用于组织膨胀和治疗的可植入颗粒的制作方法

专利名称：用于组织膨胀和治疗的可植入颗粒的制作方法
1．发明领域本发明涉及组织膨胀，胃食管回流症和尿失禁的治疗，以及皮肤皱纹的改善。
2．发明背景2．1胃食管回流症(“GERD”)尽管胃食管回流是一种正常的生理现象，但在某些情况下，它是一种可导致种种症状的病理生理状态，在极端情况下，这些症状可能变得严重。胃食管回流症(“GERD”)描述的是酸液和酶液从胃回流到食管，导致胸骨后有灼热感，同时伴有胃酸回流到嘴里，甚至是肺里。能说明GERD严重性的并发症包括食管组织糜烂，以及正常上皮被病理性组织所取代的食管溃疡。
统计数据表明，约35％的美国人口至少每个月患一次胃灼热，有5-10％的美国人口至少每天患一次。关于这种疾病更为重要的是，内镜检查得到的医学证明数据表明，约2％的美国人口患有GERD。该病与个体的年龄有关，40岁以上的人群似乎患该病的可能性增加。(Nebel O.T.等，《美国消化疾病杂志》21(11):953-956(1976))。
正常病人在饭后其下食管括约肌保持关闭，但患GERD的病人，其下食管括约肌松弛，使得一些酸性物质由于胃收缩而回流到食管。事实上，GERD可以主要归结于下食管括约肌的短暂松弛。在其他情形下，GERD可归结于下食管括约肌休息状况的降低或是括约肌本身先天性尺寸短小。也存在其他原因，导致该疾病的存在和严重程度不同。
此外，一些外部因素加剧了GERD的症状，这些因素包括吃脂肪性事物、吸入咖啡因、吸烟、穿紧衣服，以及某些药物治疗。流涎的减少也是加剧GERD的一个因素，因为在正常情况下，唾液是一种碱性液体，能帮助中和酸回流，从而缩短食管与酸的接触时间。
红斑是GERD首先可见到的症状之一，可以通过内镜检查看到。组织糜烂表明了疾病的进一步发展，它可变为深度溃疡并导致癌症(腺癌的发病率比其他类型的癌症增长更快)。约有3.5％的65岁以下的食管阻塞、失血、以及在某些情形中的穿孔病人发生弥漫性溃疡和特定的并发症。溃疡状况不仅会导致并发症，而且对治疗更有对抗性。尽管严重的并发症在年轻病人中不常见，但是在20-30％的65岁以上病人中将发生(Reynolds J.C.，《美国卫生系统杂志-药理学》53,(1996))。
在本发明之前，为提高括约肌的功能，曾尝试两种膨胀方法，将牛胶原和特氟隆糊剂用于病人。但是这两种方法都未成功，因为随着时间推移，这些物质会从植入的最初位置移开。
目前，GERD一般是通过不需处方而出售的(“OTC”)抗酸药或者处方药来控制，处方药包括质子泵抑制剂、能动剂和H2阻滞剂。另外，一部分GERD病人需要外科手术介入；最常见的外科手术是胃底折术，这可以使用常规外科技术或者使用腹腔镜检查技术实现。然而，胃底折术有严重副作用的危险，在治愈GERD方面仅取得勉强的成功。约50％的GERD病人还有呼吸方面的症状，在经历胃底折术的病人中，这些呼吸症状甚至进一步增加(在Johnson W.E.等人的一项研究中报告为76％，《外科学文献》131:489-492(1996))。
2．2尿失禁尿失禁是一个普通流行的问题，它会影响整个社区和特定保健区内的所有年龄和不同身体健康状况的人。在医学上，尿失禁使病人易患上尿道感染、压迫溃疡、会阴疹和尿脓毒症。从社会和心理的角度讲，尿失禁与窘迫、社会斑痕形成、抑郁相联，特别是对老年人而言，会提高入院治疗的风险(Herzo等，《老年学年评-老年病学》9:74(1989))。从经济上讲，费用惊人，光就美国而言，每年用于治疗失禁的费用多达100亿美元以上。
失禁可归结于真性尿压迫(尿道活动过度)、内因性括约肌缺陷(“ISD”)，或者两者都有。失禁在妇女中尤其普遍，其次在儿童中也发生(特别是ISD)，男子在接受根治性前列腺切除术后也可能出现失禁。
治疗尿失禁的一种方法是服用具有膀胱松弛性能的药物，以及主要依靠这类药物的抗胆碱能药物疗法。例如，在治疗紧急失禁时，已经使用了诸如溴丙胺太林等抗胆碱能药，以及诸如消旋奥苦布宁、双环胺等组合平滑肌松弛剂/抗胆碱能药。(参见A.J.Wein，《北美泌尿学临床杂志》22:557(1995))。然而，这些药物疗法经常不能在全部的失禁病人治疗中获得完全的成功，并且经常会在病人身上产生显著的副作用。
除药物疗法外，在本发明之前被本领域技术人员所采用的其他方法包括使用人工括约肌(Lima S.V.C等，《泌尿学杂志》156:622-624(1996),Levesque P.E.等，《泌尿学杂志》156:625-628(1996))，膀胱颈支撑假体(Kondo A.等，《泌尿学杂志》157:824-827(1996))，注射交联胶原(Berman C.J.等，《泌尿学杂志》157:122-124(1997)，Perez L.M.等，《泌尿学杂志》156:633-636(1996)；Leonard M.P.等，《泌尿学杂志》156:637-640(1996))，和注射聚四氟乙烯(PerezL.M.等，《泌尿学杂志》156:633-636(1996))。
最近一项较为有名的治疗与ISD相关的尿失禁的方法是为病人进行尿道周内镜胶原注射，这样可以扩大膀胱肌，减少膀胱渗漏或者压迫失禁的发生可能性。
