透明质酸酶在制备用于治疗眼科疾病中液化玻璃体液的眼用制剂中的应用的制作方法

专利名称：透明质酸酶在制备用于治疗眼科疾病中液化玻璃体液的眼用制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及用于对人或其它哺乳动物的眼睛给药治疗的酶制剂，更具体地说，涉及用一种或多种酶治疗影响哺乳动物眼睛的视网膜和/或玻璃体液的眼科疾病的方法。
背景技术：
人眼睛的解剖学结构在人体中，眼睛的解剖学结构包括“玻璃体”，玻璃体位于晶状体的后面，并占眼球腔约五分之四的体积。玻璃体由被称为玻璃体液的胶状物质构成。一般情况下，正常人眼睛的玻璃体液含有约99％的水和1％的大分子物质，大分子包括胶原、透明质酸、可溶性糖蛋白、糖以及其它低分子量代谢物。
视网膜基本上是在眼球内部后表面上形成的神经组织层。视网膜环绕有称为脉络膜层的细胞层。视网膜可分成参与视觉机制的视觉部分和不参与视觉机制的非视觉部分。视网膜的视觉部分含有视网膜杆和视网膜锥体，它们都是有效的视觉器官。有大量动脉和静脉进入视网膜中央，并向外展开以给视网膜提供血液循环。
玻璃体的后部与视网膜直接接触。纤维状丝网从视网膜延伸出，并穿入或插入玻璃体以将玻璃体和视网膜连接在一起。
玻璃体出血的原因、治疗和临床后遗症糖尿病性视网膜病、创伤和其它眼科疾病有时会导致视网膜血管破裂或渗漏，结果使血液流到眼睛的玻璃体液中(即玻璃体出血)。这种玻璃体出血一般表现为玻璃体液的去雾状或浑浊。
玻璃体出血时常，但不总是伴有视网膜的破裂或脱离。当玻璃体出血伴有视网膜破裂或脱离时，迅速诊断和外科修复视网膜的破裂或脱离非常重要。不能迅速诊断和外科修复视网膜的破裂或脱离会使视网膜破裂或脱离区域的光感受器细胞发生坏死。视网膜光感受器细胞的坏死会导致失明。此外，视网膜脱离长时间未修复会导致进一步的玻璃体出血和/或在出血位点形成纤维组织。纤维组织的形成会导致在玻璃体和视网膜之间形成不利的永久性纤维附着。
用于修复视网膜破裂和脱离的外科手术一般需要外科医师能够透过玻璃体液观察视网膜的损伤区域(即“透过玻璃体观察视网膜”)。当玻璃体出血已经发生时，玻璃体内存在的出血后的积血会使玻璃体变得非常浑浊以致于外科医师不能透过玻璃体现察视网膜。玻璃体的这种出血性可需要6-12个月或更长时间来变得足够清澈以能透过玻璃体观察视网膜。然而，鉴于视网膜破裂或脱离的诊断或治疗被延迟有可能导致并发症，通常不希望等待玻璃体内的出血后积血自然清除。
此外，即使玻璃体出血不伴有视网膜破裂或脱离时，通常也难以验证没有发生视网膜破裂或脱离，因为浑浊的玻璃体妨碍了医师对视网膜进行常规眼底镜检查。而且，玻璃体内存在的出血后积血可能会严重削弱病人受损伤眼睛的视觉或使视觉完全模糊，并且这种不利作用会持续到出血后的积血基本上或完全清除为止。
因此，玻璃体内存在的出血后积血会导致许多临床问题，包括a)不能通过视觉观察进行检测和诊断出血和/或视网膜任何所伴随的破裂或脱离的位点和病因，b)全部或部分削弱受损伤眼睛的视觉，和c)削弱或阻碍通常用于修复出血位点和/或修复任何所伴随的视网膜破裂或脱离的透过玻璃体的外科手术治疗的进行。
当玻璃体出血已导致玻璃体变模糊或浑浊时，医师可能要选择进行称为玻璃体切除术(vitrectomy)的操作，其中是将所有(或部分)玻璃体从眼睛内部取出，并代之以澄清液体。进行玻璃体切除术是为了使医师能进行必需的视网膜检查和/或出血及任何所伴随的视网膜破裂或脱离的外科修复。这种玻璃体切除术是技术性非常强的操作，并伴有数种严重缺陷、危险和并发症。在这些缺陷、危险和并发症中，潜在的是，除去玻璃体会导致视网膜进一步脱离或破裂和/或除去玻璃体会引起已变弱的视网膜血管进一步出血。
现有技术中透明质酸酶和其它酶的眼科应用为了将玻璃体切除术操作期间导致视网膜进一步脱离或破裂的可能性减到最少，美国专利5292509(Hageman)已提出，在取出玻璃体之前，将一些不含蛋白酶的葡萄糖胺聚糖酶注射到玻璃体中，以使玻璃体与视网膜分离或脱离。玻璃体的这种脱离或分离是为了将切除玻璃体时视网膜发生进一步破裂或脱离的可能性减至最小。可用于将玻璃体与视网膜分离的葡萄糖胺聚糖酶的具体实例包括软骨素酶ABC，软骨素酶AC，软骨素酶B，软骨素4-硫酸酯酶，软骨素6-硫酸酯酶，透明质酸酶和β-葡糖苷酸酶。
虽然已知透明质酸酶具有多种眼科应用，包括在美国专利5292509(Hageman)中描述的玻璃体切除术辅助应用，但是以前出版的论文指出，当以超过1 IU的剂量，即以15、30、50和150 IU的剂量给药到玻璃体内时，透明质酸酶对视网膜和/或眼睛的其它解剖学结构具有毒性。参见，玻璃体内给予透明质酸酶的安全性；Gottlieb，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.和Soloupis，R.，《眼视觉科学研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)3111，2345-52(1990)。
其它研究人员证实了一些透明质酸酶制剂的眼毒性，他们提出，这些透明质酸酶制剂用作毒性刺激剂，以在动物毒性模型中诱导实验-诱导的眼睛新血管形成。参见，视网膜前新血管形成的兔实验模型，Antoszyk，A.N.，Gottlieb，J.L.，Casey，R.C.，Hatchell，D.L.和Machemer，R.，《眼视觉科学研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)321，46-51(1991)。
不幸的是，以前还不知道所报道的透明质酸酶的治疗活性和毒性是否广泛适用于所有透明质酸酶制剂，或不知道透明质酸酶的疗效和/或毒性是否仅适用于含有一定赋形剂的透明质酸酶制剂或得自特定来源的透明质酸酶。这种考虑非常重要，因为随透明质酸酶的来源和溶剂和/或其它与透明质酸酶混合的制剂组分的不同，现有技术中所用的各种透明质酸酶制剂的纯度和特征(例如分子量分布)也有可能不同。
现有技术中用于眼睛给药的透明质酸酶制剂的纯度和特征术语“透明质酸酶”通常指能解聚一些粘多糖如透明质酸的内-β-葡糖苷酸酶。Myer，K.等人《酶》(The Enzymes)；第4卷，第2版，第447页，Academic Press，Inc.，New York(1960)。
透明质酸酶使透明质酸和软骨素硫酸A和C的内-N-乙酰基己糖胺键水解，主要生成四糖残基。
有重要证据表明，不同来源的透明质酸酶在酶的分子量分布和具体的酶活性方面不同。鉴于可从不同来源，包括牛睾丸、羊睾丸、一些细菌如链霉菌属细菌、和一些无脊椎动物如水蛭中分离透明质酸酶，分子量分布和酶活性的这种差异颇值得注意。
据报道，已将Wydase透明质酸酶制剂对哺乳动物的眼睛给药，来进行各种临床和试验应用，包括用于治疗青光眼以及在将玻璃体从眼睛中取出的玻璃体切除术进行期间用于促进玻璃体液化。
虽然据报道已有一些透明质酸酶制剂在注射入或局部施予眼睛时显示出理想的疗效，但是考虑到这类制剂通过眼内注射的常规临床给药的安全性，应注意透明质酸酶和/或硫柳汞防腐剂的潜在毒性。
因此，本领域需要配制和开发出新的透明质酸酶制剂，其能以足以产生最佳疗效的剂量水平对眼睛给药，而不引起眼毒性。
此外，鉴于存在上述与出血后积血从玻璃体内自然清除很缓慢有关的问题，本领域需要阐明并开发出新的方法和操作，以促进出血后积血从眼睛玻璃体内的清除，从而可透过玻璃体进行眼底(包括视网膜)观察，而不需要取出玻璃体(即全部或部分玻璃体切除术)。
另外，也需要预防和治疗由视网膜血管化的损伤或病变导致或造成血视网膜屏障损伤的哺乳动物眼睛的各种疾病。
发明简述本发明提供了治疗哺乳动物眼科疾病的酶方法。通过将一定量的能有效地液化被治疗眼睛的玻璃体液而不对眼睛造成毒性损害的透明质酸酶对眼睛给药，能防止视网膜的新血管形成以及增加对视网膜有毒性的物质从玻璃体中清除的速度。玻璃体液的液化能增加液体从玻璃体腔中交换的速度。液体交换速度的增加有助于消除其存在会导致眼睛和视网膜损伤的物质和状况。
本发明提供了诱导玻璃体液液化以预防哺乳动物眼科疾病的方法，其中包括将一定量的能有效液化玻璃体液的透明质酸酶与哺乳动物眼睛玻璃体液接触的步骤，由此来预防眼科疾病而并不对哺乳动物眼睛造成毒性损伤。
