测定荧光变化的方法如上所述。化学发光底物通过化学反应被电激发，然后发射可检测(例如通过化学发光计)的光或提供能量给荧光接受器。酶标记的例子包括萤光素酶(如火萤萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸每、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如鸟酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。O′Sullivan等，Methodfor the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，在Methods in Enzym.(J.Langone&H.Van.Vunakis编辑)，Academic press,NewYork,73:147-166(1981)中描述了偶联酶和抗体的方法。
酶-底物组合的例子包括，例如(ⅰ)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(如邻苯二胺(OPD)或3,3′,5,5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ⅱ)碱性磷酸酶(AP)和作为显色底物的对硝基苯磷酸酯；以及(ⅲ)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和显色底物(如p-硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员还可采用其它各种酶-底物组合。关于这些组合的综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，标记可以间接地与抗体偶联。本领域技术人员应该知道实现这一目的的各种方法。例如，抗体可以与生物素偶联，而上述三大类标记则与亲和素偶联，或两者互换。生物素选择性地结合亲和素，从而通过这一间接的方式将标记和抗体偶联起来。另外，为了间接地偶联标记和抗体，可使抗体与小的半抗原(如异羟基洋地黄毒苷原)偶联，而上述不同类型的标记中的一种则与抗半抗原抗体(如抗异羟基洋地黄毒苷原抗体)偶联。这样，就间接地将标记和抗体偶联起来。
在本发明的另一个例子中，不必对抗ErbB2抗体作标记，它的存在可通过与ErbB2抗体结合的标记过的抗体来检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测试方法中，如竞争性结合测试，直接和间接的夹心测试和免疫沉淀测试。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.1987)。
竞争性结合试验取决于标记过的标准品与测试样品分析物竞争结合有限量抗体的能力。试样中ErbB2蛋白的量与结合抗体的标准品的量成反比。为了测定已结合标准品的量，抗体最好在竞争前后为不溶性的，这样就能方便地将已结合抗体的标准品和分析物从未结合的标准品和分析物中分离出来。
夹心试验包括采用两种抗体，每种抗体能结合待检测蛋白的不同的免疫原性部分或表位。在一个夹心试验中，测试样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后，第二抗体与分析物结合，从而形成了不溶性的三组分复合物。例如参见美国专利No.4,376,110。第二抗体本身可用可检测物质作为标记(直接夹心试验)，或可利用标记了可检测物质的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心试验)。例如，一类夹心试验是ELISA试验，在该种情况下，可检测物质是酶。
对于免疫组织化学，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可包埋在石蜡中并用防腐剂(例如福尔马林)来固定。
抗体也可用于体内诊断试验。抗体最好用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记，这样通过免疫闪烁显影就可确定肿瘤的位置。
E．诊断用试剂盒为方便起见，本发明的抗体可以试剂盒形式提供，即将预定剂量的试剂与进行诊断性试验的说明书组合包装。当抗体用酶作标记时，试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子(如提供可检测发色团或荧光团的前体底物)。另外，还可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以差别很大，溶液中的试剂浓度能基本使试验灵敏度达到最优。特别是，试剂可以是干粉形式(通常是冻干的)提供，包括在溶解时能提供浓度合适的试剂溶液的赋形剂。