现行防止失禁发生的方法有大家所熟知的缺陷。给患有顽固性失禁的儿童使用人工括约肌，需要对尿道进行长期的监视，因为在设备放置后有潜在的肾衰竭可能(Levesque P.E.等，《泌尿学杂志》156:625-628(1996))。利用内窥镜在膀胱颈周围直接注射胶原，在治疗没有显著发病率的括约肌缺陷方面有很高的成功率。但是，使用胶原在平均两年之后会导致失败，因此需要考虑其成本有效性(Khullar V.等，《英国妇产科学杂志》104:96-99(1996))。此外，可能由于移动现象而使病人的节制能力恶化，为恢复节制能力需要重复注射(Herschorn S.等，《泌尿学杂志》156:1305-1309(1996))。
在根治性前列腺切除术之后使用胶原治疗压迫尿失禁，其结果一般会令人失望(Klutke C.G.等，《泌尿学杂志》156:1703-1706(1996))。并且，有一项研究提供证据表明，注射牛皮胶原会产生IgG和IgA类的特异性抗体(McCell M.&Delustro F.，《泌尿学杂志》155:2068-2073(1996))。这样，病人对胶原的致敏作用将可能长期需要。
由于缺乏其他合适方法，尽管成功率有限，经尿道的胶原注射疗法仍为一种可接受的治疗内因性括约肌缺陷的方法。
2．3皮肤皱纹由于年老、暴露于阳光或者其他原因对皮肤造成的伤害经常导致皱纹和其他皮肤异常。为除去皮肤皱纹，人们通常求助于美容手术，诸如拉脸整容和缩皮。另外，胶原注射也被用来去除或者减少皮肤皱纹。胶原注射还被用于组织膨胀或者用于提高身体某些部位的丰满度，例如提高嘴唇或者脸上眼睛和眼眉周围的丰满度。但是，胶原是一种天然产的物质，长期以后身体可能会将其酶促降解和去除，因而需要重复治疗。从美容角度看，有一个更为惊人的问题是，胶原可能会从注射的起始点移开，在皮肤下面不希望的地方产生难看的隆起或肿块。
微珠或者固体微粒已被用于修正皮肤皱纹。例如，硅粒、特氟隆糊剂、胶原珠和聚丙烯微球已被使用，但由于特别是组织副反应、生物降解和从起始植入处移开等原因，治疗结果令人失望。
2．4微粒在本发明之前，已经制造和销售了用于体外锚地依赖细胞培养的微球(Van Vezel,A.L.，《自然》216:64-65(1967)；Levine等，《体细胞遗传学》3:149-155(1977)；0brenovitch等，《生物细胞》46:249-256(1983))。它们也在体内在进行动脉管畸形、痿管和肿瘤治疗时用于闭塞血管(参见美国第5635215号专利，1997年6月3日授予Boschetti等人；Laurent等，《美国神经学会杂志》17:533-540(1996)；以及Beaujeux等，《美国神经学会杂志》A:533-540(1996))。
此外，虽然曾经尝试将细胞直接植入活组织如脑或肝，以治疗特定缺陷，但大多都失败了。与直接细胞移植相联的主要问题是，细胞移植的长期生存能力以及免疫病理学和组织学反应。表面附着有细胞的微粒已被用于某些体内应用。Cherkesey等人在《IBRO》657-664(1996)中描述了在包衣的葡聚糖珠上培养肾上腺细胞，并将其植入哺乳动物大脑，以排挤一些与6-羟基多巴胺诱导的单边黑质损害有关的特定疾病。细胞预先附着在葡聚糖微载体上可以提高植入大脑中的细胞的功能。肝细胞移植也已用于控制急性肝衰竭或者用于取代特定的有缺陷的功能，如胆红素的缀合或白蛋白的合成。出于这个目的，要进行生长于微球表面的肝细胞的脾内注射(Roy Chowdhury等人，载于AOA Miller主编的《动物细胞技术高级研究》第315-317页，Kluers学术出版社，1989年)。
然而，大多数细胞移植结果，在指定功能方面都令人失望(或者具有低水平的生物学功能)。
3．发明概述本发明包括在治疗GERD、尿失禁和皮肤皱纹时使用可植入微粒。在每次使用时，微粒作为膨胀剂植入到合适的组织、肌肉、器官等中。另外，在每次使用时，微粒都优选用诸如肌肉细胞、脂肪细胞及类似的自体细胞预先包覆。本发明的微粒是用细胞粘连促进剂包覆、与之相连或用其填充的生物相容性无毒聚合物。这些微粒优选用阳离子单体或聚合物使其表面带有正电荷。
在一个实施方案中，本发明包括对一个胃食管回流症患者的治疗，该治疗包含将亲水性生物相容性微粒植入到下食管括约肌中，所述微粒包含(a)一正电荷和细胞粘连促进剂；(b)层积在所述珠粒表面上的自体细胞。这些微粒优选为本文中详细描述的微球或微珠。自体细胞优选从将要进行植入的区域提取。植入前可以用从病人提取的血清或全血洗涤微粒。关于GERD的治疗，也可以通过使用本领域技术人员公知的标准技术来进行植入，如用注射器或其他合适的设备进行注射。
在另一个实施方案中，本发明包括对一个尿失禁患者的治疗，该治疗包含将亲水性生物相容性微粒植入到尿道括约肌中，所述微粒包含(a)一正电荷和细胞粘连促进剂；(b)层积在所述珠粒表面上的自体细胞。这些微粒优选为本文中详细描述的微球或微珠。另外，自体细胞优选从将要进行植入的区域提取。植入前可以用从病人提取的血清或全血洗涤微粒。通常使用注射器或者其他适于植入特定组织的设备进行移植。
在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗人的皮肤皱纹的方法，该方法包含给药或植入已用自体细胞预先处理的微粒，这些微粒包含带正电荷的亲水性共聚物和细胞粘连促进剂。微粒在植入前可以只是简单地与自体细胞接触或者与自体细胞充分混合。
值得注意的是，上述治疗GERD和尿失禁的这两种方法可以与现今治疗这些疾病的常规方法结合使用，即口服利尿药、抗酸药、合适的药物治疗及类似方法。这种联合治疗能使病人恢复得更快、更安全和更舒服。
在另一实施方案中，本发明包含对皮肤皱纹的治疗或改善，方法是将亲水性生物相容性微粒给药到皮肤皱纹区域或者周围，所述微粒包含(a)一正电荷和细胞粘连促进剂；(b)层积在珠粒表面上的自体细胞、胶原、胶原衍生物或葡糖胺聚糖。换言之，是将用细胞粘连促进剂包衣并用适宜的组织膨胀细胞预先处理的微球或者微珠给药到治疗区域。