此方法优选是为了治疗下述病症而实施增生性糖尿病性视网膜病变，老年性黄斑部退行变性，弱视，色素性视网膜炎，黄斑裂孔，或黄斑渗出(macular exudate)。透明质酸酶可以是液体溶液，酶与玻璃体液接触的步骤包括，将所述液体溶液注射到玻璃体液中。透明质酸酶与玻璃体液在没有硫柳汞存在下进行接触。
在一个实施方案中，透明质酸酶以5-200个国际单位的剂量与玻璃体液接触。在另一实施方案中，透明质酸酶以1个国际单位的剂量与玻璃体液接触。透明质酸酶能以多次剂量的形式给药，单次眼内注射的注射体积可小于100∶1。
在另一实施方案中，分子量大于约100000(通过10％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有透明质酸分解活性。分子量大约为60000-100000(通过10％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有明胶分解活性。此外，分子量大于约45000(通过10％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有酪蛋白分解活性。而且，分子量大于约100000(通过4-20％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有透明质酸酶活性。此外，分子量大约为50000-60000(通过4-20％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有透明质酸酶活性。此外，分子量大约20000以下(通过4-20％SDS PAGE电泳测定的)的透明质酸酶没有透明质酸酶活性。
在另一实施方案中，透明质酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制剂中含有高达8000 IU的透明质酸酶、5.0-130.0mg乳糖、以及0.01-100.0mmol磷酸盐。在另一实施方案中，透明质酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制剂中含有6500 IU的透明质酸酶、5.0mg乳糖、以及0.02mmol磷酸盐。在另一实施方案中，透明质酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制剂中含有500-1000 IU的透明质酸酶、5.0-10.0mg乳糖、以及0.01-10.0mmol磷酸盐。
在本发明另一实施方案中，提供了治疗哺乳动物眼科疾病的方法，包括将一定量的能有效治疗所述眼科疾病而不对所述哺乳动物眼睛造成毒害的透明质酸酶与所述哺乳动物眼睛的玻璃体液进行接触的步骤。其中治疗后，玻璃体液中没有出血后积血，可以对所述哺乳动物眼睛的视网膜进行观察。此外，该接触步骤在没有进行玻璃体切除术的情况下进行。
附图的简要说明附

图1表示具有泳道1-6的凝胶电泳，所述泳道表示1)31000-200000的分子量标准，2)羊透明质酸酶ACS，3)VI-S型牛透明质酸酶，4)V型羊透明质酸酶，5)IV-S型牛透明质酸酶，和6)I-S型牛透明质酸酶。
附图2是总结下述内容的表格，与VI-S、IV-S和I-S型牛透明质酸酶以及V型羊透明质酸酶相比，由酶谱法测定的本发明透明质酸酶ACS的透明质酸、明胶分解和酪蛋白分解活性。
附图3是总结下述内容的表格，依据下面的实施例1，给兔子单次量玻璃体内注射BSS、BSS+硫柳汞、透明质酸酶ACS以及透明质酸酶Wydase的毒性作用。
附图4是总结下述内容的表格，依据下面的实施例2，单次量的玻璃体内透明质酸酶ACS在兔子中的效力。
附图5是总结下述内容的表格，依据下面的实施例2，多次量的玻璃体内透明质酸酶ACS在兔子中的安全性和效力。
附图6是总结下述内容的表格，依据下面的实施例9，单次量的透明质酸酶ACS在患有糖尿病性视网膜病变的病人中清除出血的效力。
发明详述提供下面的详细描述和实施例仅是为了描述和解释本发明的一些优选实施方案，而不以任何方式对本发明的范围进行限定。
促进出血后的积血从眼睛玻璃体中清除的酶方法依据本发明，申请人已确定，当一定类型的酶在玻璃体发生出血后与玻璃体液接触，能增加出血后积血从玻璃体液中清除的速度。
在这方面，本申请人已发明了用于促进出血后积血从眼睛玻璃体清除的方法，所述方法通常包括将透明质酸酶以足以能促进出血后积血从玻璃体中清除，同时又不损害视网膜或眼睛其它组织的剂量与玻璃体液接触的步骤。优先选择具有下述分子量分布的透明质酸酶，即分子量分布能容许透明质酸酶在没有硫柳汞存在下以1 IU以上、优选15 IU以上、更优选75 IU以上的剂量玻璃体内给药，而同时对视网膜或眼睛其它组织不引起毒性损害。本发明的出血清除方法可以在不进行任何玻璃体切除术或其它手术操作或除去玻璃体液的情况下进行，因此就防止了进行这种玻璃体切除术所带来的潜在危险和并发症。
出血清除酶优选的给药途径是直接对玻璃体眼内注射。或者，本发明的出血清除酶可以任何能使酶在玻璃体内有足够分布以产生所期望出血清除效果的合适给药途径(例如局部给药)给药。
优选的注射液可含有具有下述分子量分布的透明质酸酶和使注射液基本等渗以及具有适于对眼睛给药的pH的非活性成分，即分子量分布能容许透明质酸酶以1 IU以上、优选15 IU以上、更优选75 IU以上的剂量玻璃体内给药，同时对眼睛不引起毒性损害。优选的透明质酸酶制剂优选不含有硫柳汞。注射液可先冷冻干燥成干燥状态，然后使用前再重新溶解。
优选的眼用透明质酸酶制剂对于本发明可注射且不含硫柳汞的透明质酸酶制剂，其一般制剂如下述表1所示表1一般制剂

首先将这些制剂组分溶于无菌水中，无菌过滤，随后冷冻干燥成干燥组合物。包装冷冻干燥的组合物，使用前，将其重新溶解在合适的溶剂如无菌等渗盐水或平衡盐溶液中。所述平衡盐溶液一般含有0.64％的氯化钠，0.075％的氯化钾，0.048％的去水氯化钙，0.03％的氯化镁六水合物，0.39％的乙酸钠三水合物，0.17％的柠檬酸钠二水合物，氢化钠/透明质酸以调节PH，以及使溶液达到用于注射的最终体积所需的水(适量)。
本说明书所用术语“透明质酸酶ACS”指用于玻璃体内注射、不含有硫柳汞、并且不含有分子量在100000以上、50000-60000之间以及20000以下的透明质酸酶的一种优选的透明质酸酶溶液。其中一种这类透明质酸酶可购自Calbiochem Biochemical，P.0.Box 12087，La Jolla，CA 92039-2087(由Biozyme生产，San Diego，CA)。本申请人已经确定，透明质酸酶ACS这种特别的分子量分布使其比其它透明质酸酶制剂的眼毒性要低，同时在大量眼科应用中显示出理想疗效。
附图1显示了凝胶电泳(4-20％梯度SDS-PAGE)，此凝胶电泳表明了与从SIGMA化学公司，P.O.Box 14508，St.Louis，Missouri63178获得的VI-S、IV-S和I-S型牛透明质酸酶以及V型羊透明质酸酶的分子量分布相比，优选的透明质酸酶ACS的分子量分布。附图1所示凝胶电泳的每一条泳道(泳道2-6)负载有标准量(即透明质酸酶活性的当量单位)的每一种酶。附图1所示凝胶电泳的泳道1含有分别在200000、116000、97400、66000、45000和31000处的分子量标记。附图1所示凝胶电泳的泳道2-6含有下述各个测试透明质酸酶制剂泳道 泳道中的样本2 透明质酸酶ACS3 VI-S型牛透明质酸酶4 V型羊透明质酸酶5 IV-S型牛透明质酸酶6 I-S型牛透明质酸酶泳道2表示包括分子量为97400、50000(大约)和45000(大约)的透明质酸酶的透明质酸酶ACS的分子量分布，但清楚地显示了不含有分子量为100000以上、50000-60000之间以及20000以下的透明质酸酶。
附图1所示凝胶电泳的泳道3、4、5和6表明，VI-S、IV-S和I-S型牛睾丸透明质酸酶以及V型羊睾丸透明质酸酶都不同于本发明透明质酸酶ACS，这是因为它们含有分子量在50000-60000之间以及20000以下的透明质酸酶。此外，4种测试的睾丸透明质酸酶中有3种(即VI-S、IV-S和I-S型)含有分子量在100000以上的透明质酸酶。
