专利名称：选择性调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的短肽的制作方法
相关申请本申请是1997年5月21日提交的美国专利序列号No.08/861,338的部分继续申请，其全部内容通过在此引述而合并于本文。
本发明的技术背景丝氨酸/苏氨酸激酶是真核蛋白质激酶大家族中的成员。这一类的酶特异磷酸化细胞内蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基，对于调节多细胞有机体中的信号传导是很重要的。许多丝氨酸/苏氨酸激酶是以细胞内蛋白质存在的，参与细胞内的信号传导，包括向核子的信号传导和激活其他蛋白质的信号传导。在细胞膜内发现了其他的丝氨酸/苏氨酸激酶，如G蛋白质-偶联受体激酶，它们参与跨膜信号传导。
这样，丝氨酸/苏氨酸激酶对丝氨酸或苏氨酸的磷酸化作用，对于随环境变化而调节细胞内事件方面是一项重要的机理。许多细胞事件是由丝氨酸/苏氨酸激酶调节的。一些实例包括细胞进入和完成有丝分裂的能力，细胞繁殖，细胞分化，脂肪新陈代谢的控制，免疫反应，炎症反应，及肝糖新陈代谢的控制。
这样，可以调节(增加或降低)丝氨酸/苏氨酸激酶活性的药剂对于治疗多种疾病和状况如，癌症，肥胖，自动免疫病变，炎症和II型糖尿病，有很大的潜力。
本发明的概述目前已发现从丝氨酸/苏氨酸激酶的HJ环衍生的短肽，可显著地影响表达丝氨酸/苏氨酸激酶细胞的活性(“HJ环”本文下面定义)。如，Raf和Polo的HJ环的肽衍生物，浓度为10μm(实例2)时就可阻止体外牛动脉细胞的繁殖和转换鼠细胞组MS1和/或SVR细胞。依据前面提及的发现，本文公开的新的肽是从丝氨酸/苏氨酸激酶的HJ环衍生的肽。同时公开的还有确定从丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环衍生的调节所说的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的肽的方法。在受试者中调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法也公开了。
本发明的一个具体实施是一种新的肽，是一种从丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环衍生的肽。这种肽包括约五个到约二十个之间的氨基酸残基或氨基酸残基类似物，调节丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。肽的N-端和/或C-端可以是取代或未取代的。肽可以是线性的或环状的。
本发明的另一个具体实施是在对象中调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法。该方法包括服用治疗上有效量的肽，这种肽是一种丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环的衍生物，如上所述。
本发明的另一个具体实施是确定调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的肽的方法。该方法包括提供一种“测试肽”，其含有约五个到二十个氨基酸或氨基酸类似物，是一种从所说的丝氨酸/苏氨酸激酶衍生的肽。在所说的丝氨酸/苏氨酸激酶的控制下，在适合测定丝氨酸/苏氨酸激酶活性的条件下，将测试肽与有细胞活性或功能的细胞一起温育。测定丝氨酸/苏氨酸激酶活性，并与在相同条件但没有测试肽存在的情况下生长的相同细胞类型的细胞比较。与在没有测试肽存在的情况下生长的细胞比较大些或小些的活性表明测试肽调节丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。
本发明的肽可用在治疗多种由丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)活性过度及活性不足引起的疾病。实例包括但不限于，癌症，糖尿病，肥胖，中枢神经系统的疾病，炎症病变，自动免疫及心血管疾病。本发明的肽也可在体外应用，例如，产生与肽的衍生丝氨酸/苏氨酸激酶特异结合的抗体。这些抗体可用来确定表达丝氨酸/苏氨酸激酶的细胞，研究丝氨酸/苏氨酸激酶的细胞内分布。此外，本发明的肽可用来确定和定量与衍生出肽的丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环结合的配体。
附图简要说明
图1是在丝氨酸/苏氨酸激酶家族中发现的HJ环的从氨基酸1到氨基酸10的共有序列。
图2是环状AMP依赖蛋白质激酶和蛋白质激酶C的HJ环的从氨基酸1到氨基酸20的共有序列。
图3的表给出了丝氨酸/苏氨酸激酶RAF(SEQ ID NO.1)，环状AMP依赖蛋白质激酶(CAPK)(SEQ ID NO.2)，蛋白质激酶C(PKC)(SEQ ID NO.3)，G-受体偶联蛋白质激酶β-2肾上腺素受体激酶1和2(bARK1.2)(SEQ ID NO.4)，调钙素依赖激酶(CaMK)(SEQ ID NO.5)，Polo激酶(SEQ ID NO.6)，Akt/PKB(SEQ ID NO.7)和G-蛋白质偶联受体激酶GRK1(SEQ ID NO.8)，GRK4(SEQ ID NO.9)，GRK5(SEQ ID NO.10)，GRK6(SEQ ID NO.11)和GSK3(SEQ ID NO.12)的HJ环的氨基酸序列。也演示了在这些氨基酸序列中的保守取代的实例。“*”表示谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯。
图4的表给出了肽HJ-38(SEQ ID NO.13)，J-41(SEQID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.1 6)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)的序列。所有肽是N-乙酰化的和C-酰胺化的。“E！”表示谷氨酸的苄基酯。
图5以图的形式表示了在增加K048H101(SEQ ID NO.24)浓度(μm)的情况下，与对照物相比，对胚胎肺纤维原细胞中胶原质产出的抑制百分比。K048H101是丝氨酸/苏氨酸激酶ALK1的HJ环的肽衍生物。
图6以表的形式给出了本发明的示例肽衍生物的序列，和从其HJ环衍生出示例肽的丝氨酸/苏氨酸激酶。所示肽衍生物有K095H101(SEQ ID NO.23)；K048H101(SEQ ID NO.24)；K098H101(SEQ ID NO.25)；K099H101(SEQ ID NO.26)；K093H101(SEQ ID NO.27)；K014H101(SEQ ID NO.28)；K004H001(SEQ ID NO.29)；K004H002(SEQ ID NO.30)；K049H101(SEQ ID NO.31)；K050H101(SEQ ID NO.32)；K088H001(SEQ ID NO.33)；K088H101(SEQ ID NO.34)；K088H103(SEQ ID NO.35)；K088H104(SEQ ID NO.36)；K092H001(SEQ ID NO.37)；K018H101(SEQ ID NO.38)；K087H001(SEQ ID NO.39)；K087H101(SEQ ID NO.40)；K087H102(SEQ ID NO.41)；K087H103(SEQ ID NO.42)；K090H101(SEQ ID NO.43)；K091H001(SEQ ID NO.44)；K091H1O1(SEQ ID NO.45)；K107H001(SEQ ID NO.46)；K107H101(SEQ ID NO.47)；K107H101(SEQ ID NO.47)；K107H102(SEQ ID NO.48)；K045H101(SEQ ID NO.49)；K045H102(SEQ ID NO.50)；K008H001(SEQ ID NO.51)；K008H101(SEQ ID NO.52)；K008H102(SEQ ID NO.53)；K008H103(SEQ ID NO.54)；K035H001(SEQ ID NO.55)；K035H101(SEQ ID NO.56)；K038H101(SEQ ID NO.57)；K038H102(SEQ ID NO.58)；K003H101(SEQ ID NO.59)；K003H104(SEQ ID NO.60)；K001H102(SEQ ID NO.61)；K001H103(SEQ ID NO.62)。
本发明的详细叙述丝氨酸/苏氨酸激酶(本文后面称“STK”)是一种细胞内或膜结合蛋白质，它使用ATP或GTP的γ-磷酸盐，在丝氨酸或苏氨酸残基的羟基基团上生成磷酸单酯。STK含有同源的实施磷酸化作用的“激酶域”或“催化域”。根据对大量蛋白质激酶的比较，目前已了解蛋白质激酶的激酶域，包括STK，可被分成十二个亚域，这些区域通常不被大型氨基酸插入打断，并且含有保守残基的特性模式(参见Hanks和Hunter所著“真核蛋白质激酶家族”蛋白质激酶实事手册，卷I，学院出版社，第二章1995[Hanks and Hunter，“The Eukaryotic Protein KinaseSuperfamily”，in Hardie and Hanks(ed.)，The Protein Kinase FactsBook，Volume I，Academic Press，Chapter 2，1995)]。这些亚域指亚域I到亚域XII。
本文所指的“HJ环”是在STK的激酶域内，亚域IX中间和亚域X中间之间的区域发现的。因为在不同的蛋白质激酶的亚域中发现高度的同源性，包括STK，所以不同STK的域的氨基酸序列可以对比。这样，STK的HJ环可通过参考标准型蛋白质激酶的氨基酸序列确定，如PKA-Cα，可以说是与在PKA-Cα的约氨基酸229-248之间发现的约二十个氨基酸残基的邻接序列相对应。