F．抗体的治疗用途可以考虑采用本发明的抗ErbB2抗体来治疗各种病征，包括以ErbB2受体过度表达和/或激活为特征的那些病征。有待用ErbB2抗体治疗的病征或疾病例子包括良性或恶性肿瘤(如肾、肝、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠、前列腺、胰、肺(ling)、外阴、甲状腺、肝细胞癌；肉瘤；成胶质细胞瘤和各种头部和颈部肿瘤)；白血病和淋巴恶性肿瘤；其它疾病，如神经、胶质、星形胶质、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质和囊胚腔疾病；以及炎症、血管生成和免疫疾病。
可根据已知的方法将本发明的抗体给予哺乳动物(较佳的是人)，这些方法例如作为药团的静脉内给药、或通过肌内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径持续灌输一定时间。静脉给予抗体的方式是较佳的。
其它治疗方案可以与本发明的抗ErbB2抗体给药联合。例如，待用本文公开的抗体来治疗的患者还可接受放射治疗。或者，还可将化疗剂给予患者。这些化疗剂的制剂和剂量方案可根据生产商的说明书来使用，或可根据专业医师的实践经验来确定。这些化学治疗的制剂和剂量方案还公开在Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,MD(1992)中。化疗剂可在给予抗体前后或同时给予。抗体可以与抗雌激素化合物(如三苯氧胺)或抗黄体酮化合物(如onapristone)(见EP616812)组合，这些分子的剂量是本领域中已知的。
还希望给予抗其它肿瘤相关抗原的抗体，如与EGFR、ErbB3、ErbB4、或血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。或者另外，可以将两种或多种抗ErbB2抗体给予患者。有时，还可将一种或多种细胞因子给予患者。在一个较佳的实例中，抗ErbB2抗体与生长抑制剂一同给药。例如，可以首先给予生长抑制剂，然后再给予ErbB2抗体。然而，也可考虑同时给药，或首先给予ErbB2抗体。生长抑制剂的合适剂量是目前采用的那些剂量，而且由于生长抑制剂与抗ErbB2抗体的组合作用(协同作用)，该剂量还可降低。
为预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于上述待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程(无论抗体用来预防还是治疗)、以前的治疗、患者病史以及对抗体的反应、主治医师的判断。抗体可以适当地一次性或在一系列治疗中给予患者。
根据疾病严重程度和类型，给予患者的初始候选抗体剂量约为1μg/kg至15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，例如通过一次或多次给药或连续灌输。根据上述因素，典型的每日剂量大约为1μg/kg至100mg/kg或更高。反复给药几天或更长时间的须取决于病征，治疗持续直至病征发生所希望的抑制。然而，也可采用其它剂量方案。该治疗的进展情况很容易通过常规技术和试验来监测。
G．生产的产品在本发明另一个实例中，提供了一种含有用于治疗上述疾病的物质的产品。产品包括一个容器和一个标签。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射管和试管。容器可用诸如玻璃或塑料之类的各种物质制成。容器中盛放了可有效治疗病征的组合物，还可以含有一个无菌入口(例如，容器可以是盛静脉用溶液的袋或有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是抗ErbB2抗体。容器上的或附带的标签说明了该组合物可治疗所列出的病征。产品还可包含第二个容器，该容器中含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐溶液、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。它还可包括商业和应用上所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤过滤器、针头、注射器和装有使用说明书的包装物。
H．物质的保藏下列杂交瘤细胞系已经保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 ParklawnDrive,Rockville,MD,USA(ATCC))中抗体命名ATCC编号 保藏日期7C2 ATCC HB-12215 1996年10月17日7F3 ATCC HB-12216 1996年10月17日4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日这些保藏是根据“国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约”及其规定的条款作出的。这确保了培养物自保藏之日起30年内保持存活。该细胞系须根据布达佩斯条约及遵从Genentech,Inc.和ATCC间协议下从ATCC获得，该合同确保了(a)在该专利申请审查期间，授权委员根据37CFR§1.14和35USC§122决定的人员可获得该培养物，且(b)公众获得该保藏培养物的所有限制在授予专利时将最终被取消。
