调节免疫应答的方法及装置的制作方法

专利名称：调节免疫应答的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明普遍涉及一种在哺乳动物中调节对抗原的免疫应答的方法，该方法使用一种以受控方式将抗原暴露于免疫系统细胞的可植入装置。通过建立一种模仿淋巴节的组成和作用的人工环境并对装置内抗原的生物利用率进行调控，可诱导出针对某种抗原的强烈应答，或能够对已有的免疫应答进行减量调节。
背景技术：
对抗原的免疫应答的诱导以及该应答的强度取决于抗原、各种免疫细胞、和包括细胞因子和趋化因子在内的协同刺激分子之间的复杂相互作用。免疫细胞暴露于抗原和协同刺激性环境的时间和程度可进一步调节免疫应答。体内这些不同类型的细胞和辅助因子可被方便地带到诸如淋巴节等淋巴组织的附近。在涉及该过程的众多类型的细胞中，诸如巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞可将抗原由外围传送至有组织的局部淋巴组织，也可对抗原进行加工，将抗原性肽呈递给T细胞，以及分泌协同刺激分子。因此，如果使抗原以一种局部交错方式抵达淋巴器官，那么在最佳浓度梯度及含有协同刺激分子的适当环境下即能够在引流淋巴节内诱导应答。
以这种方式，如通过疫苗接种，将外来抗原引入体内并不一定会引起具有预期强烈免疫应答的产生。用于疫苗接种的抗原可包括减毒并灭活的细菌和病毒及其组分。疫苗接种的成功在某种程度上取决于抗原的类型和数量、免疫位点的位置、以及疫苗接种时免疫系统的状况。并非所有的抗原都具有同等的免疫原性，而对弱免疫原性抗原而言，几乎没有可用来提高免疫有效性的替代方法。尽管有多种技术可用来在实验动物中加强免疫应答的产生，如将抗原与一种更具免疫原性的载体蛋白或生物分子(如钥孔血蓝素)相结合，或使用弗氏佐剂或明矾等佐剂，但这些技术和佐剂不能用于人类疫苗接种。因此，有许多疾病本可通过在暴露于感染性因子之前进行免疫接种的方法加以预防，或利用治疗性疫苗来诱导产生对已有致病因子或细胞，如癌，的有效免疫应答，而这些方法却无法对病人使用。
为确定由导致名为无菌性脓肿的异物所吸引的免疫细胞群体，而在哺乳动物体内进行了海绵植入研究，并使植入前或植入后的海绵带有抗原以进一步研究被吸引的细胞群体。Vallera等(1982，癌症研究42397-404)将含有肿瘤细胞的海绵植入小鼠以检测在16天的周期内被吸引的细胞的构成，并发现在早期时出现了细胞毒性细胞前体，而细胞毒性在第16天时达到峰值。将含有肿瘤细胞的海绵植入已预先用肿瘤细胞免疫的小鼠，则显示海绵内细胞毒性细胞的出现更加迅速。在两种情况下，来自脾、淋巴节或腹膜的细胞均未显示出细胞毒性，这表明对海绵内抗原的应答具有高度区域性。
Jenski等(1985，免疫学方法杂志85153-161)则利用类似条件通过植入带有抗原的海绵使亚致死照射后接受同系骨髓移植的小鼠恢复了细胞免疫力。免疫力恢复的确定是通过测量海绵内恢复细胞的细胞毒性T淋巴细胞活性随时间的变化。Zangemeister-Wittke等(1989，免疫学杂志143379-385)是将肿瘤疫苗注射到植入肿瘤免疫小鼠的海绵内，并监测海绵部位产生的二次免疫应答。在邻近植入的海绵的淋巴节内未出现明显的伴发效应。