此外，也用酶谱法比较了标准量(即透明质酸酶活性的当量单位)的上述透明质酸酶ACS和VI-S、V、IV-S和I-S型透明质酸酶对透明质酸、明胶和酪蛋白的分解活性。对于附图2，每一酶谱所用的具体方法如下明胶分解活性的酶谱明胶1mg/ml明胶；10％的聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝50mM Tris盐酸，5mM CaCl2，0.05％Triton X-100 pH 7.5；染色，用考马斯蓝；脱色，用10％的乙酸/50％的甲醇。
酪蛋白分解活性的酶谱酪蛋白4mg/ml；15％的聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝50mM Tris盐酸，5mM CaCl2，0.05％Triton X-100 pH 7.5；染色，用考马斯蓝；脱色，用10％乙酸/50％的甲醇。
透明质酸分解活性的酶谱透明质酸2mg/ml；10％的聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4；染色，用3％乙酸中的0.5％的爱尔新蓝；脱色，用10％的乙酸/50％的甲醇。
附图2的表中总结了这些透明质酸、明胶和酪蛋白酶谱的结果。很明显，当通过10％SDS PAGE电泳测定时，本发明优选的透明质酸酶ACS不含有分子量在约100000以上的能分解透明质酸的透明质酸酶，而每一种测试的睾丸透明质酸酶(即VI-S、V、IV-S和I-S型)都含有分子量在100000以上的能分解透明质酸的透明质酸酶。
相类似地，当通过10％SDS PAGE电泳测定时，本发明透明质酸酶ACS不含有分子量在约60000-100000之间的能分解明胶的透明质酸酶，而每一种测试的睾丸透明质酸酶都含有分子量在约60000-100000之间的能分解明胶的透明质酸酶。
此外，当通过10％SDS PAGE电泳测定时，本发明优选的透明质酸酶ACS不含有分子量在约45000以上的能分解酪蛋白的透明质酸酶，而每一种测试的睾丸透明质酸酶(即VI-S、V、IV-S和I-S型)都含有分子量在约45000以上的能分解酪蛋白的透明质酸酶。
由于本发明优选的透明质酸酶ACS的特异分子量分布和特异的酶活性，和/或在其制剂中不含有硫柳汞，使得本发明提供了这样的透明质酸酶制剂，当其以其它透明质酸酶制剂会引起毒性作用的剂量水平对眼睛给药时，对眼睛没有毒性。
当用于下述实施例中时，按照下述以及表1所示方法和一般公式将优选的透明质酸酶ACS制成不含硫柳汞的制剂。更具体地说，用在下述实施例中的透明质酸酶ACS是按照下表2所示的具体制剂制得的
表2具体制剂A

或者，另一可用于以单位剂量给药的具体制剂如下表3所示表3具体制剂B

在另一具体制剂中，透明质酸酶ACS以冷冻干燥形式提供，其组分如下表4所示表4具体制剂C

上表所列的稀释量和注射体积是对于75 IU剂量而言的。可以改变稀释量以适应剂量变化。
在另一具体制剂中，透明质酸酶ACS是以液体形式提供的，其组分如下表5所示
表5具体制剂C

所有组分可按比例减少，以获得具有相同注射体积的较低剂量。而且，乳糖的量可减少二分之一或四分之一。
表6具体制剂D

如下面的实施例所述，表2(上面)中透明质酸酶ACS的具体制剂A可按照能带来疗效但不对眼睛或相关解剖学结构引起毒性的剂量直接注射到眼睛后房中，其中所述疗效包括但无需限于本发明的清除玻璃体出血的作用。或者，透明质酸酶ACS的具体制剂B或C也可以这样注射。还提供了表6中透明质酸酶ACS的具体制剂D在本发明方法中的应用。硫柳汞、透明质酸酶ACS和透明质酸酶(Wvdase)对兔子的眼毒性实施例1将体重为1.5-2.5kg的52只健康的新酰杂交种New ZealandCross Variety兔子(26只雄兔，26只雌兔)分别标以识别记号，并分别关在悬挂的笼子中。给兔子提供每日基础量的市售兔饲料团和任意量的自来水。
将兔子分成13组，每组4只(2只雄性，2只雌性)。每一组中选择2只兔子(1只雄性，1只雌性)进行眼底照相和荧光素血管造影预处理。
眼底照相是这样进行的将兔子固定，用装有Kodak Gold 200 ASA胶卷的KOWARC-3眼底照相机给视神经，视网膜弓照相。
荧光素血管造影包括，经耳缘静脉注射1.5ml 2％的无菌荧光素溶液。注射约30秒后，荧光素在视神经、视网膜血管和眼底显影。
第二天，静脉注射34mg/kg的盐酸氯胺酮和5mg/kg赛拉嗪将每只兔子麻醉。用开睑器卷眼睑，用碘伏(iodine-providone)洗液将眼睛消毒。
通过用装有0.5英寸长的30号针头的1cc结核菌素注射器将平衡盐溶液(BSS)、BBS+硫柳汞、透明质酸酶(Wydase)或透明质酸酶ACS注射给药，来进行所述制剂的试验处理。本实施例所用透明质酸酶ACS溶液不含硫柳汞，而是由上面表2所示的透明质酸酶ACS具体制剂构成。
对每一动物试验组进行的试验处理如下组#治疗1BSS2BSS+0.0075mg硫柳汞3BSS+0.025mg硫柳汞4透明质酸酶(Wydase)1 IU5透明质酸酶(Wydase)15 IU6透明质酸酶(Wydase)30 IU7透明质酸酶(Wydase)50 IU8透明质酸酶(Wydase)150 IU9透明质酸酶ACS 1 IU10 透明质酸酶ACS 15 IU11 透明质酸酶ACS 30 IU12 透明质酸酶ACS 50 IU13 透明质酸酶ACS 150 IU注射后第一天，用与给药前检查相同的方法观察这26只进行眼底照相和荧光素血管造影的兔子。
注射后第二天，将13只已经在给药前和第一天进行过眼底照相和荧光素血管造影雄兔和13只未被选来进行照相和造影术的雌兔，用以戊巴比妥钠为主药的药物进行安乐死。然后手术取出眼球，置于pH为7.37、含有0.1M磷酸盐缓冲盐水的2.5％戊二醛固定液中。
或者，将一只随机选择的兔子注射戊巴比妥使其安乐死，然后将戊二醛溶液注左心室(心内注射)进行固定，以测定固定操作对摘出的眼睛内的组织学结果的作用。
在第7天，将13只已经进行过照相和造影术的雌兔按照前述方法进行观察。
给药7天后，按照上述方法将剩余的26只兔子安乐死。按照与第二天固定眼睛相同的方式将眼睛固定。也将一只随机选择的兔子进行与前面随机选择的兔子所进行的相同的心内戊二醛固定操作。
对在本实施例中处理的眼睛进行肉眼和显微镜下观测以发现与处理有关的毒性作用证据。附图3给出了总结每一处理组的毒性或非毒性作用的组织学证据的表格。
简言之，用BSS处理的对照组眼睛在给药后第2天和第7天未出现毒性。
用BSS+硫柳汞(0.0075mg)处理的第2组兔子的眼睛在给药后第2天没有毒性，但是在第7天表现出血-视网膜屏障破裂的证据。
用BSS+硫柳汞(0.025mg)处理的第3组兔子的眼睛在给药后第2天和第7天都表现出严重的与治疗有关的毒性作用。
用1 IU剂量Wydase处理的第4组兔子的眼睛在给药后第2天和第7天没有毒性，但是，用15 IU-150 IU剂量Wydase处理的第5-8组兔子的眼睛在给药后第2天和第7天一般都表现出剂量-相关的毒性作用。
用透明质酸酶ACS以1 IU-150 IU剂量处理的第9-13组兔子的眼睛在给药后第2天和第7天一般都没有表现出毒性作用。然而，在用150 IU剂量处理的动物中观察到了有些荧光素漏出。
因此，推论出硫柳汞和含有硫柳汞的Wydase制剂在测试剂量下确实在兔子的眼睛中产生了毒性作用，然而，透明质酸酶ACS在测试剂量下在这些兔子中不产生毒性作用。
附图3总结了在第7天检测到的结果。如附图3所示，于第7天，在用BSS+硫柳汞(0.0075mg)、以及1 IU-150 IU之间所有剂量下的透明质酸酶(Wydase)处理的兔子的眼睛中，观察到了严重的毒性作用。与之相反，在用1-150 IU剂量的透明质酸酶ACS处理的兔子眼睛中，没有观察到任何毒性作用。
玻璃体内注射的透明质酸酶ACS在兔子眼睛中的安全性和效力实施例2在本实施例中，将12只健康的新酰杂交种兔子分别标以识别记号，并分别关在悬挂的笼子中。给兔子提供每日基础量的市售兔饲料团和任意量的自来水。
将兔子随机分成4个处理组，每组3只兔子。
首先，用1-2滴10％的托吡卡胺将每一只兔子的眼睛扩瞳，然后肉眼检查，用20屈光度的透镜进行间接的检眼镜检查，对眼睛的前房进行裂隙灯检查。
对兔子的眼睛进行初始检查后，将100∶1或10∶1的血液注射到每只兔子的每只眼睛的玻璃体内。