这里所用的术语“给药”、“植入的”或“植入”可以互换使用，意思都是指用本领域技术人员熟知的适于治疗这类疾病的技术将物质释放到治疗区域。可使用侵入与非侵入法进行释放。
4．附图简述

图1为括约肌膨胀的示意图。珠粒被包覆并在生理条件下注射到括约肌中。随着珠粒注入量的增加，括约肌体积成比例增大，腔的尺寸成比例减小。珠粒逐渐而不可逆地整合在肌肉内。
5．本发明的详细描述本发明使用表面带正电荷和细胞粘连促进剂以及可选的细胞成长促进剂的微粒，特别是微珠，治疗GERD、尿失禁和皮肤皱纹。本发明的微粒优选与自体细胞一起使用。换言之，本发明的微粒在植入前用合适的细胞定居。这个在植入前的步骤已经表明可以减少或消除免疫反应和移植排斥反应。另外，使用带正电荷的、不可生物降解的、生物相容的微珠和无论是否为组织特异性的自体细胞，可提高组织接受性和整体治疗效果。
按照本发明的方法，可以治疗GERD、尿失禁和皮肤皱纹，并避免或显著减少组织副反应，包括移植排斥、颗粒降解、吸收、移动和其他副反应。本发明的方法也包括增强的结缔组织反应。
本发明所使用的微珠或微粒是基于用促进细胞粘连的试剂包覆的生物相容性无毒聚合物。为增强珠粒的长期稳定性，活细胞附着在微粒上，在此形成与周围组织相连的层积细胞。
按照本发明，将被植入身体不同位置的微粒由含有用于细胞粘连的适宜物质的不可再吸收的亲水聚合物组成。它还可以含有不透射线的分子或其他标志剂，以在插入之前或者当中通过放射学加快定位。适于该应用的亲水共聚物为丙烯族共聚物，如聚丙烯酰胺及其衍生物、聚丙烯酸酯及其衍生物，以及聚烯丙基和聚乙烯基化合物。所有这些聚合物都是交联的，以便稳定和不可再吸收，并可在它们的结构中含有其他显示特定性能诸如趋化作用的化学物质、促进细胞与细胞或组织例如食管壁或尿道壁细胞或者皮肤细胞粘连的化学物质，和/或标志剂。
用于本发明的微粒对组织和细胞无毒，它们是生物相容的，并借助于它们所促进的细胞生长而在植入部位与各种细胞和组织相粘连。另外，这些微粒是不可再吸收和不可生物降解的，因而是稳定的、持续的，一经被植入所需部位，它们将保留其通常形状与位置。
一般而言，本发明所用的微粒可以为任何形状，但优选为球形微粒。本发明所用的微粒直径可为约10-约1000μm。本发明所用的在其表面粘附有细胞的微粒优选的直径是50-1000μm。
本发明的可能的变化包括用任何生物相容的、无毒的、不可再吸收的聚合颗粒、膜、纤维或者用细胞粘连促进剂处理过的其他固体物质取代微粒。本发明也包括线性可溶性聚合物，它们在注射后于原处交联成固态的细胞粘连促进填充剂。本发明也设想了空微粒(微泡)的配制和/或注射，它们是事先配制好的，或通过使用合适的导管在适当位置生成。
本发明所使用的微粒或其他固体物质是能变形的，因此能容易地进入或通过注射器具和小导管，而不会持久改变。但是，微粒也能抵抗在植入过程中或之后所产生的肌肉收缩压力。它们也是热稳定的，使消毒和冷冻储存容易且方便。
本发明所用的微粒或其他固体物质在悬浮液中也是稳定的，使得微粒和其他固体物质能在悬浮液中配制和储存并与不同的液体一起注射。更具体地说，微粒的亲水性允许将它们放入悬浮液中，特别是为无菌和热性(无热原)的可注射溶液形式，同时避免聚集体的形成或者与储存容器和移植设备器壁的粘连，如导管、注射器、针头及类似物。优选地，这些可注射溶液含有近似分布在管径切面中约为10-2000微米的微粒或其他固体物质。
本发明的微粒既亲水又为阳离子。这些微粒优选包含中性亲水单体、双官能单体、带有阳离子电荷的一个或多个单体以及可选的能使微粒可检测的功能化单体的共聚物。微粒也可以包含一种或多种细胞粘连促进剂以及一种标志剂。
共聚物优选为亲水性丙烯酸共聚物，它包含共聚形式的约25-约98重量％的中性亲水性丙烯酸单体，约2-约50重量％的双官能单体和约0-约5重量％的一种或多种具有阳离子电荷的单体。
举例而言，作为参考文献而引入本文的法国专利第2378808号所记载的共聚物可以按照本发明用于制备碱性微粒共聚物。
至于亲水性丙烯酸单体，可以使用丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酰胺及其衍生物、或者羟基甲基丙烯酸甲酯。
双官能单体的例子包括但不限于N,N’-亚甲基-双-丙烯酰胺、N’,N’-二烯丙基tartiamide或者乙二醛-双-丙烯酰胺。
另外，带有阳离子电荷的单体包括但不限于带有叔胺或季胺功能的那些，优选为二乙氨基乙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺丙基三甲铵或者丙烯酰胺乙基三乙铵。
在一个特别优选的实施方案中，使用一个包含约25-约98重量％的甲基丙烯酰胺，约2-约50重量％的N,N-亚甲基-双-丙烯酰胺的共聚物。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，有可能通过使粘合剂成网状而提高微球的稳定性。以明胶为例，可以从对明胶胺有反应的双官能化学剂中挑选网化剂(例如戊二醛、甲醛、乙二醛及类似物)。