Chen等(1994，癌症研究541065-1070)收集了带有已照射肿瘤细胞的植入海绵内的T细胞，以说明这些细胞可用来继承性转移抗肿瘤活性。在植入携肿瘤细胞海绵的动物体内测量了由海绵及局部淋巴节和脾回收的肿瘤反应性细胞毒性T细胞的频率。海绵内包含的肿瘤细胞反应性细胞毒性T细胞比淋巴节高4倍，比脾则高50倍。
尽管为了解决可用的有效疫苗方面的这些缺陷而在进行着有意义的研究，但与治疗技术及材料相关的困难依然存在。因此需要开发出一种可克服目前与流行免疫疗法及治疗协议，如预防性和治疗性免疫接种，相关的难题的技术或方法，从而需要推进有效而又高效的新策略的发展，用于改善对健康哺乳动物及那些可受益于免疫疗法的动物实施免疫法的有效性。此外，对特定抗原或系列抗原的免疫应答加以抑制的能力将为，例如，过敏反应的治疗及移植排异的预防提供优势。因此，本发明将针对这些目标的实现。
发明概述本发明提供一种方法，该方法通过在哺乳动物体内植入一种含有被装入带孔但又不通透的容器的多孔基质的装置来调节哺乳动物体内对某种抗原的免疫应答。在装置的多孔基质中存在有所需免疫应答所针对的抗原。该抗原可在植入前即存在于装置中，也可在植入后引入该装置；植入时，装置的基质中存在的抗原能够以不具生物利用率但植入后可变为具有生物利用率的形式提供。该装置将吸引免疫系统的细胞与装置中的抗原相遇，并且这种相遇将调节对抗原的免疫应答。带孔容器作为扩散屏障，可保持装置内由免疫细胞在装置中产生的高水平的细胞因子和其它协同刺激因子，这些因子与装置中的其它免疫细胞接触时可提高所需免疫应答的建立。孔洞可作为免疫细胞的进出通道。所需免疫应答可包括细胞免疫、粘膜免疫和体液免疫，并且对健康哺乳动物和那些可受益于免疫疗法的动物均适用。
例如，本发明的实施是在植入哺乳动物体内之前在本发明的装置中提供少量的抗原。而优选的是在植入哺乳动物体内约3天后，将抗原引入装置的多孔基质，或使其中的抗原变为具有生物利用率。在哺乳动物体内将诱导出对该抗原的强烈免疫应答。
在另一实施方案中，该装置由最终可在体内降解的生物可降解材料组成。作为选择，也可在该装置实现其预期效应后将其由体内取出。
从其最广泛的方面来看，本发明提供一种用于免疫哺乳动物的可植入装置，该装置具有以下特征一种被装入带孔但又不通透的容器的多孔基质，装置的基质中另含有一种在植入前即以生物可用形式存在或可在植入后变为生物可用形式的抗原，或在植入后将抗原引入其中。装置内抗原的生物利用率可通过以延迟释放剂型等非生物可用形式提供抗原来加以控制，如通过微球、微胶囊或脂质体等一旦降解即可将抗原释放入装置的基质中的形式提供。
在另一实施方案中，本发明的方法和装置可用来降低或减量调节哺乳动物体内对某种抗原的免疫应答，它是通过在装置中使用一种高浓度的特定抗原，这可导致对特定抗原的免疫应答的抑制，并抑制对该抗原的免疫应答的建立。细胞因子或其它协同刺激分子也可在装置中提供。
本发明所述方法和装置的更多应用包括从装置中收集免疫细胞，以用于随后为进行继承性免疫疗法、主动免疫法和免疫系统重建而实施的再次引入体内。其它应用还包括改善多克隆抗体(免疫血清)及单克隆抗体的制备，如在含有人免疫细胞的动物中制备人单克隆抗体。
由下文将会明显看出，利用本文所述发明，通过建立一种模仿淋巴节的组成和作用的人工环境并对装置内抗原的生物利用率进行调控，可产生针对某种抗原的强烈应答。在用于特定抗原的不同条件下，则能够对已有的免疫应答进行减量调节。
附图简述

图1显示在植入哺乳动物皮肤后的9天时间中本发明所述装置内的细胞群体的时程。