对STK的HJ环的第二个定义，是对在前面段落中提供的定义的补充，可通过参考STK的激酶域的三维结构得出。STK的激酶域已发现含有至少九个α-螺旋，称为螺旋A到螺旋I[Tabor 等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B340315(1993)，Mohammadi等人，<细胞>Cell 86577(1996)；Hubbard等人，《自然》372746(1994)]。HJ环是约二十个氨基酸的邻接序列，开始于F螺旋内从F螺旋N-端的约五个氨基酸残基，延伸约五个氨基酸残基到G螺旋中。
此外，本发明的肽的C-端或N-端，或它们两者，可分别地被羧酸保护基或胺保护基取代或不取代。适合的保护基的描述可见于在Green和Wuts的著作“有机合成中的保护基”[Green andWuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley和Sons，第5和第7章，1991]，其内容通过在此引述而全部合并于本文。较好的保护基是那些了促使肽运送入细胞的基团，如，通过减小肽的亲水性并增加亲油性的基团。N-端保护基的实例包括酰基基团(-CO-R1)和烷氧基羰基或芳氧基羰基(-CO-O-R1)，其中R1是脂族、取代的脂族、苄基、取代的苄基、芳族或取代的芳族的基团。酰基基团的具体实例包括乙酰基，(乙基)-CO-，n-丙基-CO-，异-丙基-CO-，n-丁基-CO-，仲-丁基-CO-，叔-丁基-CO-，苯基-CO-，取代的苯基-CO-，苄基-CO-，(取代的苄基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基的实例包括CH3-O-CO-，(乙基)-O-CO-，n-丙基-O-CO-，异-丙基-O-CO-，n-丁基-O-CO-，仲-丁基-O-CO-，叔-丁基-O-CO-，苯基-O-CO-，取代的苯基-O-CO-，苄基-O-CO-，(取代的苄基)-O-CO-。在C-端的羰基基团可被保护起来，为酰胺(如，在C-端的羟基基团被-NH2-，-NHR2和-NR2R3取代)或酯(在C-端的羟基基团被-OR2取代)。R2和R3分别是脂族、取代的脂族、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基的基团。此外，与氮原子一起，R2和R3可形成带有约0-2个杂原子如氮、氧或硫的C4到C8的杂环。适合的杂环实例包括哌啶烷基，吡咯烷基，吗啉代，硫吗啉代，哌嗪烷基。C-端保护基实例包括-NH2，-NHCH3，-NH(CH3)2，-N(乙基)，-N(乙基)2，-N(甲基)(乙基)，-NH(苄基)，-N(C1-C4烷基)(苄基)，-NH(苯基)，-N(C1-C4烷基)(苯基)，-OCH3，-O-(乙基)，-O-(n-丙基)，-O-(n-丁基)，-O-(异-丙基)，-O-(仲-丁基)，-O-(叔-丁基)，-O-苄基，-O-苯基。
“HJ环的肽衍生物”包括含有HJ环的氨基酸序列的肽。“HJ环的肽衍生物”还包括如，STK的HJ环的亚序列。亚序列是在较大序列内发现的从约五个到约二十个氨基酸或氨基酸残基的邻接序列。这样，HJ环的亚序列是在HJ环内发现的从约五个到二十个氨基酸或氨基酸残基的邻接序列。HJ环的亚序列也可指HJ环的“片段”。
“肽衍生物”也包括含有“改性序列”的肽，其中在原始序列或亚序列中的一个或多个氨基酸已被自然产生的氨基酸或氨基酸类似物取代(也称“改性氨基酸”)。在本发明的一个方面，肽衍生物含有与STK的HJ环的亚序列相对应的序列，附带条件是在肽衍生物中的任何一个氨基酸残基可与亚序列中的相对应的氨基酸残基不同。例如，如果亚序列是[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，那么肽衍生物可以是[AA1’]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2’]-[AA3]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3’]-[AA4]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4’]-[AA5]-，[AA1]-[AA2]-[AA3]-[AA4]-[AA5’]-，其中[AA’]是自然产生的或改性的与[AA]不同的氨基酸。在本发明的另一方面，肽衍生物含有与STK的HJ环的亚序列相对应的序列，附带条件是在肽衍生物中任何两个氨基酸残基可与亚序列中相对应的氨基酸残基不同。
“氨基酸残基”是在肽内发现的组成，由-NH-CHR-CO-表示，其中R是自然产生氨基酸的侧链。当指在肽内发现的组成时，在本申请中“氨基酸残基”和“氨基酸”可互换使用。“氨基酸残基类似物”包括含有下列式子的D或L残基-NH-CHR-CO-，其中R是脂族基团，取代的脂族基团，苄基基团，取代的苄基基团，芳族基团或取代的芳族基团，其中R不与自然产生氨基酸的侧链相对应。当在肽内发现的组成时，在本申请中“氨基酸残基类似物”和“氨基酸类似物”可互换使用。
如本文所用的，脂族基团包括直链的、支链的或环状的C1-C8完全饱和的烃，含有一个或两个杂原子如氮、氧或硫和/或含有一个或多个不饱和单元。芳族基团包括，碳环芳族基团如苯基和萘基，以及杂环芳组基团如咪唑基，吲哚基，噻嗯基，呋喃基，吡啶基，吡喃基，呃唑基，苯噻嗯基，苯呋喃基，喹啉基，异喹啉基，吖啶基。
脂族基团、芳族基团或苄基基团上适合的取代基包括-OH，卤代基(-Br，-Cl，-I和-F)，-O(脂族基团、取代的脂族基团、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基)，-CN，-NO2，-COOH，-NH2，-NH(脂族基团、取代的脂族基团、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基)，-N(脂族基团、取代的脂族基团、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基)2，-COO(脂族基团、取代的脂族基团、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基)，-CONH2，-CONH(脂族基团、取代的脂族基因、苄基、取代的苄基、酰基或取代的酰基)，-SH，-S(脂族基团、取代的脂族基团、苄基、取代的苄基、芳族基团或取代的芳族基团)和-NH-C(＝NH)-NH2。取代的苄基或芳族基团也可含有脂族基团或取代的脂族基团作为取代基。取代的脂族基团也可含有苄基，取代的苄基，酰基或取代的酰基作为取代基。取代的脂族基团，取代的芳族基团或取代的苄基可含有一个或多个取代基。
在HJ环的序列或HJ环亚序列中的氨基酸残基的适合的取代基包括，产生调节STK活性的肽衍生物的保守取代基。“保守取代基”是指取代基中取代氨基酸(自然产生或改性的)含有与被取代的氨基酸大约相同的尺寸和电子属性。这样，取代氨基酸在侧链上就会有与原始氨基酸相同或相似的官能团。
“保守取代基”也指使用与被取代的氨基酸相同的取代氨基酸，只是在其侧链中的官能团已经被用适当的保护基功能化了。适当的保护基在Green和Wuts的论著“有机合成中的保护基”[Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley和Sons，第5和7章，1991]中公开了，其内容通过在此引述而合并于本文。对于N-端和C-段保护基而言，较好的保护基是那些促使肽运送到细胞内的基团，如，通过减小肽的亲水性及增加肽的亲油性，在细胞内通过水解或酶解可在体内裂开的基团[参见Ditter等人，《药物化学科学》[J.Pharm，Sci.57783(1968)]；Ditter等人，《药物化学科学)》[J.Pharm，Sci.57828(1968)]；Ditter等人，《药物化学科学》[J.Pharm，Sci.57557(1968)]；King等人，《(生物化学》[Biochemistry 262294(1987)]；Lindberg等人，《药物新陈代谢及生理处置》[Drug Metabolism andDisposition 17311(1989)]；以及Tunek等人，《生化药物化学》[Biochem.Pharm.373867(1988)]；Alderson等人，《生物化学生物物理学》[Arch.Biochem.Biophys.239538(1985)]，以及Singhal等人的论著[FASEB J.1220(1987)]。羟基保护基包括酯、碳酸盐和氨基甲酸盐的保护基。胺保护基包括烷氧基和芳氧基，如上所述的N-端保护基。羧酸保护基包括脂族、苄基和酰基酯的酯，如上所述的C-端保护基。在一个具体实施中，在本发明的肽中，一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链上的羧酸基团被保护起来，较好的是用如甲基、乙基、苄基或取代的苄基酯，更好的是用苄基酯保护起来。
下面提供的自然产生和改性的氨基酸组，组中的每一种氨基酸具有相似的电子和空间属性。这样，保守取代基可用同组的另一种氨基酸来取代该氨基酸而制成。应该理解的是，这些组是没有限制的，即每个组中都可以添加有其他改性氨基酸。
组I包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸和含有下列侧链的改性氨基酸乙基，n-丁基，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH3和-CH2SCH3。较好地，组I包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，蛋氨酸。
