蛋白质的口服释放方法

专利名称：蛋白质的口服释放方法
技术领域：
本发明涉及包括可膨胀水凝胶基质和包含在基质中蛋白质的组合物，和该组合物在将生物活性化合物以活性形式经口腔释放到脊椎动物肠中的应用。
背景技术：
在开发蛋白质类化合物(如胰岛素)的口服释放系统的过程中存在两个主要问题。第一个问题是许多蛋白质在胃肠(GI)系统，主要是胃中被消化酶灭活。这个问题可以通过设计一种载体而被克服，所述载体在释放药物进入GI道更适宜区域，特别是肠道低部区域之前保护蛋白质免受胃苛刻环境的破坏。此外，可应用蛋白酶抑制剂以阻滞存在于GI系统中能够分解口服蛋白质的酶的活性。另一问题是将完整的大肽穿过肠道基膜进入血流的缓慢转运。研究者已经尝试借助于吸收增强剂来绕过障碍，所述吸收增强剂可帮助巨分子穿过屏障转运。然而，目前缺乏有效的可利用释放载体。因此，期望有效的和相对低造价制备的口服释放系统。
发明概述本发明涉及包括水凝胶基质载体和生物活性化合物的组合物，以及组合物将化合物以活性形式释入肠道的应用。一种优选的水凝胶基质包括聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)交联二甲基丙烯酸四甘酯共聚物网，即“P(MAA-g-EG)水凝胶”，由于酸性侧基的存在和嫁接链上的醚基团与质子侧基之间互聚络合物的形成，水凝胶显示出pH依赖性膨胀性质。在酸性介质，由于形成互聚络合物，该系统相对不膨胀。在碱性溶液，侧基电离和络合物分离。这些水凝胶的pH依赖性膨胀加之它们的生物粘附特性使得这些水凝胶成为口服释放蛋白质的理想载体。
附图简述

图1 P(MAA-g-EG)水凝胶中的可逆络合作用。C代表裹入的生物活性化合物。
图2 在37℃时，平衡聚合物体积分率作为样品pH值的函数，所述样品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩尔比的MAA∶EG。
图3 37℃时，平衡筛孔尺寸作为样品pH值的函数，所述样品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩尔比的MAA∶EG。
图4 37℃时丙羟茶碱于pH3.2(·)和7.4(●)和维生素B12于pH3.2( )和7.4(◎)的缓冲盐溶液中的控制释放。
图5a 37℃时茶硷自P(MAA-g-EG)水凝胶体外搏动性释放。
图5b 37℃时万古霉素自P(MAA-g-EG)水凝胶体外搏动性释放。
图5c 37℃时胰岛素自P(MAA-g-EG)水凝胶体外搏动性释放。
图6 含比值1∶1 MAA/EG和分子量为1000PEG嫁接链的P(MAA-g-EG)水凝胶在pH值3.2和7.4时与牛下颌腺粘蛋白接触时的粘附行为。
图7 大鼠口服25U/kg(O)和50U/kg(·)负载于P(MAA-g-EG)水凝胶中的胰岛素和50U/kg胰岛素溶液(●)(N＝5)后的血糖浓度。
图8 大鼠口服负载于的P(MAA-g-EG)水凝胶中的胰岛素(25U/kg)在含抑肽酶(O)和不含抑肽酶(·)时及50U/kg胰岛素溶液(●)(N＝5)后的血糖浓度。
图9 健康(·)和糖尿病(O)雄性Wistar大鼠口服P(MAA-g-EG)明胶胶囊微球(胰岛素剂量为25IU/kg体重)后的血糖反应。
图10 糖尿病雄性大鼠口服P(MAA-g-EG)Eudragit胶囊微球(25IU/kg体重)后的血糖反应。
图11 健康犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明胶胶囊微球(胰岛素剂量为10IU/kg体重)后的血糖反应。
图12 糖尿病犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明胶胶囊微球(胰岛素剂量为10IU/kg体重)后的血糖反应。