图2显示在植入不含任何抗原的装置4天后，装置中出现的细胞的数量及类型分析。
图3显示在不引入任何抗原的情况下，植入4、7和10天后装置中各种细胞类型群体的变化。
图4显示在植入后第3、7和10天将抗原引入装置对装置中CD3-阳性细胞(T细胞)、CD80-阳性细胞(B细胞)、以及CD14-阳性细胞(作为抗原呈递细胞的代表性亚类的巨噬细胞)数量的影响。
图5显示在植入不含或含有不同数量流感抗原的装置10天后、或利用抗原加佐剂于爪垫中免疫10天后，小鼠脾脏中CD4阳性(辅助性T细胞)和CD8阳性(细胞毒性T细胞)细胞的表达变化分析。
图6显示脾细胞对流感抗原的增殖应答测定，这些细胞来源于已植入含有抗原并含有或不含佐剂的装置的小鼠，或来源于由抗原加佐剂于爪垫中免疫的小鼠。脾脏T细胞的增殖是根据干扰素的产生来进行测量。
图7显示分离自小鼠腘淋巴节的T细胞的γ-干扰素分泌水平，这些小鼠已由流感抗原加佐剂于爪垫中免疫。
图8显示根据小鼠中γ-干扰素的分泌水平测量的脾脏T细胞的增殖应答，这些小鼠已利用含有或不含佐剂的本发明所述装置以流感抗原免疫。
图9显示根据已利用不含佐剂的本发明所述装置以一定剂量范围的卵清蛋白抗原免疫的小鼠中γ-干扰素的分泌水平测量的脾脏T细胞激活水平与通过爪垫注射相同剂量范围的抗原和佐剂而免疫的动物的脾细胞增殖应答的比较。
图10同样显示根据已利用不含或含有BCG佐剂的本发明所述装置以0、50μg、50ng或50pg卵清蛋白免疫的小鼠中γ-干扰素的分泌水平测量的脾脏T细胞增殖应答与通过爪垫注射含Ribi佐剂的相同剂量抗原而免疫的动物的脾细胞增殖应答的比较。
图11显示已植入含不同剂量HIV gp120肽抗原装置的动物中抗抗原IgG2a特异抗体的应答与通过爪垫注射含佐剂的相同剂量抗原而免疫的动物的比较。
图12显示除在第一次免疫后三星期时用初次免疫量的10％以相同途径进行加强外，其余均与图11所示的实验相同时的结果。植入动物体内的装置重新装载抗原。
图13为利用含有或不含Ribi或BCG佐剂的本发明所述装置免疫的动物或利用含相同佐剂的传统爪垫免疫法免疫的动物中产生抗HIV gp120肽的IgG2a特异抗体的比较。
图14显示利用不含佐剂的本发明所述装置，或利用含Ribi佐剂的传统爪垫免疫法以不同剂量细胞色素C抗原免疫的动物中IgG2a特异抗体的水平。循环IgG2a的水平利用连续稀释的小鼠血清加以监测。
图15显示利用不含佐剂的本发明所述装置以0.1μg或10μg流感血凝素蛋白片段(BHA)免疫后的小鼠与利用含Ribi佐剂在爪垫以相同抗原剂量免疫的小鼠所产生的总流感病毒特异IgG的水平比较。
图16显示利用γ-干扰素进行T细胞激活测定的读出结果。显示小鼠利用不含佐剂的本发明所述装置以流感抗原进行免疫，与利用含佐剂的抗原以爪垫免疫法进行免疫，以及将抗原置于植入的多孔聚合基质中(但不象本发明的装置那样置于带孔容器中)进行免疫之间的比较。
图17显示上述实验中将来源于已被流感免疫的小鼠的脾细胞用无关抗原(EBV)进行体外攻击的结果，表明在利用本发明所述装置免疫后产生的应答的特异性。
图18显示一种蛋白(牛血清白蛋白)仅从海绵扩散与从本发明所述装置扩散的测试结果比较。
图19显示在插入小鼠4天后由不含或含有流感抗原的本发明所述装置提取的细胞的表型。图中给出未处理的小鼠的外周血淋巴细胞中相同细胞类型的值。