在第2天，依据下述处理方案，将BSS或透明质酸酶ACS注射到每一处理组兔子右眼的玻璃体内，其中每只兔子接受一次注射组#处理左眼右眼A未处理BSS(30∶1)×1B未处理25 IU透明质酸酶ACS 30∶1×1C未处理50 IU透明质酸酶ACS 30∶1×1D未处理75 IU透明质酸酶ACS 30∶1×1本项试验中所用的透明质酸酶ACS制剂是上述实施例2所示制剂。
在第3、5、7、14和21天，用裂隙灯再次检查每只兔子的眼睛，以评价角膜前房、前房和虹膜。另外，用10％的托吡卡胺溶液将每一只兔子的眼睛扩瞳，用20屈光度的透镜通过间接检眼镜检查视网膜。
附图4总结了所观察的透明质酸酶ACS的出血清除效力。一般情况下，由于已注射了一定量的血液，所以每一处理组中每只兔子的左眼(未处理)含有浑浊的玻璃体和一些血块。组A中用BSS处理(对照)的兔子的右眼也含有浑浊的玻璃体和一些血块，然而处理组B-D中所有用透明质酸酶处理的兔子的右眼都含有澄清的玻璃体，并且能进行透过玻璃体的视网膜观察。此外，处理组B-D中所有兔子右眼的视网膜看上去都很正常并没有与处理有关的毒性。
试验结果表明，以25、50、和75 IU单次剂量玻璃体内给药后，透明质酸酶ACS能有效地增加血液从被处理兔子的眼睛中清除的速度，并且在此项试验中，以所述单次剂量给药时，透明质酸酶ACS在被处理兔子的眼睛中不产生明显的毒性作用。
在一试验变例中，除了透明质酸酶以2周的间隔4次连续剂量给药来代替单次剂量给药外，用与上述试验相同的方式进行本实施例。每次给药后所进行的检查是一致的，检查结果总结在附图5中。总的来说，由于已注射了一定量的血液，所以每一处理组中每只兔子的左眼(未处理)含有浑浊的玻璃体和一些血块。组A中用BSS处理(对照)的兔子的右眼也含有浑浊的玻璃体和一些血块，然而处理组B-D中所有兔子(即用透明质酸酶ACS处理的兔子)的右眼均含有澄清的玻璃体，并且能进行透过玻璃体的视网膜观察。此外，甚至透明质酸酶多次给药后，处理组B-D中所有兔子右眼的视网膜看上去都很正常并且没有与处理有关的毒性。
试验结果表明，以25、50、和75 IU×4的剂量玻璃体内给药后，透明质酸酶ACS能有效地增加血液从兔子眼睛中清除的速度，并且甚至在2周的时间间隔内以4次连续剂量给药后，透明质酸酶ACS在被处理兔子的眼睛中不产生明显的毒性作用。
玻璃体内注射的透明质酸酶ACS在人眼睛中的安全性和效力实施例3本项研究的主要目标是，确定含有高纯度的从牛睾丸组织中提取的透明质酸酶的平衡盐溶液能否注射到视觉损伤的眼睛的玻璃体内而又不引起任何严重的眼睛副作用。试验材料和方法使用平衡盐溶液(BSS)作为无效对照剂，平衡盐溶液得自Allergan Pharmaceutical(Irvine，CA)。BSS含有0.64％氯化钠、0.075％氯化钾、0.048％氯化钙二水合物、0.03％氯化镁六水合物、0.39％乙酸钠三水合物、足以将pH调至7.1-7.2的氢氧化钠/盐酸、以及注射用水(适量100％)。将30微升等份试样的BSS或透明质酸酶具体制剂D(表6)装在安装有长0.5英寸的29号注射针的300μl微量注射器中。然后用装有注射样本的微量注射器把样本注射到病人眼睛的玻璃体内。
最初，随机指定至少有一只眼睛视觉受损的8个受试者接受50μ1含50 IU透明质酸酶ACS的BSS或单独的BSS(3∶1的比例)的玻璃体内注射给药。跟踪观察一个月以确信能很好耐受后，第二组6个视觉受损的受试者参与本项试验，并以2∶1的比例随机指定加入更高剂量的透明质酸酶ACS组(100 IU)或BSS对照组。
用于评价测试制剂安全性的操作在本项试验过程中的不同时间间隔完成，并且包括间接检眼镜检查，眼底照相，荧光素血管造影，视网膜电流描记，外部眼检查，裂隙灯活组织显微镜检查，扁平张力测量，厚度测量，和自身屈光检查。
本项试验包括了同时进行的安慰剂对照组，这样可将只与透明质酸酶ACS有关的副作用和载体(BSS)/注射操作所带来的副作用区别开。此外，仅对视觉受损的眼睛进行治疗，这是因为测试制剂被注射到邻近视网膜的部位，并且任何严重的不利反应对视力都可能有危险。用计算机生成的随机方案指定病人进行治疗，对于试验的第一阶段，从601开始编号，对于第二阶段，从701开始编号。病人和研究人员都不知道正在进行玻璃体内注射的样本是BSS载体还是透明质酸酶ACS/BSS溶液。
建立每一病人的基准后，给受试者注射酶或对照安慰剂。让病人坐在舒适的椅子上。将1滴或2滴局部麻醉剂局部滴注到欲治疗的眼睛中，然后让病人向下看，并将蘸有盐酸丙美卡因眼用溶液的无菌棉签擦在角膜上面约4-5mm处的巩膜区域(上位/1200子午线)敷10秒种。然后将测试制剂用装有29号注射针的200μl微量注射器注射到玻璃体中，其中注射针头的全部长度插入施用第二种麻醉剂的部位。结果虽然仅有很少几次达到统计学有效性，但是裂隙灯活组织显微镜检查表明，相对于仅用BSS治疗的病人，用透明质酸酶ACS/BSS制剂治疗的病人表现出前段病理变化(最突出特征是在前房中存在细胞和闪光)的比例要高。然而，第6次观测(治疗后一个月)后发现，对于任一用裂隙灯评价的变量，没有观测到任何组间差异。
在一个用BSS治疗的病人和两个用50 IU透明质酸酶ACS/BSS治疗的病人中，通过视网膜电流描记法/视觉激发性电位测定的视网膜/皮层反应随时间变得恶化。然而，视网膜电流描记模型的交替总是双向的，并且在高剂量(100 IU)透明质酸酶ACS/BSS组病人的治疗或未治疗眼睛中都没有发生这种交替现象，而且，在任一无论是治疗还是未治疗的眼睛中，荧光素血管造影测试结果也没有表明存在视网膜局部缺血。
间接眼检镜检查显示，在受试者的眼睛中有液化和玻璃体后部脱离(PVD)现象。这些玻璃体的特征是，注射测试制剂之后很快表现出高度运动性和/或液化作用，对于含有透明质酸酶ACS的制剂而言，这是所希望的结果。一些注射BSS的测试眼睛也出现了液化和PVD现象，这可能是在治疗前就已存在了，因为BSS不具有任何酶活性，并且注射的体积很小(30μl)。
关于PVD，在第一组病人中，通过裂隙灯活组织显微镜检查，发现接受透明质酸酶ACS治疗的6个病人中有4个病人表现出PVD缺乏(即601，602，604和606)(参见下表6)。治疗后，这些受试者中每一个都表现出存在PVD。从第二组病人得到的结果较不清楚，这是由于难以用裂隙灯显微镜法给玻璃体成像所致。
表6用50∶1和100∶1透明质酸酶ACS进行玻璃体内注射的人安全性试验


从实施例2的结果可知，在较早的临床前试验中，透明质酸酶ACS以高达150 IU的不同剂量注射到兔子眼睛的玻璃体内不引起任何显著的组织病理学变化，因此预计在人中低于150 IU的剂量将会很好地耐受。与此预计相一致的是，在现在的试验中将透明质酸酶ACS/BSS注射到视觉受损眼睛的玻璃体内产生了少数症状，由于它们在每一试验组中以可比较的频率发生，因此相信这些少数症状都是由于注射操作本身所产生的，并且与治疗有关的不利后果相当轻且持续时间很短。
此外，观察到在用透明质酸酶ACS治疗的人眼睛中，玻璃体后部脱离的发生率增加，在用透明质酸酶ACS进行玻璃体内注射的病人中所观察到的PVD的增加表明，本发明的方法能有效地诱导玻璃体液的液化和脱离。因此，本项试验表明，透明质酸酶ACS能注射到人玻璃体内而不引起严重或长期的眼并发症。透明质酸酶在促进出血后的积血从眼睛玻璃体中清除方面的应用下述实施例4描述了透明质酸酶ACS用于促进出血后的积血从眼睛玻璃体中清除的实例。在实施例4中，所用的透明质酸酶是表2所示不含硫柳汞的透明质酸酶ACS制剂。
实施例4透明质酸酶玻璃体内给药后对出血清除的促进在本项试验中，用透明质酸酶ACS以50-200 IU的剂量单次玻璃体内注射，来治疗6个呈现玻璃体出血的病人(5个男性病人，1个女性病人)。
在本试验中给予的透明质酸酶ACS是按照上面表2中所示制剂制得的。
本试验中所有受试病人都有糖尿病性视网膜病史，并被发现具有持续了不同时间的玻璃体出血。在每一病人中，玻璃体内存在的血液量都足以妨碍通过标准眼底镜检查手段对视网膜进行的观察。
每一病人接受单次的透明质酸酶ACS玻璃体内注射。4个病人的注射剂量是50 IU，1个病人的注射剂量是70 IU，1个病人的注射剂量是200 IU。
本项试验的观测结果总结在附图6中。
在本实施例接受治疗的6个病人中，单次玻璃体内注射透明质酸酶ACS后6-16天内，出血的玻璃体变得足够清晰，能进行透过玻璃体的视网膜观测。玻璃体这种人为的变清比所预计的在这些病人中不进行透明质酸酶治疗而自然变清的过程快很多。
