专利名称：治疗神经缺损的方法
该申请要求1997年8月4日提交的暂定申请系列号为60/055,383的优先权，其全部内容被引入本文作为参考。
本发明领域是治疗由影响中枢神经系统的损伤、疾病或发育障碍引起的神经缺损。
背景技术：
神经营养因子是多方面地支持神经细胞生存、增生、分化、大小和功能的肽类(综述，见Loughlin和Fallon，神经营养因子(Neurotrophic Factors)，学术出版社(Academic Press)，San Diego，化学文摘(CA)，1993)。随着识别的营养因子或生长因子的数量不断增加，基于其结构或结合亲和力多数能被分到一个或另一个确定的家族中。来自各家族的生长因子，包括表皮生长因子(EGF)家族，已被证明支持黑质纹状体系统(按照本发明方法可治疗的一个区域)的多巴胺神经元(综述，参见Hefti神经生物学杂志(J.Neurobiol.)251418-1435，1994；Unsicker，生长因子研究进展(Prog.Growth Facter Res.)573-87，1994)。
作为EGF家族的基本成员，EGF在25多年前被鉴定(Savage and Cohen，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)2477609-7611，1972；Savage等，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)247；7612-7621，1972)。此后，其它成员也已被识别；它们包括牛痘病毒生长因子(VGF；Ventatesan等，病毒学杂志(J.Virol.)44637-646，1982)、粘液瘤病毒生长因子(MGF；Upton等，病毒学杂志(J.Viroi.)611271-1275，1987)、休普氏纤维瘤病毒生长因子(SFGF；Chang等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7535-540，1987)、双调蛋白(AR；Kimura等，自然(Nature)348257-260，1990)，和肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF；Higashiyama等，科学(Science)251936-939，1991)。这些因子的一个共同特征是含有六个半胱氨酸的氨基酸序列，其中这些半胱氨酸形成三个二硫键交联并维持一个使它们共同具有结合EGF受体能力基础的保守结构。
EGF是迄今研究最多的家族成员，并是第一个被定位在脑组织中在发育期成人前脑和包括苍白球、腹侧苍白球、脚内核、黑质和海马回的中脑区域，发现有EGF样免疫反应活性(IR)(Fallon等，科学(Science)2241107-1109，1984)。
EGF族的另一个成员TGFα，也被定位于脑组织中。它与EGF受体结合(Todaro等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA775258-5262，1980)，激活受体的酪氨酸激酶活性，并在广泛的各种细胞类型中，引发相似的促有丝分裂反应(综述，见Derynck，癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)，5827-52，1992)。TGFα也可能结合于其它未识别的受体(这可有助于解释它在某些细胞内的不同作用)。早已证明，TGFα-IR不均一地分布在整个成年大鼠中枢神经系统神经元的核周体和前脑星形胶质细胞亚群上(Code等，脑研究(Brain Res.)421401-405，1987；Fallon等，生长因子(Growth Factors)2241-250，1990)。利用核酸酶保护分析(Weickert和Blum，脑研究进展(Devel.Brain Res.)86；203-216，1995)和核酸原位杂交技术(Seroogy等，神经报道(Neuroreport)6105-108，1994)，在啮齿动物整个脑部(Lee等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)53655-3646，1985；Kudlow等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2643880-3883，1989)和纹状体及其它脑区域(Weickert and Blum，脑研究进展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995)已经检测到TGFα mRNA。
TGFα和EGF mRNA在出生后早期达到其相对最高丰度(与总RNA相比)，此后下降，提示其在发育中起作用(Lee等，1985，见上文；Lazar和Blum，神经科学杂志(J.Neurosci)121688-1697，1992)。在全脑，下降超过50％(Lazar和Blum，1992，见上文)，而在纹状体，相对TGFα mRNA下降峰水平的2/3(Weickert和Blum，1995，见上文)。在整个发育期进行检测，全脑TGFαmRNA超出EGF mRNA水平在1个数量级以上(Lazar和Blum，1992，见上文)。
通过免疫细胞化学方法表明，EGF受体被定位在大鼠脑的星形胶质细胞和皮质与小脑神经元的亚群，在人解剖脑标本的神经元中(Gomez-Pinilla等，脑研究(Brain Res.)438385-390，1988；Werner等，组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)3681-86，1988)。在用放射标记EGF的放射自显影研究中，在大鼠皮质和包括纹状体的皮质下区域发现EGF结合位点(Quirion等，突触(Synapse)2212-218，1988)。原位杂交研究证明，EGF受体mRNA在纹状体和腹侧中脑核细胞中(Seroogy等，1994，见上文)及在发育和成年大鼠脑的增生区域中(Seroogy等，脑研究(Brain Res.670157-164，1995)。相对于EGF和TGFαmRNAS，纹状体和腹侧中脑核的EGF受体mRNA在发育期最丰富，随着动物成熟而逐渐下降(Seroogy等，1994，见上文)。
在生理上，TGFα作用于全身众多细胞类型，包括许多神经起源的细胞类型(综述，见Derynck，1992见上文)。它支持培养的中枢神经元存活(Morrison等，科学(Science)23872-75，1987；Zhang等，细胞调节(Cell.Regul.)1511-521，1990)，以及与EGF不同，增强脊神经节感觉神经元的存活和轴突向外生长(Chalazonitis等，神经科学杂志(J.Neurosci.12583-594，1992)。它也刺激发育和成年脑的神经元和神经胶质祖细胞的增生和分化(Anchan等，神经元(Neuron)6923-936，1991)。
近年来已研究了EGF-家族肽对培养物的中脑多巴胺神经元的营养作用。EGF增强在混合的中脑培养物中E16多巴胺神经元的存活(Casper等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)30372-381，1991)，但是它仅轻度刺激多巴胺摄取(Knusel等，神经科学杂志(J.Neurosci.)10558-570，1990)。TGFα也支持游离细胞培养物的中脑多巴胺神经元的存活，但它的作用较EGF更具选择性(Ferrari等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)30493-497，1991；Alexi和Hefti，神经科学(Neurosci)55903-918，1993)。
EGF-家族生长因子的另一重要特征是，它们具有保护中脑多巴胺细胞免受神经毒损害的能力。已经证实EGF保护多巴胺神经元免遭游离细胞培养物中的谷氨酸盐和使君子酸盐的细胞外毒素的侵害(Casper和Blum，神经化学杂志(J.Neurochem.)651016-1026，1995)。也证实它保护培养的多巴胺细胞免受选择性多巴胺神经毒1-甲基-4-苯基吡啶的损害(MPP+；Park等，脑研究(Brain Res.)59983-97，1992)，和在MPP+-处理的培养基中增加多巴胺摄取(Hadjiconstantinou等，神经化学杂志(J.Neurochem.)57479-482，1991)。
EGF在体内的研究结果与在培养物中获得的结果一致；EGF在两种情况下均有神经保护作用。例如，脑室内(ICV)输注EGF减少苯丙胺-诱导的旋转，增加SN中酪氨酸羟化酶免疫活性(TH-IR)细胞的存活数量，及在PD大鼠模型中增加切断黑质纹状体通路后纹状体的TH-IR纤维数(Pezzoli等，运动障碍(Movement Disord.)6281-287，1993；Ventrella，神经外科科学杂志(J.Neurosurg.Sci.)371-8，1993)。将EGF ICV输注至1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)损伤的小鼠脑中，增加多巴胺与3，4-二氢-zy苯乙酸(DOPAC)的含量和纹状体酪氨酸羟化酶的活性(Hadjiconstantinou等，1991，见上文；Schneider等，脑研究(Brain Tes.)674260-264，1995)。
相对于EGF，TGFα尽管在体外具有更强的活性，但它在体内-特别是在患神经缺损的动物，包括人的营养作用是未确定的。如在这里描述的，本发明是根据正常和异常(损伤的)中枢神经系统细胞中输注TGFα所新发现的作用。
发明概述本发明特征是治疗患神经缺损患者的方法和组合物。该方法可以这样进行，例如，通过将患者中枢神经系统(CNS)的神经元祖细胞与结合表皮生长因子(EGF)受体的多肽接触(在体内或培养基中)，并引导增生祖细胞的子代全部移行到CNS区域，其中它们在此区域驻留并以足以减轻神经缺损的方式发挥作用。该方法可包括另一个步骤使神经祖细胞的子代与刺激分化的化合物接触。
通过下面的附图简述、发明详述和操作实施例，本发明的其它目的、优点和新特性将变得更清楚。
附图简述
图1是大鼠前脑的冠状切面图。示于右边的注射吸管代表可输注生长因子的部位，纹状体(str)。(大脑皮质＝ctx；侧脑室＝1v)。
图2A-2D是贯穿成年大鼠中脑的脑冠状切面的显微照片，照片显示EGF受体mRNA的分布。在图2A中，“感觉”探针用作对照。在图2B-2D中，贯穿黑质(sn)的切面显示，在海马(hip)、sna中部和腹侧被盖区(vta)的臂旁核与黑旁paranigral核的中等丰度表达。在中脑的最-尾侧(图2D)，脚间核(ip)标记强度最大。刻度棒＝5mm。
图3是贯穿输注了TGFα的成年大鼠脑纹状体的冠状切面的显微照片，显示EGF受体mRNA的分布。在输注的一侧，邻接侧脑室的纹状体内侧杂交密度显著增加。
图4是贯穿输注了TGFα并有6-OHDA损伤的成年大鼠前脑的冠状切面的显微照片，显示EGF受体mRNA的分布。进行原位杂交以定位EGF受体mRNA，显示很强的嵴伸入纹状体体部。
图5是表示5组受试动物中(正常；aCSF输注，没有损伤；aCSF输注，损伤；TGFα输注，没有损伤；TGFα输注，损伤)每组在纹状体中TGFαmRNA杂交的平均标准化密度的直方图。成对的棒代表在处理的纹状体同侧和对侧的密度。对接受黑质6-OHDA损伤处理的两组，同侧平均杂交密度以四分之一程度显著减小。纹状体输注TGFα肽对此减小没有影响。均值±S.EM.(学生t-检验，同侧-对侧成对比较；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
图6是表示在实施例5所述相同的5个受试组动物中，在侧脑室边界的沿纹状体边缘的室管膜下区TGFα mRNA杂交的平均标准化密度的直方图。成对的棒代表在处理的纹状体同侧和对侧的密度。接受T TGFα纹状体输注的两组，在同侧室管膜下区平均杂交密度大约增倍。均值±S.EM.(学生t-检验，同侧-对侧成对比较；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
图7是表示在纹状体嵴、纹状体非-嵴部和所有动物纹状体嵴室管膜下区TGFα mRNA杂交的平均标准化密度的直方图。成对的棒代表在处理的纹状体同侧和对侧的密度。在处理同侧的纹状体嵴中，TGFα mRNA杂交的平均标准化密度最高。在对侧纹状体没有出现纹状体嵴。TGFα输注。均值±S.EM.(学生t-检验，同侧-对侧成对比较；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
图8A和8B是接受黑质6-OHDA损伤和TGFα输注14天的成年大鼠脑贯穿纹状体的冠状切面的显微照片。图8A，处理同侧的尾状核-豆状核银染色显示在嵴的背部有大量细胞，许多细胞呈现细长的形态学并正常朝室管膜下区方向定向。沿侧脑室(1v)部位细胞数量也增加。在对侧纹状体(图8B)中，纹状体或沿侧脑室部位的细胞群均未扩展。
图9A-9D是用6-OHDA损伤和TGFα输注不同时间期限的成年大鼠脑硫素-染色的冠状切面的显微照片。图9A，输注4天后，室管膜下区的细胞扩展仅在背景染色基础上可检测到。图9B，输注6天后，靠近侧脑室集合的硫素-染色的细胞非常粗大。图9C，输注9天后，在细胞扩展的腹侧末端，相对于室管膜下区轻度外侧处显示浓厚地染色的细胞区域。图9D，输注14天后，浓密的形成良好的嵴明显地伸进纹状体的体部。
图10A和10B是6-OHDA损伤和TGFα输注14天的成年大鼠脑冠状切面的显微照片。图10A，nestin免疫组化显示强的纹状体嵴。图10B，接近-交界切片的硫素染色证实nestin-IR细胞和纹状体嵴之间的标记。
图11A-11C是6-OHDA损伤和在距侧脑室不同距离处TGFα输注14天的成年大鼠脑硫素-染色的冠状切面的显微照片。图11A，输注插管插入远-腹侧纹状体，嵴与室管膜下区平行并较在中-纹状体输注时所见的密度小。图11B，输注插管插入中-纹状体，嵴特征性地呈S-形状，腹侧部分伸向远处进入腹侧纹状体。图11C，紧紧靠近侧脑室输注，纹状体嵴是L-形状并通常显示出非常浓厚的硫素染色。
图12是描述用6-OHDA损伤黑质和中-纹状体TGFα输注14天后成年大鼠脑冠状切面纹状体嵴的最大外侧位移(从侧脑室；单位为mm)的直方图。根据“方案A”(左-最大棒)处理的动物，首先接受损伤，然后用TGFα输注4～5周。根据“方案B”处理的动物，开始输注14天TGFα后接受损伤2天。均值±S.EM.(学生t-检验，P值，*P＜0.01)。
发明详述I.纹状体和黑质纹状体系统A.解剖学、连接和神经化学在脑中，纹状体、苍白球、黑质、被盖区(VTA)、下丘脑核和杏仁核共同称为基底神经节。纹状体包含背侧和腹侧部分，每一部分进一步细分为其它解剖结构。人的背侧纹状体由尾状核和豆状核组成。C-形尾状核沿着侧脑室的弧度。其尾部伸出超过下角末端并在双颞侧与杏仁核连接。尾状核的头从前角的前端转向腹侧并与豆状核融合。尽管人脑的解剖学差异很大，但在啮齿动物中，它们结合成共同结构，尾状核-豆状核或尾状豆状核。