图20显示不含抗原的本发明所述装置与血清中的刺激性细胞因子水平的比较。
图21显示通过植入含流感病毒疫苗的本发明所述装置与通过流感病毒疫苗加佐剂经皮下免疫的动物中，由经过流感感染的靶细胞裂解测量的细胞毒性T细胞的激发程度比较。
图22显示利用含流感病毒疫苗的本发明所述装置免疫的小鼠与利用该疫苗加佐剂经皮下免疫的小鼠中，由流感病毒特异性IgG1的水平测量的体液应答的比较。
图23显示利用含流感病毒疫苗的本发明所述装置免疫的动物与利用该疫苗加佐剂经皮下免疫的动物中产生的流感特异性IgG1的亲和力比较。
图24显示在利用含流感病毒疫苗的本发明所述装置免疫后，以及利用该疫苗加佐剂经皮下免疫后，用流感病毒攻击的小鼠的存活率比较。
图25显示经本发明所述装置免疫，以及经肌内免疫的SCID小鼠产生的流感特异性人IgG抗体的效价比较。
图26显示抗流感抗原的血清抗体(如图25所述)与通过抗原的肌内给药产生的抗体的亲和力比较。
图27显示由本发明所述装置中存在大量抗原而导致的免疫应答抑制。
图28说明本发明所述装置利用质粒DNA进行免疫方面的应用。
图29-31说明本发明所述装置在产生对多糖抗原的免疫应答方面的应用。
图32显示本发明所述装置在诱导对高度保守从而具有弱免疫原性的抗原，亲环蛋白，的免疫应答方面的应用。
图33显示本发明所述装置在全动物诱导针对寄生虫抗原的免疫应答方面的应用。
发明详述本发明提供一种在哺乳动物中调节对抗原的免疫应答的方法，该方法使用一种以受控方式将抗原暴露于免疫系统细胞的可植入装置。通过建立一种模仿淋巴节的组成和作用的人工环境并对该装置内抗原的生物利用率进行调控，可诱导出针对某种抗原的强烈应答，或能够对已有的免疫应答进行减量调节。该装置包含一种多孔基质，即一种海绵状材料，周围环绕着或被包含在一种带孔但又不通透的在此被称为容器的包层或屏障中。带孔容器作为扩散屏障，可使该装置内保持高浓度的免疫细胞分泌产物。可在把该装置插入皮肤内之前或之后将要产生的或要减量调节的免疫应答所针对的抗原置于装置的多孔基质内。对诱导强烈的免疫应答而言，优选的是使装置基质内的抗原在装置插入约3天后变为具有生物利用率。这可通过在该时间点左右将抗原注射于装置内，或通过使用一种装置，其基质内含有一种可在约3天后变为具有生物利用率的延迟释放形式的抗原，来加以实现。对减量调节或抑制针对特定抗原的免疫应答而言，根据具体的抗原，优选的是在装置植入哺乳动物之前将具有完全生物利用率的抗原置于其中。在植入装置后再将抗原置于装置内的情况下，可利用注射器和皮下针头通过确定装置的位置，并将针头插入该装置的方法将抗原跨皮肤引入装置。该装置可留在体内适当位置，或可从体内取出。它可由最终能够在体内分解的可生物降解材料制成，也可在实现其预定效果后被移除。在以后的时间里可将抗原再次引入装置。抗原可在该装置内单独使用，也可与一种佐剂或混合佐剂共同使用。优选的是不使用任何佐剂。
本发明针对多种形式的免疫疗法提供一些改进措施，由其可产生或加强针对某种抗原的预期免疫应答，也可反之将针对特定抗原的现有免疫应答或可能产生的免疫应答分别进行抑制或阻断。它们包括接种法，如针对特定抗原对健康哺乳动物进行接种，和治疗性接种法。免疫应答的阻断或抑制可在与特定抗原相遇前施加于哺乳动物，如未来的移植受体、预期要与一种过敏原接触的哺乳动物，或诸如在自身免疫疾病中易于对外源或内源抗原产生免疫应答的个体。在暴露于抗原后，对免疫应答的抑制可能是有用的，如对抗原产生变应性或过敏性应答的哺乳动物，或遭受移植排异的个体。本发明的方法和装置可针对各种形式的免疫，如细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。