发明详述本发明涉及通过口服给药向脊椎动物释放生物活性蛋白质和药物的组合物。这里使用的术语活性化合物指对生命细胞有效的任何化合物，例如可诱导细胞内生化作用的化合物。根据一个实施例，口服给予的组合物包括可膨胀水凝胶基质，和包含在可膨胀水凝胶基质中的不稳定蛋白质。这里所用的不稳定蛋白质包括暴露于低pH或暴露于恒温动物消化道中的酶之后生物活性被破坏或变小的任何蛋白质。
水凝胶是本领域普通技术人员众所周知的水可膨胀性、交-联的聚合物基质。参见例如，Dresback于1980年9月2日提交的美国专利4,220,152，在此特意地在将其公开引入参考。已发现水凝胶是向脊椎动物口服释放蛋白质的有效释放载体。可利用水凝胶的可膨胀特性，当组合物通过消化道时首先保护水凝胶内容物免受胃恶劣环境的影响，然后将水凝胶内容物释入GI道更适宜区域，特别是肠道较低区域。已经发现本发明组合物在通过胃时基本不膨胀并定位于小肠，在小肠部位水凝胶膨胀并伴随着其内容物的释放。
水凝胶可充满或负载各种生物活性化合物，包括但不限于药物、生长激素、疫苗成分、维生素、类固醇和肽，并可作为此类生物活性化合物的口服释放载体。随着水凝胶在动物消化系统中变成水合物，负载于水凝胶中的化合物以控制方式释放。在一实施例中，本发明水凝胶基质是由聚甲基丙烯酸构成的粒状形式，该聚甲基丙烯酸聚合物嫁接了一个离子性长链聚合物如聚乙二醇(PEG)。
水凝胶颗粒优选在存在交联剂的条件下通过甲基丙烯酸聚合反应而合成。交联剂可选自本领域人员已知的各种生物适合性交联剂包括二甲基丙烯酸四甘酯、二甲基丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸二乙烯酯、二甲基丙烯酸三乙烯酯、二甲基丙烯酸四乙烯酯、二甲基丙烯酸五乙烯酯、相应的二丙烯酸酯，或星形聚合物包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺基团。聚合反应由本领域技术人员已知的自由基引发剂如热引发剂包括有机过氧化物或UV自由基引发剂来引发。
在一实施例中，水凝胶基质包括与生物适合性交联剂交联的甲基丙烯酸和聚(二醇)单甲基丙烯酸酯(或单丙烯酸酯)的共聚物。本发明使用的“聚(二醇)单甲基丙烯酸酯”包括聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯、聚(丙二醇)单甲基丙烯酸酯和聚(乙烯/丙二醇)单甲基丙烯酸酯，其中聚(乙烯/丙烯乙二醇)单甲基丙烯酸酯是由羟基功能性甲基丙烯酸酯引发氧化乙烯和氧化丙烯混合物聚合形成的聚合物。结果聚(二醇)侧基分子量为约200～约4000，更典型的是约200～约2000，在一实施例中为约200～约1200。甲基丙烯酸和聚(二醇)单甲基丙烯酸酯(或单丙烯酸酯)单体比值为约4∶1～约1∶4。
在一优选实施例中，水凝胶基质包括甲基丙烯酸和聚(二醇)单甲基丙烯酸酯与二甲基丙烯酸四甘酯交联的聚合物，“P(MAA-g-EG)水凝胶”。为制备所述聚合物，分子量约为200～约2000，更典型地是约200～约1200的聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯与甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸四甘酯进行共聚。甲基丙烯酸和聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯单体分子比约为4∶1～约1∶4。在另一实施例中，甲基丙烯酸和聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯单体分子比约为1∶1。交联剂加入量约0.25～约10.00摩尔％，更优选约0.25～约1.00摩尔％，在一实施例中约为0.75摩尔％。