组II包括甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，苏氨酸和含有乙基侧链的改性氨基酸。较好地，组II包括甘氨酸，丙氨酸。
组III包括苯基丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸，色氨酸，环己基甲基，和含有取代的苄基或苯基侧链的改性氨基酸残基。较好的取代基包括下列中的一个或多个卤代基，甲基，乙基，硝基，甲氧基，乙氧基和-CN。较好地，组III包括苯基丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。
组IV包括谷氨酸，天冬氨基酸，谷氨酸或天冬氨酸取代或未取代的脂族，芳组或苄基酯(如甲基，乙基，n-丙基，异-丙基，环己基，苄基或取代的苄基)，谷氨酰胺，天冬酰胺，CO-NH-烷基化谷氨酰胺或天冬酰胺(如甲基，乙基，n-丙基，异-丙基)和含有侧链-(CH2)3-COOH的改性氨基酸，它的酯(取代或未取代所脂族，芳族或苄基酯)，它的酰胺，和它的取代或未取代的N-烷基化酰胺。较好地，组IV包括谷氨酸，天冬氨酸，甲基天冬氨酸，乙基天冬氨酸，苄基天冬氨酸，甲基谷氨酸，乙基谷氨酸，和苄基谷氨酸。
组V包括组氨酸，赖氨酸，精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，赖氨酸同系物，精氨酸同系物，鸟氨酸同系物。较好地，组V包括组氨酸，赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸。氨基酸的同系物包括在侧链上从1到约3个其他亚甲基单元。
组VI包括丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸和含有由-OH或-SH取代的C1-C5直链或支链烷基侧链的改性氨基酸。较好地，组VI包括丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸。
在另一方面，在HJ环序列或HJ环亚序列中的氨基酸残基的适合的取代基还包括“重度”取代基，其产生调节STK活性的肽衍生物。产生调节STK活性的肽衍生物的重度取代基，与高度保守的位置相比，更可能处于整个丝氨酸/苏氨酸激酶家族中不是高度保守性的位置上。图1显示了STK的HJ环的前十个氨基酸的共有序列。图2显示了环状AMP相关激酶和蛋白质激酶C的HJ环的约二十个氨基酸的共有序列。在STK家族中的高度保守位置，和在那些位置上通常可发现的保守氨基酸已作指示。在STK家族中不是高度保守的位置用“X”标出。因为D-氨基酸在与甘氨酸氢侧链相同的位置上有一个氢，所以D-氨基酸和其类似物可在图1的位置6，或在图2位置6和12上替代甘氨酸。
“重度取代基”其中取代氨基酸(自然产生或改性的)与被取代的氨基酸相比，尺寸和/或电子属性显著不同。这样，取代氨基酸的侧链可以比被取代的氨基酸的侧链显著地大(或小)，和/或可以含有与被取代的氨基酸电子属性显著不同的官能团。这种类型的重度取代基实例包括取代丙氨酸的苯基丙氨酸或环己基甲基甘氨酸，取代甘氨酸的异亮氨酸，取代相应L氨基酸的D氨基酸，或取代天冬氨酸的-NH-CH((-CH2)3-COOH)-CO-。另外，官能团也可加在侧链上，从侧链上删除或与其他官能团交换。这种类型的重度取代基的实例包括，在缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸的脂族侧链上加上胺或羟基，羧酸，在天冬氨酸或谷氨酸的侧链上用胺替换羧酸，或在赖氨酸或鸟氨酸的侧链上删除胺。在另一个可选择的方式中，取代氨基酸的侧链可以具有与被取代的氨基酸的官能团显著不同的空间和电子属性。这样的改性包括色氨酸取代甘氨酸，赖氨酸取代天冬氨酸，和-CH(-CH2)4-COOH取代丝氨酸的侧链。这些实例不意味有限制性。
其活性可被肽及肽衍生物调节的STK的实例，如本文所述，包括但不限于，属于下列STK家族的STKPolo家族[Glover等人，<细胞生物学>J.Cell Biol.，1351681(1996)]，Raf，分裂素活性蛋白质激酶(MAP激酶)，Akt/PKB[Frank等人，(细胞)Cell 88435(1997)和Hemmings等人，《科学》275628(1997)]和G蛋白质偶联受体激酶。其他适合的STK包括环状AMP(cAMP)相关蛋白质激酶，蛋白质激酶C，调钙素相关激酶，肝糖合成酶激酶-3(GSK3)和环状GMP(cGMP)相关蛋白质激酶。
适合的Polo家族组成包括但不限于，Plk，Snk和SaK。适合的Raf家族组成包括但不限于，Raf-1，A-Raf，B-Raf。适合的G蛋白质相关激酶包括但不限于，β-肾上腺素受体激酶1和2，视网膜紫质激酶(GRK1)，GRK4，GRK5，GRK6。适合的MAP激酶包括但不限于，MAPK，MAPKK，和MAPKKK。还包括蛋白质激酶C异形，其包括但不限于，异形为α，βI/Hγ，δ，ε，η(L)，θ，μ，ξ，ι和λ。
本发明包括含有与在STK的HJ环中发现的序列，其亚序列和其改性亚序列相对应的氨基酸序列的肽。适合的亚序列包括但不限于，与STK的JH环的[AA]1到[AA]20，[AA]3到[AA]10，[AA]7到[AA]14，[AA]11到[AA]18，[AA]3到[AA]14，[AA]7到[AA]18，和[AA]3到[AA]18和其亚序列相对应的序列。图3显示了下列STK的HJ环的序列RAF，环状AMP相关激酶，蛋白质激酶C，G-蛋白质偶联受体激酶βARK1和2和GRK1，GRK4，GRK5，和GRK6，调钙素相关激酶，Polo，Akt/PKB和GSK3。
图3也提供了环中氨基酸序列的号码图表。HJ环N-端的氨基酸在位置1上，可称为“[AA]1。序列中的下一个氨基酸称为“[AA]2，在位置2上，接着氨基酸[AA]3到[AA]20，在位置3-20上。这样，带有氨基酸序列[AA]1到[AA]20的肽20-mer包括在HJ环中的二十个氨基酸。带有氨基酸序列[AA]3到[AA]10的HJ环的肽衍生物，如在前面段落中所述的，在所说的HJ环中包括第三个氨基酸到第十个氨基酸。
本发明还包括含有与STK的HJ环的改性序列或亚序列相对应的氨基酸序列的肽，调节包括RAF，环状AMP相关激酶，蛋白质激酶C，G-蛋白质偶联受体激酶βARK1，βARK2，GRK1和GRK4-6，调钙素相关激酶和Polo的STKs的活性。一方面，序列或亚序列中的一个、两个或多个氨基酸用保守取代基改性；取代基可在共有位置上，也可在非共有位置上，或在两种位置上都有。另一方面，序列或亚序列中的一个、两个或多个氨基酸用重度取代基改性；取代基较好的是在非共有位置上。取代基还包括带有D-氨基酸残基或其类似物的保守甘氨酸残基(如图1中的位置6或图2中的位置6和12)。图3还提供了RAF，环状AMP相关激酶，蛋白质激酶C，G-蛋白质偶联受体激酶βARK1，βARK2，GRK1和GRK4-6，调钙素相关激酶和Polo，Akt/PKB，GSK3的HJ环的保守氨基酸取代基实例。
本发明肽衍生物的具体实例包括肽HJ-38(SEQ ID NO.13)，HJ-41(SEQ ID NO.14)，HJ-42(SEQ ID NO.15)，HJ-43(SEQ ID NO.16)，HJ-43.1(SEQ ID NO.17)，HJ-45(SEQ ID NO.18)，HJ-46(SEQ ID NO.19)，HJ-47(SEQ IDNO.20)，HJ-48(SEQ ID NO.21)，HJ-29(SEQ ID NO.22)，肽的序列在图4中给出。如上所述这些肽的N-端和/或C-端可被改性。如图4中所示，这些肽的N-端被乙酰化了，C-端被酰胺化了。如上所述，酰胺和羧酸的其他保护基也可使用。此外，可去掉或不去掉一个或两个保护基。肽可以是线性的或环状的。
还包括含有HJ-38(SEQ ID NO.13)，HJ-41(SEQ ID NO.14)，HJ-42(SEQ ID NO.15)，HJ-43(SEQ ID NO.16)，HJ-43.1(SEQ ID NO.17)，HJ-45(SEQ ID NO.18)，HJ-46(SEQ ID NO.19)，HJ-47(SEQ ID NO.20)，HJ-48(SEQ IDNO.21)，和HJ-29(SEQ ID NO.22)序列的肽，附带条件是在肽中的任何一个氨基残基可以变化，为任何自然产生氨基酸或其类似物。本发明也包括含有，附带条件是在肽中的任何两个氨基残基可以变化，为任何自然产生氨基酸或其类似物的序列的肽。
本发明还包括调节SRK活性的环状肽，其含有与STK的HJ环的改性序列或亚序列相对应的氨基酸序列。
“环状肽”指，如在肽或肽衍生物内通过N-端的氮原子和C-端的羰基碳的肽键形成环。
“环化”也是指，通过化合物的N-端的氮和肽中的适当氨基酸的侧链之间的共价键形成环，较好地是C-端的氨基酸。如，可在N-端的氮原子和天冬氨酸或谷氨酸的侧链的羰基碳之间形成酰胺。另外，肽或肽衍生物可通过在化合物C-端羰基和肽中适当氨基酸的侧链之间形成共价键进行环化，较好地是N-端氨基酸。如，在C-端羰基碳和赖氨酸或鸟氨酸的侧链上的氨基氮原子之间形成酰胺；在C-端羰基碳和丝氨酸或苏氨酸的侧链上的羟基氧原子之间形成酯。
“环化”也指，通过肽中适当的两个氨基酸的侧链之间的共价键形成环，较好地是终端氨基酸。如，在两个半胱氨酸的侧链上的硫原子之间可形成二硫化物。或者，可在如谷氨酸或天冬氨酸的侧链上的羰基碳，和如丝氨酸或苏氨酸侧链上的氧原子之间形成酯。在如谷氨酸或天冬氨酸的侧链上的羰基碳，和如赖氨酸或鸟氨酸的侧链上的氨基氮之间形成酰胺。
此外，肽和肽衍生物可通过在两个端点之间，在一个端点和肽或肽衍生物中氨基酸侧链之间，或在肽或肽衍生物中两个氨基酸的侧链之间的连接基团进行环化。适当的连接基团在Lobl等人，WO92/00995和Chiang等人，WO94/15958中公开，其内容通过在此引述而合并于本文。