将单体与标志剂进行化学偶联，通常可以获得官能化单体，它们可以是-化学染料，如Cibacron蓝或Procion红HE-3B，使微球能直接可见(Boschetti，《生物化学与生物物理学杂志，方法学》19:21-36(1989))。用于这类标志剂的官能化单体的例子包括N-丙烯酰六亚甲基Cibacrone蓝或者N-丙烯酰六亚甲基Procion红HE-3B；-磁共振显影剂(铒、钆或磁铁矿石)；-造影剂，如钡或碘盐(例如，包括酰氨基-e-丙酰胺基-3-三碘-2,4,6-苯甲酸，这些可以在Boschetti等人所描述的条件下配制(《法国化学会通报》1986年第4期)。对钡或磁铁矿盐而言，它们可以以粉末形式直接加入最初的单体溶液。
如上所示，也可以在微球合成以后再标记，例如通过嫁接荧光标记衍生物进行(例如，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)及类似物)。
本发明中可使用本领域熟知的不同种类的细胞粘连促进剂。具体而言，可以从胶原、明胶、葡糖胺聚糖、纤连蛋白、凝集素、聚阳离子(例如聚赖氨酸、脱乙酰壳多糖及类似物)或者其他天然或合成生物细胞粘合剂中选出生物粘连促进剂。
细胞粘连促进剂在微粒或者其他固体物质中的优选量为每1ml所确定的微粒有约0.1-1g的促进剂。
通过悬浮液聚合反应、点滴聚合反应或者本领域技术人员熟知的任何其他方法可以配制微粒。微粒制备方式的选择通常取决于所得微粒的所需特性，如微粒直径和化学组成。本发明的微粒可以采用本领域中公开的标准聚合方法制得(E.Beoschetti，“用于生物色谱分析和生物医学应用的微球”，第一部分，“微带的制备”，载于John,Wiley＆Sons,Arshady R.所著《微球、微囊化和脂质体》，1998年(出版中)，其引用在此作为参考)。微球的制备是从含有诸如胶原(明胶是一种变性胶原)等粘合剂的单体水溶液开始的。然后该溶液与非水性的可混溶的溶剂混合，生成液滴的悬浮液，再利用合适的催化剂通过单体聚合反应，将悬浮液变成固态凝胶。之后通过过滤或离心作用收集微球并进行洗涤。
通过亲和层析中被称为“配体固定”的化学偶联过程将细胞粘连促进剂或标志剂引入到微珠上。另一种引入的方法是在组成微珠的明胶网内扩散，然后通过沉淀或化学交联在适当位置捕获扩散的分子。在珠粒植入前，治疗剂、药品或其他适合由珠粒转运的活性分子也能按照最后一种方法引入微珠中。
本发明的微球也可以通过作为参考文献引入本文的法国专利第2378808号和美国专利第5648100号中所描述的标准聚合方法获得。一般而言，单体在溶液中的聚合在约0-100℃之间进行，在有聚合反应起始剂的情况下，为约40-60℃。
聚合反应起始剂最好从氧化还原系统中选出。值得注意的是，有可能使用碱金属过硫酸盐与下列物质的组合物N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、二甲氨基丙腈，或者使用有机过氧化物诸如苯甲酰过氧化物，或者甚至是2,2’-偶氮基-双-异丁腈。
起始剂的用量由该领域技术人员根据单体的量和所需的聚合速率进行调整。
聚合反应可以在本体或者乳液中进行。
在进行本体聚合时，含有不同溶解组分的水溶液与起始剂在均匀介质中进行聚合。这样有可能获得一块水凝胶，其再通过筛网分离成微球。
乳液或悬浮液聚合是一种优选制备方法，因为可以直接获得所需尺寸的微粒。其过程是含有不同溶解组分(如不同单体、细胞粘合剂)的水溶液，通过搅拌与不与水混溶的有机液相混合，作为选择还可以存在乳化剂。调整搅拌速率，以获得能形成所需直径液滴的在有机相中的水相乳液。然后加入起始剂开始聚合反应。与之相伴的是放热反应，接着可以测量反应介质的温度。
有可能使用植物或矿物油、某些石油蒸馏产物、氯化烃或这些不同溶液的混合物作为有机相。此外，当聚合反应起始剂包括几种组分(氧化还原系统)时，可以在乳化之前，将其中一个组分加入水相。
由此获得的微球可以通过冷却、倾析和过滤而回收。之后按照大小种类进行分离，并进行清洗，以去除副产品的任何痕迹。
聚合反应阶段之后为细胞粘合剂的网状形成阶段。如果在合成后通过嫁接使得微球可以辨认，那么，也有可能在聚合反应阶段后出现标志剂阶段。
本发明的具有细胞粘连和生长促进特性的微粒可以直接用于组织膨胀。并且，在体外，这些微粒能有特定的自体细胞长在它们表面，因而使得这些微粒对于组织膨胀特别有用。
在本发明之前，将悬浮在生理溶液中的可植入物质注入组织导致了在肌肉块内生成分散的聚集体。这些分散的聚集体能生成处在一起的、不同量的植入物质，但是这些物质不能附着或成为组织本身的一部分。这种分离使得植入物从移植起始部位移走。
按照本发明，为了避免上述问题，可以单独分开注射微粒。更为优选的是，微粒表面可以定居一层细胞，以使植入物更好地整合并长期稳定。
本发明的微粒显示出在其表面生长细胞的卓越能力。例如，原发性肌细胞已经成功地粘附在本发明的微粒表面上，使得在肌肉组织内可以获得更好的整合。另外，由于组织膨胀的最终目标是人为地增大组织质量，因此在注射前，也将前脂肪细胞用于定居微粒表面。在这种情况下，前脂肪细胞具有同其他正常细胞相类似的体积，但在植入后，当前脂肪细胞在体内生理条件下时，它们会积聚脂肪液滴，从而使植入物质的体积增大10％以上。
按照本发明，在病人体内进行组织膨胀的一种方法可以按以下描述进行a)通过简单的活检从病人体内提取原始细胞并进行分离；b)这些细胞在生长促进条件下(如可能使用含有自体血清(从病人身上提取)的营养培养基，直至汇合)在微粒表面上生长；c)将生长在顶部的带有病人细胞的微粒注射到病人的预定膨胀组织中。
为治疗GERD，运用内镜释放或腹腔镜技术，将微粒或其他固体物质通过食管引入并注射到食管与胃相接的括约肌，即下食管括约肌壁内。这样就减小了括约肌的内腔，使得肌肉收缩更容易，只有更少的胃液回流到食管。此外，这种治疗减少了下食管的炎症。这些微粒或其他固体物质也可以加载不透X射线的染料或其他显影剂，以用于随后的X射线显影。