水凝胶可以按照本领域技术人员已知的标准技术负载所需的化合物。在一实施例中，P(MAA-g-EG)水凝胶形成大小范围为直径约50μm～约500μm，更优选直径约100-200μm的微粒。根据一实施例，通过形成聚合基质并研磨基质以形成所需平均颗粒大小的水凝胶颗粒从而制得水凝胶微粒。水凝胶微粒可负载所需化合物并使用本领域技术人员已知的标准技术包装为标准片剂或胶囊剂。在一实施例中，水凝胶颗粒包入明胶胶囊。
根据一实施例，通过平衡分配使水凝胶负载生物活性化合物。尤其是，水凝胶在pH＞5.8并包含所负载组合物的溶液中成为水合物。然后回收水凝胶，再用pH＜5.8的溶液洗涤。然后干燥水凝胶并于4℃贮存。负载本发明水凝胶的另一方法包括将所需化合物的水溶液加到单体和交联剂的溶液中以及引发混合物聚合反应的步骤。
化合物通过交联聚合物网扩散的能力取决于凝胶膨胀程度和化合物的大小。水凝胶膨胀，交联点之间的聚合物链伸展和网孔大小或相关长度，ξ，增加从而允许材料中更大溶质渗透(见图1)。平衡膨胀得到络合网架，网架膨胀程度取决于存在于系统中的化学性和物理性交联的数量。在P(MAA-g-EG)网架，平衡膨胀比值更主要取决于周围环境的pH。
本发明P(MAA-g-EG)水凝胶，暴露于酸性条件(典型地是pH＜5.8)时形成暂时的物理性交联，这是由于聚甲基丙烯酸酯基团和侧伸出的聚(二醇)基团之间形成氢键。这些物理性交联本质上是可逆的，并取决于环境pH和离子强度。因此，交联度和网眼大小，ξ，更主要取决于周围环境的pH和离子强度。在酸性介质，由于大分子间络合物形成，故此系统相对不膨胀。在碱性溶液，侧基离子化和络合物分离。P(MAA-g-EG)水凝胶的平衡膨胀示于图2。数据表示作为pH函数的水凝胶(PEG嫁接物分子量1000，MAA∶EG分子比1∶1)的聚合物体积分率。以等克分子量的MAA和EG在低pH值时为例，络合程度高和膨胀状态下凝胶中聚合物体积分率，V2，S，几乎为0.70。然而，如果膨胀溶液的pH增加到高于pH＝4.6，则络合物开始分离且主链延伸导致凝胶中平衡聚合物体积分率显著降低。由于更多的水掺入到结构中，所以该高度膨胀、无-络合水凝胶包含的聚合物小于5％。
因为P(MAA-g-EG)凝胶中的络合/解络现象，网架的网孔大小随着有关的pH范围不同而显著不同。此外，得到了在不同pH溶液中轻度变形(小于10％)水凝胶的系数。使用这些数据，通过测定交联(不论共价还是物理性的)之间聚合物链首尾相连长度，可计算出作为pH函数的网孔大小。平均网孔大小或相关长度引人注目地受膨胀溶液pH的影响(图3)。在低pH溶液中，将出现络合，P(MAA-g-EG)水凝胶网孔大小低至70。然而，随着pH增加，物理性交联分离，聚合物链延伸导致网孔大小乘以因子3而增加至几乎210。更重要地，假定理想网架，扩散可利用面积等于网孔大小的平方。于是，无-络合水凝胶(pH大于5.2)较络合水凝胶(pH小于5.2)的扩散面积大9倍。由于络合现象的可逆性质，P(MAA-g-EG)水凝胶用于振荡性释放药物非常理想。另外，由于小的pH变化可引起网架结构大的变化，故这些材料可良好地作为肽和蛋白质的载体。尤其是，本发明P(MAA-g-EG)水凝胶可作为分子量范围为约1,000～约100,000，更优选地为约1,000～约20,000的化合物的释放载体。
在评价凝胶作为特定药物载体潜能时的重要参数是有效分子大小(水动力学直径，dh)与网孔大小的比值。为了研究这些网架的大小-排除特性，研究了两种不同分子大小的溶质，即丙羟茶碱(分子量238，dh＝4.3)和维生素B12(分子量1355，dh＝17)，从络合和无-络合水凝胶中的释放(图4)。溶液pH＝3.2时，水凝胶聚合物高度络合，药物转运显著受阻。2小时内从网架中释放的维生素B12少于10％。然而，由于分子小，在同样时间内几乎有30％的丙羟茶碱从凝胶中释放。当水凝胶与pH＝7.4的溶液接触时，由于侧酸基团的离子化，致使水凝胶链间络合分离。结果，水凝胶膨胀到很大的程度，允许维生素B12和丙羟茶碱自聚合物大量扩散。