需要指出，不象在用高剂量的透明质酸酶ACS处理下的兔子中所观察的荧光素泄漏，在本项以人为基础的试验中没有观察到任何毒性作用。
透明质酸酶在治疗其它眼科疾病中的应用本申请人还观测了透明质酸酶ACS以试验剂量进行玻璃体内单次给药在治疗一些眼科疾病中的效力。用透明质酸酶ACS治疗后，患有以前诊断的眼疾病包括增生性糖尿病性视网膜病变，老年性黄斑变性，弱视，色素性视网膜炎，黄斑裂孔，黄斑渗出(macular exudate)和囊样黄斑水肿的病人，其这些眼疾病的临床症状表现出改善。
本申请人还已确定，本发明的透明质酸酶ACS制剂能以1 IU以上的剂量玻璃体内给药，而不对眼睛造成毒性损害，并能使玻璃体迅速液化，同时使玻璃体与视网膜和其它组织(例如epiretinal膜，黄斑)分开或脱离。玻璃体液化和脱离的结果是，玻璃体对视网膜和其它组织的物理拉力被减到最小，玻璃体内液体的自然交换速度加快。因此，本申请的透明质酸酶ACS制剂特别适于治疗许多能受益于玻璃体液化/脱离和/或毒素或其它有害物质(例如血管生成因子，水肿液等)从眼睛后房和/或从附着在后房的组织(例如视网膜或黄斑)中加速清除的疾病(例如增生性糖尿病性视网膜病变，与老年性黄斑变性，弱视，色素性视网膜炎，黄斑裂孔，黄斑渗出(macular exudate)和囊样黄斑水肿)。此外，据信玻璃体的液化也能移除以聚合玻璃体液形式存在、支持新血管形成所必需的基质。因此，本发明能用于防止或减轻视网膜新血管形成的发生。
此外，许多眼科疾病的病因是血液-视网膜薄膜的去稳定作用。这种去稳定作用使脉络膜血管层的各种组分(例如血清组分、脂质、蛋白)能进入玻璃体腔并损害视网膜表面。这种去稳定作用也是造成称为新血管形成的玻璃体腔血管浸润的初始原因。
因此，本发明的实施方案也涉及预防和治疗由视网膜血管化的损伤或病变导致或对血-视网膜屏障造成损伤的哺乳动物眼睛的各种障碍。这类疾病的实例包括但不限于增生性糖尿病性视网膜病变，与老年性黄斑变性，弱视，色素性视网膜炎，黄斑裂孔，黄斑渗出(macularexudate)和囊样黄斑水肿，以及其它其临床症状因本发明的透明质酸酶ACS治疗而好转的疾病。
下面是使用上述透明质酸酶ACS制剂、使所述眼科疾病改善的应用实施例。此外，本发明还涉及除透明质酸酶ACS之外的酶在诱导玻璃体液化方面的应用。其它可用于本发明的酶的实例包括其它葡萄糖胺聚糖酶，例如其它透明质酸酶制剂，软骨素酶ABC，软骨素酶AC，软骨素酶B，软骨素4-硫酸酯酶，软骨素6-硫酸酯酶，和β-葡糖苷酸酶。胶原酶也属于本发明所考虑的范围。此外，蛋白酶也是本申请所考虑的酶。
希望使用除透明质酸酶ACS之外的酶来实施本发明方法的本领域技术人员应当使用本发明的指导来选择合适的酶及其剂量。具体地说，当用于本发明时，讨论酶-底物特异性和非毒性试验的实施例将用其它酶实施以确定其有效性。因此，本发明包含的指导适用于确定能促进玻璃体液化而同时不对视网膜或眼睛其它组织结构产生损害的基本上没有毒性的酶。
增生性糖尿病性视网膜病(PDR)的透明质酸酶治疗在工作年龄的美国人中，糖尿病性视网膜病变是导致失明的首要原因。视网膜病变的发生率随患糖尿病的时间而增加，在患糖尿病7年的糖尿患者中，约50％的患者表现出视网膜病变，而对于患糖尿病20年以上的糖尿病患者，此比例则增加到约90％。据估计约有700000美国人患有PDR。
糖尿病的视网膜血管后果基本上部分由微血管渗漏和由于慢性高血糖的毛细血管不能灌输构成。微血管渗漏可依次导致视网膜水肿、脂质渗出和视网膜内出血。毛细血管不能灌输导致形成视网膜内微血管异常(IRMA)。这些异常是形成的动静脉分支，以灌输由糖尿病介导的小动脉退化导致的丧失血管形成能力的视网膜区域。
血管内皮生长因子在毛细管不能灌输区域从缺氧视网膜中的表达被认为是导致视网膜外新血管形成发展的原因。这种新血管形成和其有关的纤维组分可自发消失或并发有玻璃体出血或牵引视网膜脱离。在荧光素血管造影术中，通过从这些新血管中渗漏的大量染料(因为这些新血管没有和视网膜脉管系统形成紧密的内皮连接)可容易地看到新血管形成。在视网膜缺氧区域的受损轴浆流导致形成棉絮状渗出点。
由于在早期PDR具有很强的无症状特性，因此对于增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)需要仔细地甄别糖尿病以便尽早确定诊和治疗。增生性糖尿病性视网膜病变可分成3个亚型(1)非增生性视网膜病变；(2)前增生性视网膜病变；(3)增生性视网膜病变。每一类都有一些形态学特征。非增生性视网膜病变的特征包括毛细血管微血管病(微血管闭塞和渗透性改变，毛细血管不能灌输，视网膜毛细血管微动脉瘤，基膜增厚，和视网膜内微血管异常(IRMA))；视网膜内出血；渗出物；和黄斑改变。前增生性视网膜病变具有上述描述非增生性视网膜病变的部分或所有变化以及下述特征严重的静脉珠化，棉絮状渗出物，广泛的IRMA以及广泛的视网膜局部缺血。增生性视网膜病变的特征是视网膜外新血管形成和纤维组织增生，玻璃体改变和出血，黄斑病，和视网膜脱离。
纤维血管组织的产生是PDR特别重要的并发症，因为其经常会导致玻璃体介导的视网膜损伤。纤维血管组织可形成会与玻璃体后膜形成致密粘着物的视网膜前的膜。这些粘着物将玻璃体牵拉力传递给视网膜，从而可导致视网膜脱离。
玻璃体基质通常牢固地附着在相邻的视网膜和称为Martegiani环的视神经头的外周缘上。在Martegiani环和玻璃体基质之间所有其它位点上的玻璃体与视网膜的粘着很不牢固。从视网膜中的新血管形成导致形成从神经头或眼底其它部位延伸到玻璃体中的血管束。这些血管束的收缩可导致视网膜部分或全部脱离。
在黄斑处的视网膜脱离是PDR的主要并发症。大多数由PDR导致的视网膜脱离开始时是没有裂孔的牵引式脱离，但是在此疾病的后期，视网膜脱离可通过形成视网膜裂孔而变得破裂。牵引式脱离是由异常的玻璃体视网膜粘着或随后会导致纤维束皱缩以及视网膜隆凸的玻璃体牵引所致。
本发明涉及用透明质酸酶ACS通过玻璃体内注射来治疗处于前增生期和增生期的PDR。不限定于特别的机理，据信玻璃体内注射透明质酸酶ACS的作用是促进玻璃体液相的清除。通过注射透明质酸酶ACS而使得玻璃体内透明质酸解聚后，玻璃体内注射的研制水从玻璃体中转移到脉络膜的速度明显增加。本发明利用此观察结果来液化玻璃体，例如为了促进各种生长诱导因子和其它由于患有PDR而渗漏到玻璃体内的血清产物的清除。本发明的透明质酸酶ACS治疗可单独进行，或与其它PDR治疗联合进行。
实施例5前增生性糖尿病性视网膜病变的治疗在实施例5中，通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS来治疗表现出前增生性糖尿病性视网膜病变的糖尿病患者的此糖尿病并发症。治疗的目的是减轻或阻止表征为视网膜外新血管形成和纤维组织增生、玻璃体改变和出血、黄斑病、和视网膜脱离的增生性糖尿病性视网膜病变的发展。
一旦病人被诊断出患有糖尿病，就要进行增加的眼科监视，因为在患有糖尿病的患者中，以后会发展成增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)的比例很高。此增加的眼科监视应包括周期性视网膜检查和荧光血管造影术以监视静脉珠化、IRMA、和视网膜局部缺血的程度。
当前增生性糖尿病性视网膜病变开始达到增生性阶段时，即开始透明质酸酶ACS治疗。此阶段定义为，在2个或2个以上象限中存在静脉珠化现象、在1个或1个以上象限中存在IRMA、和/或微动脉瘤以及在所有象限中有出血圆点。一旦存在这些标记，就开始进行本发明的透明质酸酶ACS疗法。
给患者进行全面的眼科检查以确定眼健康状况的基础。眼科检查包括间接检眼镜检查，裂隙灯活组织显微镜检查，视网膜周围检查，眼内压测量，视敏度(肉眼及最佳校正)症状学检查，眼底照相，荧光素血管造影，视网膜电流描记和A-扫描检测。
初步检查之后，将透明质酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃体内。如果两只眼睛都患有PDR，将它们单独治疗。将50∶1的50 IU上述透明质酸酶ACS眼用溶液注射到欲治疗眼睛的玻璃体内，以促进玻璃体中透明质酸的解聚，使玻璃体液化。