本申请的受让人已经同意，如果该保藏的培养物在合适的条件下培养时死亡、丢失或被破坏，他们可立即通知要求用同一培养物的存活样品代替。得到保藏的该细胞系不应被视为获得实施本发明的许可证，那是违反政府当局根据专利法授予本发明的权力的。
相信前述说明足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明不受保藏抗体范围的限制，因为本发明范围包括了任何功能上等价的抗体。本文的保藏物并不等于承认本文的说明不足以实施本发明的所有方面(包括其最佳实施方式)，它也应被理解成将权利要求范围限制在其代表的具体描述内。实际上，除了本文所述的以外，根据前面的描述，本领域技术人员显然还可对本发明作各种改动，这些改动也包括在所附权利要求的范围内。
提供下列实施例只是为了说明，而并不是用来限定。说明书引用的所有文献均特意纳入本文作参考。
实施例1诱导细胞死亡细胞系。已建立的人乳房肿瘤细胞BT474和MDA-MB-231(来自ATCC)培养在基本(Gibco,Grand Island,NY)培养液中，其中加有10％热灭活胎牛血清(FBS)(HyClone,Logan,UT)、丙酮酸钠、L-谷氨酸(2mM)、非必需氨基酸和2x维生素溶液，培养保温于37℃,5％CO2。(Zhang等，Invas.& Metas.11(4):204-215(1991)和Price等，Cancer Res.50(3):717-721(1990))。
抗体。按Fendly等Cancer Res.50:1550-1558(1990)和WO89/06692所述，产生针对ErbB2胞外结构域抗ErbB2的IgG1κ小鼠单克隆抗体4D5和7C2。简而言之，如Hudziak等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84:7159(1987)所述产生NIH3T3/HER2-3400细胞(表达率约为1×105分子/细胞)，用含25mM EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)收获细胞，用于免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5、7周给小鼠i.p.注射含107细胞的0.5ml PBS。在第9周和第13周，对其抗血清能免疫沉淀32P标记的ErbB2的小鼠i.p.注射经麦芽凝集素-琼脂糖(WGA)纯化的ErbB2膜提取物。然后，i.v.注射一次0.1ml的ErbB2制剂，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653融合。通过ELISA和放射性免疫沉淀法筛选杂交瘤上清液的ErbB2结合作用。MOPC-21(IgG1),(Cappell,Durhan,NC)，被用作同种异型匹配对照。
细胞周期状况和活性的分析。在FACSTAR PLUSTM(Becton DickinsonImmunocytomety Systems USA,San Jose,CA)上通过流式细胞计数法同时检测细胞的活性和周期状况。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞单层来收获乳房肿瘤细胞，将细胞培养在0.05％胰蛋白酶和0.53mM DETA(Gibco)中，再将它们重悬在培养基中。细胞用含1％FBS的PBS洗涤两次，细胞沉淀与50μl 400μM 7氨基放线菌素D(7AAD)(一种能使所有透过性细胞被染色的活性染料)(Molecular Pobes,Eugene,OR)冰上孵育30分钟。然后用1.0ml多聚甲醛的0.5％PBS溶液固定细胞，同时，在4℃用含5％吐温20TM的220μl HOECHST33342TM染料(10μg/ml)进行透化处理和染色。
用LYSYSⅡTM软件采集并保存来自1×104个细胞的数据，用PAINT-A-GATETM软件(Becton Dickinson)(Darzynkiewica等，Cytometry 13:795-808(1992)和Picker等，J.Immunol.150(3):1105-1121(1993))进行分析。使用7AAD和Hoechst染色分别测定了的细胞周期各阶段以门控(gated)单细胞计的活性和细胞百分数。(利用Hoechst信号的宽度比面积的脉冲分析排除细胞双联体。)用血细胞计数仪测定细胞数量。
DNA分析。在96孔平底测试板上，接种8×103细胞/孔，一式三孔，粘附过夜，然后再在有或没有抗ErbB2或对照Ig存在下继续培养不同的时间。在培养的最后12小时内，各孔加入1μCi3H-胸腺嘧啶(Amersham,Arlingto,VA)。