腹侧纹状体由听神经核、嗅结节和有关的纹状体细胞桥构成。苍白球包括球苍白球、脚内核(entopeduncular nucleus)、网状黑质部分(SNr)和腹侧苍白球。脚内核和SNr具有非常相似的传入和传出联系。腹侧核包含既与苍白球相似又与脚内核相似的混合联系区域。黑质的其它部分，致密部分(SNc)，包括跨越黑质-腹侧盖区(SN-VTA)的多巴胺神经元以及在SNr中的多巴胺细胞丛。基底节环路相当复杂，但在大鼠和人是非常相似的(Fallon和Loughlin，大脑皮质(cerebral cortex)，E.G.Jones和A.Peters编著，第6卷，第41-127页，Plenum出版，纽约，1987；Alheid和Heimer，脑研究进展(Progr.Brain Res.)107461-484，1996)，这使得大鼠成为研究哺乳动物脑中该系统的联系、神经化学、药理学、功能和临床相互关系的非常有用的模型。
纹状体，与基底节的其它核一起参与运动和情绪的调节。影响该系统或其神经支配的许多疾病与运动神经元损伤严重有关，经常伴有情感障碍。
尾状核和豆状核是基底节的初级传入神经核，并接受来自大脑皮质和丘脑中央核及丘脑板内核的兴奋性投射。皮质纹状体的传入纤维是谷氨酰能神经。丘脑的传入纤维也被认为是谷氨酰能神经。黑质部纹状体(SNc)通过黑质纹状体通路提供致密多巴胺能传入纤维到纹状体(对大鼠此系统的综述，见Fallon和Loughlin，大鼠神经系统(The Rat Nervous System)，G.Paxinos，编著，第215-237页，学术出版社，圣地亚哥，1995)。腹侧纹状体和听神经核接受大量来自中脑腹内侧VTA的多巴胺细胞的多巴胺能神经支配。来自杏仁核的边缘传入纤维和来自中脑或中缝核的5-羟色胺能纤维也终止在腹侧纹状体。
纹状体传入纤维的分布和终止并不是简单地代表它们的起始区域。纹状体构成埋入功能和化学上均与其不相同的周围基质中的斑或带状体。这种结构最初应用乙酰胆碱酶(AChE)组织化学法得到证明，此AChE选择性地使基质着色(Graybiel和Ragsdale，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755723-5726，1978)。自那以后，组织化学酶、免疫细胞化学、原位杂交、放射标记配体结合受体、顺行变性和其它方法已被用于识别许多其它在两个隔室中不同分布的标志物。基质标志物包括钙结合蛋白、生长抑素和多巴胺摄取([3H]马吲哚结合)位点(Gerfen，J.Comp.Neurol.236454-476，1985；Voorn等，J.Comp.Neurol.289189-201，1989)。带状体能通过其相对较高丰度的脑啡肽、伴有黑质纹状体损害的5’-核苷酸酶活性、酪氨酸羟化酶、mu opoid结合受体和P物质而被识别(Graybiel等，神经科学(Neurosci.)6377-397，1981；Schoen和Grabiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。然而，象可能预料的那样，这些标志物中许多有种属间变异和发育变异，而且某些仅在纹状体特定区域是有用的。
斑或基质隔室中许多纹状体通路的选择性起始和终止使得化学标志物的多相性进一步复杂化。例如，从运动原、扣带回、躯体感觉和基质中皮质末端视觉区域的传入纤维(Gerfen，自然(Nature)311461-464，1984；Donoghue和Herkenham，脑研究(Brain Res.)365397-403，1986)。大多数来自边缘皮质深处V层和VI层的皮质纹状体传入纤维终止于斑，而大多数来自较浅的V层和II、III层的传入纤维终止于基质(Gerfen，科学(Science)246385-388，1989)。来自VTA和SNc背层的传入纤维提供多巴胺能传入神经进入基质。斑接受来自SNc腹层的多巴胺神经分布和SNr中的多巴胺细胞丛(Schoen and Graybiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。在背侧纹状体，来自丘脑内侧部核的传入纤维终止于斑，而来自外侧部的传入纤维(包括前、后板内核和rostral ventral tier nuclei)主要分布于基质组织(Ragsdaleand Graybiel，J.Comp.Neurol.311134-167，1991)。此外，发自杏仁核基底外侧核的纹状体杏仁核纤维，选择性地分布于斑隔室(Ragsdale和Graybiel，J.Comp.Neurol.269506-522，1988)。
纹状体传出纤维对于斑-基质组织来说也是特异分布的。已经证明，发自纹状体两个主要通路之一的纹状体黑质通路由两个不同的投射组成。来自斑隔室神经元的纤维终止在腹侧SNc多巴胺神经元周围和SNr多巴胺细胞群上。基质神经元引起局部图解式排列的投射到SNr，包括非-多巴胺能区域和树突位于SNr的多巴胺神经元(Gerfen，1984，见上文；Jiminez-Castallanos和Graybiel，神经科学(Neurosci.)32297-321，1989)。
其它主要传出投射，即纹状体苍白球通路，投射到苍白球。尚未表明它的分布与斑-基质组织有关；然而，它在神经化学上不同于纹状体黑质系统。大多数纹状体苍白球纤维表达脑啡肽而非强啡肽或P物质。相反，很少的纹状体黑质投射含有脑啡肽，但多数表达强啡肽和P物质(Gerfen和Young，脑研究(Brain Res.)46061-167，1988)。在灵长类，两个系统起源的解剖学区域也不同纹状体苍白球的传出纤维主要来源自豆状核，而纹状体黑质的传出纤维主要源于尾状核(Parent等，脑研究(Brain Res.)303385-390，1984)。
除了纹状体连接的多相性分布外，在纹状体还发现了几种形态上和化学上不同类型的神经元(Albin等，神经科学趋势(Trends Neurosci.)12366-375，1989；Groves，脑研究回顾(Brain Res.Rev.)5234-238，1983)。基于它们的树突形态，把它们传统地分为棘状或非棘状神经元。纹状体中有两类普遍认识的棘状神经元，它们含有γ-氨基丁酸(GABA)、P物质、脑啡肽和强啡肽的多种联合，但主要是GABA能。中等棘状神经元(棘状I型)是迄今最丰富的，包含所有纹状体神经元的90-95％。它们有光滑的细胞体并且在它们树突的远端部分密集地积聚着棘突。其树突的分枝范围距离细胞体大约200μm。中等棘神经元是SNc中多巴胺能神经元的主要终极靶，主要在棘树突茎上形成突触。棘状II型神经元非常大，伴有可变异的延伸出距离细胞体高达约600μm的树突。
棘神经元是纹状体的投射神经元。在含有GABA和P物质基质中的那些，主要投射到苍白球内部片段(GPi)和SNr，另一方面，含有脑啡肽的棘状GABA能基质神经元，神经分布于苍白球外部片段(GPe)。斑隔室的棘神经元将大多数传出纤维传送到SNc(Albin等，1989，见上文)。
两个主要传出通路的纹状体投射神经元通过其多巴胺受体亚型也能被辨别。投射到黑质的P物质/强啡肽神经元主要表达D1多巴胺受体，而脑啡肽能纹状体苍白球神经元主要表达D2受体，然而，在每一种投射中，没有一种受体类型是特异性的表达(Besson等，神经科学(Neurosci.)26101-119，1989；Gerfen等，科学(Science)2501429-1432，1990)。
三种确认类型的棘神经元组成了纹状体中间神经元群(Groves，1983，见上文；Carpenter，在神经科学核心教材(Core Text of Neurosciences)，325-360页，Williams和Wilkins，巴尔蒂莫(Baltimore)，1991)。它们一起占纹状体神经元总数的10％或略少。棘状I型神经元是三种神经元中最常见的，有略微小于中等神经元的光滑的树状树突。它们大部分是GABA能，但许多含有生长抑素和神经肽Y。棘状II型神经元通过其大的细胞体和AChE与胆硷乙酰转移酶(ChAT)染色来识别。该类型细胞与中等棘神经元形成对称的突触。中等棘状III型神经元特征最少，但认为它含有GABA。除了已经识别的神经元亚型之外，可能还有其它化学上定义和连接上定义的这些类型神经元的亚型。
B.局部解剖图和发育在中脑多巴胺系统的纹状体投射中用顺行性和逆行性跟踪剂进行实验，揭示成年啮齿动物精细的局部解剖图(Fallon和Moore，J.Comp.Neurol.180545-580，1978)。背侧纹状体接受来自腹侧和中间SN及VTA神经元的多巴胺能神经支配。腹侧纹状体及听神经核接受来自背侧VTA和中间SN的多巴胺能传入纤维(Fallon，Ann.NY Acad.Sci.5371-9，1988)。
发育系统神经发生的梯度与成熟系统投射的局部解剖图排列相平行。在大鼠胚胎期之前15天(E15)，胚胎中SN的背外侧部分是最早产生的(Altman和Bayer，J.Comp.Neurol.198677-716，1981)。来自该区域的投射支配纹状体的外侧和腹侧区域(Carter和Fibiger，神经科学(Neurosci.)2569-576，1977；Veening等，神经科学(Neurosci.)51253-1268，1980)，这也是最早产生的纹状体区域(Bayer，神经科学(Neurosci.)4251-271，1984)。由于较年轻的神经元以腹外侧到背内侧的梯度在纹状体聚集，所以来自SN的更多腹内侧(及以后产生的)部分(E15后产生)的传入纤维分布于这些以后产生的纹状体区域。这样，最年轻的(腹内侧)黑质多巴胺神经元使神经分布于最年轻的(背内侧)纹状体神经元，而较老的(背外侧)黑质多巴胺神经元使神经分布于较老的(腹外侧)纹状体神经元。该模式也在GABA能纹状体黑质投射中进行了重复(Bunney和Aghajanian，脑研究(Brain Res.)117423-435，1976)。
纹状体神经元是从出生前和出生后早期脑中的围绕侧脑室的神经上皮衍生而来。一个室区域最初排列脑室，以后与正好在其下方的室下(或室管膜下)区域联系。当脑成熟时，室区域消失，但室管膜下区域继续形成一薄层细胞，该区域含有神经干细胞和祖细胞，这些祖细胞沿着一个限定的和受限制的通路移行到嗅球充满易变中间神经元的细胞群(Luskin，神经元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科学(Science)2641145-1148，1994)。
C.病理学纹状体及其多巴胺能神经支配易受许多疾病的传染，包括神经变性疾病(Albin等，1989，见上文)如亨廷顿病(HD)和帕金森病(PD)。HD是一种常染色体显性遗传性疾病(4号染色体)，其特点是纹状体进行性变性。它与四肢和面部不随意的舞蹈样不自主(choreathetotic)运动及随意运动障碍有关(综述，见Purdon等，精神病学神经科学杂志(J.Psychiatr.Neurosci.)16359-367，1994)。在基质隔室中的中等棘状GABA能神经元最易受影响，特别是投射到GPe的GABA/脑啡肽能神经元(Albin等，1989，见上文)。也在基质隔室中发现的大的非棘状胆硷能中间神经元和含有生长抑素、神经肽Y和NADPH-黄递酶的小的非棘状中间神经元则相对地被闲置(Ferrante等，科学(Science)230561-563，1985；Reiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855733-5737，1988)。然而，在HD更进一步的发展阶段，神经元变性包括各型纹状体神经元和蔓延到基底神经节、大脑皮质、下丘脑和小脑的其它核。
帕金森病(PD)的特点是静止性震颤、强直、不能初始运动(不能运动)和运动缓慢(运动迟缓)(Marsden，Lancet 335948-952，1990)。与运动缺损有关的是多巴胺能黑质纹状体通路的进行性变性，和不同程度的听神经核多巴胺神经支配的缺失以及蓝斑去甲肾上腺素能细胞和缝的5-羟色胺能神经元变性有关(Javoy-Agid等，神经病学进展(Adv.Neurol.)40189-198，1984；Agid，Lancet 3371321-1327，1991)。在明显的运动缺损出现以前，高达80％的黑质多巴胺神经元可能缺失。
在神经变性性疾病的治疗中，使用已知为神经营养因子的肽类作为治疗剂的主要策略之一是抑制变性过程和提高残余细胞的功能。在下面实施例中的研究将阐明本发明如何开拓除了以前已经提示之外的神经营养因子的应用。
II.神经缺损的治疗如下面的实施例证实的那样，成人前脑室管膜下区的神经元前体可能对输注结合EGF受体的多肽(例如，TGFα；这里使用的术语“多肽”是指任何氨基酸残基链，而不考虑长度或翻译后修饰)反应，而被刺激增生并且全部移行进入中枢神经系统(CNS)(例如，进入纹状体)。另外，人们可以把增生细胞作为致密嵴定向移行。如下面所述，定向移行可按不同方式完成。例如，它通过被靶区域的去神经(它可通过神经化学或机械力来达到)、通过使用多肽生长因子(例如，TGFβ，它增加细胞粘附分子(如纤连蛋白和层粘连蛋白)的区域性表达)，和通过将细胞沿着所需移行的通路与对抑制移行的自然发生信号具有抑制作用的化合物进行接触来进行(即，通过抑制一种抑制剂而创造一个许可的微环境)。
此外，移行嵴的形状可通过改变输注位置加以控制(例如，通过变更输注套管或含有本发明活性成分的生物降解性胶囊的位置)。相似地，嵴内的细胞数目可以通过改变活性成分的剂量来控制(例如，TGFα的剂量)，或者通过改变释放化合物相对于室管膜下区域神经前体细胞群的距离。如下面所述(如表10A，10B，11A，11B和11C所说明的)，当动物接受了中纹状体或中层纹状体输注时，移行细胞在它们到达输注插管以前即停止，产生S-型或L-型嵴。这样，不仅可能促进细胞的移行而且可能控制移行的终点。调节生长因子(和也许其它的成分)释放的剂量和部位可以使受影响的区域限制到一个相对局限的靶区域。
在成年哺乳动物脑中神经系统前体细胞的增生和移行是可以独立控制的不同的过程。没有传入神经阻滞的TGFα或EGF脑室内(ICV)或纹状体内输注能诱导增生，但是变性的、损伤了的(例如，因传入神经阻滞或其它损伤)，或者其它异常的(即，机能不良)细胞一定表现出促进移行的程度至少足以影响神经缺损的修复。如下面进一步所述，人们可以模仿药物对变性的、损伤的或其它异常细胞的促进作用。例如，通过给药一种诱导化合物刺激纹状体中细胞粘附分子的短暂表达。例如，在小脑星形胶质细胞培养物中，转化生长因子β(TGFβ)使纤连蛋白强有力地上调(Baghdassarian等，Glia 7193-202，1993)。在过度表达TGFβ的转基因小鼠中，纤连蛋白和层粘连蛋白在中枢神经系统也大大增加超过了正常水平(Wyss-Coray等，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.).14753-67，1995)。这样，用刺激细胞外基质分子或细胞粘附分子表达的任何化合物来指导移行，特别是沿着所需移行通路的定向移行也认为是在本发明的范围之内。