治疗后，在第1、2、7、15、30和60天检查患者的眼睛。每次检查都检查病人的玻璃体液化情况。此外，用带有巩膜凹的检眼镜间接检查病人玻璃体后脱离。最后，通过定期视网膜检查和荧光素血管造影术连续监视患者PDR的程度，以检查静脉珠化、IRMA和视网膜局部缺血的程度。
实施例6增生性视网膜病变的治疗在本实施例中，通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS来治疗表现出增生性视网膜病变的糖尿病患者。治疗的目的是减轻增生性糖尿病性视网膜病变的程度，预防除去视网膜外新血管化组织后疾病的复发，以及减少视网膜脱离的可能性。
呈现增生性糖尿病性视网膜病变的患者接受本发明的透明质酸酶ACS治疗和除去新血管化组织手术的联合治疗。增生通常从形成具有很少纤维组织成分的新血管开始。增生是由分化到血管内皮细胞中的原间质成分产生的。然后此新形成的血管发生纤维化生，即成血管细胞芽转化为纤维组织。
新血管会渗漏荧光素，因此在血管造影期间，增生部分特别显著。新血管和纤维组织穿过内界膜，并在内界膜和玻璃体后膜之间的界面上形成树枝状分枝。纤维血管组织可形成能与玻璃体后膜形成紧密粘着物的视网膜前的膜。这些粘着物非常重要，因为在玻璃体皱缩后期，它们将玻璃体牵拉力传递给视网膜。
PDR的增生性阶段定义为呈现3个或3个以上下述特征新血管，在视神经一个圆盘直径上或内出现新血管，很多新血管(定义为在视神经上有三分之一圆盘面积新血管化或视神经上有二分之一圆盘面积新血管化或在别处有二分之一圆盘面积新血管化)，和视网膜前出血或玻璃体出血。
一旦确诊进入了增生阶段，给患者进行全面的眼科检查以确定眼健康的基准。眼科检查包括间接检眼镜检查，裂隙灯活组织显微镜检查，视网膜周围检查，眼内压测量，视敏度(肉眼及最佳校正)症状学检查，眼底照相，荧光素血管造影，视网膜电流描记和A-扫描检测。
初步检查之后，将透明质酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃体内。如果两只眼睛都患有PDR，将它们单独治疗。将50∶1的50 IU上述透明质酸酶ACS眼用溶液注射到欲治疗眼睛的玻璃体内，以促进玻璃体中透明质酸的解聚，使玻璃体液化。除了使玻璃体解聚外，也用全视网膜光凝固法直接治疗新血管化组织以将对视网膜的损害作用减至最小。
全视网膜光凝固法(PRP)可与本发明透明质酸酶ACS治疗联合使用来治疗患有PDR的患者。全视网膜光致凝固法是一种激光光凝固法。激光例如氩绿激光(614nm)、氩蓝绿激光(488和514nm)、氪红激光(647nm)、可调染料激光、二极管激光和氙弧激光通常被用于视网膜手术。激光能量主要被含有对相邻结构产生热效应的色素(黑色素、叶黄素、或血色素)的组织吸收。氪红激光是优选的疗法，因为与氩激光相比，氪红激光能更好地穿透中心巩膜内障和玻璃体出血，而对于氩激光，若要达到与氪红激光相同水平的穿透，就需要更多能量。
激光视网膜手术中所用的参数可根据光凝固法的目标进行调整。当在较低功率设置，治疗持续时间较长，并且产生较大光点时，激光对小血管具有凝结作用。聚焦激光光凝固法用在糖尿病患者中以阻止微动脉瘤渗漏。激光光点直接照在微动脉瘤上，以使动脉瘤轻微变白和关闭。当以栅格形式照在视网膜水肿区域时，激光可减轻微动脉瘤渗漏。在较高能量水平时，组织的激光切除是可能的。全视网膜光凝固法被认为是通过破坏视网膜组织、减少眼睛局部缺血组织的数量来有效地发挥作用的。汇合的激光光点可用在新血管膜上来除去异常血管。
需要知道，本发明不需要特定的治疗顺序。在一个实施方案中，患者先用透明质酸酶ACS治疗，然后进行激光治疗。在另一个实施方案中，患者先进行激光治疗，然后进行本发明的透明质酸酶ACS治疗。
治疗后，在第1、2、7、15、30和60天检测患者的眼睛。每一次检测都检查病人的玻璃体液化情况。另外，还用带有巩膜凹的间接检眼镜检查病人玻璃体后脱离。最后，通过定期视网膜检查和荧光素血管造影术连续监视患者PDR的程度，以检查静脉珠化、IRMA、视网膜局部缺血、新血管化、以及玻璃体出血的程度。如果发现玻璃体出现新的聚合或解聚不完全，则允许重复进行上述治疗。
老年性黄斑退行变性的透明质酸酶治疗本发明还涉及透明质酸酶ACS在与老年性黄斑退行变性(AMD)的治疗中的应用。老年性黄斑退行变性是逐渐的、并且经常是两侧的视觉下降。它是导致成人正常失明的最常见原因。它可能是由于脉络膜血管层或视网膜传入血管老化和血管病所致。AMD基本上有两种形态类型“干”型和“湿”型。
AMD的病因性异常是，在布鲁赫膜和视网膜色素上皮水平(RPE)发生退化性变化。这种变化的标志性损害是脉络膜小疣。脉络膜小疣在临床上表现为RPE水平小的、黄白色沉着物。脉络膜小疣可分为硬、软或基底层状的脉络膜小疣。
本发明涉及湿型和干燥型AMD的治疗和预防。在湿型AMD中，认为病变累及脉络膜毛细血管层。脉络膜血管层是脉络膜的组成部分，其作用是使眼球血管化。脉络膜血管层由给色素上皮提供大多数营养的丰富的毛细血管网和视网膜外层构成。脉络膜血管层的损伤会最终导致新血管并发症，这是黄斑变性的原因。
在干燥型AMD中，非盘状黄斑变性是由于下面的脉络膜血管层部分或完全闭塞所致。通过检眼镜可观察到视网膜色素上皮层变性和形成裂孔。也可以观察到色素上皮层下面的沉着物例如钙螯合物或protinaesous等。在干燥型ADM中，通常会逐渐发生继发性视网膜变化，导致视敏度逐渐下降。此外，在一部分患者中，会导致视觉的严重损失。
本发明涉及通过液化玻璃体来治疗干燥型ADM和防止黄斑变性。据考虑，玻璃体的液化会增加将以后会导致黄斑变性的沉着物从视网膜中清除出去的速度。
湿型ADM主要是由于随后会导致色素上皮层下新血管化的脉络膜血管层不足造成的。新血管化也被认为是为适应由于囊状损伤而致氧合作用不充分而产生视网膜血管化的结果。新血管化也会导致几种其它疾病，例如色素上皮层和视网膜感觉区的脱离。这种疾病一般在60岁以后发生，男女的发病率相等，并且通常患者的两侧都表现出这种疾病。
大概老年性黄斑退行变性最重要的并发症是眼球的布鲁赫氏膜缺陷，新血管是由此层而生长的。上皮层新血管化可导致在视网膜和视网膜下产生渗透性沉积物。新血管化也可导致出血进入玻璃体，这可导致视网膜杆和圆锥变性，以及囊样黄斑水肿(下面将要讨论)。或形成会导致不可逆视觉损失的黄斑裂孔。
虽然在患有AMD的患者中，发生AMD的新血管并发症的比例仅有10％，但是AMD的新血管并发症是导致视觉严重损失的最主要原因。危险因素包括年龄增长，软脉络膜小疣，非区域性萎缩，家族病史，远视，和视网膜色素上皮层脱离。AMD的脉络膜新血管化的症状包括视物变形症，旁中央盲点或中央视觉减弱。检眼镜发现包括视网膜下液体，血液，渗出物，RPE脱离，视网膜囊状变化，或存在浅灰绿色视网膜下新血管膜。荧光素血管造影术通常是有效的诊断方法。在此诊断过程中，看上去是损伤边缘模糊的视网膜下染料的进行性淤积，或染料从未确定来源的渗漏是此疾病的标志。通过荧光素血管造影术所显示的脉络膜新血管膜的其它部分包括，高阻塞的荧光素，弱堵塞的荧光素，血液，和盘状瘢痕。
目前对新血管AMD的理解使我们知道，典型的脉络膜新血管化是与视觉迅速衰退最有关的损伤。因此，AMD的治疗必须覆盖损伤部分的所有新血管和纤维血管。目前，只有当典型的新血管化具有明显的分界边缘时，才进行治疗，并且光凝固法已显示出很好的治疗效果。
在脉络膜中央凹外发生新血管化(距离中夹凹＞＝200微米)的眼睛中，氩激光光凝固法能使5年内严重视觉损失的发生率由64％减至46％($6条线)。在治疗后的第一年，用激光治疗过的眼睛通常有一半会复发新血管化。复发的新血管化始终与严重视觉损失的发生有关。
在脉络膜近中央凹处发生新血管化(距离中夹凹1-199微米)的眼睛中，氩激光光凝固法能使1年内严重视觉损失的发生率由45％减至31％，虽然在5年内，未治疗组和治疗组的差异并不明显。
激光治疗仍然是治疗AMD的基本疗法，然而，本发明可通过降低新血管化的复发率来增强此方法的效力。
实施例7与老年性黄斑退行变性的治疗在本实施例中，通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS来治疗患有与老年性黄斑退行变性的患者。此治疗的目的是减轻或阻止新血管化、黄斑病、和视网膜损伤的发生。