与ErbB2胞外结构域结合的亲和性。按照Iodogen法(Fracker等，Biochem.Biophys.Res.Comm.80:849-857(1978))制备Hadioiodinated抗ErbB2抗体。用培养在96孔组织培养板(Flacon,Becton Dickenson Labware,Lincoln Park,N.J.)上的BT474细胞单层进行结合试验。细胞经胰蛋白酶消化，在96孔板上以104细胞/孔的密度接种，并粘附过。用含0.1％叠氮钠的冷培养液洗涤细胞单层两次，然后一式三份与100μl125I-抗-ErbB2抗体(以含0.1％叠氮钠冷培养基配)的连续稀释液冰上孵育4小时。各样品与过量100倍摩尔的非放射性抗体(100μl总体积)预先培养以估计非特异性结合。用含0.1％叠氮钠冷培养基洗涤两次去除非结合放射性。在每孔用150μl 0.1M NaOH溶解细胞后，在γ测量仪内检测与细胞结合的放射性。利用Scatchard法测定抗ErbB2的结合常数(Kd)。
结果。利用Scatchard法测定抗ErbB2抗体(7C2和4D5)的结合亲和性。结合常数(Kd)为6.5×10-9M(4D5)和2.9×10-9M(7C2)。利用非标记抗体，然后用FITC-7C2进行了封闭(blocking)试验。如图2所示，4D5和7C2与不同的表位反应。
研究了上述抗体对过量表达ErbB2的人乳房癌细胞BT474生长的作用。图3显示了与同种异型匹配对照一起孵育的细胞的流式细胞计数分析结果。10-12％细胞死亡，28％的活细胞处于细胞周期的S-G2-M期。当细胞与纯培养基一起培养时也获得了相近的结果。与对照相比，4D5处理导致(正向光散射测定)细胞变小，死细胞比例中度增加(27.0％)和S-G2-M期细胞显著减少(6.3％)伴随以G0/G1期细胞的增加(94％)。细胞数量减少了46.7％。除了从理论上讲之外，4D5似乎主要诱导细胞周期停滞(CCA)于G0/G1期，要么就是大量细胞死亡。图3C显示了BT474细胞与50μg/ml 7C2培养的结果。与对照细胞(未给出数据)相比，在残留活细胞的正向光散射上没有变化，死亡细胞比例大增(72％)，细胞数减少70％。所以，活细胞减少了85％。周期中细胞略有减少(21％，相比之下对照的平均值为29％)，但是，由于大量细胞死亡，难以区别是CCA还是周期细胞优选损失。因此，7C2与4D5以不同的方式作用于细胞；7C2主要诱导细胞死亡，而4D5则主要诱导CCA。图3D显示了向TB474细胞同时添加50μg/ml 7C2和1μg/ml4D5的结果。与单用7C2处理的细胞(图3C)相比，死亡细胞比例没有增加。但是，残留活细胞数量又减少了50％。此外，同时具有透过性细胞膜和严重降解DNA(＜1X)的细胞显著增加。对少量残留活细胞的分析显示，与单用4D5处理的细胞相比，周期中细胞也类似地减少(图3D与图3B相比)。
作为另一对照，MDA-MB-231乳房癌细胞(以正常水平表达ErbB2)(Lewis等，Cancer Immunol.Immunther.37:255-263(1993))接受4D5和7C2处理。与对照相比，两种抗体都不影响这些细胞的生长(S-G2-M期27-28％活细胞，12-13％死细胞)。
使用亚最适剂量的4D5(0.05μg/ml)时清楚地证明了两种抗体的叠加效果。图4A显示，经4D5或7C2处理的细胞，胸腺嘧啶的掺入分别减少了22.3％和23％，同时用4D5和7C2处理则减少58％。使用20μg 7C2和0.1μg4D5的另一实验也得出类似的结果，即，单用7C2或4D5处理，胸腺嘧啶的掺入分别减少41％和25％，而用7C2加4D5处理则减少72％。在图4B中显示了活细胞数量。测定了总细胞数，并进行了FACS分析来确定活细胞数量。与不处理的对照相比，用7C2、4D5或两者组合处理，活细胞分别减少了64％、29％和84％。
实施例2细胞程序死亡的诱导材料和细胞培养。所有的肿瘤细胞系均来自American Type CultureCollection(Rockvill,MD)。细胞培养在Dulbecco’s改进型Eagle培养基(D-MEM):Ham’s F-12(50∶50)中，其中加有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺。由Clonetics获得人乳腺上皮细胞(HMEC)，培养在含有牛垂体提取物的MEGM(乳腺上皮细胞生长培养基，Clonetics)中。使用的生化试剂是膜联蛋白V-FTIC(BioWhittaker,Inc.)，碘化丙锭(PI,Molecular Probes,Inc.)和HOECHST33342TM(Calbiochem)。按Fendly等Cancer Res.50:1550-1558(1990)和WO89/06692所述，生产抗ErbB2单克隆抗体(MAb)(参见实施例1)。被测的抗ErbB2MAb定名为4D5,7C2,7F3,3H4,2C4,2H11,3E8和7D3。同种异型匹配对照MAb 1766针对单纯性疱疹病毒(HSB-1)的糖蛋白D。