在另一个实施方案中，为治疗GERD而在食管和胃相接的括约肌内注入的微粒也包括适量的用于治疗GERD的药物，如H2组胺拮抗剂，包括西米替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁；H+，K+-腺苷三磷酸酶抑制剂，包括奥美拉唑和兰索拉唑；抗酸药，包括例如Al(OH)3、Mg(OH)2和CaCO3。用于治疗尿失禁和皮肤皱纹时，微球可以与抗炎剂、血管生成抑制剂、放射性元素和抗有丝分裂剂一起使用。
在McGraw-Hill出版社(1996)出版的第九版《Goodman＆Gilman治疗药理学基础》和1997年的《医师手册》中报道了与本发明的微球或微粒结合使用的其他治疗剂，包括用于治疗皮肤疾病、GERD和尿失禁的那些。
与在先技术中的方法相比，本发明治疗GERD方法的主要优点在于a)与外科手术相比，对病人的侵袭作用更小；b)比抗酸药或其他药物的作用更持久；c)有具有趋化作用的良好的生物相容性；d)能应用X射线显影或MRI来帮助随后对病人的评估。
为治疗尿失禁，将微粒或其他固体物质经尿道引入并注射到膀胱括约肌壁内，从而减小了括约肌内腔，使得肌肉收缩更容易，由此降低失禁发生的可能性。微粒或其他固体物质也可以加载不透X射线的染料或其他显影剂，以用于随后的X射线显影。
在另一个实施方案中，为治疗尿失禁而注入膀胱括约肌的微粒中也可以包括适量的用于治疗尿失禁的药物，如制尿药、抗胆碱能药、盐酸羟丁宁和抗利尿激素。
所注入的微粒会产生一些短暂的副作用，如局部发炎，因此微粒可含有或与抗炎药一起注射，如水杨酸衍生物，包括阿斯匹林；对氨基苯酚衍生物，包括扑热息痛；非类固醇抗炎药，包括消炎痛、苏林大、依托度酸、托美丁、双氯酚酸、酮咯酸、布洛芬、萘普生、氟瑞托芬、酮洛芬、苯氧苯丙酸钙、噁丙秦；邻氨苯甲酸，如甲芬那酸、甲氯芬那酸；烯醇酸，如吡罗昔康、替诺昔康、保泰松、oxyphenthatrarone；以及萘丁美酮。这些抗炎药优选吸收在微粒的网上，在一小段时间(几天)里慢慢释放。在被注射到病人体内之前，微粒也可用来释放其他可掺入微粒网内的特定药物。药物将只在一段短时间内在植入部位局部释放，以提高整体治疗效果。
将活性分子，如药物掺入本发明微粒的方法是，将干燥的微粒与所述活性分子或药物的水溶液或氢化有机溶液混合。微粒由于吸收溶液而膨胀，感兴趣的活性分子掺入到微粒网中。由于实质基于离子交换作用的主动吸收机理，活性分子将保留在微粒内。这些微粒本身携带阳离子基因，具有吸附阴离子分子的能力，如众所周知的抗炎药。然后，随着注射到病人体内，由于生理盐和pH的作用，这些阴离子分子将缓慢释放。不同种类的微粒吸附药物分子的能力可以由技术人员容易地确定，它取决于制备微粒时所用的起始溶液中所存在的阳离子单体的数量。
与在先技术中的方法相比，本发明治疗尿失禁方法的一些主要优点在于a)比使用常规胶原粘性溶液具有更持久的作用；b)具有趋化作用的良好的生物相容性；c)可在X射线或者MRI中显影，有助于随后的评估；d)避免了用可再吸收的天然产生物质如胶原进行重复治疗。
按照本发明进行的皮肤皱纹治疗方法的主要优点在于a)与外科手术相比，对病人的侵袭作用更小；b)比使用胶原注射的作用更持久；c)具有趋化作用的良好的生物相容性。
为治疗皮肤皱纹，可以通过注射导入微粒，这些微粒也可以包括一种或多种抗炎剂。
下列实施例作为参考对本发明作了更进一步的定义，这些实施例详细描述了用于组织膨胀、治疗皮肤皱纹、尿失禁和GERD的微粒的制备。下列实施例仅仅是说明性的，它们不以任何方式限制本发明的范围。对本领域技术人员不言而喻的是，在不背离本发明的目的和范围的情况下，可以对材料和方法进行许多更改。
6．实施例6．1实施例1制备具有趋化性能的不规则水凝胶颗粒将58g氯化钠和27g醋酸钠在室温下溶于100ml软化水。向此溶液中加入400ml甘油，将pH调节至pH6.0，然后将单体溶解。更明确地说，向此溶液中加入90g羟甲基丙烯酰胺、2g盐酸甲基丙烯酰胺丙基-三甲基-氯化铵和10g N,N’-亚甲基-双丙烯酰胺，并搅拌该混合物直至完全溶解。将该溶液加热至约70℃，并加入100ml浓度为500mg/ml的明胶溶液。然后加入软化水将该混合物的总体积调整至1000ml。最后加入20ml 70mg/ml的过硫酸铵水溶液和4ml N,N,N’,N’-四甲基-乙二胺。所得混合物在70℃下储存大约3小时，直至形成致密的三维凝胶。此凝胶完全不溶于水。将其切成小块，然后研磨得到尺寸接近于100-200μm的非常小的颗粒。将这些颗粒悬浮于1升含有5％(w/v)戊二醛的生理缓冲剂中并振摇2小时。最后，充分洗涤这些颗粒，以去除未聚合的物质、副产物和盐。为了得到均匀的颗粒大小分布，利用合适的筛网将颗粒悬浮液过筛。
这些颗粒具有在肌肉膨胀之前的组织细胞粘连所需的特性，并包括用于有效细胞粘连机理的阳离子基团和粘合剂。
6．2实施例2制备具有趋化性能的球形聚丙烯水凝胶颗粒将如上述实施例1中所述制得的单体溶液缓慢倒入1500ml搅拌的热石蜡油(50-70℃)中。几分钟后，得到液态的悬浮液/乳液(单体水溶液分散到油中，形成非常小的球形液滴)，在悬浮液中发生聚合反应。微滴转化成微珠。通过离心回收固体微珠，将其悬浮于1升含有5％(w/v)戊二醛的生理缓冲剂中并振摇2小时。最后用水充分洗涤这些颗粒，以完全去除痕量的油。可以用有机溶剂萃取更有效地去除油或者在痕量非离子洗涤剂的存在下进行充分洗涤。如果需要，可以通过尼龙网过筛调整所得到的微珠并在高压灭菌器中灭菌。这些微球具有在肌肉膨胀之前的细胞粘连所需的特性和性能。