一旦患者达到60岁，就进行加强的眼科检查，以检测是否发生ADM。加强的眼科检查包括周期性视网膜检查和荧光素血管造影术以检测是否存在视网膜下液体、血液、渗出物、RPE脱离、囊状视网膜变化，或是否存在浅灰绿色视网膜下新血管膜。
当诊断出ADM时，就进行与或不与其它治疗如光凝固法联合进行的透明质酸酶ACS治疗。在治疗的第一阶段，给患者进行全面的眼科检查以确定眼健康状况的基基础。眼科检查包括间接检眼镜检查，裂隙灯活组织显微镜检查，视网膜周围检查，眼内压测量，视敏度(未校正及最佳校正)症状检查，眼底照相，荧光素血管造影，视网膜电流描记和A-扫描检测。
预检查之后，将透明质酸酶ACS注射到病人患有ADM的眼睛的玻璃体内。如果两只眼睛都患有ADM，它们可以分别治疗。将50∶1的50IU透明质酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到患ADM眼睛的玻璃体内，以促进玻璃体内透明质酸的解聚，从而使玻璃体液化。
注射过透明质酸酶ACS的眼睛可能也需要激光光凝固法治疗。在实施例5和6中描述的此激光治疗方案应当在用透明质酸酶治疗AMD之后进行。在另一实施方案中，光凝固法治疗在进行本发明的酶治疗之前进行。
治疗后，在第1、2、7、15、30和60天检查患者的眼睛。因为有复发的可能性，所以此后病人每1个月要回来进行一次定期检查。每一次检查都检测玻璃体的液化情况。此外，用带有巩膜凹的检眼镜间接检查病人玻璃体后脱离。最后，通过定期视网膜检查和荧光血管造影连继续监测患者视网膜下液体、血液、渗出物、RPE脱离、囊状视网膜变化，或浅灰绿色视网膜下新血管膜的存在情况。如果有证据表明或发现新血管化复发，可能还需要再进行透明质酸酶ACS和/或激光治疗。
下述实施例证实了甚至不用光凝固法，本发明的效力。
实施例8玻璃体内注射透明质酸酶后黄斑变性症状的改善一个具有老年性黄斑退行变性病史的年龄在79岁以上的男性患者，其右眼未校正视力是20∶400。将100 IU剂量的透明质酸酶ACS一次注射到患者右眼玻璃体内。左眼不进行治疗。
给药后反复检查患者的视力，其左眼(未治疗)的视力保持不变，而观察到右眼(治疗)的视力有如下改善

*cf表示“指算”在此项试验中未观察到透明质酸酶ACS的任何副作用。
弱视的透明质酸酶治疗术语弱视衍生自希腊语，其表示视觉迟钝(amblys＝迟钝，ops＝眼睛)。弱视是由于脑的视觉区域发育异常所致，而脑的视觉区域发育异常又是由于在早期的视觉发育期间，异常的视觉刺激所致。与弱视有关的病理并不特定地限于眼睛，而且，其位于包括外侧膝状核和纹状体皮层在内的脑的视觉区域。此发育异常是由3个机制导致的(1)称为图像失真的模糊的视网膜视像；(2)皮层抑制；或(3)皮层抑制加图像失真。本发明主要涉及由介质浑浊引起的图像失真。更具体地说，本发明是针对玻璃体浑浊的组织。
弱视通常定义为至少有两条不同的视敏度斯内伦氏线。早期检查和早期治疗对于弱视的治疗很关键。对于治疗由玻璃体浑浊引起的弱视，策略是通过改变玻璃体的浑浊来提供清晰的视网膜视像，这样就产生了清晰的视觉。
在本实施例中，通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS来治疗由玻璃体浑浊导致弱视的患者。治疗的目的是通过加快玻璃体内液体的交换速度来减轻玻璃体浑浊。
实施例9透明质酸酶ACS的玻璃体内给药治疗后弱视症状的改善一个具有弱视病史、年龄为40岁的女性患者，其右眼的未校正视力为20∶400，左眼的未校正视力为20∶200。将100 IU剂量的透明质酸酶ACS一次注射到患者右眼玻璃体内。左眼不进行治疗。
给药后反复检查患者的视力，其左眼(未治疗)的视力保持不变，而观察到右眼(治疗)的视力有如下改善

在此患者中未观察到透明质酸酶ACS的任何副作用。
色素性视网膜炎的透明质酸酶治疗色素性视网膜炎(RP)是指一些可遗传的进行性视网膜变性，其特征是双侧夜盲缩小的视野和视网膜电流图异常。早期症状包括暗适应困难以及视网膜赤道部视野缺损。随着疾病进展，视野缺损加重，一般只剩下一小块视野，直到最终甚至累及中央视野。在此疾病早期，由于囊样黄斑水肿，黄斑萎缩，或发生后囊下白内障，中央视敏度可能也会受到影响。RP代表其致病机理通常是在对光传导起关键作用的光受体外侧部分生成至少一种异常蛋白的多种疾病。
RP的临床后果之一是中央凹外周毛细血管和视神经头的血-视网膜屏障不稳定。通过血管造影术，可观察到这种不稳定会导致荧光素染料渗漏。除了渗漏以外，也可能发生并可观察到液体如微囊在丛状层外的积聚。这些充满液体的微囊可最终破裂，导致视网膜层受损伤。本发明涉及，通过促进积聚在微囊中的组织液的清除来治疗与视网膜损伤有关的RP。
实施例10透明质酸酶玻璃体内给药后色素性视网膜炎症状的改善具有色素性视网膜炎病史、年龄为59岁的男性患者，其左眼的未校正视力为20∶400，并且校正后的视力也为20∶400。将100 IU剂量的透明质酸酶ACS一次注射到患者左眼玻璃体内。右眼不进行治疗。
透明质酸酶ACS给药后反复检查患者的视力，其右眼(未治疗)的视力保持不变，而观察到左眼(治疗)的视力有如下改善

+HM表示“手运动”≠cf表示“指算”试验结果表明，无论对于未校正视敏度(从20∶400改善到20∶80)，还是对于最佳校正视敏度(从20∶400改善到20∶40)，受试者的视力都有显著改善。而且，虽然在治疗期间观察到眼内压发生改变，但是注射约2星期后，眼内压看上去恢复到基准水平。虽然这是从一个患者中获得的结果，但是这些结果看上去能足以保证进一步研究。
黄斑裂孔的透明质酸酶治疗黄斑的破裂或爆裂性打开称为黄斑裂孔。有趣的是，这种适应症通常在60岁-80岁的女性中发生，或在创伤如照亮损伤、日光损伤、巩膜拱起后发生，或在患有葡萄肿的眼睛中发生。症状包括视物变形和视敏度下降。
据认为，黄斑裂孔形成是由于玻璃体后皮层发生玻璃体后脱水收缩腔内液体流动诱使的穿过视网膜表面的正切牵引所致。在绝大多数黄斑裂孔患者中存在玻璃体后脱水收缩腔。据认为，当玻璃体后凝胶从视网膜表面回缩时，在两个表面间形成的间隙会产生其中玻璃体液的运动可与视网膜表面进行负性相互作用的区域。玻璃体液在玻璃体后脱水收缩腔内的正切运动被认为会促使视网膜破裂，导致产生黄斑裂孔。
本发明涉及用透明质酸酶ACS解聚玻璃体以消除导致黄斑裂孔形成的病理状态。通过解聚玻璃体，透明质酸酶ACS介导的玻璃体再生的结果是，玻璃体后脱水收缩腔被消除。玻璃体后脱水收缩腔的消除使得视网膜和玻璃体之间的液体能自由流动到玻璃体腔中，分散掉否则就已经直接作用到视网膜表面上的任何有害压力。
下述实施例讨论表现出黄斑孔形成早期症状的患者的治疗。
实施例11黄斑裂孔的治疗通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS治疗表现出黄斑裂孔形成早期症状的患者。接受治疗的患者表现出黄斑孔形成的各种症状。症状包括与黄色中央点或环有关的中央凹缺损。在黄斑裂孔形成区域，凹已经开始变薄，并且损伤区域表现出微红外形。在此阶段的荧光素血管造影术可显得正常，或呈现微弱的荧光素过度。出现偏心全层开裂表明此疾病正处于早期阶段。观察到这些症状时，开始透明质酸酶ACS治疗。
当确诊黄斑裂孔形成时，开始进行本发明的透明质酸酶ACS治疗。对患者进行全面的眼科检查，以确定眼睛健康状况的基准。眼科检查包括间接检眼镜检查，裂隙灯活组织显微镜检查，视网膜周围检查，眼内压测量，视敏度(未校正及最佳校正)症状检查，眼底照相，荧光素血管造影，视网膜电流描记和A-扫描检测。
预检查之后，将透明质酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃体内。如果两只眼睛都患有黄斑裂孔，它们可以分别治疗。将50∶1的50 IU透明质酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到欲治疗眼睛的玻璃体内，以促进玻璃体内透明质酸的解聚，从而使玻璃体液化。
治疗后，在第1、2、7、15、30和60天检查患者的眼睛。每一次检查都检测玻璃体的液化情况。也进行对于监视治疗过程特别有效的荧光血管造影术。此外，用带有巩膜凹的检眼镜间接检查病人玻璃体后脱离。