测定细胞程序死亡诱导作用的流式细胞计数实验。以每碟3×106细胞的密度将细胞接种到100×20mm培养皿上，贴附过。然后去除培养基，换以单纯新鲜培养基或含10μg各MAb的培养基。就大多数实验而言，细胞培养3天。为了时间进程的研究，细胞培养0.25、0.5、1、2、24、72和96小时，7或10天。用于剂量反应性实验的MAb浓度为0.01,0.1,1和10μg/ml。在每次处理之后，单独收集各份上清液并保存在冰上，用胰蛋白酶消化来脱落单层细胞，并汇集相应的上清液。然后，细胞4℃1200rpm离心5分钟，沉淀重悬在3ml冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)中，等分入35mm盖有滤网的12×75试管中(每管1ml,3管为一处理组)以去除细胞凝块。然后在各组的3管中加入膜联蛋白V-FTIC(1μg/ml)或PI(10μg/ml)或膜联蛋白V-FTIC加PI。用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTM软件(BectonDickinson)分析样品。为了进行细胞周期分析，细胞与9μg/ml HOECHST33342TM37℃培养2小时，然后用MODFIT LTTM软件(Verity Software House)在EPICSELITETM流式细胞计数仪(Coulter Corporation)上分析。
如下进行去除血清实验。BT474乳房癌细胞以每碟5×106的密度接种在100×20mm培养皿中的培养基上。第二天，换以含0.1％FBS的培养基，细胞培养3天。然后，在细胞内加入10μg/ml MAb 7C2或4D5(以含0.1％FBS的新鲜培养液配)。培养3天后，如前所述分析膜联蛋白V的结合、PI的吸收和细胞周期的进程。为了比较无血清细胞与有血清细胞的生长，同时对培养在含10％FBS的培养基中的另外平皿上的BT474细胞进行了平行研究。
检测DNA梯度的形成。为了测定核小体间DNA的片段化，如前所述，接种BT474乳房癌细胞并与10μg/ml MAb 4D5或7C2培养3天。提取DNA，以32P-末端标记，在含5μg/ml溴乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳。然后干燥凝胶，曝光Kodak胶片。经10μg/ml MAb 4D5或7C2处理3天的BT474乳房癌细胞观察到了DNA梯度的形成，这是细胞程序死亡的标志。
电子显微摄影研究。BT474细胞用10μg/ml MAb 7C2处理3天，然后固定在0.1M二甲基胂酸盐缓冲液(含1.25％甲醛/1％戊二醛)中。在二甲基胂酸盐缓冲液中的2％四氧化锇中进行后固定。然后，固定细胞用乙酸双氧铀末端封闭染色，在梯度浓度乙醇中脱水，包埋在Eponet中。用切片机切取切片，在Philips CM12TM电子显微镜下观察。用MAb 7C2处理后观察到致使细胞核和细胞质浓缩的细胞高度皱缩，这是细胞程序死亡的典型表现。最终，程序性死亡的细胞被下层的细胞吞噬。
图5至14显示了以上实验的结果。正如电子显微镜观察、膜联蛋白-V结合、细胞周期DNA成分的分析，DNA梯度的形成和延时显微摄影所证明，某些抗ErbB2 MAb在过度表达ErbB2的人肿瘤细胞系内诱导细胞程序死亡。识别ErbB2胞外结构域上相同表位的抗ErbB2 MAb 7C2和7F3表现出最强的前细胞程序死亡作用。识别另一不同ErbB2表位的抗ErbB2 MAb 4D5除了强烈减少增殖以外还诱导少量的细胞程序死亡。7C2或4D5诱导的细胞程序死亡似乎不依赖于细胞周期。经除去血清或4D5处理，再经7C2处理造成的生长抑制导致培养物中的细胞全部死亡。
实施例3卵巢细胞的程序死亡和组合处理方法。SKOV3卵巢癌细胞以每碟106个细胞的密度接种在20×100mm培养皿上，使粘附2至3天。然后去除培养基，换以单纯新鲜培养基或含相应抗HER2MAb的培养基。为了进行单个MAb处理的研究，细胞与10μg/ml MAb 7C2或4D5一起孵育3天。为了进行抗体组合处理，BT474细胞在最初的24小时内用0.25或0.5μg/ml MAb 7C2处理。此后，加入10μg/ml MAb 4D5，细胞再培养3天。每次处理后，都单独收集上清液并保存在冰上，以胰蛋白酶消化脱落细胞单层并与对应的上清液汇集。然后在4℃以1200rpm离心细胞5分钟，将沉淀重悬在冰冷的Ca2+结合缓冲液中(10mM Hepes,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)中，等分入35mm盖有滤网的12×75试管中。然后用膜联蛋白V-FTIC(1μg/ml)和碘化丙锭PI(10μg/ml)染色细胞，用FACSCONVERT CELLQVESTTM软件(BectonDickinson)在FACScanTM流式细胞计数仪上分析样品。
诱导卵巢细胞中细胞程序死亡。在SKOV3卵巢癌细胞系中，经MAb 7C2处理3天后的残留活细胞(膜联蛋白V阴性/PI阴性)百分数降低了48％(膜联蛋白V结合增加了3.8倍)(图1)。