释放数据拟合为平面系统经典Fickian表达的溶液的短时近似值并计算丙羟茶碱和维生素B12通过络合和无-络合P(MAA-g-EG)水凝胶扩散的扩散系数(表1)。由于溶质直径与网孔大小的比值增加，大分子量溶质，维生素B12，的转运较丙羟茶碱更显著地受到络合的影响。维生素B12自无-络合水凝胶的扩散系数较络合水凝胶高出两个数量级，而丙羟茶碱在无-络合水凝胶的扩散系数只高出络合水凝胶一个数量级。
表1.丙羟茶碱和维生素B12在络合和无-络合P(MAA-g-EG)水凝胶中的扩散系数。溶质 PH ξ() dh/ξ D3.12×108(cm2/s)丙羟茶碱3.2 70.8 0.060 0.403丙羟茶碱7.4194.4 0.022 9.38维生素B123.2 70.8 0.240 0.0168维生素B127.4194.4 0.087 6.75为进一步研究P(MAA-g-EG)水凝胶作为维生素、药物和气体生物活性化合物口服释放载体的能力，测定了在受激胃肠条件下各种化合物的搏动性释放。使用茶硷(MW＝180.2)、万古霉素(MW＝1485.7)和胰岛素(MW＝5733.2)进行体外释放试验。见实施例1。通过平衡分配将每个化合物负载于P(MAA-g-EG)水凝胶中，然后将负载了化合物的水凝胶浸入200ml pH＝1.2受激胃液中2小时。接着将聚合物微粒转移至pH＝6.8的磷酸缓冲液中。使用HPLC检测释入环境溶液的胰岛素浓度，并将茶碱、万古酶素和胰岛素的结果分别用图5a-5c显示。
化合物自水凝胶基质的释放在酸性溶液中降低(见图2，暴露的前2小时)。然而，观察到在pH 6.8缓冲液中化合物的快速释放。随着药物分子量增加，这种现象趋向于更为明显。例如P(MAA-g-EG)水凝胶是胰岛素(MW＝5733.2)的有效释放载体在试验的第一时段，在受激胃液(pH-1.3)中胰岛素自聚合物的释放小于10％。然而，将颗粒置入pH＝7.4缓冲液后，水凝胶快速膨胀使得胰岛素快速释放。结果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在发展口服胰岛素释放系统方面是有益的。这里使用的术语胰岛素旨在包括纯化的人和动物天然胰岛素以及它们的衍生物，如胰岛素脂蛋白(lispro)和重组形式的胰岛素，及胰岛素或胰岛素衍生物的单价或二价盐。
此外，由于作为附着促进剂的嫁接PEG链的存在，P(MAA-g-EG)水凝胶显示出强的粘膜粘附特性。而且，P(MAA-g-EG)水凝胶的粘膜粘附性强烈地依赖于环境液的pH(见图6)。凝胶和粘膜之间的粘附在刺激性肠道状态条件下(pH＝7.4)显著高于刺激胃环境状态时。然而，为了真实地比较凝胶的粘膜粘附特性，将粘附功标准化以解释聚合物凝胶部分。水凝胶的标准化粘附功在无-络合态时高出两个数量级。相应地，当它们通过胃并保持络合状态时P(MAA-g-EG)水凝胶的粘膜粘附特性会相对较低。在到达肠道后链间络合解离，因此相对于与胃粘膜的粘附性，凝胶对肠道粘膜粘附性增加。因而，口服给予脊椎动物后，胰岛素载体在胰岛素被吸收区域(即在肠道)的驻留时间大大增加。
不同pH值时水凝胶粘附性的不同是由于PEG链在每个材料中的移动性不同。在高度膨胀、无-络合状态，侧PEG链是游离的并作为粘附的锚方便地穿透粘膜。在络合状态，P(MAA-g-EG)水凝胶中的侧PEG链与主链形成络合物，并且不能与粘膜表面相互作用。
根据本发明，水凝胶组合物可用于将治疗有效量的蛋白质施予脊椎动物。方法包括将包括包含于水凝胶载体中蛋白质的组合物对脊椎动物口服给药的步骤。包含于水凝胶基质中的组合物可进一步包括本领域普通技术人员已知的蛋白酶抑制剂、可药用载体、稳定剂和生物适合性填充剂。