在原始氨基酸序列或亚序列中适当的取代基是那些，如上所述可产生调节STK活性的肽衍生物的取代基。当STK的活性增加了或降低了，STK的活性是“被调节了”。STK活性的增加或降低可通过测定测试STK的蛋白质底物的磷酸化的程度来测定，或通过受STK控制的细胞活性或功能的相应调节，增加或降低来测定。这些细胞功能的实例包括细胞繁殖，细胞分化，细胞形态，细胞存活或凋亡，细胞对外界刺激的反应，基因表达，油脂新陈代谢，肝糖新陈代谢和有丝分裂。
通过提供一种或多种细胞活性受STK控制的细胞，可容易地确定肽或肽衍生物对STK活性的调节。在适合测试丝氨酸/苏氨酸激酶活性的条件下，用肽或肽衍生物温育细胞制备测试混合物。测定STK活性并与适当的对照物相比，如与在相同的条件下，没有肽或肽衍生物存在下温育的相同的细胞活性相比。与对照物相比，在测试混合物中STK活性的大些或小些，表示测试肽或肽衍生物调节了所说的STK活性。
适用测试的细胞包括表达膜结合或细胞内STK的正常细胞，已被遗传设计以表达STK的细胞，表达STK的恶性细胞或表达STK的不死细胞。
测定STK活性的适当条件包括适合测试受STK控制的细胞活性或功能的条件。通常，当细胞暴露在适合细胞生长的条件下时，包括适合的温度(如在约30℃到42℃之间)和介质中适当浓度的营养物的(如氨基酸，维生素，生长因子)存在，可测定细胞的活性。
另一方面，通过在剥夺血清的情况下生长细胞，可估定某些STK活性[如，Atk/PKB，Dudek等人，《科学)》275661(1997)]。细胞通常在存在血清的培养物中生长，如牛血清，马血清或牛胎血清。许多细胞，如神经细胞如PC-12细胞，在血清不充分时通常不能存活。使用不充分血清培养细胞即是指“剥夺血清的情况”，包括如含约0％到4％的血清。通过肽或肽衍生物在血清剥夺的状况中对细胞如神经元细胞的保护程度确定STK的活性。具体条件在Dudek等人，及与本申请一起提交的题目为“选择调节细胞内信号发出的短肽”的共同待审理申请(1997年5月21日提交，律师案卷号No.CMCC-547)中的实例4提供了，其内容通过在此引述而合并于本文。
一般，通过定量测定STK控制的细胞活性，来测定测试混合物中STK的活性。细胞活性可以是如，细胞扩增。由STK控制的扩增细胞的实例包括内皮细胞如牛动脉细胞，鼠MSI细胞或鼠SVR细胞[参阅Arbiser等人，1997年，《美国国家科学研究学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94861(1997))]，血管平滑肌细胞，和多种组织的恶性细胞如乳腺癌，肺癌，结肠癌，前列腺癌，恶性黑素瘤。通过测量细胞扩增测定STK活性，如通过比较初始细胞存在的数目和给定的一段时间后的细胞存在数目。涉及细胞扩增的STK是polo家族，Taf或Atk/PKB中的成员。如果使用的细胞其中STK控制细胞的分化[如前成脂肪细胞如3T3-L1表达STKs Akt/PKB，GSK3和蛋白质激酶-参阅Kohn等人，《生物化学杂志)》，1996年(J.Biol.Chem.27131372(1996))]，那么通过测量分化程度可测定活性。通过细胞如初生脂肪细胞，肝细胞和纤维原细胞的代谢作用活性变化，或通过测量葡萄糖的吸收，脂肪生成，或肝糖的新陈代谢[参阅，如Weise等人，《生物化学杂志》，1995年(J.Biol.Chem.2703442(1995))]可测定活性。活性也可通过基因表达、细胞形态或细胞显型的改变程度来测定。细胞形态改变的一个实例在与本申请一起提交的题目为“选择调节细胞内信号发出的短肽”的共同待审理的申请(1997年5月21日提交，律师案卷号No.CMCC-547)中作了报道，其中公开了蛋白质酪氨酸激酶的HJ环的某些肽衍生物可以使血管平滑肌变长并呈现纺锤形。
通过测定细胞扩增确定STK活性的适当条件的具体实例在实例2中提供。
本文上述的确定肽或肽衍生物是否调节由STK控制的细胞活性或功能的试验可用细胞实施，而不是本文所特别描述的其他方式。尚未发现的STK或其功能尚未了解的STK，一旦确定了其所控制的细胞功能或活性，也可用于这种试验。这些STK也在本发明的范围内。
本发明也涉及在受试者中调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法。“受试者”较好的是人，但也可以是需要治疗的动物，如兽医动物(如狗，猫，等等)，畜牧动物(如牛，猪，马等等)和实验室动物(如田鼠，鼠，豚鼠等等)。
可以调节受试者中的STK活性来治疗由STK活性不足或活性过度引发的疾病。如，MAP激酶[Seger和Krebs在FASEB期刊上的文献，(FASEB J.9726(1995))]和环状相关蛋白质激酶[《细胞分子生物学》“Molecular Biology of the Cell，”由Alberts，Bray，Lewis，Raff，Roberts和Watson等人编辑.第5章，(Garland出版公司)，(1994)]，在真核细胞中是细胞分化周期控制系统的重要组分。其他STK，如蛋白质激酶C，Raf激酶[Nishizuka，在FASEB期刊上(The FASEB Journal)的文献，9484(1995)，Locric，等人，Oncongene 121109(1996)；Laird等人，《生物化学》27026，742(1995)]和G蛋白质偶联受体[Lange-Carter，等人，《科学》260315(1993)]，依次涉及MAP激酶的控制或在有丝分裂期间活化。另一方面，G蛋白质偶联受体(GRK)，可减少受体的敏感性，这样就涉及调节多种荷尔蒙反应[Freedman和Leflowitz在<荷尔蒙研究进展>中的文献，(Freedman and Leflowitz，Recent Prog.Hormon.Res.)52319(1996)]。Akt/PKB的活化作用涉及抑制凋亡如逐渐的细胞死亡[Frank等人，<细胞>88435(1997)；《边缘科学》(Hemmings Science)275628(1997)]。调节这些酶活性的本发明的肽和肽衍生物，在给受试者服用治疗上有效的量时，可用来在受试者中治疗癌症。
C-AMP依赖激酶，GSK3和Akt/PKB涉及肝糖新陈代谢的控制。调节C-AMP相关激酶活性的本发明的肽和肽衍生物，在给受试者服用治疗上有效量时，可用来在受试者中治疗II型糖尿病和出血性休克。已报道CAMP衍生物可抑制人类癌症细胞生长[Karsros等人，FEBS Lett.22397(1987)]，说明C-AMP依赖激酶的抑制剂也可用于治疗癌症。
Raf激酶涉及脂肪新陈代谢的控制。调节Raf激酶活性的本发明的肽和肽衍生物，在给受试者服用治疗上有效的量时，可用来在受试者中治疗肥胖。
调节蛋白质激酶C的药剂可用来治疗多种疾病状况，包括心血管疾病(血栓症，动脉硬化症，动脉硬化，心脏肥大，局部缺血，再灌注损伤，高血压)，免疫抑制和炎症病变(如哮喘，牛皮癣，红斑狼疮，糖尿病，器官移植排斥抑制，肠炎和AIDS)，中枢神经系统疾病(如Alzheimer’s症，中风，创伤)，依赖蛋白质激酶C活化作用的脓毒性休克和局部缺血引发的肾脏衰竭[Nambi，WO93/16703，Bradshaw，等人，“药剂作用”(AgentsAction)38135(1993)；Birchall等人，“药物化学和试验治疗”(The J.Pharm.And Exper.Therapeut).2922(1994)]。调节蛋白质激酶C活性的本发明的肽和肽衍生物，在给受试者服用治疗上有效量时，可用来在受试者中治疗这些疾病。
已知G-蛋白质受体激酶的磷酸化作用[Freedman和Lefkowitz的<荷尔蒙研究进展>，(Freedman and Lefkowitz，RecentProg.Hormon.Res)51319(1996)]会导致受体敏感性减少，这样就延长了如肾上腺素荷尔蒙效用的持续时间。因此，调节G-蛋白质受体激酶活性的药剂对治疗由相配体如多巴胺的较低生物药效性造成的疾病有潜在的作用。已报道调钙素相关激酶的抑制剂可抑制多巴胺释放[Nagatsu等人<生物化学生物物理学研究公报>，(“Biochem.Biophy.Research，Commun”)1431045(1987)]。这样，调节G-蛋白质受体激酶和调钙素受体激酶活性的药剂对治疗与多巴胺信号功能紊乱有关的疾病，如Pardinson’s症，有潜在的作用。已报道调钙素相关激酶的抑制剂可舒缓动脉肌肉[Saitoh等人，<生物化学>J.Bio.Chem.2627796(1987)]，这样，对治疗高血压有潜在的作用。GSK3的抑制作用可增加胰岛素受体的细胞内活性，从而加强了葡萄糖的吸收和其他相关的代谢活性。这样，调节GSK3活性的药剂对治疗I类和II类糖尿病有潜在的作用。
依据本文所公开的方法，肽和肽衍生物可设计用来调节HJ环已排序和细胞功能已知的STK的活性。这样，肽和肽衍生物可设计用来影响(增加或减少)那些细胞功能。进一步的研究可能会揭示，某些其根本病因目前不了解的疾病状况，是由STK控制细胞功能的活性过度或活性不足引起的。这些疾病可通过服用肽来治疗，这些肽是活性过度的或活性不足的STK的HJ环的肽衍生物。适当的肽和肽衍生物可用本文所公开的方法确定。这些治疗方法，肽和肽衍生物包括在本发明的范围内。
“治疗上有效量”是指与在没有治疗的情况下典型临床结果相比，产生了作为治疗效果的改善的临床结果的化合物的量。“改善的临床结果”包括作为治疗结果延长了携带疾病个体的生命期望。“改善的临床结果”也可包括作为治疗结果使携带疾病个体经历少一些的疾病症状或并发症。对于癌症，“改善的临床结果”包括延长的生命期望。还可包括减缓或制止肿瘤生长的速度，致使肿瘤尺寸缩小，降低转移速度和/或改善生命质量(如减少身体不舒适或增加灵活性)。
对于糖尿病，改善的临床结果是指延长的生命期望，减少疾病的并发症(如神经病，视网膜病，肾病和血管衰退)及改善生命质量，如上所述。
对于肥胖，改善的临床结果是指对摄入的每卡路里的体重增加量被减少了。还指减少了肥胖的并发症如心脏疾病，如动脉硬化和高血压。