前脑神经干细胞，即引起移行的祖细胞，据信停留在沿着脑室壁的适当位置(Morshead等，神经元(Neuron)131071-1082，1994)。在下面描述的实验中，在移行嵴进入纹状体之后，强的EGF受体杂交区域继续沿着侧脑室停留。此外，在嵴和侧脑室之间总能发现伸长的细胞。这样，尽管整个细胞团移行离开室管膜下区域，但干细胞本身可能不是移行嵴的部分。这些神经干细胞提供新神经元和神经胶质细胞的可再生来源。因此可刺激神经祖细胞的多个波以移行进入受损的、或者已变性的或者其它与神经缺损有关的脑区域。这些细胞的持续性也提示成年前脑中的干细胞的正常功能--目前认为是为嗅球提供新神经元--不应该被治疗不可逆地打断。
TGFα(及其mRNA)的纹状体大量表达和多巴胺能神经支配的缺乏也是发育早期纹状体的特性(Weickert和Blum，脑研究进展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995；Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.2163-175，1984)。相似地，在TGFα-输注动物中室管膜下区域EGF受体mRNA表达的增加，拟似在发育期脑室周神经上皮中所见到的大量EGF受体mRNA杂交(Seroogy等，脑研究(Brain Res.)670157-164，1995)。编码可以促进神经祖细胞移行的粘连蛋白、其受体和其它细胞粘附分子的信使RNAs也被发育性调节(Pesheva等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)20420-430，1988；Prieto等，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)111685-698，1990；Pagani等，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)1131223-1229，1991；Linnemann等，国际神经科学进展杂志(Int.J.Devel.Neurosci.1171-81，1993)。这样，如在本研究中输注TGFα和6-OHDA损伤的动物中观察到的效果概念化的一种方式是如对胚胎神经发生的选择性概括那样。即，成年哺乳动物脑中的神经干细胞可以对增生信号作出反应，它们的子代细胞可以对移行信号作出反应，就象它们在发育期动物中所进行的那样。
近来，在成年啮齿动物CNS整个室管膜下(Weiss，Soc.Neurosci.Abstr.25101，1995；Ray等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.5，1996)和在成年人前脑的室管膜下(Kirschenbaum等，脑皮质(Cerebral Cortex)4576-589，1994)已经发现了神经干细胞。按照本文中描述的方法，可以利用这些细胞为脑和脊髓不同区域的病态的、受损的、或其它损伤的或机能不良的CNS神经元提供一种新的神经元来源。
A.本发明的优点如下面进一步所述，提出的治疗神经病缺损的技术之一涉及从有此类缺损的病人中取出神经前体并使这些前体在培养基中生长以产生大量神经祖细胞。然后应用本领域普通技术人员已知的技术将这些祖细胞重新植入同一病人(例如，见Stein等，在脑修复(Brain Repair)第87-103页，牛津大学出版社，纽约，1995，或leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)。很显然，该技术对于那些目前需要使用来自流产胎儿胚胎细胞的技术来说是先进的；它完全避免了由于需要使用流产胎儿作为组织供体而引发的伦理问题。另外，由于它不会刺激引起较高移植排斥发生率的免疫反应，所以它更可能会成功。
在体内刺激神经前体的增生和移行还有另外的优点；体内刺激降低了攻击性神经外科操作的程度和可能的数量。不进行干细胞切除手术，使用胚胎的或培养细胞移植物时通常需要的多样移植细胞栓将不再是必需的。此外，不会有由于移植过程引起的未分化神经祖细胞的大量消亡。通常，使用人胎儿的多巴胺能细胞移植，90％到超过99％的植入细胞在它们在宿主脑内建立以前死亡(Freed等，Soc.Neurosci.Abstr.22481.3，1996)。
本发明提供的另一个优点是神经祖细胞不通过瘢痕组织从宿主脑分离出来。移植细胞栓被包封在胶质疤痕组织与反应性星形胶质细胞的壳内。除了致密胶质组织的物理屏障外，疤痕组织内反应性星形胶质细胞释放抑制轴突自然伸长的因子(Mckeon等，1995)。在体内产生的神经祖细胞不是通过疤痕组织从脑的其它部位分离的。因而，其轴突的自然生长不会因为反应性星形胶质细胞大量增生而受到限制。因此，本发明提供的定向移行允许大量新细胞选择性地在CNS特定损害区域再集聚(其在程度上可以不同)而不干扰未损害区域。
本发明的技术也较以前在体内进行的刺激前脑神经干细胞的单一研究有了进步。在那项研究中，成年大鼠接受EGF的ICV输注6天，接着高达7周的后输注(Craig等，神经科学杂志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，TGFα输注14天，接着输注小于3个月结束输注。其差别是关键的，因为仅在本研究中室周扩展的细胞以整体移行进入下覆的纹状体中。神经祖细胞团定向移行进入选择的靶区域代表一个非常优选使新神经元再集聚在变性的脑区域的方法。
近来非常感兴趣的一个领域是控制神经干细胞分化。一旦干细胞已经分化，细胞的最后定位和神经化学表型则是最重要的并且在下面将进一步讨论。
当神经前体细胞从成年啮齿动物脑中取出并在体外分化时，可见到免疫化学性地识别为星形胶质细胞、少突神经胶质细胞和神经元的细胞(Reynolds和Weiss，科学(Science)255.1707-1710，1992；Reynolds等，J.Neurosci.124565-4574，1992；Lois和Alvarez-Buylla，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902074-2077，1993)。许多识别为神经元的细胞对于在纹状体发现的两种正常细胞类型的神经化学标志物-GABA和P物质，也存在免疫反应。从成年人脑中移植的前体细胞也表达神经元的标志物并显示与神经元有关的神经元电生理特性(Kirschenbaum等，脑皮质(Cerebral Cortex)4576-589，1994)。
这些实验提示当纹状体嵴细胞在体内自发分化时，其中许多将变成具有纹状体神经元典型表型的细胞。最近一些数据提示它们的表型可通过暴露于不同联合的神经营养蛋白而被改变(Lachyankar等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.7，1996)。接受不同处理的前体细胞一旦分化，它们表达不同的神经化学免疫标志物，包括乙酰胆碱酯酶、GABA、，酪氨酸羟化酶(TH)和钙结合蛋白。TH的表达特别令人感兴趣，因为增生、移行和定向分化为多巴胺细胞的联合可以提供一种新方法来替代帕金森氏病(PD)中丧失的纹状体多巴胺。
在PD病人中，大量新的功能性产生多巴胺的纹状体细胞有助于逆转运动缺损，其方式类似于用流产胎儿的脑组织移植。在亨廷顿氏病(HD)病人中，神经前体会受到刺激而使新的中等棘状GABA能和其它神经元在纹状体处再集聚，而在该疾病时中等棘状GABA能和其它神经元丧失。近来某些来自不同研究领域的证据指出纹状体苍白球通路本身的重建也许是可能的。移植进入纹状体的在条件控制下不死的神经前体细胞分化并且把突起从纹状体发送到苍白球(Lundberg等，1996)。
B.可治疗的神经缺损由于本发明建立在多潜能前体细胞受到刺激而在脑内分化和移行的发现上，所以它被用来治疗由各种各样的疾病、障碍和损伤引起的神经缺损。这些损伤包括，但不限于，下列所述(本领域技术人员可以对下面所列的不同疾病和障碍进行分类；然而归类的有关神经缺损按照本发明方法是可以治疗的)。
1.变性疾病按照本发明方法可以治疗的变性疾病包括阿耳茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、匹克氏病、进行性核上麻痹(PSP)、纹状体黑质变性、皮质-基底节变性、儿童期分裂症、橄榄体脑桥小脑萎缩症(OPCA；包括可遗传的类型)、莱内氏病(Leigh disease)、婴儿坏死性脑脊髓病、亨特氏病(Hunter’s disease)、粘多糖病、各种脑白质营养不良(如克腊伯氏病(Krabbe’s disease)、家族性脑中叶硬化(Pelizaeus-Merzbacher disease)等等)、黑蒙性(家族的)白痴(amaurotic(familial)idiocy)、库福斯氏病(Kuf’sdisease)、家族黑蒙性白痴(Spielmeyer-Vogt disease)(少年型)、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs disease)、巴氏病(Batten)、Jansky-Bielschowsky病、Reye氏病、小脑共济失调、慢性酒精中毒、脚气病、哈斯二氏综合征(Hallervorden-Spatz syndrome)、小脑变性等等。
2.中枢神经系统外伤和神经毒损伤按照本发明方法治疗的外伤和神经毒损伤包括枪击伤、钝伤、穿透伤(如刺伤)、手术操作过程中造成的损伤(例如，从中枢神经系统中切除肿瘤或脓肿或治疗癫痫)、中毒(例如，MPTP或一氧化碳引起的中毒)、婴儿颤抖综合征、药物的不良反应(包括特应性反应)、药物过量(例如，苯丙胺过量)、创伤后脑病等等。
3.局部缺血神经系统供氧和血流的任何中断均可能损伤或杀死其中的细胞，包括神经元和神经胶质细胞。按照本发明方法可以治疗这些损伤和包括发作(包括全身发作(如可能起因于心脏骤停、心律失常或心肌梗塞)或病灶发作(如可能起因于血栓、栓子、出血或其它的动脉阻塞))引起的损伤、缺氧、低氧、不完全淹溺、肌阵挛、严重吸烟、张力障碍(包括遗传性张力障碍)、后天性脑积水等等。
4.发育障碍本发明方法可以治疗的发育性障碍包括精神分裂症、某些严重的精神发育迟缓、大脑性瘫痪(不论引起的原因是否是感染、缺氧、早产、血型不合等等和不论表现是否为视觉缺失、聋、迟缓、精细运动不能等等)、先天性脑积水、影响CNS的代谢障碍、严重的孤独症、Down综合征、LHRH/下丘脑障碍、脊柱裂等等。
5.影响视觉的障碍本发明方法可以治疗影响视觉的障碍，特别是那些因视网膜细胞缺失或衰竭引起的障碍。这些障碍包括糖尿病性视网膜病、严重的视网膜脱离、与青光眼有关的视网膜损害、视网膜创伤性损伤、视网膜血管闭塞、黄斑变性、遗传性视网膜营养不良、视神经萎缩和其它视网膜变性疾病。
6.脊髓损伤和疾病本发明方法也可以治疗影响脊髓的损伤和疾病。这种损伤或疾病包括脊髓灰质炎后遗症、肌萎缩性侧索硬化、非特异性脊髓变性、外伤损伤(如机动车或运动事故引起的损伤，包括挤压、部分离断、完全离断的任何损伤、或者影响脊髓细胞功能的其它有害方式)、脊髓手术引起的损伤(例如，切除肿瘤)、前角细胞疾病、麻痹性疾病等等。
7.脱髓鞘或自身免疫性疾病本发明方法可以治疗由脱髓鞘或自身免疫反应引起的神经缺损。该缺损可能由多发性硬化、狼疮和其它原因引起。
8.感染性或炎症性疾病本发明方法可以治疗由感染性或炎症性疾病引起的神经缺损。能够引起可以治疗的缺损的感染性或炎症性疾病包括痉挛性假硬化和其它慢性病毒感染性疾病、AIDS性脑病、脑炎后帕金森氏综合征、病毒性脑炎、细菌性脑膜炎和由其它微生物引起的脑膜炎、静脉炎和颅内静脉窦血栓静脉炎、梅毒性帕金森氏综合征、CNS结核等等。
9.其它本领域普通技术人员能很好地认识无论什么原因的神经缺损，并且能应用本发明方法治疗有这种缺损的病人。除了上面所列的病症外，本发明方法还可以治疗下述原因引起的神经缺损施莱奈恩二氏综合征、重症肌无力、各种痴呆、大量由寄生虫引起的疾病、癫痫等等。本发明方法可以很方便地用于减轻由这些和其它疾病、障碍或损伤引起的神经缺损。
C.与EGF受体结合的多肽1.EGF家族EGF家族中的多肽在某种程度上似乎是独立的。例如，TGFα和EGF仅有30％结构同源性(Marquardt等，科学(Science)2231079-1082，1984)。然而，它们显示相似的结合动力学，并刺激分子量为180,000的EGF膜受体酪氨酸-特异性磷酸化(Cohen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2554834-4842，1980；Reynold等，自然(Nature)292259-262，1981)。两种生长因子功能上的等同，部分与六个半胱氨酸残基的相对位置相同有关，在共有序列CX7CX4，5CX10CXCX8C中用”C”表示半胱氨酸残基。这些保守残基产生类似的二硫键-介导的结构约束，并因此形成相关的三维结构(Twardzik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825300-5304，1985)。本领域普通技术人员能够很好地将已知的任何氨基酸序列与EGF-家族共有序列进行比较以决定一个多肽是否有可能与EGF在功能上相等(如果如此的话，则适用于本发明方法)。(参见例如，Blomquist等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817363-7367，1984，描述了揭示半胱氨酸和甘氨酸残基在EGF、TGFα和牛痘病毒19kDa早期蛋白的序列中的相似模式的计算机检索)。
除EGF、TGFα和牛痘病毒(VGF)以外，已知EGF家族包括双调蛋白(AR)、β-动物纤维素(BTC)、(epiregulin)(ER)、肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)、神经鞘瘤-衍生的生长因子(SDGF)、HUS 18878、粘液瘤病毒生长因子、休普氏纤维瘤病毒和畸胎瘤-衍生的生长因子-1(TDGF-1；也称为Cripto-1(CR-1))。
2.测定EGF受体结合的方法本领域普通技术人员能够方便地测定任何已知的多肽是否与EGF受体结合。这里使用的术语“结合”指多肽和EGF之间任何特异性相互作用，其中这种相互作用导致足够信号传导以引发生物反应，优选是导致减轻神经缺损的反应。优选地，适用于本发明方法的任何已知多肽将与EGF受体结合，其中亲和力至少为EGF本身结合亲和力的50％，更优选至少70％，最优选至少90％(见Twardzik等，见上文，VGF、TGFα和EGF在EGF受体结合方面的生物活性比较)。