一优选的水凝胶载体是P(MAA-g-EG)，在一实施例中P(MAA-g-EG)水凝胶基质包含包括胰岛素的可药用组合物。而且，根据本发明的一个实施例，胰岛素组合物进一步包括蛋白酶抑制剂或吸收促进剂。包含于P(MAA-g-EG)水凝胶内的包括胰岛素的组合物已经显示出在将胰岛素释入动物血流方面具有惊人的有效性(见实施例3和4)。利用本领域技术人员已知的技术将水凝胶基质典型地制备成微粒形式并包装于适宜的口服释放载体内(即片剂、胶囊等)。
在一实施例中，释放系统由聚(甲基丙烯酸)与聚(乙二醇)的交联共聚物和所包含的胰岛素组成。在组合物通过胃的苛刻环境时，由于共聚物结构呈现pH敏感性膨胀行为而使胰岛素得以保护，所以该系统特别有效。侧PEG链也起到粘附促进剂作用而增加水凝胶载体在打算释放部位的驻留时间。如实施例2中指出的那样，水凝胶的粘膜粘附性明显地受pH的影响，由此与粘附于胃表面相比更宜于粘附于肠道表面。此外，侧PEG聚合物的存在作为肽稳定剂并帮助保持生物活性化合物如胰岛素的生物活性。
水凝胶共聚物中形成的链间络合物对环境液体的性质和pH以及共聚物组合物和嫁接链长度敏感。在胃的酸性环境，由于由羧酸质子与嫁接链上醚基团之间的氢键稳定的互聚物络合物的形成，水凝胶呈络合状态。由于孔眼小，ξ，在这些状态时具有至少1000分子量的化合物(例如胰岛素)不能方便地通过膜扩散，因而这些化合物免受胃的苛刻环境的破坏。随着颗粒通过胃并进入肠道，环境pH增加超过凝胶的转变pH。络合物立即解离，网孔迅速增大导致分子量小于100,000的化合物释放。因此，P(MAA-g-EG)水凝胶可用作分子量范围为约1,000～约100,000化合物的有效的口服释放载体。
实施例1P(MAA-g-EG)水凝胶内容物的pH依赖性释放研究了P(MAA-g-EG)水凝胶作为不同大小三种化合物的释放载体的能力茶碱(MW 180.2)、万古酶素(MW 1485.7)和胰岛素(MW5733.2)。
在37℃通过甲基丙烯酸和聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反应制备P(MAA-g-EG)水凝胶，生成的低聚物链与二甲基异丁烯酸四甘酯交联。将生成的水凝胶在去离子水中漂洗一周以除去未反应单体和未-交联的低聚物链，真空干燥并研磨成平均颗粒直径为100-150μm的粉末。
利用茶碱(MW 180.2)、万古酶素(MW 1485.7)和胰岛素(MW 5733.2)进行药物掺入实验。将每一个药物溶于pH 7.4的磷酸缓冲液中并将P(MAA-g-EG)水凝胶加入到药物溶液中，通过平衡分配负载水凝胶。然后将水凝胶基质与酸性溶液接触，从而诱导互聚络合物形成，由此降低水凝胶基质网孔的大小。接着过滤收集水凝胶微球并真空干燥。用HPLC分析检测起始溶液中残留药物量的浓度和洗脱游离水凝胶所得过滤液中药物浓度来计算掺入效率。
按照日本药典(Japanese Pharmacopoeia(JP))搅拌方法进行药物释放实验。37℃以100rpm在JP的1液(pH 1.2)、2液(pH 6.8)中用桨搅拌组合物。用1液处理2小时后，过滤收集聚合物样本并转移至pH 6.8的2液中。HPLC检测药物浓度。
实验开始后30分钟胰岛素掺入水凝胶基质的平均掺入效率达94％，因此认为该聚合物是胰岛素的适宜载体。茶碱、万古酶素和胰岛素自P(MAA-g-EG)水凝胶释放结果分别显示于图5a、5b、5c。在酸性溶液中化合物自水凝胶基质的释放降低(见暴露前2小时)。然而，在pH6.8缓冲液中观察到化合物的快速释放。随着药物分子量增加，这种趋势变得更为明显；实验的第一阶段在受激胃液(pH-1.3)中胰岛素自聚合物的释放小于10％。然而，将颗粒置入pH＝7.4缓冲液后，水凝胶迅速膨胀使得胰岛素快速释放。结果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在开发口服胰岛素释放系统中是有用的。