黄斑渗出的透明质酸酶治疗黄斑渗出物是能穿透血-视网膜屏障并且透过黄斑渗入玻璃体腔的物质。有两种渗出物，即软渗出物和硬渗出物。软渗出物实际上不是渗出物，而是在神经纤维层内的神经节细胞轴突簇，它们已经在局部缺血性损伤或梗塞位点上发生了球状扩张。硬渗出物通常是基底视网膜病微血管变化所致的渗出物。硬渗出物呈黄色和蜡状，并且经常以环状形式沉积在黄斑周围。硬渗出物由衍生自血管渗漏的血清组分渗出物或衍生自视网膜内变性神经成份的脂质产物的脂质和蛋白质类物质构成。硬渗出物的吸附作用主要由巨噬细胞吸收作用介导，然而，由于渗出经常发生在视网膜元血管区域的外丛状层，所以这一吸附过程可能很慢。本发明尤其能用于减轻由于视网膜不稳定导致的渗出性积聚的程度，因为透明质酸酶ACS能解聚玻璃体，从而使玻璃体水组分的交换速度增加。
实施例12黄斑渗出的治疗用本发明的透明质酸酶ACS注射法治疗表现出黄斑渗出的患者。对患者进行全面的眼科检查，以确定眼睛健康状况的基准。眼科检查包括间接检眼镜检查，裂隙灯活组织显微镜检查，视网膜周围检查，眼内压测量，视敏度(未校正及最佳校正)症状检查，眼底照相，荧光血管造影，视网膜电流描记和A-扫描检测。
预检查之后，将透明质酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃体内。如果两只眼睛都患有黄斑渗出，它们可以分别治疗。将50∶1的50 IU透明质酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到预治疗的眼睛的玻璃体内，以促进玻璃体内透明质酸的解聚，从而使玻璃体液化。
治疗后，在第1、2、7、15、30和60天检查患者的眼睛。每一次检查都检测玻璃体的液化情况。也进行对于监视治疗过程特别有效的荧光素血管造影术。此外，用带有巩膜凹的检眼镜间接检查病人玻璃体后脱离。
囊状黄斑水肿的治疗囊状黄斑水肿是由不同病因导致的常见的眼睛异常。这种病理状态主要是由于中央凹外周毛细血管和视神经头的血-视网膜屏障发生障碍，使液体渗漏，积聚在外丛状层的微囊中所致。该区域相对较薄并位于视网膜血管化区域下面。当进行荧光素血管造影术检查时，囊状黄斑水肿在临床上产生蜂窝式外形。水肿恶化时，外丛状层可能会破裂，产生层状裂孔。形成的裂孔可延伸到视网膜内层，或最终可形成完全的黄斑裂孔。
本发明涉及通过透明质酸酶ACS介导玻璃体解聚，来治疗囊状黄斑水肿以及防止黄斑裂孔形成。
实施例13囊状黄斑水肿的治疗按照实施例11和12的方法，通过玻璃体内注射透明质酸酶ACS来治疗表现出囊状黄斑水肿症状的患者。
本领域技术人员应当知道，上面只是用一些优选的实施方案和实施例对本发明进行了描述，并没有对本发明可采取或被实施的所有实施方案进行详尽的描述。实际上，在不脱离本发明实质和范围的前体下，可对上述具体的实施方案和实施例作各种变化。因此，对上述实施方案和实施例所作的所有合理修改都应当包括在下述权利要求的范围内。
权利要求
1.诱使玻璃体液液化以治疗或预防哺乳动物眼睛疾病的方法，包括如下步骤将一定量的能有效地液化所述玻璃体液，从而使所述疾病被治疗或预防，而同时不对所述哺乳动物眼睛产生毒性损害的透明质酸酶与所述哺乳动物眼睛的所述玻璃体液进行接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗增生性糖尿病性视网膜病变而实施的。
3.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗老年性黄斑退行变性而实施的。
4.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗弱视而实施的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗色素性视网膜炎而实施的。
6.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗黄斑裂孔而实施的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗黄斑渗出而实施的。
8.根据权利要求1的方法，其中所述方法是为了治疗囊状黄斑水肿而实施的。
9.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶是水溶液，并且所述酶与玻璃体液接触的步骤包括将所述液体溶液注射到玻璃体液内。
10.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶在不存在硫柳汞的情况下与玻璃体液接触。
11.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶以5-200国际单位的剂量与玻璃体液接触。
12.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶以1国际单位的剂量与玻璃体液接触。
13.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶是以多次剂量的形式给药。
14.根据权利要求13的方法，其中单次玻璃体内注射的注射体积低于100∶1。
15.根据权利要求1的方法，其中通过10％SDS PAGE电泳测定时分子量在约100000以上的所述透明质酸酶不具有透明质酸分解活性。
16.根据权利要求1的方法，其中通过10％SDS PAGE电泳测定时分子量在约60000-100000之间的所述透明质酸酶不具有明胶分解活性。
17.根据权利要求1的方法，其中通过10％SDS PAGE电泳测定时分子量在约45000以上的所述透明质酸酶不具有酪蛋白分解活性。
18.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶不包含通过4-20％SDS PAGE电泳测定时分子量在约100000以上的透明质酸酶。
19.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶不包含通过4-20％SDS PAGE电泳测定时分子量在约50000-60000之间的透明质酸酶。
20.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶不包含通过4-20％SDS PAGE电泳测定时分子量在约20000以下的透明质酸酶。
21.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶被制备成不含有硫柳汞的注射液，注射液具有如下配方高达8000 IU的所述透明质酸酶；5.0-130.0mg的乳糖；和0.01-100.0mmol的磷酸盐。
22.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶被制备成不含有硫柳汞的注射液，注射液含有如下配方6500 IU的所述透明质酸酶；5.0mg的乳糖；和0.02mmol的磷酸盐。
23.根据权利要求1的方法，其中所述透明质酸酶被制备成不含有硫柳汞的注射液，注射液具有如下配方500-1000 IU的所述透明质酸酶；5.0-10.0mg的乳糖；和0.01-10.0mmol的磷酸盐。
24.治疗哺乳动物眼睛疾病的方法，包括如下步骤将一定量的能有效治疗所述疾病并不对所述哺乳动物眼睛眼睛造成毒性损害的透明质酸酶与所述哺乳动物眼睛的玻璃体液接触。
25.根据权利要求24的方法，其中所述玻璃体液没有出血性积血从而能容许观察所述哺乳动物眼睛的视网膜。
26.根据权利要求24的方法，其中所述接触步骤是在不进行玻璃体切除术的情况下进行的。
全文摘要
本发明提供了治疗哺乳动物眼睛疾病的酶方法。通过将一定量的能有效液化被治疗眼睛的玻璃体体液并不对所述哺乳动物眼睛造成毒性损害的透明质酸酶给药,能防止新血管化和提高将对视网膜有毒性的物质从玻璃体中清除出去的速度。玻璃体液的液化提高了液体从玻璃体腔中交换的速度。交换速度的增加使得会引起眼睛和视网膜损伤的物质和病理状态被清除。
文档编号A61K9/08GK1257430SQ98805342
公开日2000年6月21日 申请日期1998年5月22日 优先权日1997年5月22日
发明者H·L·卡拉格奥兹安, V·H·卡拉格奥兹安, M·C·肯尼, J·L·G·弗洛雷斯, G·A·C·阿拉贡, A·B·内斯布恩 申请人:先进角膜系统公司