给个体服用的肽或肽衍生物的量取决于疾病的种类和严重性，及个体的特性，如通常的健康状况，年龄，性别，体重和对药物的容忍量。本领域的技术人员可依据这些和其他因素确定适当的剂量，一般地，对于成人肽或肽衍生物的治疗有效量的范围是从约每天1mg到约每天1000mg。较好的剂量范围是从约每天1mg到约每天100mg。
本发明的肽和肽衍生物较好地是非肠道用药。非肠道用药可包括，如系统用药，如通过肌肉注射，静脉注射，皮下注射，腹腔注射。抗蛋白水解作用的肽或肽衍生物可口服用药，如用胶囊，悬浮剂或片剂的形式。
肽或肽衍生物可与药用可接受的作为治疗上述疾病药用合成物的部分的载体一起给个体服用。适合的药用载体可含有不与肽或肽衍生物作用的惰性组分。可实施的标准药用配方技术如在Remington’的《药科学》，Mack出版公司(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA)中所述的那些技术。非肠道用药适合的药用载体包括如，无菌水，，生理盐水，细菌抑制盐水(盐水含有约0.9％mg/ml苄基乙醇)，磷酸缓冲盐水，Hank’s溶液，Ringer’s-乳酸盐等等。制备胶囊合成物(如包裹着硬凝胶或环糊精)的方法在此领域是已知的(Baker，等人，“生物活性药剂的控释”(Controlled Release of BiologicalActive Agents)，John Wiley和Sons编辑，1986)。
本发明的肽和肽衍生物除了治疗用途还有其他许多应用。一些应用在下面的段落中阐述。
本发明的HJ环肽是从在天然蛋白质中线性的排列中衍生而来的。因此，它们可用来制备STK的特异抗体。而且，因为对于每个STK的亚家族，HJ-环序列是独特的，所以抗HJ-环抗体可特别地用来分离STK不同的亚家族。
通过与适当的载体共轭结合如匙孔戚血蓝蛋白或血清蛋白，可培养HJ环肽适当的抗体；多克隆和单克隆抗体的制备可采用适当的技术实施。有很多种方法已被描述[参阅如Kohler等人，《自然》，256495-497(1975)；Eur.J.的<免疫>(Immunol)6511-519(1976)；Milstein等人，《自然》266550-552(1977)；Koprowski等人，美国专利第4,172,124号(U.S.Patent No.4,172,124)；Harlow，E.和D.Lane，1988，抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，(寒春码头实验室，ColdSpring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY)；“分子生物学中的通用方案”，卷2，(Current Protocols In Molecular Biology，Vol.2)，增补27(Supplement 27，1994年夏)，Ausubel，F.M.等人编辑.，(John Wiley&Sons纽约，New York，NY)，第11章Chapter11，(1991)]。通常，细胞杂交可通过融合适当的不死细胞组(如骨髓瘤细胞组如SP2/0)和抗体产生细胞来制备。抗体产生细胞，较好的是脾或淋巴节产生的细胞，可用从重要抗原免疫的动物中获取。融合的细胞(杂交细胞)可采用选择性培养条件分离，并用限制稀释液克隆。产生有所需特异性的抗体的细胞可用适当的试验方法选取(如ELISA)。
HJ环肽的抗体，包括单克隆抗体有很多用途。如，那些抗从HJ环肽衍生来的蛋白质的抗体，或与从HJ环肽衍生来的蛋白质反应的抗体，较好的是与所说的蛋白质特异结合的抗体，可用来确定和/或分类在细胞表面表现那种蛋白质细胞(如通过荧光活性细胞分类或组织学分析的方式)。对蛋白质特异的单克隆抗体也可用来检测和/或定量在细胞表面的表达或在样品中的存在(如在ELISA中)。另外，抗体也可用来确定在细胞的细胞质中是否存在细胞内STK。生成澄清的细胞溶胞体(如用氢氧化钠(0.2N)和十二烷基硫酸钠(1％)处理细胞，离心，将沉淀与上层液分离)，并用STK特异的抗-HJ环抗体处理。然后，分析澄清溶胞体，如通过对STK和抗体之间的Western印迹分析或免疫沉淀分析。接受刺激后一些STKs变成膜结合的，或细胞骨架缔合的。抗-HJ环抗体可用来在多种生理条件下，通过采用传统免疫细胞化学技术如免疫荧光技术，免疫过氧化酶技术，和免疫电子显微镜法，连同特异抗-HJ-环抗体，研究STK多种亚家族的细胞内分布(划分)。
与免疫原作用的抗体也很有用。如它们可用来检测和/或定量样品中的免疫原，或提纯免疫原(如免疫亲和提纯法)。
STK内的HJ环在调节STK活性中起重要的作用，如本发明的肽和肽衍生物在STK活性方面具有显著影响的事实所证实的。本发明的HJ环肽也可用来确定与特异STK的HJ环相互作用，并调节STK活性的配体。如可直接地或通过连接物，制备特异HJ环共价接合的亲和柱。这种柱接着可用来分离和确定那些键合HJ肽的并也可能键合从HJ肽衍生出的STK的特异配体。然后配体可从柱中洗脱，鉴定测试其调节STK功能的能力。
蛋白质酪氨酸激酶是另一类蛋白质激酶。这些蛋白质以膜-结合受体出现参与跨膜信号发出，或以细胞内蛋白质出现参与细胞内信号传导，包括向核子的信号传导。键合配体产生信号传导，通过激酶对细胞内蛋白质酪氨酸残基的磷酸化作用启动。与STK相同，酪氨酸激酶也用这种磷酸化作用机制控制细胞功能。酪氨酸激酶与STK具有高度的同源性，包括HJ环。这样，酪氨酸激酶活性和它们控制的细胞功能可用肽(它们HJ环的肽衍生物)调节，如上面对STK的讨论一样。肽和酪氨酸激酶HJ环的肽衍生物，和使用它们的方法，在一起提交的题目为“选择性调节细胞内信号发出的短肽”(1997年5月21日提交，律师案卷号No.CMCC-547)的共同待审理的申请中公开，其内容通过在此引述而合并于本文。
本发明化合物中的肽序列的合成可用固相肽合成法(如，BOC或FMOC)，溶液相合成法，或其他适合的技术包括前述方法的综合来合成。BOC和FMOC法已经被建立并被广泛应用，具体的描述在Merrifield的<美国化学学报>(J.Am.Chem.Soc.)882149(1963)；Meienhofer的，<荷尔蒙蛋白质和肽>(Hormonal Proteins and Peptides)，由C.H.Li，编辑，“学院出版社”(Academic Press)，1983，pp.48-267；Barany和Merrifield在“肽工程”，“The Peptides，E”中，Gross and J.Meienhofer，编辑，“学院出版社”(Academic Press)，纽约New York，1980，pp，3-285中。固相肽合成法在Merrifield，R.B.，《科学》，232341(1986)；Carpino，L.A.和Han，G.Y.，<有机化学>J.Org.Chem.，373404(1972)；及Gauspohl，H.等人，<合成>Synthesis，5315(1992)中作了描述。这些文献的内容通过在此引述而合并于本文。
含有肽序列的化合物环化的方法在如Lobl等人，WO92/00995中作了描述，其内容通过在此引述而合并于本文。环化的化合物可通过，用当其他侧链保护基保持完整时可选择性移去的基团，保护要用在环闭合的两个氨基酸的侧链来制备。选择性去保护作用，通过使用直交侧链保护基如烯丙基(OAI)(如谷氨酸或天冬氨酸侧链的羰基基团)，烯丙氧基羰基(Aloc)(如赖氨酸或鸟氨酸侧链的氮)或乙酰氨基甲基(Acm)(如半胱氨酸的巯基)保护基可很好地实施。OAI和Aloc可用Pd°轻易地移去，Acm可用碘处理轻易移去。
下面的实例是用于说明本发明的，它们不在任何方面对本发明有任何限制。
实例1-HJ肽的制备本发明的新型化合物可采用Applied Biosystems的430A肽合成器，使用F-Moc技术依据制造商方案合成。制备肽的其他适用方法对此领域的技术人员是已知的。参阅如，Merrifield，P.B.，《科学》，232341(1986)；Carpino，L.A.，Han，G.Y，<有机化学>(J.Org.Chem.)，373404(1972)；Gauspohl，H.，等人，《合成》(Synthesis)，5315(1992)，这些文献的内容通过在此引述而合并于本文。
使用Rink酰胺树脂[4(2’，4’二甲氧基苯基-FMOC氨基甲基)苯氧基树脂]来合成C-酰胺化的肽。用FMOC基团保护氨基酸的α-氨基基团，用弱碱，N-甲基吡咯烷酮的20％哌啶(NMP)在每个环的开始处移去FMOC基团。去除保护基后，将树脂用NMP冲洗移去哌啶。使用溶解在HOBt(1-羟基苯并三唑)和DMF(二甲基甲酰胺)中的HBTU(2(1-苯并三唑基-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子)，用FASTMOC化学(FASTMOC Chemistry)实施氨基酸衍生物的原位激活。加入NMP将氨基酸溶解在这种溶液中。加入DIEA(二异丙基乙基胺)启动激活作用。另外，采用DCC(二环己基碳化二亚胺)和HOBt的激活法以形成HOBt活性酯。在NMP中实施偶联。接着使用0.75g晶体苯酚；0.25ml EDT(1，2-乙二硫醇)；0.5ml(苯硫基甲烷)；0.5ml的去离子水；10ml TFA，进行N-端(选择地)乙酰基化作用，肽从树脂中的TFA(三氟乙酸)解离过程，和加侧链保护基。实例2-Raf和Polo的HJ肽衍生物调节内皮细胞体外扩增用Gospodorowicz等人，《美国国家科学研究学报》，1976年(Proc.Narl.Acad.Sci.734120(1976))中公开的工艺获取牛动脉细胞(本文称为“A19细胞”)。用Arbiser等人，《美国国家科学研究学报》，1976年(Proc.Narl.Acad.Sci.94861(1997))中公开的工艺获取鼠MS1和SVR细胞，这些文献的内容通过在此引述而合并于本文。
将96孔的平底组织培养微滴板，在马上要平铺细胞之前，预铺上凝胶(Difco)，即在玻片双蒸馏水(DDW)中加入0.100ml/孔的新鲜过滤的1％凝胶。在37℃将培养皿温育约1小时，然后用吸去多余的溶液。