实施例2体外粘膜粘附研究使用溶液聚合技术将P(MAA-g-EG)水凝胶制成薄膜。在pH＝3.2和7.4的DMGA缓冲盐液将水凝胶涨大平衡。将膨胀水凝胶切成直径20cm的盘状并置入25℃和90％RH的张力测验器中。鉴于用胶粘剂将胶凝的牛颌下粘蛋白样本固定于低口，使用氰基丙烯酸酯医用胶粘剂将聚合物样本粘附于检测器的上柄。将两口拉在一起15分钟然后以1mm/min速度分开。测定分离力作为位移的函数。分离功，等于按曲线下面积计算的生物粘附功。
由于P(MAA-g-EG)水凝胶可以阻滞蛋白酶抑制剂的作用，又能附于肠道壁粘膜，使得紧密接触并由此有助于药物的吸收，故P(MAA-g-EG)水凝胶可以很好地起到胰岛素载体的作用。
当包含胰岛素的水凝胶置于肠道液中，水凝胶迅速膨胀而使胰岛素释放。包含胰岛素的P(MAA-g-EG)微粒在磷酸缓冲盐溶液中膨胀1小时，然后移至肠液中。使用EIA试剂盒检测胰岛素在肠液中的蛋白分解。在蛋白水解酶存在时，大于50％的胰岛素生物活性维持1小时以上。相反，当胰岛素溶于肠液中，生物活性迅速丧失。P(MAA-g-EG)水凝胶起到保护胰岛素的作用，这是由于水凝胶将钙结合到离子化侧基上，而这种结合反过来阻滞蛋白水解酶的作用。
此外，由于作为粘附促进剂的嫁接PEG链的存在，使得P(MAA-g-EG)水凝胶显示出粘膜粘附特性。P(MAA-g-EG)水凝胶的粘膜粘附性强烈地依赖于环境液的pH(图6)。图6曲线下面积等于凝胶和粘膜之间的粘附力。在刺激肠pH(pH＝7.4)条件下，凝胶和粘膜之间的粘附力显著增大。然而，为真实比较水凝胶的粘膜粘附性，将粘附功标准化以解释聚合物凝胶部分(见表2)。标准化的粘附功在无-络合状态水凝胶要高出络合水凝胶2个数量级。相应地，水凝胶对肠道粘膜的粘附要大大超过对胃粘膜的粘附。因此，胰岛素载体在胰岛素能够吸收部位的驻留时间大大增加。
表2.含比值1∶1MAA/EG和分子量为1000嫁接PEG链的P(MAA-g-EG)水凝胶的粘附功pH粘附功聚合物体积分率，O2，s标准化的粘附功W*106(J) W/(O2，s)2/3*106(J)3.2 5.380.693 62.17.4 9.340.049 6720水凝胶在不同pH值的不同粘附性是由于PEG链在每种材料中的移动性。在高度膨胀的无-络合状态时，嫁接PEG链是游离的并作为粘附的锚很容易穿透粘膜。在络合状态，嫁接PEG链在P(MAA-g-EG)中与主链形成络合物，因而不能穿透凝胶/粘膜界面和形成临时锚。
实施例3胰岛素大鼠给药的体内研究通过甲基丙烯酸和聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反应制备嫁接共聚物。将生成的水凝胶在去离水中漂洗7天以除去未反应单体和未-交联的低聚物链，将水凝胶真空干燥并研磨成粉末。过滤粉末得到平均颗粒直径为100-150μm的颗粒。通过平衡分配负载晶状猪胰岛素(26.9U/mg)。过滤负载了药物的颗粒并洗去表面药物及进行真空干燥。
雄性Wistar大鼠(200g)禁食24小时。仰卧位固定大鼠，给予负载了胰岛素的聚合物明胶胶囊微粒，明胶胶囊在胃中立即溶化。实验前和给药后0.25、0.5、1、2、4、6和8小时由颈静脉采集0.2ml等份血液样本进行血清葡萄糖检测。3000rpm离心3分钟分离血清并冷冻血清至分析时使用。使用EIA试剂盒通过酶联免疫分析法测定血清胰岛素水平。使用B-测试试剂盒用葡萄糖氧化酶方法测定血清葡萄糖水平。
图7概括了大鼠接受包含在P(MAA-g-EG)微粒中的胰岛素剂量后的血糖反应。接受聚合物剂型后2小时内，观察到强的低血糖效应(血糖水平降低)。血糖水平的下降强烈地取决于胰岛素剂量。在接受胰岛素溶液的大鼠未观测到反应。