组合处理。与各抗体单独处理相比，按次序加入MAb 7C2和4D5诱导的细胞程序死亡产生了加合效果(图16)。BT474细胞先用0.5μg/ml MAb 7C2处理，后用10μg/mlMAb 4D5处理，使得活细胞(膜联蛋白V阴性/PI阴性)减少至12％，相比之下，单独用MAb 4D5或MAb 7C2处理，活细胞分别为68％或29.1％。用亚最适剂量的MAb 7C2也观察到了加合效果(即用0.25μg/ml 7C2加10μg/ml4D5使活细胞减少至37.5％)，相比之下，单独用MAb 4D5或MAb 7C2处理，活细胞分别为68％或77％。同时加入MAb 7C2和4D5或者先加4D5再加7C2似乎不造成细胞死亡的加合效果。所以，除了理论所述之外，按照先MAb 7C2再MAb4D5的次序使用对于加强细胞程序死亡效果是十分重要的。
实施例4抗HER2抗体的体内效果建立一个过量表达HER2的人乳房癌异种移植模型，用来评价抗HER2 MAb相关HER2过量表达肿瘤的作用。此模型使用挑选的在裸鼠体内生长的TB474细胞系，即BT474M1。带肿瘤小鼠每周接受两次单克隆抗体4D5、7C2或7F3，或者4D5与7C2或7F3相组合处理。每周两次测量肿瘤的大小来评价肿瘤的生长。4D5单克隆抗体对来自BT474M1细胞系的过量表达HER2的异种移植肿瘤具有显著的生长抑制作用。以上结果与现已公开的结果近似。单克隆抗体7C2和7F3本身在所测剂量时具有中度生长抑制作用，并且显著加强4D5的生长抑制作用。这些抗体对动物都不表现出毒性作用。
动物模型。NCR.nu./nu.小鼠(雌性纯合体，4周龄)皮下植入0.72mg缓释17β雌二醇片来支持肿瘤的生长。在植入雌激素24小时后，动物经皮下接种含5×106BT474M1肿瘤细胞的MATRIGELTM溶液。每日监测动物的健康状况，并每周两次测量肿瘤。汇集后提供出有关肿瘤测量的报告。每周称量动物体重以评价研究期间的毒性作用。对105个动物进行了接种，并且全部在研究中接受了评价。
处理方案。将动物随机地分成7个处理组(15个一组)。处理开始于接种肿瘤6天之后。在处理之前测量了所有动物的肿瘤大小和各处理组的平均肿瘤大小，以确证各组间的一致性。处理组为(1)载体对照注射-每周两次腹膜内注射(IP)100μl(2)非相关性抗体(αgp120)(匹配的同种异型)-每周两次100μl IP,10mg/kg(3)MAb 7C2-每周两次IP注射100μl,10mg/kg(4)MAb 7F3-每周两次IP注射100μl,10mg/kg(5)MAb 4D5-每周两次IP注射100μl,10mg/kg(6)MAb 7C2(10mg/kg)+MAb 4D5(10mg/kg)-每周两次IP注射100μl(7)MAb 7F3(10mg/kg)+MAb 4D5(10mg/kg)-每周两次IP注射100μl所有处理组均每周处理两次，总共10次腹膜内注射处理。由于肿瘤很大，处理组1-4在此时被杀死。第5、6和7组的处理继续，达总共16次抗体处理。在研究的全过程中，每日监测动物的健康状况，每周两次测量肿瘤，每周测量体重。在得到后即提供了各个动物的数据和处理组的平均数据。
实验的终止。在结束处理后，处理组1-4动物由于肿瘤很大而被处死。肿瘤体积不得超过4g(4,000mm3)。所有动物都没有观察到明显的体重减轻，也从未发现较处理之初体重减轻15％以上的现象。实验结束后，处死所有的动物。
结果。将针对HER2生长因子受体的单克隆抗体4D5、7C2和7F3用于过量表达HER2受体的小鼠异种移植模型。抗体单独使用，或者将生长抑制抗体(4D5)与细胞程序死亡抗体(7C2和7F3)组合使用。在研究早期，细胞程序死亡性抗体(7C2和7F3)具有生长抑制作用，但在以后的时间点处此作用消失(图17)。生长抑制抗体，4D5，正如过去的研究所报道的，在研究的全过程中具有显著的生长抑制作用。将4D5与7C2或7F3组合，显著加强了生长抑制效果，以4D5/7C2为最佳组合。在4D5单独处理组和4D5/7C2处理组中各有一例完全恢复。抗体对照组(抗-gp120MAb)与盐溶液处理对照组相当。在接种肿瘤后的初期，体重增加，然后在研究的剩余过程中保持不变。所有抗体对动物都未表现出毒性作用。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Genentech.Inc.
Board of Regents,University of Texas System(ⅱ)发明名称抗ErbB2抗体(ⅲ)序列数目9(ⅳ)通信地址(A)收件人Genentech,Inc.
(B)街道l DNA Way(C)城市South San Francisco(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)邮编94080(ⅴ)计算机可读形式(A)记录介质类型3.5英寸，1.44Mb软盘(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WinPatin(Genentech)(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Lee.Wendy M.
(B)登记号40,378(C)参考/案卷号P1053R2PCT(ⅸ)通讯信息