培养介质由DMEM，青霉素/链霉素/谷酰胺(青霉素-100U/ml；链霉素-100μg/ml；谷酰胺-2mM)和10％不含内毒素的牛胎血清制备。测试的细胞类25×103个细胞/ml的悬浮液，在上述培养介质中制备，并以0.160ml/孔分布(约4000个内皮细胞/孔)。
用含有0.1％BSA的磷酸缓冲盐水(PBS)，在100％DMSO中稀释10mM HJ肽溶液制备一组HJ肽原种溶液。将每个原种溶液中HJ肽的浓度调节到测试混合物中HJ肽所需浓度的九倍。
细胞平铺约2小时后，将0.020ml的每种HJ肽原种溶液加入到相应的孔中，每种浓度进行六份复制。此外，没有加入HJ肽的BSA溶液用作对照物。在10％CO2湿润温育箱内37℃温育72-80小时。
将板标记，弃除介质。然后每块板用PBS(0.200ml/孔)冲洗一次。将孔用100％乙醇冲洗(0.200ml/孔)。将乙醇移去，完全干燥这些孔。另外，对孔用4％甲醛PBS(费舍尔应用科学(Fisher Scientific)；分类号(Catalog No).HC200-1的PBS缓冲的10％福尔马林液)(0.12ml/孔)处理至少30分钟。用甲醛处理加强了与乙醇对比的O.D.。
用硼酸盐缓冲液(0.1M，pH8.5)冲洗各孔。在各孔中加入新鲜过滤的1％亚甲基蓝溶液(0.600ml/孔)，并在室温温育10分钟。将各孔用自来水冲洗五次，之后将各孔彻底干燥。加入0.1N的HCl(0.200ml/孔)析去颜色。析去过夜后，在630nm读取O.D.确定每个孔的细胞数量。计数细胞的工艺在Oliver等人，的<细胞学>J.Of Cell Sci.，(1989)中非常详细的描述了，其内容通过在此引述而合并于本文。
一些不同种HJ肽的结果在表中列出。
表
*在该浓度观察到了对细胞扩增的显著抑制。
从表中的结果可用看出，Raf和Polo的HJ肽衍生物抑制牛动脉细胞和转换的鼠细胞组MS1和SVR的细胞扩增。实例3-活化素/TGFbR K048H101(SEQ ID NO.24)的HJ肽衍生物抑制胚胎肺纤维原细胞胶原质的生成将胚胎肺纤维原细胞悬浮在含有0.5％FCS的DMEM中，以每孔50,000个细胞(45μl/孔)的密度接种在96孔平底组织培养板中。在45μl热活化的含TGFβD的条件介质(从MCF-7细胞中收集)中，在没有或有增加浓度的测试肽(0-10μM在10μlPBS+0.1％BAS+1％DMSO)存在的情况下，温育细胞48小时。总体积为每孔100μl。可溶胶原质在温育的最后阶段，移去上清液，并以50μl/孔的等分试样平铺在新的组织培养板中。在湿润环境中37℃将板温育24小时，使得胶原质粘着，然后在37℃干燥24小时。干燥的板用蒸馏水冲洗3次，每孔200μl，每次冲洗1分钟，在每孔中，用100μl在饱和的苦味酸中的(w/v)0.1％直接红80染色，室温下约1小时。多余的染料用10mM HCl冲洗五次，每孔200μl，每次冲洗10秒。胶原质结合染料用0.1M氢氧化钠洗脱，每孔200μl，在540nm读取。细胞计数移去上清液后，室温下细胞用每孔200μl缓冲福尔马林液处理1小时，然后用每孔200μl的0.1M硼酸盐缓冲液冲洗，处理过的细胞用每孔50μl的1％亚甲基蓝染色。多余的染料用自来水冲洗。细胞结合的染料用200μl的0.1M的HCl洗脱，在595nm读取。胶原质按照相对每个细胞进行表达。
K048H101(SEQ ID NO.24)的结果在图5中显示。如从图5中可看到的，在K048H101浓度低至1μM时，仍然出现对胶原质生成的几乎完全的抑制。在0.6μM的K048H101中，出现约80％的抑制。
抑制胶原质形成可用于抑制疤痕形成，如在整形手术中，和抑制粘连产生，一种腹部手术的主要并发症。实例4-整联蛋白-连接的激酶(ILK)K107H101(SEQ ID NO.47)的HJ肽导致B16黑素瘤细胞形态改变当在有K107H101时进行温育，可观察到B16黑素瘤细胞形态的改变，K107H101是从丝氨酸/苏氨酸激酶的HJ环衍生的，名为整联蛋白-连接的激酶(ILK)的肽。如在Wu C.等人，<生物化学>(J.Bio.Chem.)273528-536(1998)中所述的，ILK和肿瘤形成有关。因此，ILK衍生的肽可能用作抗肿瘤药剂。Wu等人，文献的全部内容通过在此引述而合并于本文。等同物使用不超过常规的试验，本领域的技术人员可认出或能确定本文所述发明的具体实施的许多等同物。这样的等同物都包含在下面权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种含有丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环的肽衍生物的肽，其中(a)所说的肽有约五个到约二十个之间的氨基酸或氨基酸类似物；(b)所说的肽调节丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。
2.根据权利要求1所述的肽，其中的肽是环状的。
3.根据权利要求1所述的肽，其中的肽是线性的。
4.根据权利要求3所述的肽，其中的肽的N-端和C-端是未取代的。
5.根据权利要求3所述的肽，其中的N-端或C-端中的至少一个是被取代的。
6.根据权利要求5所述的肽，其中的N-端是酰胺化的，C-端是酰化的。
7.根据权利要求3所述的肽，其中的肽衍生物含有与所说的丝氨酸/苏氨酸激酶的所说的HJ环的氨基酸序列的任何亚序列相对应的氨基酸序列，附带条件是肽衍生物序列中的任何一个氨基酸可变化，为任何氨基酸或其类似物。
8.根据权利要求3所述的肽，其中的丝氨酸/苏氨酸激酶是从下列家族基团中选取的丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员Polo，Raf，分裂素活性蛋白质激酶(MAP激酶)和G蛋白质偶联受体激酶。
9.根据权利要求3所述的肽，其中的丝氨酸/苏氨酸激酶是从下列基团中选取的蛋白质激酶C，环状AMP依赖激酶，调钙素依赖激酶，环状GMP依赖蛋白质激酶，Akt/PKB和GSK3。
10.根据权利要求8所述的肽，其中丝氨酸/苏氨酸激酶是Polo家族的成员，是从含有Plk，Snk，和Sak的组中选取的。
11.根据权利要求8所述的肽，其中丝氨酸/苏氨酸激酶是Raf家族的成员，是从含有Raf-1，A-Raf，和B-Raf的组中选取的。
12.根据权利要求8所述的肽，其中丝氨酸/苏氨酸激酶是G蛋白质依赖激酶，是从含有β2-肾上腺素受体激酶，视网膜紫质激酶和GRK4-6的组中选取的。
13.根据权利要求3所述的肽，其中肽衍生物含有与所说的HJ环的氨基酸序列的任何亚序列相对应的氨基酸序列。
14.根据权利要求3所述的肽，其中肽含有序列HJ-38(SEQID NO.13)，J-41(SEQ ID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.16)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQ ID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)。
15.一种肽，其含有序列HJ-38(SEQ ID NO.13)，J-41(SEQID NO.14)，J-42(SEQ ID NO.15)，J-43(SEQ ID NO.16)，J-43.1(SEQ ID NO.17)，J-45(SEQ ID NO.18)，J-46(SEQ ID NO.19)，J-47(SEQ ID NO.20)，J-48(SEQ ID NO.21)，J-29(SEQ ID NO.22)，附带条件是肽中的任何一个氨基酸残基可变化，为任何自然产生的氨基酸或其类似物。
16.一种肽，其含有AA1到AA20的氨基酸序列，或含有其包括至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA8是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有丙氨酸，丝氨酸，和苏氨酸的组中选取的；AA12是从含有组氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA13是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA14是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA15是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA16是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的组中选取的；AA17是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA18是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA19是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的；AA20是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的。
17.根据权利要求16所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应Raf的HJ环序列(SEQ ID NO.1)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
18.根据权利要求16所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应Raf的HJ环的序列(SEQ ID NO.1)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