该装置的形状及其使用方法可模拟哺乳动物淋巴组织，尤其是淋巴节，的结构和功能。在体内，引入的外来抗原被抗原呈递细胞、巨噬细胞以及树突状细胞吸收并加工，这些细胞进入淋巴节后将来自抗原的免疫原性肽以特定的构象与MHC抗原一同呈递给T淋巴细胞。T细胞的特定亚类(CD4-Th2)可协助B细胞，并支持高亲和力体液免疫的产生。B细胞能够与抗原直接相互作用(尤其是复合抗原或记忆抗原)并分化为浆细胞，分泌针对免疫性抗原的特异抗体。抗原呈递细胞还分泌可共同参与免疫应答产生的细胞因子、淋巴因子及趋化因子。装置中的带孔容器部件作为一道扩散屏障，可维持装置内及装置中的免疫细胞附近的抗原水平和诸如细胞因子等免疫细胞分泌产物的水平。孔洞可限制这些分子从装置中扩散，但它允许免疫细胞和其它细胞自由进出该装置。据观察发现，极少量的抗原已足以诱导强烈的免疫应答。因此可将装置中存在的抗原与装置中的免疫细胞和协同刺激分子的相互作用进行优化，以增强对抗原的免疫应答的产生，并通过产生记忆细胞群体而赋予长期免疫。
将本发明的装置植入哺乳动物体内可导致无菌性脓肿，其中，免疫系统的某些细胞被异物所吸引并穿过有限数量的孔洞。在起初的几天里，装置中积聚的细胞群体逐渐增加，甚至在不存在任何抗原的情况下也是如此。随着装置中的抗原约在第3天变为具有生物利用率，以及抗原与基质中存在的免疫系统细胞相遇，抗原则被抗原呈递细胞所吸收并进行加工，然后呈递给T淋巴细胞。由于该装置经由带孔容器而暴露于外界的程度有限，因而免疫细胞可以进入，但抗原却保留在装置内并保持高浓度，由装置中的细胞群体所分泌的协同刺激因子同样保持高浓度，这与淋巴节内的方式相同。当T淋巴细胞致敏并激活后可通过有限数量的孔洞离开装置并重新进入循环。因此，该装置提供一种方法，用于控制抗原暴露于免疫系统细胞的程度，并维持细胞因子和其它产生稳固免疫应答所需的因子的水平。由下文实施例将会发现，该装置在产生对特定抗原的免疫应答方面将提供不同级别的改进措施。
从理论角度进一步考虑，植入含有大量特定抗原的本发明所述装置将会以相反于上文所述的方式发挥功能，因为它能够减量调节或抑制现有的或潜在的对抗原的免疫应答。将T细胞暴露于过量抗原明显会诱发抗原特异性T细胞的凋亡，从而除去抗原特异性T细胞和祖细胞，而有效抑制针对抗原的细胞应答和体液应答。通过在抗原刺激中加入细胞因子(如IL-2、IL-4、-IFN、IL-12)而介导的T细胞超活化，或在不应状态下(即在激活状态消退之前)将T细胞暴露于额外抗原刺激都将触发细胞的凋亡，并导致抗原特异性系统中反应性克隆(B细胞或T细胞)的缺失。熟练技术人员将了解或能够很容易地确定应选择的适当特定抗原浓度，以利用本发明所述装置实现对免疫应答的刺激或抑制。特定抗原的免疫原性以及由此决定的其免疫抑制剂量和免疫刺激剂量的范围可利用该领域已知的体外或体内方法加以确定。
此外，由利用本发明所述装置实现的免疫应答的加强要超出可由传统免疫法实现的水平，传统的免疫法通常包括对动物使用佐剂。从理论基础上来看，仅将抗原受控暴露于装置内的免疫细胞和其协同刺激因子似乎可提供一种用于实现强烈免疫应答的最佳环境，它要优于由利用佐剂实现的免疫应答。