给予包括包含胰岛素和蛋白酶抑制剂即抑肽酶的P(MAA-g-EG)水凝胶组合物的效果由图8表示。对照组大鼠给予的是无蛋白酶的含胰岛素水凝胶(作为比较)，一组给予50U/kg胰岛素溶液(作为对照)。接受聚合物剂型胰岛素的这两组大鼠在给药后2小时内血糖浓度大幅度下降。而那些接受胰岛素和蛋白酶抑制剂即抑肽酶联合用药的大鼠其血糖水平下降最大。抑肽酶阻滞肠道酶的降解作用并使胰岛素局部释放而保持较长时间活性。所以，在接受水凝胶胰岛素和蛋白酶抑制剂组合物(包胶囊于P(MAA-g-EG)水凝胶中)的大鼠转运进入血流的胰岛素量最高，导致血液葡萄糖浓度的较大降低。
实施例4糖尿病大鼠和犬的体内研究通过施予链佐星诱导健康雄性Wistar大鼠患糖尿病。通过施予四氧嘧啶使健康犬患糖尿病。用大量自由基、甲基丙烯酸和聚(乙二醇)二异丁烯酸酯(PEG MW＝1000)悬浮聚合反应制备P(MAA-g-EG)微球。加入作为交联剂的二异丁烯酸四甘酯。加入占单体总量0.5％的作为热反应引发剂的2，2’-偶氮二异丁腈(AIBN)。
通过将胰岛素平衡分配入P(MAA-g-EG)微粒中完成药物负载。牛胰岛素溶于200μl 1N NaOH中。用20ml磷酸缓冲液(pH＝7.4)稀释胰岛素溶液并用200μl 0.1N NaOH校准。将最初干燥的P(MAA-g-EG)在胰岛素溶液中膨胀24小时而完成负载。然后过滤颗粒并用100ml 0.1N HCL溶液洗涤从而微粒塌陷并“挤出”残留的缓冲液。真空干燥负载了药物的微球并贮于4℃。用HPLC分析初液和洗涤的过滤液中胰岛素浓度来测定负载程度。
在施予负载胰岛素的P(MAA-g-EG)水凝胶之前，雄性Wistar大鼠(250g)禁食24小时。仰卧位固定大鼠，使用明胶胶囊和EudragitL100制备的胶囊将负载了胰岛素的P(MAA-g-EG)微粒和对照溶液灌胃。明胶胶囊在胃中迅速溶化，而Eudragit胶囊以显著慢的速度溶解。
试验期间，大鼠分笼(每笼4只动物)并可进水。给药后0.25、0.5、1、2、4、6和8小时由颈静脉采集0.2ml等份血液样本。3000rpm离心3分钟分离血清。使用葡萄糖B-测试试剂盒用葡萄糖氧化酶方法测定血清葡萄糖水平。
糖尿病犬(25kg)在服用制剂之前禁食24小时。使用明胶胶囊的聚合物剂型口服投药。在投药时喂食犬。
试验期间，将犬关进笼内并允许进水。自留置导管采集血液样本。使用便携式葡萄糖分析仪测定血清葡萄糖水平。
虽然许多系统能够有效地降低口服含胰岛素聚合物载体后的健康动物的血糖水平，但在糖尿病动物未观察到类似的结果。糖尿病和健康大鼠在口服含胰岛素P(MAA-g-EG)明胶胶囊微粒(剂量25IU/kg)后的血糖反应由图9表示。糖尿病大鼠的血液葡萄糖水平下降至起始水平的40％。血糖水平下降持续超过8小时，而事实上糖尿病动物的血糖水平下降程度大于健康动物。此外，在糖尿病动物观察到低血糖效应的持续时间更长。
糖尿病大鼠口服负载胰岛素的P(MAA-g-EG)Eudragit胶囊微粒(剂量25IU/kg)后的血糖反应见图10。单次给药后接受这些剂量的大鼠的葡萄糖水平下降超过50％至少8小时。用Eudragit包胶囊的微粒较明胶胶囊更为有效，大概是由于包在Eudragit胶囊中的微粒因Eudragit胶囊的缓慢溶解而暴露于上GI道恶劣环境的时间短的缘故。
健康犬在口服单聚合物剂型(10IU/kg)后血糖显著下降。0时，喂食犬，机体的正常反应维持在基础水平。喂食后，血糖水平升高，然而，由于胰岛素在小肠上段的摄取，给药后2时内血糖水平下降超过20％。此外，与前面在大鼠观察到的一致，8小时点附近，出现第二次下降反应，可能由于胰岛素的结肠吸收。还有，8小时后血糖水平稳定下降，可能由于胰岛素的结肠吸收所致。