19.根据权利要求18或20所述的肽，其中的肽包括序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
20.一种包括有AA1到AA20的氨基酸序列其至少五个氨基酸的亚序列的肽，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是丙氨酸或甘氨酸；AA5是从含有丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸和丙氨酸；AA7是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA12是甘氨酸，丙氨酸；AA13是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA14是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA15是脯氨酸；AA16是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸，的组中选取的；AA17是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA18是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的；AA19是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的组中选取的；AA20是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的。
21.根据权利要求20所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应环状AMP相关激酶的HJ环的序列(SEQ ID NO.2)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
22.根据权利要求20所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应的环状AMP相关激酶HJ环的序列(SEQ ID NO.2)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
23.根据权利要求21或22所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
24.一种肽，其含有AA1到AA20的氨基酸序列，或含有其至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有半胱氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸和丙氨酸；AA7是从含有组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA8是从含有脯氨酸，丙氨酸，丝氨酸的组中选取的；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA12是甘氨酸或丙氨酸；AA13是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA14是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA15是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA16是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA17是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA18是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的；AA19是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的组中选取的；AA20是从含有谷氨酸，组氨酸，和谷氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的。
25.根据权利要求24所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应蛋白质激酶C的HJ环的序列(SEQ ID NO.3)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
26.根据权利要求24所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应蛋白质激酶C的HJ环的序列(SEQ ID NO.3)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
27.根据权利要求25或26所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
28.一种肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列，或包括其至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是赖氨酸或鸟氨酸；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的组中选取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是组氨酸；AA8是丝氨酸或苏氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的组中选取的；AA12是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA13是组氨酸；AA14是赖氨酸或鸟氨酸；AA15是丝氨酸或苏氨酸；AA16是赖氨酸或鸟氨酸；AA17是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA18是赖氨酸或鸟氨酸；AA19是组氨酸；AA20是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的。
29.根据权利要求28所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应bARK1.2的HJ环的序列(SEQ ID NO.4)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
30.根据权利要求28所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应bARK1.2的HJ环的序列(SEQ ID NO.4)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
31.根据权利要求29或30所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
32.一种肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其含有至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有半胱氨酸，丝氨酸，和苏氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸的组中选取的；AA8是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA12是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA13是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA14是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA15是从含有；赖氨酸，鸟氨酸和组氨酸的组中选取的；AA16是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA17是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，赖氨酸，鸟氨酸的组中选取的；AA18是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的；AA19是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的组中选取的；AA20是从含有谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的。
33.根据权利要求32所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应Akt/PKB的HJ环的序列(SEQ ID NO.7)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
34.根据权利要求32所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应Akt/PKB的HJ环的序列(SEQ ID NO.7)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
35.根据权利要求33或34所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