如果在进行EGF受体结合试验中需要指导，本领域技术人员可查阅描述适宜方法的多种出版物中的任何一本(与该主题有关的5本出版物在此全面引用)。例如，可以参阅Cohen和Carpenter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721317-1321，1975)或者，它们的修订版，Twardzik等，见上文。类似地，对于EGF受体，包括特异性结合和序列信息、信号和受体拓扑学，可以参阅例如，McInnes和Sykes(生物聚合物(Biopolymers)43339-366，1997)，Boonstra等，(国际细胞生物学(Cell Biol.Intl.)19413-430，1995)，或Gill(分子生殖发育学(Mol.Reprod.Dev.2746-53，1990)。
D.定向移行下面的实施例也提供神经前体细胞成功地定向移行的证据，特别是在成年啮齿动物前脑。在下面的操作实施例中使用的免疫组化和其它技术(和其中详细描述的)，以及本领域普通技术人员常用的可比技术，可用于确定任何生长因子输注或任何其它用于引导细胞移行的刺激物的作用。的确，可以追踪细胞移行的某些细节(即，可测定神经系统内细胞数量、它们的大小、形状和位置)。
在体内，各种刺激可用于细胞以定向引导全部细胞的移行(术语“全部”，在这里用于描述细胞移行时，是指细胞群基本上向相同方向移动足够时间被看成一团(正如图9、10和11所显示的那样))。广义地，可以按一种或两种方式定向移行(1)助长(conducive)方式，即，使用正向吸引移行细胞的刺激物(如增加细胞粘附分子或细胞外基质分子(例如粘连蛋白、层粘连蛋白或神经细胞粘附分子)表达的化学吸引剂、神经营养因子或化合物(如TGFβ))，或者(2)允许方式，即，通过使用抑制那些会抑制移行细胞的信号的刺激物。
定向移行的刺激包括在靶区域(可以是细胞已被破坏的部位，例如，纹状体或黑质，在这些部位已知多巴胺能细胞毁损与大量衰弱性神经变性疾病有关；大脑皮质，此处神经元和神经胶质毁损是由血栓或栓塞发作后引起的局部缺血所致；或者脊髓，此处运动神经元由于例如创伤而被毁损；或者由于发育障碍使细胞形成异常联系的任何部位)中组织损伤。另一方面，可以在从神经祖细胞发源地向其所需移行终点伸出的通道内或沿着此通道损伤组织。
组织可以下列方式受损伤物理力(例如，腐蚀或切除神经元，或切断一种或多种由神经细胞体伸出的突起)、使用化学物质如毒素或神经毒素(例如，蓖麻毒或6-OHDA)、腐蚀性化学制剂(例如，酸或碱溶液)、诱导细胞程序性死亡的化合物(参见例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)、或者诱导脱髓鞘作用的化合物(参见例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.231689，1997)、或能够抑制细胞活性的化合物，例如反义寡核苷酸(如抑制编码细胞主要神经递质基因的转录)、抗体或多肽。许多此类化合物为本领域技术人员所熟知，并且包括那些与细胞表面受体结合但未能激活受体的化合物，例如metabotropic受体通常被谷氨酸盐结合的。例如，在下面描述的研究中，利用6-OHDA(与输注TGFα一起)的去多巴胺神经作用对细胞移行的影响是显然的。
本领域普通技术人员使用上述任何一种化学物质能够很好地将细胞定向移行到神经系统的靶区域，特别是现在可以用例如核磁共振成像或计算机断层扫描生成的异常清晰和精确的病人脑和脊髓的图像而确定靶部位。
此外，下面描述的研究可以看出，改变与定向移行所用化合物有关的一种或多种变量(变量包括性质、部位、浓度和使用时间)来影响细胞沿着更精确的途径定向移行并确定细胞要到达的位置。
E.分化因子尽管一些神经前体细胞在给予足够长的时间内可以自发地进行分化，但是通过控制什么时候和在哪里发生分化将会极大地受益；对此加以控制使得人们可以把神经“再生”(再生可以是部分或全部，只要它足以减轻神经缺损即可)限制在其需要的CNS区域。因此，在神经祖细胞与结合EGF受体的多肽接触之前、期间或之后，可给予各种刺激。
广义地说，诱导分化的刺激可包括“普通”分化或“定向”分化。普通分化刺激是刺激细胞以其天然方式进行分化，在通过刺激细胞表达其天然表型即可以减轻神经缺损的情况下使用。例如，本领域已知，一旦暴露于普通分化信号，纹状体室管膜下区细胞分化成GABA能神经元。这样，通过使用普通分化因子刺激这些细胞分化将会减轻与亨廷顿氏病(Huntington’s disease)有关的神经缺损；此疾病患者中，GABA能介质棘状神经元选择性丧失。
本领域普通技术人员能够很好地使用刺激普通分化的已知方法来刺激细胞增生和移行。例如，已知将细胞与成视网膜细胞瘤蛋白接触以使细胞退出细胞周期，退出细胞周期这是分化所必需的(参见最新研究，Slack等，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)1401497-1509，1998)，和将细胞与细胞周期有关的激酶抑制剂-p21接触，可以使细胞保持在有丝分裂后期(即，分化的)(Berger等，Soc.Neurosci.Abstr.22505；1996)。在本文方法中可用于刺激分化的另一刺激是细胞周期蛋白D细胞周期调节剂(Ouaghi等，Soc.Neurosci.Abstr.221706，1996)。如果希望刺激少突神经胶质细胞前体分化，则可以使用整联蛋白(参见例如，Buttery等，Soc.Neurosci.Abstr.221723，1996)。众所周知脑衍生神经营养因子(BDNF)和视黄酸(RA)刺激细胞分化的能力(参见例如，Ahmed等，神经科学杂志(J.Neurosci.)155765-5778，1995)。
如果神经前体细胞在定向移行之前被培养，则它们可被移植入能够影响它们分化的脑区域。例如，当位置靠近室下区时，与移植到更外侧位点(仅有0-8％细胞分化)的神经前体细胞相比，高百分比的移植神经前体细胞分化成神经元(高达35％)(Catapano和Macklis，Soc.Neurosci.Abstr.23345，1997)。类似地，当将小脑前体细胞移植进海马时，小脑前体细胞表达海马神经元的标志物(Vicario-Abejon等，神经科学杂志(J.Neurosci.156351-6363，1995)。因此，本领域普通技术人员将理解到，作为增生性神经祖细胞的子代与刺激祖细胞分化的化合物接触的另一种方法，可通过将细胞移植入能够诱导其分化的脑区域内或者足够近的区域来完成本发明。
定向分化刺激是刺激细胞分化，但表型与其天然表达的不同的刺激。当可通过刺激细胞表达非天然表型而减轻神经缺损时，可使用定向分化因子。此种情况的一个例子是帕金森氏病，纹状体细胞分化成产生多巴胺的细胞替代黑质中多巴胺能神经分布的丧失。类似地，人们设法刺激胆碱能表型在中隔区的表达，此区细胞在阿耳茨海默氏病时选择性丧失；在脊髓运动神经元的表达，肌萎缩性侧索硬化和创伤性脊髓损伤后脊髓运动神经元丧失；以及在少突神经胶质细胞的表达，少突神经胶质细胞在诸如多发性硬化等脱髓壳疾病中丧失。
衍生自神经胶质细胞株的GDNF/营养因子(TGFβ)家族的因子，可诱导神经细胞分化(而且，被RA增强)(Hishiki等，癌症研究(Cancer Res.)582158-2165)，在大鼠中脑培养基中，GDNF刺激运动神经元分化。BDNF和睫状神经营养因子(CNTF)也促进运动神经元分化(它们的作用对于GDNF的作用似乎是相加或协同作用)(Zurn等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)44133-141，1996)。另外，使用在神经管腹侧区表达的球联蛋白(Martinez-Morales等，发育(Development)1245139-5147)和声刺猬(sonic hedgehog)编码的蛋白质(Tanabe等，现代生物学(Curr.Biol.)565l-658，1995)可以诱导运动神经元分化。声刺猬家族的成员之一，印度刺猬，在发育和成熟视网膜中表达并促进视网膜祖细胞增生和光感受体发育(Levine等，神经科学杂志(J.Neurosci.)176277-6288，1997)。
皮质神经祖细胞采用受EGF、TGFα和生长所基于的底物类型影响的区域特异性表型。将EGF或TGFα放到生长因子缺乏的MatrigelTM或IV型胶原上，使得衍生自非-边缘区域祖细胞的边缘神经元的百分比加倍(Ferri等，发育(Development)1211151-1160，1995)。
已知胰岛素影响胎儿神经细胞培养物的分化，甚至超过IGF-1(Abboud等，Soc.Neurosci.Abstr.231425，1997)。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和神经营养蛋白可用于海马细胞的定向分化(Vicario-Abejon等，神经元(Neuron)15105-114，1995)。
在一实施方案中，本发明方法可用于修复退行性疾病丧失的神经通路。例如，基于其分化，分化的纹状体GABA能神经元可修复纹状体苍白球投射。本领域普通技术人员能够很好地认识到，本发明方法能够使大量神经通路重建。
F.药物组合物适宜在本发明使用的多肽(即，那些与EGF受体结合或促进分化的多肽，这里也称作“活性化合物”)可掺入到适于给药的药物组合物中。这些组合物通常包含一种或多种多肽和“药学上适用的载体”，药学上适用的载体是指在包括与给药的药物相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等等。使用的介质和试剂是本领域所熟知的。除了任何常规介质或试剂的范围内与活性化合物不相容外，考虑了它们在组合物中的应用。
本领域普通技术人员将药物组合物按它们打算给药的途径(可以包括肠外，如静脉、皮内或肌内注射；口服给药；或直接用于受影响区域)进行配制。设想本方法是这样进行的把多肽用于从脑部采集并放入培养基中的神经元前体中或直接体内用于前体细胞中(例如，通过注射小管或分流器输注，或者通过装入一个载体如生物降解胶囊内而植入)。但是其它给药途径，特别是胃肠外(优选静脉内)给药，也包括在本发明范围之内。
适用于本发明药物组合物的溶液或悬浮液(例如，在包含与EGF受体结合的多肽和促进神经元前体分化的化合物的组合物中)可以包括无菌稀释剂如水、生理盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌或抗真菌剂如苯甲醇、对羟基苯甲酸酯(如对羟基苯甲酸甲酯)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等；抗氧剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；交联剂如EDTA；缓冲液如乙酸、柠檬酸或磷酸；和调节张力的物质如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱来调节，如盐酸或氢氧化钠。
适于注射的药学组合物包括无菌水溶液(其中活性化合物是水溶性的)或分散剂和为临时配制无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。对于静脉内给药，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐液(PBS)。所有情况下，组合物必须是无菌的，而且应当为容易通过注射器的流体(可以保持适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，在为分散剂时通过维持一定粒度和通过使用包括表面活性剂)。如上所述的组合物必须在制备和贮存条件下稳定，并且必须进行抗微生物如细菌和真菌污染的防腐处理。许多情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。在组合物中包含延缓吸收物质，如单硬脂酸铝和明胶，可以实现延缓注射组合物吸收的目的。
将活性化合物(如，结合EGF受体的多肽)按其所需的量掺入到适宜溶剂及如所需的上述列举的一种或联合的配合剂中，然后过滤灭菌，可以制得灭菌注射组溶液。通常，通过将活性化合物掺进包含基本分散介质和上述列举配合剂中所需的其它组分的灭菌载体中而制得分散剂。在为配制灭菌注射溶液的灭菌粉末形式时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，它产生活性化合物加上得自前述灭菌过滤溶液的任何其它所需的组分的粉末。
在一实施方案中，活性化合物是与保护它不被机体快速清除的一种或多种载体一起制备，如控释制剂，包括植入体和微囊释放系统。可使用生物降解、生物相容性聚合物，例如乙烯基醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。材料可通过商业渠道获得，例如，购自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂质体悬浮液也可用作药学适用载体。这些可按照本领域已知的方法制备，如在美国专利4522811中所描述的方法。
将本发明组合物制成方便给药的剂量单位形式和均一剂量是尤为有利的。这里所说的剂量单位形式是指适合接受治疗者作为单位剂量使用的物理独立的单位形式；每一单位包含为产生期望治疗效果而计算出的预定量的活性化合物和相关的所需药学载体。对本发明剂量单位形式的说明由下面因素决定或直接依赖于它们活性化合物的独特的特性、要达到的特定治疗效果和合成该用于治疗个体的活性化合物的现有技术中的固有局限性。
作为直接应用结合EGF受体或促进细胞分化的多肽的替代，可将编码这些多肽的核苷酸分子插入到载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过例如静脉注射、局部给药(美国专利5328470)或通过立体定位注射(参见例如，Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057，1994)输送给个体。基因治疗载体的药学制剂可以包括在可适用稀释剂中的基因治疗载体，或者包括包埋在缓释基质中的基因治疗载体，例如，在脑和脊髓中。另一方面，如果完整基因释放载体能够从重组细胞完整无缺地产生的话，例如逆转录病毒载体，则药学制剂可以包括已知或多种产生基因释放系统的细胞。
药物组合物可与给药说明书一起装入容器、包装盒或分散器中。
G.治疗方案通过实施例(本领域普通技术人员从一个模型(无论是体内还是体外模型)能够很好地推导到另一模型，朝着对患者最适剂量进行)，对于啮齿动物脑，刺激神经元前体细胞增生的输注至少持续2周的期间。结果是沿着脑室交界的未分化祖细胞数量明显增加。下面的工作实施例中，连续输注TGFα也支持放射状细胞移行，但在某些动物观察到，靠其自身尚不足以刺激大量放射状移行。根据本发明方法，所进行的任何治疗的期间可依所期望的结果不同而异。例如，在下面工作实施例中，在细胞团从脑室移行开之前的一周多的期间细胞数量大大增加。另外，靶区的去神经支配(神经化学的或机械的方法)促进迟延移行，并且同时输注的因子如另一神经营养因子-TGFβ也可药理学地促进迟延移行，TGFβ增加细胞粘附分子区域性表达，所述细胞粘附分子被认为是放射状移行(如上所述)的基础。移行细胞嵴的移行模式和最终定位可以通过改变输注位置来控制。