糖尿病犬的葡萄糖反应也证实了口服后的胰岛素摄取。糖尿病犬的血糖水平由口服的含胰岛素的P(MAA-g-EG)明胶胶囊微粒(剂量10IU/kg)控制。喂食并给予聚合物剂型，最初犬的葡萄糖水平迅速升高。然而，由于胰岛素的吸收，1小时后葡萄糖水平在接下来的3个小时内保持稳定。接受聚合物剂型的糖尿病犬其血糖水平较未接受胰岛素的犬低40％。
口服胰岛素释放系统必须能够保护药物免受胃的恶劣环境的破坏并使胰岛素在长时段内以生物活性构象形式存在以便沿GI道到达吸收的更适宜区域如小肠上段。由于其性质，络合P(MAA-g-EG)水凝胶是此应用的理想载体。
P(MAA-g-EG)水凝胶经口服途径能够有效释放生物活性胰岛素。这些材料已经显示出降低糖尿病大鼠和犬的血糖水平并维持血糖在正常水平附近超过8小时。这些材料功能良好，由于胰岛素包含在水凝胶中不被释放直至材料到达小肠上段。在小肠中，水凝胶强烈地粘附于粘膜使得载体和吸收位点密切接触。此外，聚合物起到阻滞肠道蛋白水解酶活性的作用使得胰岛素在吸收前长时间保持活性状态。据信聚合物对酶功能的抑制作用衍生自聚合物与酶功能所必需的阳离子，如钙，形成络合物的能力。
权利要求
1.一种口服给药的药学组合物，所述组合物包括可膨胀水凝胶基质和包含在此基质中的不稳定蛋白质，所述水凝胶基质包括甲基丙烯酸和聚(二醇)单甲基丙烯酸酯的交联共聚物。
2.权利要求1所述组合物，其中聚(二醇)单甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯。
3.权利要求1所述组合物，其中水凝胶基质是与二甲基丙烯酸四甘酯交联。
4.权利要求2所述组合物，其中甲基丙烯酸和聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯的分子比是约1∶1。
5.权利要求4所述组合物，其中蛋白质分子量为约1,000～约20,000。
6.权利要求4所述组合物，其中蛋白质是胰岛素。
7.权利要求4所述组合物，其中聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯的分子量为约200～约4000。
8.权利要求4所述组合物，其中水凝胶是颗粒形并包于胶囊内。
9.权利要求8所述组合物，其中胶囊是明胶胶囊。
10.权利要求4所述的组合物，进一步包括蛋白酶抑制剂。
11.施予脊椎动物的胰岛素口服释放组合物，所述组合物包括包含于P(MAA-g-EG)水凝胶中的胰岛素。
12.权利要求1 1所述的组合物，进一步包括蛋白酶抑制剂。
13.权利要求11所述组合物，其中水凝胶是颗粒形并包于胶囊内。
14.权利要求13所述组合物，其中胶囊是明胶胶囊。
15.将治疗有效量的蛋白质施予脊椎动物的给药方法，所述方法包括将权利要求1所述组合物口服给药施予所述脊椎动物的步骤。
16.制备权利要求1所述组合物的方法，包括以下步骤甲基丙烯酸和聚(二醇)二甲基丙烯酸酯和交联剂的聚合形成水凝胶基质；所述水凝胶基质与蛋白质的水溶液接触，其中溶液的pH值大于约5.4；和调整溶液的pH至小于约5.4；并分离含蛋白质的水凝胶基质。
17.权利要求16所述方法，其中聚(二醇)单甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)单甲基丙烯酸酯。
全文摘要
描述了对脊椎动物口服给药的生物活性组分的组合物和方法。该方法包括将组合物口服给药施予脊椎动物的步骤,所述组合物包括可膨胀水凝胶基质和包含在水凝胶基质中的生物活性组分。
文档编号A61K38/28GK1259045SQ98805351
公开日2000年7月5日 申请日期1998年4月2日 优先权日1997年4月2日
发明者N·A·佩帕斯, A·M·洛曼, T·纳盖, M·莫里施塔 申请人:普渡研究基金会