(A)电话650/225-1994(B)电传650/952-9881(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度166氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu1 5 10 15Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val20 25 30Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser35 40 45Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu50 55 60Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg65 70 75Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala80 85 90Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr95 100 105Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu110 115 120Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
125 130 135Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys140 145 150Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg155 160 165Ala166(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro1 5 10 15Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln20 25 30Gly Cys32(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度59氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val1 5 10 15Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln20 25 30Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val35 40 45Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg50 55 59(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度97氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg20 25 30His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln ASn Gly Ser35 40 45Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala50 55 60His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly
65 70 75Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp80 85 90Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro95 97(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro1 5 10 11(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:His Gln Ser Leu Gly Thr Gln1 5 7(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys1 5 8(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys1 5 8(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln1 5 8
权利要求
1．一种分离的抗体，该抗体与ErbB2的结构域1结合。
2．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体与ErbB2上的7C2/7F3表位结合。
3．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体诱导过度表达ErbB2的细胞死亡。
4．根据权利要求3所述的抗体，其特征在于该抗体通过细胞程序死亡来诱导细胞死亡。
5．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体是单克隆抗体。
6．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体有非人互补决定区残基和人构架区残基。
7．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体是标记的。
8．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体被固定在固相中。
9．一种分离的抗体，该抗体与ErbB2结合，并诱导过度表达ErbB2的细胞发生细胞程序死亡。
10．根据权利要求9所述的抗体，其中细胞是BT474细胞。
11．根据权利要求9所述的抗体，其中细胞是SKBR3细胞。
12．根据权利要求9所述的抗体，其中细胞是Calu3细胞。
13．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体有抗体7C2的互补决定区。
14．根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体有抗体7F3的互补决定区。
15．一种组合物，它含有权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
16．根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该组合物还包含不与ErbB2结构域1结合的第二种抗ErbB2抗体。
17．根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该组合物还包含与ErbB2结合并50-100％地抑制细胞培养中SKBR3细胞生长的第二抗体。
18．根据权利要求17所述的组合物，其中第二抗体与ErbB2上的4D5表位结合。
19．根据权利要求18所述的组合物，其中第二抗体有抗体4D5的互补决定区。
20．根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该组合物是无菌的。
21．一种核酸，它编码权利要求1所述的抗体。
22．一种载体，它包含权利要求21所述的核酸。
23．一种宿主细胞，它包含权利要求21所述的核酸。
24．根据权利要求23所述的宿主细胞，其特征在于它是产生抗体7C2或7F3的杂交瘤细胞系。
25．一种生产抗ErbB2抗体的方法，该方法包括培养权利要求23所述的宿主细胞以表达抗ErbB2抗体，并从该宿主细胞培养中回收获得该抗ErbB2抗体。
26．一种测定ErbB2是否存在的方法，该方法包括使怀疑含有ErbB2的细胞与权利要求1所述的抗体接触，并测定所述抗体与细胞的结合。
27．一个试剂盒，它包含权利要求1所述的抗体以及用该抗体来检测ErbB2的说明书。
28．一种诱导细胞死亡的方法，该方法包括使过度表达ErbB2的细胞与有效量的权利要求1所述的抗体接触。
29．根据权利要求28所述的方法，其中细胞是癌细胞。
30．根据权利要求28所述的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
31．根据权利要求30所述的方法，其中哺乳动物是人。
32．根据权利要求28所述的方法，其特征在于该方法还包括使细胞与不结合ErbB2结构域1的第二种抗ErbB2抗体接触。
33．根据权利要求28所述的方法，其特征在于该方法还包括使细胞与结合ErbB2并50-100％地抑制细胞培养中SKBR3细胞生长的第二抗体接触。
34．根据权利要求33所述的方法，其中细胞在与第二抗体接触前先与结合ErbB2结构域1的抗体接触。
35．根据权利要求33所述的方法，其中第二抗体与ErbB2上的表位4D5结合。
36．根据权利要求35所述的方法，其中第二抗体有抗体4D5的互补决定区。
37．根据权利要求28所述的方法，其特征在于该方法还包括使细胞与生长抑制剂接触。
38．根据权利要求28所述的方法，其特征在于该方法还包括使细胞与化疗剂接触。
39．根据权利要求28所述的方法，其特征在于该方法还包括使细胞暴露在辐射下。
40．一种诱导细胞死亡的方法，该方法包括使过度表达ErbB2的细胞与有效量的权利要求9所述的抗体接触。
41．一种产品，它包括一个容器；容器上的标签；以及容器中的一种含有活性剂的组合物；其中组合物有效地诱导细胞死亡，容器上的标签说明该组合物可用来治疗以ErbB2过度表达为特征的病征，且该组合物中的活性剂是权利要求1所述的抗体。
全文摘要
本发明描述了一种与ErbB2结构域1中的表位结合并通过细胞程序死亡作用诱导细胞死亡的抗ErbB2抗体。另外还描述了这些抗体的各种应用。
文档编号A61K31/407GK1234072SQ97198947
公开日1999年11月3日 申请日期1997年10月9日 优先权日1996年10月18日
发明者B·M·芬德利, G·D·菲利普斯, R·H·朔伊尔曼, J·W·于里 申请人:基因技术股份有限公司, 德克萨斯州大学系统董事会