本领域普通技术人员能够很好地决定在本发明中施用的化合物的所需剂量。优选地，无论输注还是从缓释载体中释放，活性化合物或组分(例如，TGFα或上述任何因子)的给药剂量范围为1～100ng/kg/天；更优选施用1～50ng/kg/天；最优选1～10ng/kg/天。
实施例实施例1在正常发育和成年黑质纹状体系统中TGFα和EGF受体mRNAS的表达正如在发明详述中所述，在黑质纹状体系统中编码EGF-家族神经营养因子的mRNA被发育性调节。在下述研究中，检测TGFα和EGF受体mRNA在正常发育和成年啮齿动物系统中的表达。
A.动物和组织准备成年雄性和雌性Sprague-Dawley孕鼠(250-350g)购自Simonsen(Gilroy，CA)。在这些实验中和这里描述的所有其它实验中，动物保持在室温和湿度控制的动物园中。依照国立卫生研究院的准则，所有实验过程中动物的使用均得到加利福尼亚大学Irvine动物研究协会的批准。
新生(P0)、生后1天(P1)和P4动物低温麻醉并用断头术处死。P10，P21和成年动物用断头术处死。快速取出它们的脑，在-20℃异戊烷中冷冻并贮存于-70℃。在低温恒温器上切下20μm的冠状面切片，并按由前-到后排的顺序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆盖的载玻片上。将切片用0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)配制的4％低聚甲醛后固定1小时，磷酸缓冲液洗涤，空气干燥。切片与干燥剂一起在-20℃贮存待用。
B.杂交探针用大鼠TGFα 5’末端550个核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段制备TGFαmRNA探针，并亚克隆进pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反义和正义探针分别用SP6和T7聚合酶转录。在pGEM 7Zf中，用来自该基因5’末端长度为718碱基对的插入片段制备大鼠EGF受体mRNA探针。使用亚克隆进pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段制备大鼠TH的探针。用T7聚合酶转录EGF受体和TH的反义亚克隆。用SP6聚合酶转录EGF受体和TH的正义亚克隆。在存在[35S]UTP时，所有探针转录时被标记(NEN Research Products，Inc.)。
C.原位杂交和分析按照Simmons等(组织学技术杂志(J.Histotech.)121169-181，1989)描述的方法进行原位核苷酸杂交，除开发育脑用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA处理外。切片在65℃与浓度为107cpm/ml的正义或反义探针杂交过夜。取自同一动物的相邻切片与每一个探针杂交，以便于直接比较它们的解剖学分布。
取自发育和成年动物的玻片按组放置并放在14C-标记的脑浆标准品的近处以使BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自显影6到7天。在成功地显影放射自显影胶片后，将玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自显影单张胶片和NTB-2乳液用D-19显影剂显影并快速定影(Kodak，Inc.)。然后用硫素复染并加盖玻片。半定量分析浸泡和染色的切片并在明和暗视野显微镜下照相。
自出生后初期发育到成年期选择时间点跟踪TGFα和EGF受体mRNA在黑质纹状体系统的表达。发现TGFα mRNA杂交在出生后初期的纹状体中非常丰富，然后逐渐降低，到P21时接近成年水平。在胼胝体的表达于出生后发育期增加到与在纹状体中可比的水平。在发育期或成年黑质中未检测到明显丰富的TGFαmRNA。
纹状体EGF受体mRNA在生后发育初期达高峰，到P21又下降。EGF受体在侧脑室周围的神经上皮中含量最高，但在纹状体体部也发现有中等水平。在发育期腹侧中脑，EGF受体mRNA仅在出生后初期的脑中能够检测到，但逐渐增加，到P21天时达中等水平。
在成年动物，TGFαmRNA在纹状体中度表达，在腹侧纹状体和听神经核低-到-中度表达。发现EGF受体mRNA在纹状体体部杂交水平低，而在听神经核有遍布分散的较高的点状表达，在紧靠侧脑室边缘的纹状体区域保持中等水平。
在成年腹侧中脑，在黑质(SN)，特别是中部致密区(medial parscompacta)，及腹侧盖区(VTA)的黑质旁(paranigral)和鳃旁核(parabranchial)发现EGF受体mRNA杂交。
前述研究表明，TGFα和EGF受体mRNA在黑质纹状体系统个体发育过程中被强烈调节，它们在成年的表达主要代表发育模式的继续(Lazar和Blum，神经科学杂志(J.Neurosci.)121688-1697，1992；Weickert和Blum，Devel.Bain Res.86203-216，1995)。发育和成年动物的TGFα和EGF受体mRNA杂交与这些早期报道的发现极为相似。它们在成年纹状体和中脑的持续性与其在成熟黑质纹状体系统的支持作用是一致的。
EGF受体mRNA在成年动物沿着前脑室外侧室管膜下区的适当表达表明在此区域维持作用或细胞功能(Seroogy等，脑研究(Brain Res).670157-164，1995；Weickert和Blum，1995，见上文)。已表明TGFα(或EGF)支持来自此区域而在体外移植和生长的“EGF-敏感”细胞的存活和分化(Reynolds和Weiss，科学(Science)2551707-1710，1992；Reynolds等，神经科学杂志(J.Neurosci.)124565-4574，1992)。在体内发育期，它可能起着类似功能。
实施例26-羟多巴胺损伤和纹状体TGFα输注对TGFα和TGF受体mRNA表达的调节。
原位杂交用于测定黑质纹状体TGFα或EGF受体mRNA是否受到纹状体内输注TGFα的影响。此外，也检测了单侧6-OHDA损伤对输注和未输注动物受体表达的影响。
A.治疗组体重250-300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠购自Simonsen(Gilroy，CA)，分配到五个治疗组中的每一组(1)纹状体TGFα输注，黑质6-OHDA损伤(此后称“损伤”)；(2)TGFα输注，没有损伤；(3)人工脑脊液(aCSF)输注，损伤；(4)aCSF输注，没有损伤；(5)无输注，无损伤。每个实验组用4至8只动物。每次手术后监测动物直至完全康复，其它所有时间动物在温度和湿度得到控制的动物园中喂养。
B.6-羟多巴胺损伤用每公斤体重8mg赛拉嗪和100mg氯胺酮将大鼠麻醉。注射前立即用0.9％盐水和0.01％抗坏血酸配制4.8mg/ml 6-羟多巴胺盐酸冷溶液(6-OHDA；Sigma Chemical Co.)。使用灭菌技术，用耳间调零作参照，以1μl/分的速度定向注入左侧黑质(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)8μl(Paxinos和Watson，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates，Academic Press，San Diego，1986)。通过酪氨酸羟化酶(TH)mRNA在中脑的原位杂交监测6-OHDA损伤的成功和程度。TH是多巴胺合成通路的限速酶，并且是多巴胺产神经元的通用标志物。一只具有不完全损伤的动物(保留相当数量的黑质TH-IR细胞)排出在此研究之外，也未包括在总动物数量中。
C.输注损伤后4～5周植入渗透微型泵(型号2002，Alzet，Inc.)。对于实验动物，微型泵充有大约200μl人工脑脊液(aCSF)配制的0.05μg/ml TGFα，而对照动物，微型泵仅仅充有aCSF；在植入前于37℃孵育过夜。如上进行麻醉，在无菌条件下，利用前囟(Bregma)作参照，将联在微型泵上的5mm小管(脑输注工具箱，Alzet，Inc.)定向植入左侧尾-豆状核(+1.2A/P；+2.7m/l)(Paxinos和Watson，1986，见上文)，并用羧化物粘固粉固定到颅骨上(图1)。微型泵本身埋在肩胛间区的皮下。输注液在2周期间以0.5μl/小时的速度直接释入纹状体。
D.组织制备在输注期末，断头处死动物。快速取出它们的脑，在-20℃异戊烷中冷冻并贮存在-70℃。按20μm切下冠状面切片，并按由前-到后排的顺序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆盖的载玻片上。用0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)配制的4％低聚甲醛后固定1小时，用磷酸缓冲液洗涤，空气干燥。切片与干燥剂一起在-20℃贮存待用。
E.杂交探针用大鼠TGFα5’末端550个核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段制备TGFαmRNA探针，并亚克隆进pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反义和正义探针分别用SP6和T7聚合酶转录。在pGEM 7Zf中，用该基因5’末端长度为718碱基对的插入片段制备大鼠EGF受体mRNA探针。使用亚克隆进pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段制备大鼠TH的探针。用T7聚合酶转录EGF受体和TH的反义亚克隆。用SP6聚合酶转录EGF受体和TH的正义亚克隆。在存在[35S]UTP时，所有探针转录时被标记(NEN Research Products，Inc.)。
F.原位杂交和分析按照Simmons等(1989，见上文)描述的方法进行原位核苷酸杂交。除发育脑用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA处理外。来自实验和对照动物的平行切片在65℃与浓度为107cpm/ml的正义或反义探针杂交过夜。取自同一动物的相邻切片与每一个探针杂交，以便于直接对比它们的解剖学分布。
取自实验和对照动物的玻片按组放置并放在14C-标记的脑浆标准品的近处以BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自显影6到7天，玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自显影单张胶片和NTB-2乳液用D-19显影剂显影并快速定影(Kodak，Inc.)。然后用硫素复染并加盖玻片。
G.分析和定量检测浸泡和染色的切片并在明和暗视野显微镜下照相。使用MCID系统(Microcomputer Imaging Device，Imaging Research，Inc.)定量分析放射自显影。在感兴趣区域的每一解剖区域内多位点取样，读取密度计读数并进行平均。然后，从得自14C脑浆标准品的数据而用计算机-生成的三维多项式标准曲线中，可以估算TGFα和EGF受体杂交的相对浓度。接着，将每个治疗组的每个区域的估算值平均并计算标准误。实验处理的同侧脑区与相同切片的相应对侧区进行比较，或者与大致相同部位的对照脑的相应区进行比较。使用学生t-检验检测对比的显著性。
H.正常表达和控制输注在接受aCSF纹状体输注的对照动物中，TH、TGFα和EGF受体mRNA在纹状体、纹状体室管膜下区和SN的表达，与正常动物均无显著差异(见实施例1中正常发育和成年鼠的表达)。在整个SN-VTA，TH mRNA杂交显著。在SN未测到TGFαmRNA。然而，EGF受体mRNA在中脑黑质致密部(SNc)、paranigral、臂旁核和VTA的脚间核显著(图2)。
TGFαmRNA杂交在尾-豆状核和听神经核(NA)表达，在NA的密度稍低。发现在纹状体的整个体部EGF受体杂交水平低，而NA高的点状表达分散在整个低水平背景中，在沿着侧脑室的纹状体增生区是中等水平。
I.6-OHDA损伤的效果单侧黑质6-OHDA损伤使同侧纹状体TGFαmRNA杂交降低达25％，但不影响对侧TGFαmRNA杂交(图5)。损伤动物与正常动物比较，纹状体和室管膜下区EGF受体杂交没有变化(图6)。在中脑，6-OHDA损伤使同侧SN-VTAEGF受体杂交消失。
J.TGFα输注的作用在接受TGFα输注的未损伤动物，与对侧纹状体或正常动物纹状体相比，输注纹状体中的TGFαmRNA杂交没有变化(图5)。接受TGFα或aCSF输注的少数动物，在紧紧围绕输注插管疤痕处显示出TGFαmRNA杂交轻度增加。输注没有使TGFαmRNA杂交在黑质增加到可测到的水平。
在所有接受TGFα输注的动物，EGF受体mRNA杂交在同侧室管膜下区显著增加，但在纹状体其它区域没有增加(图6)。单独输注TGFα，在SNcEGF受体杂交与正常没有变化。
K.TGFα输注与6-OHDA损伤结合接受TGFα输注与黑质6-OHDA损伤的动物中的黑质TGFαmRNA杂交与仅损伤的动物没有区别(图5)。类似地，EGF受体杂交在TGFα输注/6-OHDA损伤动物的中脑与仅损伤动物没有区别。
除了室管膜下区杂交增加，前脑EGF受体mRNA杂交在同侧纹状体体部显示非正常的致密杂交嵴(图4，6和7)。在TGFα输注/损伤联合组的6只大鼠中有5只发现有嵴，但在TGFα输注/未损伤组6只大鼠中仅有1只有嵴。纹状体周围EGF受体杂交没有变化。
L.讨论上述结果允许能分析黑质6-OHDA损伤或纹状体输注TGFα，或者二者联合对编码TGFα和EGF受体的mRNA在成年啮齿动物黑质纹状体系统表达的调节作用。结果清楚地显示，表达的变化与每种单独处理相关，而且当两种处理结合时有独特的纹状体表达模式。
1. 6-OHDA损伤的作用在损伤后数周内，6-OHDA损伤中脑降低黑质TGFαmRNA杂交达25％。如果在该系统中TGFα肽的水平与TGFαmRNA的表达平行，那么TGFαmRNA的降低可能是啮齿动物损伤模型有别于原发性人PD的一个方面TGFα在PD病人纹状体中大大增加(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)。已经证实TGFα在体外增强大量测量多巴胺神经元的功能(Alexi和Hefti，神经科学(Neurosci)55903-918，1993)。因而，TGFα(和EGF及其它营养因子)的增加可能反映了对多巴胺神经元及其纹状体传出纤维的继续变性的反应，和可能与中脑的残留多巴胺细胞代偿纹状体多巴胺能神经支配的损失有关(Mogi等，1994，见上文)。这样，部分-或者或许慢性-损伤模型可能能够更好地代表人PD的这一方面。