6．3实施例3制备用于组织膨胀的亲水性球形聚苯乙烯共聚物颗粒将10g苯乙烯与60ml甲苯混合。向所得溶液中加入1g二乙烯基苯、1g二甲基-氨基乙基-甲基丙烯酸酯和1g二甲基-丙烯酰胺。完全溶解后，将该单体溶液与作为聚合反应催化剂的1％AIBN(2,2’-偶氮二异丁腈)和作为粘度诱导剂的40ml石蜡油混合。将该混合物倒入含有0.5％吐温80的搅拌的水溶液中。在此情形下，有液滴悬浮液形成，当温度升高至80-90℃达3-5小时的时候，它变成固体微珠。将所得微珠干燥并用有机溶剂萃取。然后使它们在存在于中性pH的磷酸盐缓冲剂中的胶原水溶液中膨胀。如实施例1和实施例2中所述，使包埋的胶原与戊二醛交联。所得微珠具有与细胞组织相互作用的阳离子电荷和用于细胞粘连的胶原，以及用于细胞生长和生物相容性的趋化剂。它们适宜作为组织膨胀剂。
6．4实施例4制备用于细胞粘连和组织膨胀的亲水性硅珠将10g直径为20-300μm的硅珠悬浮于30ml十六胺(10mg/ml)的乙酸乙酯溶液中。将该悬浮液搅拌2小时并加入100ml乙醇。缓慢加入1M硫酸铵或氯化钠的水溶液，直至得到300ml悬浮液。然后使含有氨基的硅珠在碱性条件下与丁二醇二缩水甘油醚反应。由此得到环氧衍生物，其上使用本领域中熟知的方法偶联了明胶。所得微珠具有生物相容性、亲水性、非生物降解性和借助于阳离子氨基以及作为细胞生长促进剂的明胶的存在使细胞粘连等目标性能。它们适合按照本发明的组织膨胀。
6．5实施例5制备用于组织膨胀的、含有粘连因子的微珠按照实施例2制备的珠粒用制备亲和层析吸着剂时所用的熟知试剂进行化学活化。然后将活化珠粒用于细胞粘合剂诸如纤连蛋白或玻连蛋白或层粘连蛋白的固定。将粘合剂以1-10mg/ml的浓度溶于偶联缓冲剂(pH8-10的100mM碳酸盐或硼酸盐缓冲剂)，然后将该溶液与活化珠粒混合。所得珠粒具有细胞粘连和生长、非生物降解性以及是不可再吸收的等目标性能。它们适合按照本发明的细胞粘连和永久性组织膨胀。类似地，也可以使用按照实施例3和实施例4制备的珠粒。
6．6实施例6制备具有趋化性能的球形聚丙烯水凝胶颗粒可从商业上获得的、名称为SPEC-70的微珠(BioSepra Inc.,Marlborough,MA)是具有弹性的聚丙烯聚阴离子珠粒，它们适合用于组织膨胀。然而，这些微珠没有趋化性，也不具有阳离子电荷。首先将SPEC-70微珠在真空下干燥以除去水，然后在生理条件下将其悬浮于1％硫酸软骨素钠盐的水溶液中。一旦此化合物被吸收到珠粒结构上，就将这些珠粒在真空下排水并悬浮于含有20重量％聚赖氨酸的水溶液中。将该悬浮液振摇几小时，然后在真空下排水并迅速用蒸馏水洗涤。将这些珠粒悬浮于5％丁二醇二缩水甘油醚的乙醇溶液中，振摇过夜。在这些条件下，聚赖氨酸以及硫酸软骨素发生交联。所得改性珠粒具有以下性能，诸如带有用于细胞粘连的阳离子电荷和用于细胞生长的促进剂诸如聚赖氨酸和硫酸软骨素。
6．7实施例7制备用于组织膨胀的、具有趋化性能的、不透射线的微珠将从实施例2得到的微珠在真空下排水，然后悬浮于氯化钡的饱和溶液。将它们在室温下振摇2小时，然后在真空下排水，以除去过量的氯化钡溶液。将这些珠粒悬浮于硫酸铵饱和溶液并再振摇2小时，之后通过真空过滤除去过量的硫酸铵。与钡盐和硫酸铵接触的这一操作过程可以重复数次，直至在珠粒里面所产生的不透射线的沉淀达到所需数量。所得珠粒具有用于组织膨胀的不透射线的性能，同时也没有失去它们最初所期望的性能。可以类似地使用从实施例3、4和6得到的微珠。
6．8实施例8制备用于组织膨胀的、具有趋化性能的、不透射线的微珠将从实施例6得到的、用聚赖氨酸包覆的微珠用蒸馏水充分洗涤并悬浮于迭氮酸钠溶液。加入醋酸将该悬浮液的pH调节至约pH7，振摇数小时。迭氮酸盐是一种不透射线的分子，将它紧紧吸收到珠粒上，残留试剂通过在真空下洗涤而除去。所得珠粒仍然具有细胞促进性能，现在还具有了射线不透性。
6．9实施例9在膨胀珠粒里面引入抗炎药当前面的实施例中描述的微珠注射到目标组织中时，可能导致局部的临时性炎症反应。为了避免或减少这种现象，微珠一旦被自体细胞包覆后，就可填充一种或多种抗炎药。这些微珠的本身是带有阳离子的，并可通过离子交换作用吸收阴离子药物。
注射前，将微珠与存在于无菌生理盐水中的10mg/ml阴离子抗炎药物溶液混合。将该悬浮液振摇数小时，通过过滤或离心回收填充了药物的珠粒。所得含有抗炎药的微珠可以在本发明中用作组织膨胀剂。
6．10实施例10前脂肪细胞在聚合珠粒上的体外粘连和生长为了评定从实施例2得到的聚合珠粒允许前脂肪细胞粘连和生长的能力，从Wistar大鼠附睾周脂肪组织采集并分离出新鲜的前脂肪细胞。然后使用用于体外微载体培养的经典方案，在上述微珠的存在下培养前脂肪细胞，微珠的浓度为约7.1×105-约1.7×106细胞/ml。在第一阶段中，细胞粘附在珠粒表面，然后在整个珠粒表面上生长。总的定居期为约72小时。
从这种培养类型得到的前脂肪细胞显示出与分化成脂肪细胞(脂质积聚)有关的良好的生长和特定生物活性。另外，这些细胞显示存在特异性酶标志，诸如甘油-3-磷酸-脱氢酶和苹果酸脱氢酶。带有粘附于其上的细胞的微珠可在本发明中用于组织膨胀。可以类似地评估实施例2-5的聚合珠粒。