36.一种肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA12是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA13是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA14是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA15是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA16是组氨酸；AA17是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，赖氨酸，鸟氨酸的组中选取的；AA18是从含有赖氨酸，鸟氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，和缬氨酸的组中选取的；AA19是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的组中选取的；AA20是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的。
37.根据权利要求36所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应调钙素相关激酶的HJ环的序列(SEQ ID NO.5)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
38.根据权利要求36所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应调钙素相关激酶的HJ环的序列(SEQ ID NO.5)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
39.权利要求37或38所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
40.一种肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸的组中选取的；AA2是从含有丝氨酸和苏氨酸的组中选取的；AA3是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA4是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA5是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是从含有精氨酸，N-硝基精氨酸，β-环精氨酸，γ-羟基精氨酸，N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸，赖氨酸，鸟氨酸的组中选取的；AA8是脯氨酸；AA9是脯氨酸；AA10是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸的组中选取的；AA11是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA12是丝氨酸或苏氨酸；AA13是丝氨酸或苏氨酸；AA14是从含有半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸的组中选取的；AA15是从含有；亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的；AA16是赖氨酸或鸟氨酸；AA17是从含有谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯的组中选取的；AA18是丝氨酸或苏氨酸；AA19是从含有酪氨酸，苯基丙氨酸和色氨酸的组中选取的；AA20是从含有亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，缬氨酸的组中选取的。
41.根据权利要求40所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应polo的HJ环的序列(SEQ ID NO.6)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
42.根据权利要求40所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应polo的HJ环的序列(SEQ ID NO.6)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
43.根据权利要求41或42所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
44.一种肽，其包括AA1到AA20的氨基酸序列或其至少五个氨基酸的亚序列，其中AA1是丙氨酸或甘氨酸；AA2是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯；AA3是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA4是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA5是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA6是甘氨酸或丙氨酸；AA7是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA8是脯氨酸；AA9是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA10是酪氨酸，苯基丙氨酸，和色氨酸；AA11是脯氨酸；AA12是甘氨酸或丙氨酸；AA13是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯；A14是丝氨酸或苏氨酸；AA15是甘氨酸或丙氨酸；AA16是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA17是谷氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸或天冬氨酸的脂族，取代的脂族，苄基，取代的苄基，芳族或取代的芳族的酯；AA18是谷氨酰胺，天冬酰胺；AA19是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸；AA20是亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或缬氨酸。
45.根据权利要求44所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应GSK3的HJ环的序列(SEQ ID NO.12)或其亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的两个氨基酸可变化。
46.根据权利要求44所述的肽，其中序列AA1到AA20或其亚序列对应GSK3的HJ环的序列(SEQ ID NO.12)或亚序列，附带条件是序列AA1到AA20或其亚序列中的任何一个氨基酸可变化。
47.根据权利要求45或46所述的肽，其中肽含有序列AA1到AA20的一个八个氨基酸的亚序列，其中亚序列从含有AA3到AA10，AA7到AA14，AA11到AA18的组中选取。
48.一种确定调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的肽的方法，该方法包括步骤(a)提供肽，指“测试肽”，该肽包括所说的丝氨酸/苏氨酸激酶的HJ环的肽衍生物，并含有从约五个到约二十个氨基酸或其类似物；(b)在适合测试丝氨酸/苏氨酸激酶活性的条件下，将测试肽与含有由丝氨酸/苏氨酸激酶控制的一个或多个细胞活性的细胞一起温育；(c)测定丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其中和没有与测试肽一起温育的生长细胞相比，大些或小些的活性表示，肽调节丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。
49.根据权利要求48所述的方法，其中丝氨酸/苏氨酸激酶活性是通过测量组织培养物中所说的细胞的存活率或扩增状况测定的。
50.一种在受试者中调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法，该方法包括服用治疗上有效量的含有丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环的肽衍生物的肽，其中(a)所说的肽有约五个到约二十个氨基酸或其类似物；(b)所说的肽调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
全文摘要
公开的肽是丝氨酸/苏氨酸激酶HJ环的肽衍生物。这种肽可调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性。还公开了通过服用本发明的一种肽,调节受试者丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法。
文档编号A61P25/00GK1257538SQ98805328
公开日2000年6月21日 申请日期1998年5月20日 优先权日1997年5月21日
发明者施姆尔·本－赛森 申请人:儿童医疗中心有限公司, 耶路撒冷希伯来大学依苏姆研究发展公司