多巴胺细胞损失时程的不同也有助于解释6-OHDA啮齿动物模型和人PD之间的显然差异。在大鼠模型，单剂量注射神经毒杀死中脑多巴胺神经元相对较快。而在人PD，中脑多巴胺神经元的慢性、进行性变性发生许多年。本研究中，动物在中脑多巴胺细胞变性后即被杀死。在这些动物中可能已经发生在我们的实验中不明显的纹状体TGFαmRNA表达的早期变化。在大鼠模型损伤后的更短期间，多巴胺神经元正在变性过程中时，测定TGFαmRNA表达如何变化将会是令人感兴趣的。
TGFαmRNA在尾-豆状核的中度表达，与它作为中脑多巴胺神经元靶-衍生的生长因子的推测作用是一致的。中脑损伤后它在同侧纹状体降低的原因不明。已证明多巴胺受体结合影响TGFαmRNA在下丘脑的表达(Borgundvaag等，内分泌学(Endocrinol)1303453-3458，1992)，但是在纹状体已证实没有这种相互作用。TGFαmRNA在正常成年啮齿动物纹状体的神经元亚群和神经胶质中表达(Seroogy等，神经化学杂志(J.Neurochem)601777-1782，1993)。纹状体多巴胺变性对TGFαmRNA在突触后神经元、星形胶质细胞或者二者的表达具有潜在的影响。
6-OHDA损伤对于对侧纹状体TGFαmRNA表达没有明显改变。这一发现也与多巴胺变性-介导的TGFαmRNA表达下降一致。仅有少量百分比的中纹状体(mesostriatral)多巴胺投射是对侧的(Loughlin和Fallon，Neurosci.Lett.3211-16，1982)，因此可以预见，与损伤同侧的作用相比，损伤引起的任何对侧调节作用都很小。
DA-去神经的纹状体中的EGF受体mRNA杂交与对侧CP或未损伤对照纹状体没有显著差异。还有，由于中脑损伤或输注插管的植入，损伤后数周或植入后2周也许已存在不明显的表达早期变化。损伤的SNc中EGF受体mRNA杂交消失证实了中脑前脑束6-OHDA损伤后所见到的类似结果(Seroogy等，神经报道(Neuroreport)6105-108，1994)。此前把损伤-诱导的减少引证为黑质多巴胺神经元表达EGF受体的证据(Seroogy等，1994，见上文)，但是由于受到周围黑质多巴胺神经元损伤或死亡的调节从而致使黑质产生EGF受体mRNA的可能性是存在的。有趣的是，对PD病人尸体剖检发现，其中脑EGF受体结合与正常人无异(Villares等，脑研究(Brain Res.)62872-76，1993)。所以，损伤后EGF受体mRNA表达消失是啮齿动物损伤模型与人PD之间的另一差异。由于TGFα在纹状体表达，部分-损伤模型的大鼠脑可能能够更好地模拟在帕金森氏病患者观察到的变化。
2.TGFα输注的作用在未损伤动物，输注TGFα或aCSF对中脑或纹状体TGFαmRNA杂交的正常水平没有显著影响。尽管有在其它组织或细胞类型自动刺激TGFα表达的报道(Coffey等，自然(Nature)328817-820，1987；Barnard等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26922817-22822，1994)，本研究结果没有提供在该系统中具有此活性的证据。早些研究中的自动刺激作用是在数个小时的程度上产生。本研究中脑组织是在连续暴露于生长因子两周之后取出的。这样，在后来消退的于一开始输注时的早期上调作用便不明显。
由于TGFα和EGF受体只在损伤动物转录，在实验处理一开始后的早期时间点检测调节时程将会是有趣的。TGFα-和aCSF-输注的纹状体中，在少数动物中发现紧靠输注疤痕处的TGFαmRNA轻度增加。因而，可能是输注插管本身而不是输注造成了继续的机械损伤和神经胶质增生。
TGFα输注显著增加同侧室管膜下区EGF受体杂交，对纹状体其它区域没有影响。在其它组织，EGF受体mRNA可受到数种化学或机械方式的调节。在体外，EGF肽增加大量哺乳动物细胞类型的EGF受体mRNA(Earp等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2614777-4789，1986；Kesavan等，肿瘤基因(Oncogene)5483-488，1990)。在正常啮齿动物成纤维细胞(Thompaon和Rosner，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2643230-3234，1989)和转移的大鼠肝脏细胞株中(Raymond等，细胞生长分化(Cell.Growth Diff.)1393-399，1990)，视黄酸引起类似的增加。自身或与EGF一起暴露于环己酰胺刺激培养的人细胞滋养层增加并稳定EGF受体转录，由此提供除增加转录方式之外的增加EGF受体mRNA总量的机制(Kesavan等，1990，见上文)。
横切大鼠坐骨神经引起切断末端EGF受体mRNA逐渐增加(Toma等，神经科学杂志(J.Neurosci.)122504-2515，1992)。用鱼精蛋白处理在体外增加小鼠和人细胞株中125I-EGF结合和细胞表面受体数量(Lokeshwar等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26419318-19326)。TGFα可能模拟这些作用并增加未毁的室管膜下区细胞EGF受体转录产生和/或寿命。它也可能刺激并不正常表达相当量的EGF受体mRNA的细胞中的转录。用本领域普通技术人员已知的常规技术可以很方便地在体内研究这两种作用。
另一种可能是，TGFα刺激室管膜下区细胞增生并增加表达EGF受体mRNA的细胞总数量。EGF和TGFα是由室管膜下区分离的培养“EGF敏感”细胞的潜在的促细胞分裂剂(Reynolds和Weiss，1992，科学(Science)2551707-1710)。纹状体TGFα输注对室管膜下区EGF受体mRNA杂交的强大的诱导作用可能表明体内未损伤大脑的增生细胞类似地与这些细胞反应。
3.TGFα和6-OHDA损伤联合纹状体TGFαmRNA杂交在接受损伤和TGFα联合的动物与接受损伤和aCSF联合的动物是不同的。尽管TGFα在其它组织具有潜在的自动刺激作用，但在本研究中它对纹状体TGFαmRNA杂交的减少没有明显改变。6-OHDA介导的中脑EGF受体mRNA的消失同样不受TGFα输注的影响。在后面这种情况，进行中脑损伤，在开始输注前数周将同侧多巴胺细胞神经元破坏。这样，生长因子将没有机会阻止它们的消除。
有一些证据表明，多巴胺细胞自身表达EGF受体mRNA(Seroogy等，1994，见上文)，以及如果TGFα与神经毒损伤同时施用，则TGFα可以调节纹状体多巴胺能神经支配标志物的消失。因而，神经毒损伤和给予TGFα之间的时间间歇可以解释为什么TGFα输注对中脑EGF受体mRNA消失没有影响。
在人帕金森氏病脑中，中脑EGF受体结合与在正常人脑所见无异(Villares等，1993，见上文)。PD纹状体TGFα(和其它神经营养因子)大量增加(Mogi等，1994，见上文)可能通过提高残留神经元表达水平而掩盖了表达EGF受体的多巴胺细胞数量的减少。另一方面，体外实验表明TGFα对中脑多巴胺神经元的许多营养作用至少部分是通过黑质介导的(Alexi和Hefti，1993，见上文)。因而，TGFα可能通过旁分泌(直接)和顺序转运(间接)方式影响多巴胺神经元。
TGFα-损伤动物室管膜下区EGF受体mRNA杂交模式与在TGFα-未损伤动物所见相似。这些动物同侧纹状体的最显著特征是纹状体体部向外伸出的致密杂交嵴，较室管膜下区增强的杂交更致密。该嵴与任何一种解剖结构均不相对应，而且显然不是TGFα或TH探针。EGF受体mRNA杂交在非-嵴纹状体和在所有其它组的纹状体相似。
6-OHDA损伤的神经毒破坏和输注插管的机械损伤可能刺激神经胶质细胞增生和活化。前面的研究已经证实神经胶质增生和星形胶质细胞EGF受体表达增加是损伤的结果(Nieto-Sampedro等，Neurosci.Lett.91276-282，1988；Fernaud-Espinoa等，神经胶质(Glia)8277-291，1993)。另外，TGFα可能在星形胶质细胞活动中起着一定作用(Junier等，神经科学杂志(J.Neurosci.)144206-4216，1994)。另一种可能是生长因子输注和中脑损伤联合使室管膜下区增生细胞离开脑室进入覆在其上面的纹状体。TGFα是多种细胞类型的潜在的化学吸引剂(Reneker等，发育(Development)1211669-1680，1995)，但在大多数动物，它本身还不充足到能够刺激嵴的形成。中脑损伤可能促进细胞嵴的形成。下面实施例将测定这些细胞的起源和特性。
实施例3纹状体嵴的特性如上所述，纹状体输注TGFα与黑质6-OHDA联合诱导大量表达EGF受体mRNA的纹状体体部细胞嵴的形成，但TGFα并不比周围组织多。嵴由大量厚密的细胞组成，使得它在使用简单的硫素染色即很清晰地检测。异常纹状体嵴的身份尚不明确，但考虑到有三种可能性。
对损伤产生反应的神经胶质增生是损伤和神经毒损害脑组织的一个特征。通常，两种类型脑损伤促进星形胶质细胞增生和星形胶质细胞与小神经胶质细胞对损伤组织的浸润(Fernaud-Espinoza等，神经胶质(Glia)8277-291，1993)。已证明星形胶质细胞表达EGF受体免疫活性，特别是在对脑损伤反应时(Gomez-Pinilla等，Neurosci.Lett.91276-282，1988)。此外，TGF本身刺激星形胶质细胞增生(Alexi和Hefti，神经科学(Neurosci.)55903-918，1993)。因此，认为纹状体嵴可能是对神经毒和机械损害和生长因子联合反应的胶质细胞群。
研究了与啮齿动物纹状体的特有解剖结构有关的嵴的第二种可能来源。嵴与先前已确定的任何解剖结构不相对应。在啮齿动物，尾状核和豆状核解剖学结构不清楚。迄今，没有鉴定出能把啮齿动物基底神经节的这两个核区别开来的解剖学或神经化学标志物。然而，出生前和出生后早期发育期间，发育期纹状体不同区内神经发生的梯度与在解剖学上核呈不连续状态的动物体内尾状核和豆状核的特性梯度对应((Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.)2163-175，1984)。在啮齿动物，新纹状体神经元以外侧-到-中侧梯度加入喙前连合交叉，由此，后产生的神经元是那些最接近侧脑室的神经元。在发育尾状核系统观察到相同模式，表明啮齿动物前纹状体有更象“尾状核样”的区域。尾状核到前联合交叉，神经元以中-到-外侧的梯度加入，与在尾状核豆状核解剖学不连续的动物中的发育期豆状核相似。这样，啮齿动物纹状体后部可能更象“豆状核”。认为是这种可能性，即纹状体嵴可能代表大鼠纹状体这两个区域之间不曾被识别的边界，它允许细胞密集堆积，可能是由于某些神经化学不同的结果。
对纹状体嵴来源的第三种可能性也进行了检测。发现从成年哺乳动物前脑侧脑室的室管膜下区分离的细胞能够增生和分化成新的神经元和胶质细胞，特别是当在含有EGF-家族神经营养因子(包括TGFα)进行培养时(Reynolds等，神经元(Neuron)131071-1082，1994)。最近，EGF或TGFα输注侧脑室刺激成年小鼠脑中“EGF-敏感”干细胞和神经祖细胞增生(Craig等，神经科学杂志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，纹状体嵴来源的可能性是TGFα输注对大鼠脑具有类似的增生刺激活性。另外，考虑纹状体嵴是从室管膜下区衍生的增生神经祖细胞大量移行的可能性。
下述实验使用各种组织化学和免疫组化技术来鉴定异常纹状体嵴的特性。通过检测嵴在纹状体形成的时程和通过手术和化学处理联合干预，对嵴的起源和其出现的影响因素也进行了研究。
A.实验方案整个实验中使用250-300克成年雄性Sprague-Dawley大鼠。24只动物接受标准的大鼠TGFα中纹状体输注(0.5μg/天；Sigma Chemical Co.)。另外26只动物或者接受人工脑脊液(aCSF)输注或者不接受输注。输注开始后48小时，标准TGFα输注组和对照组动物接受6-OHDA黑质定向注射。根据输注-损伤联合情况将此部分研究所用动物按如下分为6组TGFα输注，损伤(n＝13)；TGFα输注，未损伤(n＝11)；aCSF输注，损伤(n＝12)；aCSF输注，未损伤(n＝12)；未输注，损伤(n＝1)；未输注，未损伤(n＝4)。
其它动物接受TGFα输注到纹状体的其它区域、侧脑室、大脑皮质或脑干。另有4只动物(每组两只)在纹状体中部接受标准剂量的半量或十分之一的TGFα输注。还有2只动物在纹状体中部接受表皮生长因子(EGF)输注以代替TGFα。对这些大鼠的EGF标准给药剂量是0.5μg/天。这些外加组的所有动物均被损伤。实验中所有大鼠在损伤后1到16天进行通常的灌注(输注3-18天)。为测定输注停止后嵴是否仍存在，在2周末时取出TGFα输注的4只动物的微泵，但这些动物不进行灌注直到数天后。制备脑切片并使用各种免疫细胞化学和组织化学技术进行染色。
B.TGFα输注用8mg/kg赛拉嗪和100mg/kg氯胺酮麻醉大鼠。使用Alzet渗透微型泵(2002)提供18天的TGFα输注。微泵中填充约200μl的aCSF用于对照动物，或者填充含20μg TGFα的aCSF 400μl用于实验动物。在无菌条件下，以前囟为参照，将输注插管按定向性坐标安置(+1.2A/P；＝2.7M/L；-6.0D/V)(Paxinos和Watson，大鼠脑的定向性坐标(The Rat Brain in StereotaxicCoordinates)，学术出版社，圣地亚哥，1986)，并用牙用粘固粉固定到颅骨顶部。以大约0.5μl/小时的速度通过小管进行输注。一些其它对照动物接受侧脑室输注或者覆盖皮质或其它区域。
C.神经毒损伤微型泵植入后48小时，按上述方法将大鼠麻醉。注射前即时配制4.8mg/ml 6-羟多巴胺盐酸冷溶液。使用无菌技术，用耳间为零作参照，将神经毒素定向注入同侧黑质(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)。以1μl/分的速率注射6-8μl体积。
D.制备组织损伤后1～16天给动物灌注500ml 4％低聚甲醛的0.1M磷酸缓冲盐液(PBS；pH 7.4)，动物的脑放入20％蔗糖溶液中。第2天，在-20℃异戊烷中冷冻动物脑。然后在冷冻切片机上切出40微米的冠状面切片，放入2％低聚甲醛0.1M PBS。连续切出贯穿纹状体和黑质-VTA的切片。通过脑其它部位的切出代表性切片。
E.尼氏染色将用于尼氏染色的切片机切下的脑切片放在明胶包裹的玻片上，过夜干燥。然后通过乙醇浴进行脱水和再水化作用，在硫素溶液中放置大约4分钟。通过系列乙醇浴将切片脱水，过量组织洗液洗净，加盖玻片。在光学显微镜下观察切片，用Technical Pan Film(Kodak，Inc.)在ISO 100照相(HC-110进行6分钟)。