6．11实施例11前脂肪细胞和肌细胞在微珠上的体外培养，以检查它们整合到体内组织中的能力按照经典方案，从Wistar大鼠分离出前脂肪细胞和平滑肌细胞，以去除大多数其他污染细胞。这些细胞各自在陪替氏培养皿中、在添加有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基的存在下培养。向在体外培养的细胞中加入按照实施例2制备的明胶包衣的阳离子微珠，直到它们覆盖了陪替氏培养皿的表面。起始细胞种子浓度为0.7×106细胞/ml。
反复观察显示，细胞附着在微珠的表面并进一步繁殖，最终覆盖了珠粒的所有表面。培养5-7天后，有珠粒的固体网状构造形成，此时细胞充当粘合剂，将几个珠粒的团块联合在一起。在大多数情况下，形成包含珠粒和细胞的、固态的、不易离解的聚集体。
生长期(一般为5至7天)之后，当向前脂肪细胞中加入分化因子诸如3,3’5-三碘-D-甲状腺氨酸时，前脂肪细胞开始在细胞质中积聚作为微液滴的脂肪。
用3,3’-双十八烷基氧杂碳菁高氯酸盐或2’-[4-羟基苯基]-5-[4-甲基-1-哌嗪基]2,5’-双-1H-苯并咪唑进行的特异性染色证明了细胞在珠粒底物上的良好粘连。
细胞在分化期开始时用红油染色证明了脂肪在细胞中的聚集。
此外，苹果酸酶的特异性酶促反应表明，在培养结束时，所产生的脂肪细胞是有功能活力的，具有它们主要的已表明的特性。这种酶在培养开始时并不明确，而是与脂肪的积聚同时出现。
利用DNA合成测定观察平滑肌细胞的增殖；以每个前脂肪细胞观察它们在底物上的粘连。肌细胞也显示了良好的增殖以及在珠粒上的粘连。
6．12实施例12肌细胞在聚合珠粒上的体外粘连和生长为了评定从实施例2得到的聚合珠粒允许肌细胞粘连和生长的能力，按照经典方法，从大鼠的食管采集新鲜的平滑肌细胞。然后使用用于体外微载体培养的经典方案，在上述微珠的存在下培养这些细胞，微珠的浓度为约106细胞/ml。在第一阶段中，细胞粘附在珠粒表面，然后生长直至覆盖了整个珠粒表面。总的定居期为约72小时。
从这种培养类型得到的肌细胞显示出良好的生长和性能，并显示出特异性肌球蛋白标志。带有粘附于其上的细胞的微珠可按照本发明用于组织膨胀。可以类似地评估从实施例2-5得到的珠粒。
6．13实施例13制备用于体内膨胀的细胞-微珠颗粒的可注射悬液在细胞培养期后，通过过滤收集细胞-微珠颗粒，并用来自将植入该物质的宿主的血清充分洗涤。此操作确保去除了来自细胞培养物的外源物质。然后将这些微珠悬浮于几毫升自体血清中(微珠/血清比为约1∶1)，准备好借助于合适的注射器或其他注射设备注射到想要膨胀的组织中。
6．14实施例14制备用于体内膨胀的细胞-微珠颗粒的可注射悬液将实施例2中描述的微珠按照实施例10用大鼠肌细胞进行定居，并按照实施例13使用用生理盐水稀释(50％-50％)的大鼠血清调理。将固定在珠粒上的细胞的最终无菌悬液(体积的50％由珠粒组成加上50％的生理盐水)注射到大鼠的右大腿肌肉中。珠粒注射3个月后，观察肌肉的形状并进行组织学检查。尸检应显示右大腿的肌肉体积大于左大腿肌肉。肌肉块里面的珠粒应被成纤维细胞围绕着出现，同时没有特定的炎症或坏死副作用。
上面所描述的本发明的实施方案仅仅是例举性的，本领域技术人员最多使用常规实验就可识别出或能够查明许多与本文中所述的具体方法等价的方法。所有这类等价方法都被认为包含在本发明的范围内并被以下权利要求书所覆盖。
本文中所描述的所有参考文献的内容均引用在此作为参考。
其他实施方案在下列权利要求书中。
权利要求
1.一种治疗胃食管回流症的方法，该方法包含对需要这种治疗的哺乳动物给药治疗上有效的组织膨胀量的生物相容的阳离子亲水性微粒，该微粒包含位于其表面上的正电荷及细胞粘连促进剂，所述给药为给药到下食管括约肌或横膈膜中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
3.如权利要求1所述的方法，其中的微粒用自体细胞预先处理、给药或包覆。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中的微球或用细胞包覆的微球在给药前用血清或全血洗涤。
5.如权利要求3所述的方法，其中的自体细胞是粘膜细胞、肌细胞、脂肪细胞、或其组合物。
6.如权利要求1所述的方法，其中的微粒用至少一种胶原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者与它们相连。
7.如权利要求1所述的方法，其中的微粒存在于无菌和无热原的注射溶液中给药。
8.如权利要求1的方法，其中所述微粒是包含阳离子电荷和细胞粘连促进剂的亲水性微球。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述微粒是包含亲水性共聚物和细胞粘连促进剂的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的约25-约99重量％的中性亲水丙烯酸单体、约2-约50重量％的一种或多种具有阳离子电荷的单体、和约1-约30重量％的官能化单体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述微球的直径范围为约10-约1000μm。
11.一种治疗尿失禁的方法，该方法包含对需要这种治疗的哺乳动物给药治疗有效量的生物相容的阳离子亲水性微粒，该微粒包含位于其表面上的正电荷及细胞粘连促进剂，所述给药为给药到膀胱括约肌。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.如权利要求11所述的方法，其中的微粒用自体细胞预先处理、给药或包覆。