F.银染色使用与Fink-Heimer的方法I相似(Giolli和Karamanlidis，在神经解剖学研究技术(Neuroanatomical Research Techniques)，R.T.Robertson编著，第211-240页，学术出版社出版，纽约，1978)的改良的Nauta染色方法，对变性纤维和嵴的细胞进行标记。简要讲，在用新鲜1％氢醌-1％草酸处理之前，将游离-漂浮的切片置入0.05％高锰酸钾中。用浓度不断增加的连续的硝酸铀酰/硝酸银溶液处理。再一次漂净处理后，切片与氨银反应，接着在乙醇/柠檬酸/低聚甲醛中还原，最后在硫代硫酸钠中还原。染色后，切片放到玻璃玻片上，在玻片干燥机上干燥15分钟。接下来用浓度不断增加的连续的乙醇洗液脱水，在三种连续的组织洗液中脱脂，加盖玻片。
G.免疫组织化学通过同侧腹侧中脑TH-IR的消失测定黑质损伤的质量和程度。抗黑质纤丝酸性蛋白(GFAP)(星形胶质细胞的标志物)抗体、抗nestin(神经祖细胞的标志物)抗体和抗波形纤维蛋白(放射状神经胶质细胞的标志物)抗体，用于嵴的神经化学特性研究。在游离-漂浮的切片上进行免疫组化研究。简要讲，0.1M PBS或Tris缓冲盐液(TBS；3×10分钟)洗涤脑切片，然后在由0.1MPBS或含250μl Triton TBS3％正常山羊血清组成的封闭溶液中孵育1小时。接着，室温下在旋转器上与封闭溶液稀释的下列抗体溶液孵育过夜兔抗-TH抗血清(1∶500；Eigeme Tech Intl.，Inc.)、兔抗-GFAP(1∶6400；DakoCorp.)、小鼠单克隆抗波形纤维蛋白抗体(1∶50；Sigma Chemical Co.)或者小鼠抗-nestin上清液(1∶20；University of Iowa Hybridoma Bank)。
然后洗涤切片并用生物素化的山羊抗-兔抗血清(1∶200；Vector Labs，Inc.)孵育1小时以进行TH或GFAP免疫染色，或用生物素化的马抗-小鼠抗血清(Vector Labs，Inc.)进行nestin或波形纤维蛋白免疫染色，然后洗涤并在抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC Elite kit，Vector Labs，Inc.)中孵育1小时。使用二氨基联苯胺(diaminobenzidine)(DAB)过氧化酶技术显示初级抗体结合的定位。彻底洗涤切片，将切片放到明胶-包层的玻片上，过夜干燥。最后，按上面所述的那样将切片脱水、洗净和加盖玻片。
研究中没有一只动物对于微型泵植入体或损伤手术表现出不良反应。实验过程中所有动物继续进食和水。如果损伤、输注或者二者不成功，则将这样的动物(n＝6)从在起始实验组中排出并分开进行检测。损伤成功定义为引起同侧黑质TH-IR完全或接近-完全消失。纹状体输注成功定义为输注插管的头部成功地固定在纹状体的体部内。
对于原位杂交研究，接受6天或更多天纹状体TGFα输注的所有动物表现出沿着脑室的输注同侧大量细胞集聚，用硫素染色可见。与此相比，对侧纹状体未显示这种增加，并且与aCSF-输注的动物没有差别。损伤动物EGF输注诱导沿着脑室的细胞扩展，但不诱导纹状体嵴的形成。低剂量TGFα诱导细胞扩展和嵴的形成，但是，定性地，两种情况中细胞的数量均减少。
1.6-OHDA损伤的影响接受aCSF输注的损伤动物，没有显示出沿着同侧脑室的任何细胞扩展或任何纹状体嵴的证据。接受TGFα输注的损伤动物，的确均匀地显示出沿着脑室的细胞集聚并通常表现外为纹状体嵴。与未损伤动物相比，黑质损伤明显增加嵴形成的发生率(表1)。
2.嵴的形态学和存留状态中脑输注引起特征性S-状嵴形成，嵴源自背内侧尾状核-豆状核，反曲(sweeping out)进入纹状体并在其腹侧末端向中线方向轻度回弯。嵴的最背侧部分与室管膜下区的集聚细胞相连。通常，嵴的背侧部分硫素染色最厚密，与EGF受体mRNA杂交相似。通常发现细胞嵴遍及纹状体喙-尾侧区域的大部分。TGFα输注泵移走后3个月，纹状体中嵴仍很明显。
3.GFAP免疫组织化学抗胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)(星形胶质细胞的标志物)抗血清，没能使纹状体嵴的细胞或沿着脑室的扩展细胞着色。发现着色的正常GFAP-IR星形胶质细胞在嵴的内侧和外侧，但几乎排除嵴本身。
4.银染色用改良的Nauta方法非特异标记细胞提供有关脑室细胞扩展和纹状体嵴细胞的其它信息。一个非常显著的特征是，大量细胞构成室管膜下细胞集聚和嵴(图8)。细胞厚密地集聚并主要呈梭形(图8)。在嵴的腹侧部分，伸长的细胞看来是围绕内囊纤维束展开的，这表明细胞通过纹状体移行。
5.嵴形成的时程嵴的细胞密度使得我们能够使用简单的硫素染色追踪它的形成(图9)。用于时程实验的所有动物均接受6-OHDA损伤和中纹状体TGFα输注。6天输注前的时间点中，在室管膜下区仅有非常小的细胞集聚和没有显示纹状体嵴。输注6天时，沿着脑室有清晰的细胞扩展。输注9天时，嵴的腹侧部分开始显得从脑室位移。输注12天时，嵴的腹侧部分位于距离脑室壁400μm的部位。输注16天时，嵴出现在纹状体中部，它的腹侧部分距脑室达2mm。这样，嵴起源于脑室区并且随着输注时间增加而逐渐在下面的的纹状体处放射状位移。输注12天和16天时，嵴的外侧限与脑室壁之间距离的差距是大约1.6mm。
6.Nestin免疫组织化学抗神经上皮祖细胞标志物nestin的单克隆抗体，使整个嵴的纤维束致密地着色(图10)。嵴的外侧未见到nestin-IR纤维，但是在嵴的中部偶尔可观察到着色纤维。纤维主要地与嵴呈直角定向。
7.嵴形态学变化在损伤动物中脑输注TGFα，在冠状切面上均匀地显示出S-状纹状体嵴。在尾状核-豆状核其它区域输注的大鼠中这种形态学明显改变(图11)。纹状体中部输注导致在尾状核输注位点附近产生L-状嵴，“L”形的垂直部分沿着脑室，水平部分从脑室直角延伸进入纹状体。纹状体外侧末端输注刺激与侧脑室壁平行的线状嵴形成。
8.波形纤维蛋白免疫组织化学抗放射状胶质细胞标志物波形纤维蛋白的抗血清，不能使纹状体、室管膜下区或输注2周的纹状体嵴的任何细胞染色。然而，该结果将进一步进行研究，因为对照是在胚胎动物中在不能确保排出假阴性的条件下进行的。
9.嵴位置控制与原位杂交实验所用大鼠的嵴细胞相比，现在的一系列实验中的嵴细胞自脑室向更远处最大地发生位移(图12)。这两组实验动物之间的差别是输注时间表和损伤。
用于原位杂交实验的动物接受损伤，然后在损伤后第2周左右开始进行一系列的行为测试以确定单侧损伤的成功。通常，动物直到损伤后5周才接受输注。这样，多巴胺变性过程和纹状体输注TGFα是在时间上分开的事件。
现在的一系列实验中，首先进行输注；植入输注泵后48小时进行损伤。在这些动物，黑质多巴胺神经元变性，引起黑质多巴胺能神经分别丧失，而且纹状体施予生长因子是时间上同时发生的事件。
10.纹状体之外的其它脑区域输注接受纹状体之外的其它脑区域输注的所有动物，接受2周的TGFα输注和黑质6-OHDA损伤。损伤同侧的脑室内(ICV)输注生长因子刺激邻接脑室壁的细胞集聚，但不诱导任何动物纹状体嵴的形成。
间隔和纹状体输注刺激与侧脑室中层壁结合的间隔嵴的形成。间隔嵴，与纹状体嵴一样，用EGF受体mRNA原位杂交或硫素染色可以很方便地检测到，但是在密度和细胞数量方面倾向于不那么粗壮厚密。
背侧皮层输注，即输注如此之浅以致于不能通透胼胝体，对于沿着侧脑室的细胞密度没有可辨别的影响。这些背侧输注也不诱导嵴的形成。可以轻度通透胼胝体的皮质输注，刺激沿着侧脑室的细胞扩展，但不诱导纹状体嵴的形成。这些动物确实显示出胼胝体处细胞密集，考虑后者可能是胼胝体嵴。
H.TGFα刺激细胞增生本实验与上述实验一起，证明TGFα对于细胞集聚和纹状体嵴的形成是必要的。与输注对侧室管膜下区或正常动物相比，接受纹状体aCSF输注的动物，无论是否损伤，没有一只显示出任何明显的室周细胞扩展。很显然，前脑细胞对TGFα纹状体输注敏感，沿着侧脑室增生。
给小鼠ICV输注EGF或TGFα6天的新近研究表明，脑室周围细胞被细胞增生标志物-5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)或[3H]胸腺嘧啶核苷免疫标记上的数量大量增加(Craig等，神经科学杂志(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。95％以上的这些细胞对EGF受体也呈免疫反应阳性。甲酚紫尼斯耳氏染色也显示这些动物脑室周围的细胞对施予生长因子有反应。
沿着侧脑室的细胞群扩展的可能性首先考虑是前脑神经毒损害、机械损伤和输注TGFα联合刺激胶质细胞所致。已知星形胶质细胞通过增生和改变其形态学与功能特性来对脑损伤反应(综述参见，Norenberg，J.Neuropath.Exper.Neurol.53213-220，1994)。另外，纹状体星形胶质细胞具有EGF受体(Gomez-Pinilla等，1988，见上文；Nieto-Sampedro等，1988，见上文)并且受到TGFα刺激而增生(Alexi和Hefti，1993，见上文)。本研究中，星形胶质细胞的标志物-纤性胶质细胞酸性蛋白(GFAP)的抗血清，不能证实输注2周时脑室区或嵴处的星形胶质细胞增加。事实上，大部分GFAP-IR从此区域被清除掉。例如，在嵴的中部和外侧可以见到正常星形胶质细胞着色，而在嵴本身很少观察到GFAP-IR纤维。这些发现与ICV输注EGF或TGFα 6天的实验结果一致侧脑室周围GFAP和其它星形胶质细胞标志物-S100β未见显著增加(Craig等，1996，见上文)。反应的星形胶质细胞也表达波形纤维蛋白(Federoff等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)1214-27，1984)，但是在任何检测的切片上未观察到波形纤维蛋白-IR。也未发现小神经胶质细胞的标志物(MAC-1)和少突神经胶质细胞的标志物(MAG，CNP，O4和Rip)有明显变化(Craig等，1996，见上文)。因此，免疫组织化学证据表明，TGFα诱导的沿脑室的细胞扩展和在纹状体嵴不是神经胶质细胞增生的结果。
1.细胞形态学和定位银染色和硫素染色清楚地显示沿脑室的细胞聚集中有大量细胞。室管膜下区背侧部和嵴处的细胞最致密和最多。细胞主要是梭形的，与发育期脑中移行神经祖细胞相似，它们的长轴与脑室壁成直角(或与背侧纹状体边界的室管膜下区的背侧延伸成直角)。嵴的脑室段细胞银染色显得在内囊纤维束周围展开，提示细胞穿越纹状体移行。
为了测定细胞是否确实移行，进行时程实验以检测作为开始输注生长因子后时间函数的嵴的发育和它的位置。
2.纹状体嵴的细胞移行沿着侧脑室的细胞进行性扩展和接下来这些细胞作为致密嵴进行放射状移行运动，证实细胞确实作为整体穿越纹状体移行。这样，嵴不可能是啮齿动物纹状体的推定的“尾状核-样”和“豆状核-样”区之间的解剖轮廓。
3.神经前体细胞的刺激尽管脑室旁扩展的细胞或纹状体嵴细胞没有标记上成熟星形胶质细胞、神经元、小神经胶质细胞或少突胶质细胞的免疫标志物，但是单克隆抗体识别的nestin使得嵴和沿着脑室的细胞突起浓密地染色，所述nestin是神经上皮前体细胞表达的内中间丝极(filament)。反应星形胶质细胞也表达nestin-IR，但是在嵴的细胞上GFAP-IR阴性，排除了嵴细胞的最显著部分是由星形胶质细胞形成的可能性。近几年来，nestin-IR被用于识别和标记体内和体外的神经前体细胞(Lendahl等，细胞(Cell)60585-595，1990；Craig等，1996，见上文)。纹状体嵴上强的nestin-IR和缺少胶质细胞标志物支持嵴细胞主要是神经前体细胞的结论。
至此，在成年哺乳动物脑中已经确定了能够产生新神经元和胶质细胞的两类不同的细胞群(Morshead等，1994，见上文)。一类是相对静止细胞群，真正的多能神经干细胞。另一类，组成型增生的细胞群，被认为是神经祖细胞，衍生于干细胞。干细胞群被认为停留在室管膜或室管膜下区并且在神经前体细胞死亡或移行开之后再重新补足神经前体细胞。这里使用的术语“神经前体”，是描述在成年哺乳动物脑中能产生神经元和胶质细胞的未分化的增生细胞，无论这些细胞是神经干细胞还是神经祖细胞。
先前的研究已经显示许多神经祖细胞在它们从室管膜下区移行之前死亡(Morshead和Van der Kooy，神经科学杂志(J.Neurosci.)12；249-256，1992)。然而，最近发现许多其它细胞确实存活着并沿着严格限定的通路移行到嗅球，在嗅球处细胞分化为嗅球中间神经元(Luskin，神经元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科学(Science)2641145-1148，1994)。在称为“链移行”的过程中，细胞沿着侧脑室壁的切线方向移行，其中移行细胞链被特异GFAP-IR星形胶质细胞包鞘(ensheathed)(Rousseleot等，1994；Lois等，科学(Science)271978-981，1996)。
然后，沿前脑侧脑室的室管膜下区远非胚胎期神经上皮残余的休眠状态。在正常未处理脑，继续产生向喙侧(rostrally)移行的新成神经细胞并分化成神经元。在EGF-家族神经营养因子(包括TGFα)的影响下，体外室管膜下神经前体受到刺激产生大量新的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(Reynolds和Weiss，科学(Science)2551707-1710，1992)。从这些外植体研究可以更清楚地看出，在沿着尾状核-豆状核背侧边界的室管膜下区的背侧部分神经前体细胞浓度最高。
甚至一些更近的证据表明，体内神经前体细胞可以在受到刺激后增加它们的数量并且产生新的神经元和神经胶质细胞(Craig等，1996，见上文)。发现ICV输注EGF 6天后双重标记上BrdU和成熟神经元与胶质细胞的标志物的细胞弥散分布在整个纹状体、中隔和皮质，一直残存到输注后7周。然而，在那个研究中没有发现室管膜下区细胞整体移行进入毗邻的纹状体(与本发明方法的结果明显不同)，并且细胞数量也较本发明在纹状体嵴处所观察到的紧密-压紧的细胞团少许多。另外，在Craig等描述的动物中，没有一只接受足够输注以刺激本发明观察到的细胞团移行，以及在该研究中没有一只动物接受黑质6-OHDA损伤，本发明第一次证实黑质6-OHDA损伤明显增加移行的发生率。