14.如权利要求11或13所述的方法，其中的微粒或用细胞包覆的微球在给药前用血清或全血洗涤。
15.如权利要求13所述的方法，其中的自体细胞是囊细胞、肌细胞、脂肪细胞或其组合物。
16.如权利要求11所述的方法，其中的微粒用至少一种胶原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者与它们共价相连。
17.如权利要求11所述的方法，其中的微粒存在于无菌和无热原的注射溶液中给药。
18.如权利要求11的方法，其中所述给药是经注射器完成的。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述微粒是包含阳离子电荷和细胞粘连促进剂的亲水性微球。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述微粒是包含亲水性共聚物和细胞粘连促进剂的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的约25-约99重量％的中性亲水丙烯酸单体、约2-约50重量％的一种或多种具有阳离子电荷的单体、和约1-约30重量％的官能化单体。
21.如权利要求11所述的方法，其中所述微粒加载或施与了一种或多种抗炎剂。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述微球的直径范围为约10-约1000μm。
23.一种改善皮肤皱纹的方法，该方法包含对需要其的哺乳动物给药生物相容的阳离子亲水性微粒，该微粒包含位于其表面上的正电荷及细胞粘连促进剂，所述给药是在所述皮肤皱褶部位或周围。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述皮肤皱纹部位是在人的脸、颈、躯干、手臂、手、胃、髋部、腿或脚上。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述皮肤皱纹部位是在人的眼睛、嘴唇、面颊、耳朵或鼻子区域内。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述微粒用自体细胞预先处理或给药或包覆。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述自体细胞是前脂肪细胞。
29.如权利要求23或27所述的方法，其中的微粒或用细胞包覆的微球在给药前用血清或全血洗涤。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述微粒用至少一种胶原或其衍生物、葡糖胺聚糖、或其混合物包覆或者与它们相连。
31.如权利要求23所述的方法，其中的微粒存在于无菌和无热原的注射溶液中给药。
32.如权利要求23的方法，其中所述微粒是包含阳离子电荷和细胞粘连促进剂的亲水性微球。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述微粒是包含亲水性共聚物和细胞粘连促进剂的微球，其中所述共聚物包含共聚形式的约25-约98重量％的中性亲水丙烯酸单体、约2-约50重量％的一种或多种具有阳离子电荷的单体、和约1-约30重量％的官能化单体。
34.如权利要求23所述的方法，其中所述微粒加载或施与了一种或多种抗炎剂。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述微球的直径范围为约10-约1000μm。
36.如权利要求23所述的方法，其中所述给药在数天内重复多次。
37.如权利要求1、11或23所述的方法，其中所述细胞粘连促进剂选自纤连蛋白、层粘连蛋白、软骨粘连蛋白、巢蛋白(entacin)、epibolin、肝细胞粘连分子、血清铺展因子、胶原、硫酸肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、葡糖胺聚糖、及其混合物。
38.一种适合组织膨胀的无菌注射溶液，它包含a)直径为10-1000μm的亲水性阳离子微球，所述微球包含一种中性亲水单体、一种或多种阳离子单体、一种或多种官能化单体和一种细胞粘连促进剂；和b)自体细胞。
39.一种用于组织膨胀的方法，它包含(a)制备包含亲水性聚合物和细胞粘连促进剂的阳离子微粒；(b)将所得微粒给药至哺乳动物的需要所述组织膨胀的部位。
40.一种改善皮肤皱纹的方法，它包含(a)制备包含亲水性聚合物和细胞粘连促进剂的阳离子微粒；(b)将所得微粒给药至哺乳动物的所述皮肤皱褶部位。
41.一种治疗胃食管回流症的方法，它包含(a)制备包含亲水性聚合物和细胞粘连促进剂的阳离子微粒；(b)将所得微粒通过注射到位于食管与胃交切处的括约肌壁内而对哺乳动物给药。
42.一种治疗尿失禁疾病的方法，它包含(a)制备包含亲水性聚合物和细胞粘连促进剂的阳离子微粒；(b)将所得微粒通过尿道对哺乳动物给药并将该微粒注射到膀胱括约肌壁内。
全文摘要
本发明涉及使用生物相容的亲水性阳离子微粒和细胞粘连促进剂治疗尿失禁、胃食管回流症和改善皮肤皱纹。
文档编号A61K9/18GK1299291SQ99805884
公开日2001年6月13日 申请日期1999年3月4日 优先权日1998年3月6日
发明者J·M·沃格尔, R·托马斯, E·波舍蒂 申请人:拜奥瑟普拉医疗公司