4.神经表型的证据遗留下来的一个问题是沿着脑室的扩展细胞和移行到纹状体嵴的细胞是否确实是神经祖细胞。表2总结的数据支持这些细胞确实是神经祖细胞的结论。神经化学证据显示这些细胞不表达成熟神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞或小胶质细胞的标志物，然而的确强烈表达未成熟神经祖细胞的标志物。它们表达细胞增生的标志物。它们从神经祖细胞在成年啮齿动物脑所位局的侧脑室壁产生，向两侧扩展并辐射状移行离开脑室。此外，它们的细胞形态呈梭状及它们的突起与脑室和嵴呈直角定向，与胚胎脑中神经祖细胞的移行相似并且与它们从室管膜下区开始移行一致。下表(表2)中总结的数据表明室旁扩展的细胞和纹状体嵴是发生自室管膜下神经干细胞的神经祖细胞。
5.移行机制通过纹状体多巴胺去神经支配和通过定位输注插管的物质可以控制细胞团移行进入纹状体，但是移行机制尚不清楚。嵴的形状可以通过简单改变输注起始位点而被改变的事实提示有化学吸引作用。已知TGFα是不同细胞类型的可能的化学吸引剂(Ju等，J.Invest.Dermatol.100628-632，1993；Panagakos，Biochem.Mol.Biol.Int.33643-650，1994)。它在产期的尾状核-豆状核的丰富表达可能表明它在纹状体发育中起着类似的作用。
正常脑的神经前体细胞位于侧脑室壁的较薄区域。输注进入中-纹状体更接近该区域背侧末端的细胞。推测细胞移行进入纹状体将朝着推定的生长因子浓度较高的释放TGFα的输注插管的尖端方向移动。中-纹状体输注的动物中嵴呈S-状的特性，可能是由于靠近输注插管尖端的室管膜下区背侧段细胞的受体已经饱和的结果。一旦细胞移动靠近输注位点，EGF受体已经饱和的细胞可能就停止移行。估计靠近室管膜下区脑室末端的细胞遇到较低的生长因子浓度，在TGFα浓度增加到足以使细胞受体饱和以前不得不朝着输注点移行更远的距离。伴有受体饱和的不同移行可以解释嵴的S-状特性。
输注进中部纹状体产生L-状嵴，也与神经化学梯度/受体饱和作用一致。在这种情况下，背侧室管膜下细胞在它们从室管膜下区开始移行前可能已经使其受体饱和因而停止了移行。只是室管膜下区最腹侧部分的细胞从脑室移行开。
最外侧输注可能呈现类似的推定浓度梯度，细胞沿着增生区域的距离最长。室管膜下细胞自脑室开始移行相似的距离，产生大致线状的嵴，与化学吸引、神经化学梯度作用的想法一致。
然而，来自特性研究的免疫组织化学证据使人们不相信简单的化学吸引作用的概念可以完全解释细胞团的放射状移行。移行细胞的nestin-IR突起不与推定生长因子浓度最高区域的输注插管尖端排成直线，而是与脑室和嵴方向一致。这种定向提示细胞呈直角进入尾状核-豆状核--正如移行的神经祖细胞从胚胎纹状体神经上皮移行时那样--并不朝着输注插管尖端倾斜。
另外两种发现与纹状体嵴移行的简单化学吸引作用不一致。首先，细胞不是从其产生后开始移行；细胞沿着脑室在1周以上的期间增加数量，然后作为致密细胞片整体移行。另外，同侧黑质损伤大大增加移行发生率。这两种观察结果提示一套更复杂的因子影响细胞移行。这些资料不能彻底排除化学吸引在嵴移行中的作用，但是它们指出简单的化学吸引本身不能解释嵴的移行。
可能与成年纹状体神经祖细胞放射状移行有关的另一种机制是，由于神经毒损害、输注插管手术植入造成的机械损伤或者两者都有，引起放射状神经胶质支撑框架重建。在发育脑的许多区域，放射状神经胶质引导神经祖细胞移行。它们沿着脑室定位，而其突起放射状伸进下覆的薄壁组织。在出生后早期，一旦成神经细胞移行完成，它们便转化成GFAP-IR星形胶质细胞并停止表达波形纤维蛋白和nestin。
新生大鼠外板(cortical plate)的冷冻损伤，抑制放射状神经胶质转化并引起波形纤维蛋白和nestin在成年脑受损伤区域持续表达(Rosen等，发育脑研究(Dev.Brain Res.)82127-135，1994)。成年大鼠海马的kainate损伤，诱导放射状神经胶质细胞形态学和在海马室管膜下区的星形胶质细胞表达nestin-IR和波形纤维蛋白-IR，提示脑损伤可以刺激星形胶质细胞表型回复到胚胎脑中所发现的表型(Clarke等，神经报道(Neuroreport)51885-1888，1994)。
本发明免疫组织化学实验不支持这一现象。发现输注第9天时沿着脑室的放射状-定向的纤维中富含nestin-IR纤维，但在以后的时间点，这些纤维不再沿着脑室停留。由于嵴的细胞移行来自室管膜下区，所以nestin-IR纤维也是如此。另外，用放射状胶质细胞的特异标志物-波形纤维蛋白免疫染色，无论是在嵴处还是在室管膜下区均没有显示任何标记的纤维。这样，不大可能是星形胶质细胞回复到其胚胎期放射状胶质细胞表型或者是星形胶质细胞回复作用在神经祖细胞放射状移行中发挥了作用。
新近描述的特定地用于成年哺乳动物脑神经祖细胞移行的模型阐明这些细胞从前脑室管膜下区朝着嗅球的切线运动(Lois等，1996，见上文)。喙性移行的成神经细胞是致密压紧并被沿着严格限定的移行通路的GFAP-IR星形胶质细胞包鞘的。移行细胞主要在特化的胶质导向细胞管内形成实心的移动细胞流。在我们的实验中神经前体作为薄片穿越纹状体神经纤维网而移行-不是沿着限定的通路--及与GFAP-IR细胞无关。事实上，增生的室管膜下区和细胞性嵴基本上排除了GFAP-IR。这样，链移行机制不能解释本发明所见的嵴移行。
神经祖细胞团移行的另一可能的机理是嵴细胞可能已经改变了它们对生长因子、细胞粘附分子或其它对损伤反应的物质的表达。在此情况，纹状体受到刺激以提供其自己的促进放射状移行的化学吸引剂或分子。或者，它也已经可被诱导减量调节表达抑制移行的物质。
新近检测纹状体和室管膜下区细胞粘附分子的研究提供特别有趣的观点。高度多唾液酸化的神经细胞粘附分子(PSA-N-CAM)免疫活性在发育期啮齿动物纹状体中强烈表达，但是随着动物成熟而下降(Aaron和Chesselet，神经科学(Neurosci.)28701-710，1989；Szele等，神经科学(Neurosci.)60133-144，1994)。然而，PSA-N-CAM沿着成年前脑室管膜下区继续表达(Rousselot等，1994；Szele等，1994，见上文)。部分皮质剥除术-诱导的纹状体传入神经阻滞显著增加PSA-N-CAM和另一粘附分子-L1在室管膜下区的表达(Poltorak等，神经科学杂志(J.Neurosci.)132217-2229，1993；Szele和Chesselet，J.Comp.Neurol.368439-454，1996)。人脑中PSA-N-CAM在正常纹状体的表达低，而在亨廷顿病病人的纹状体，特别是室管膜下区的表达增加(Nihei和Kowall，Ann.Neurol.3159-63，1992)。
特别有趣的是单侧额的部分皮质剥除术后出现纹状体纤连蛋白mRNA表达变化(Popa-Wagner等，神经报道(Neuroreport)3853-856，1992)。纤连蛋白是在体外已经显示支持神经元移行的分子之一(Fishman和Hatten，神经科学杂志(J.Neurosci.)133485-3495，1993)。创伤空穴正下方纹状体部分的纤连蛋白mRNA杂交在72小时时增加到最高水平。早期增加被认为是短-期伤口愈合过程的成分。接下来是较长-期的纤连蛋白在较大的同侧纹状体的表达增加，大约于损伤后10天达高峰。继发增加被认为是纹状体对传入神经阻滞的反应。跟随的另外两个编码N-CAM和α微管蛋白的mRNAs表达增加仅仅是出现在伤口愈合早期的受空间条件限制的和暂时的现象。
传入神经阻滞后第10天时纹状体纤连蛋白mRNA表达高峰很好地对应了本研究中纹状体去多巴胺神经支配后嵴移行的迟延。纤连蛋白mRNA表达高峰的迟延可以帮助解释为什么本发明祖细胞一开始不进行放射状移行而是直到输注第9天左右才开始，以及为什么当它们最终移行时它们以整体移行。在输注和损伤相隔数周进行的动物中，输注2周时最大侧移行距离明显减少。该观察结果也与纹状体纤连蛋白表达的短暂高峰一致。在没有接受黑质损伤的少数几个有嵴的动物中，下覆皮质的机械损伤已经刺激足够的纤连蛋白在纹状体表达以促进移行。然后，纤连蛋白对同侧纹状体去多巴胺神经支配反应而可能被上调，反过来，短暂促进来自室管膜下区的神经祖细胞放射状移行。
影响成年纹状体中神经祖细胞放射状移行的另一种可能是细胞粘附分子的继发作用。N-CAM输注进接受刺伤的成年大鼠脑的各个不同区域(包括纹状体)，抑制星形胶质细胞增生(Krushel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA924323-4327，1995)。星形胶质细胞释放抑制轴突分枝的因子并由此抑制神经再生反应。因此，纹状体去神经支配及相关的室管膜下PSA-N-CAM增加可能解除神经再生的抑制。
多巴胺-去神经支配的纹状体中移行作用的增强也可能直接与多巴胺能神经支配的丧失有关。在纹状体胚胎发育期，未成熟神经元起源于脑室区域并放射状移行(Bayer，1984，见上文；Bayer和Altman，Prog.Neurobiol.2957-106，1987)。纹状体神经元的发育性移行发生在来自中脑的多巴胺传入纤维的神经支配之前。刺激下丘脑神经元上的D2多巴胺受体，显著降低TGFαmRNA表达和脑垂体生长(Rorgundvaag等，内分泌(Endocrinology)1303453-3459，1992)。尽管没有对室管膜下区多巴胺受体-介导的TGFα表达抑制进行研究，但是与非-损伤动物中移行发生率的降低一致。因此，随着前脑多巴胺能神经支配的逐渐建立，发育期多巴胺神经支配可能抑制纹状体细胞的移行。
随着多巴胺能传入纤维的建立，在出生后早期纹状体多巴胺也可能参与纹状体TGFα的下调作用。成年纹状体的去多巴胺神经支配可能模拟纹状体细胞的某些只是在发育期纹状体才可见到的局部化学环境指令，例如，纹状体神经元上表达的多巴胺受体的有效配体减少。纹状体多巴胺神经支配也以相互联系的方式而与星型胶质细胞细胞外基质分子(ECM)的表达有关(Gates等，神经解剖化学杂志(J.Chem.Neuroanat.)6179-189，1993)。有趣的是，PD患者的纹状体中TGFα选择性增高(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)，与胚胎期纹状体的高表达相似。如果纹状体TGFα受多巴胺神经支配调节，那么这种增加可能与纹状体多巴胺的下降以及随后的TGFα表达抑制的解除有关。
无论什么发生机制，实验时程证实在成年大鼠脑中室管膜下区细胞可以被刺激而使细胞数量增加并作为整体放射状移行进入相邻的纹状体。使用不同位置或剂量进行TGFα输注的实验显示，纹状体嵴的移动和涉及的细胞总数量可以得到控制。特性实验提供了充分证据表明室管膜下细胞扩展和致密纹状体嵴是由神经祖细胞组成的。下面讨论这些发现的重要性以及它们用于治疗人神经变性疾病和创伤性脑损伤的潜在用途。
至此，结合参照具体实施例和实施方案已经介绍了本发明。在参阅本发明说明书基础上，本领域普通技术人员可以建议其它的实施方案。
尽管为了清楚理解的目的，借助于说明书和实施例详细描述了本发明，但是很显然可以在所附权利要求的范围之内进行一定的变化和修改。
权利要求
1.一种治疗神经缺损患者的方法，所述方法包括(a)将患者中枢神经系统(CNS)的神经祖细胞同可以与表皮生长因子(EGF)受体结合的多肽进行接触，其中多肽的剂量要足以刺激神经祖细胞增生，和(b)引导增生祖细胞的子代整体移行到CNS的一个区域，其中子代细胞在所述区域驻留并以足以减轻神经缺损的方式发挥作用。
2.权利要求1所述方法，进一步包括将细胞与刺激增生神经祖细胞的子代进行分化的化合物进行接触。
3.权利要求1所述方法，其中神经缺损由神经变性疾病、创伤损伤、神经毒损害、局部缺血、发育疾病、影响视觉的疾病、脊髓损伤或疾病、脱髓鞘疾病、自身免疫病、感染或炎症性疾病造成。
4.权利要求3所述方法，其中神经变性疾病是阿耳茨海默氏病、亨廷顿氏病或帕金森氏病。
5.权利要求3所述方法，其中局部缺血与休克有关。
6.权利要求1所述方法，其中与表皮生长因子受体结合的多肽是双调蛋白(AR)、β-动物纤维素(BTC)、表皮生长因子(EGF)、epiregulin(ER)、肝素结合的EGF样生长因子(HB-EGF)、神经鞘瘤衍生的生长因子(SDGF)、粘液瘤病毒生长因子、休普氏纤维瘤病毒生长因子、畸胎瘤-衍生的生长因子-1(TDGF-1)、转移生长因子α(TGFα)或者牛痘生长因子(VGF)。
7.权利要求1所述方法，其中与表皮生长因子受体结合的多肽是转化生长因子α。
8.权利要求1所述方法，其中神经祖细胞在体内与结合表皮生长因子受体的多肽进行接触。
9.权利要求1所述方法，其中，神经祖细胞在培养物中与结合表皮生长因子受体的多肽进行接触。
10.权利要求1所述方法，其中通过将细胞沿着、或者在移行所需通路的末端与增加细胞粘附分子或细胞外基质分子表达的化合物进行接触，从而使移行定向。
11.权利要求10所述方法，其中化合物是转化生长因子β。
12.权利要求10所述方法，其中细胞粘附分子是纤连蛋白。
13.权利要求10所述方法，其中细胞粘附分子是核纤层蛋白。
14.权利要求10所述方法，其中化合物沿着神经前体细胞和其子代细胞定向移行所到的位置之间的通路施用。
15.权利要求1所述方法，其中移行是通过将细胞沿着移行所需通路与抑制沿该通路自然产生信号的化合物进行接触而被定向的，其中所述自然产生的信号是抑制移行的信号。
16.权利要求1所述方法，其中移行是通过机械毁损CNS中的组织而被定向的。
17.权利要求1所述方法，其中移行是通过神经化学阻断CNS的细胞活性而被定向的。
18.权利要求2所述方法，其中刺激分化的化合物是视黄酸或脑衍生神经营养因子。
19.一种治疗神经缺损患者的方法，所述方法包括(a)将患者中枢神经系统(CNS)的神经祖细胞同可以与表皮生长因子(EGF)受体结合的多肽进行接触，其中多肽的剂量要足以刺激神经祖细胞增生，和(b)引导增生祖细胞的子代整体移行到CNS的第二个区域；(c)将已经移行的细胞与刺激分化的化合物进行接触。
20.权利要求19所述方法，其中将刺激神经干细胞增生的化合物和刺激分化的化合物依次给药。
21.一种药物组合物，包括结合表皮生长因子(EGF)受体的多肽和刺激神经祖细胞分化的化合物。
22.权利要求21所述组合物，其中结合EGF受体的多肽是转化生长因子α。
23.权利要求21所述组合物，其中结合EGF受体的多肽是转化生长因子α，刺激神经祖细胞分化的化合物是脑衍生的神经营养因子。
24.权利要求1所述方法，其中中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
25.权利要求1所述方法，其中中枢神经系统损伤是视网膜损伤。
全文摘要
本发明涉及治疗神经缺损患者的方法和组合物。该方法可以这样进行,例如,将患者中枢神经系统(CNS)的神经祖细胞与结合表皮生长因子(EGF)受体的多肽进行接触(在体内或在培养基中),并使增生祖细胞的子代整体定向移行到CNS的一个区域,其中子代细胞在所述区域驻留并以足以减轻神经缺损的方式发挥作用。该方法可进一步包括使神经祖细胞子代与刺激分化的化合物接触的步骤。
文档编号A61P25/28GK1273534SQ98809859
公开日2000年11月15日 申请日期1998年8月4日 优先权日1997年8月4日
发明者詹姆斯·S·里德, 詹姆斯·H·法伦 申请人:加利福尼亚大学董事会