免疫法可提供一种有效方法，用于预防众多感染性疾病因素，例如病毒如流感病毒、HIV病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒、脊髓灰质炎病毒和狂犬病病毒；细菌，如大肠杆菌、假单胞菌、志贺氏菌、梅毒、分枝杆菌、衣原体、立克次氏体和粘质沙雷菌；真菌，如曲霉、念珠菌；以及原生动物和多细胞寄生虫，如血吸虫属、疟原虫属、盘尾属和变形虫。免疫法还可能利用治疗性疫苗对已患有感染性疾病的个体进行治疗。此外，免疫法还可预防或治疗非感染性疾病，如癌症。但许多抗原的免疫原性很弱，而在预防或治疗这些疾病方面未能证明免疫法是一种适当的策略。在动物免疫中常规使用的佐剂不能使免疫应答增强。此外，个体或患者的免疫系统可能不处于最佳运行状态，从而对能够在其它健康个体中产生强烈免疫应答的抗原可能无法产生免疫应答。这些状况为利用本发明所述装置来刺激由传统免疫法无法实现的强烈免疫应答提供了机会。
在治疗某些病情，如过敏反应，或准备将患者暴露于外来抗原，如进行移植，时可能还需要对免疫应答进行抑制。不适当的免疫应答被认为是众多自身免疫疾病及其它疾病的病因，如I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力以及毒性弥漫性甲状腺肿。在个体中植入含有可疑抗原的本发明所述装置可诱导那些经致敏后能够识别该抗原的进入细胞发生凋亡，并将其从免疫系统中清除。将抗原特异性祖细胞清除能够使以后的外来抗原移植不发生排异。
本发明的更多应用包括改善实验动物中多克隆抗体(免疫血清)和单克隆抗体的产生，并获得由此产生的所需同种抗体。在一项实施方案中，利用本发明的装置可实现针对极少量抗原的多克隆抗体(免疫血清)和单克隆抗体的制备过程。为对动物进行免疫，本发明所述装置只需含有少量的稀有抗原，而且能够在此后收集脾细胞。这种方法为目前直接将稀有抗原引入脾脏这种单调且无法预测结果的方法提供了改进措施。此外，利用本发明所述装置可避免对加强免疫的依赖。并且除此之外还能够更迅速地产生免疫应答。免疫动物所需的时间缩短，使得单克隆抗体的产生更加迅速。在另一项实施方案中，可在利用该装置提供抗原以对动物进行免疫之后从装置中收集用于产生杂交瘤的免疫细胞。该方法还可用于人单克隆抗体的产生，方法是将本发明的装置植入个体，在装置中装填抗原，然后从装置中收集用于产生杂交瘤的免疫细胞。上述的多克隆抗体(免疫血清)和单克隆抗体可用于诊断、基础研究、成像和/或治疗。在另一项实施方案中，利用在重度复合性免疫缺陷病(SCID)小鼠中植入本发明所述装置可产生人单克隆抗体，其方法如下。首先，将人周围血淋巴细胞注射到SCID小鼠体内，使其中的人淋巴细胞填充小鼠免疫系统。将本发明的装置植入，装置中含有可在植入约3天后变为具有生物利用率的所需抗原，然后从装置中收集细胞，由此获得的人B淋巴细胞即可用于产生杂交瘤，这些杂交瘤能够分泌抗所需抗原的抗体。
本发明所述装置的进一步应用是从哺乳动物中收集免疫细胞，用于以后的再次引入哺乳动物。从该装置中去除细胞的方法有，例如，从植入的装置中吸出，或由体内取出后通过聚合物基质溶解而从装置中收集，随后可将细胞通过诸如冷冻保存的方法加以储存，并可以在以后的时间里重新引入哺乳动物。这对经受全身放射治疗的哺乳动物尤其有效。可将不含抗原的本发明所述装置植入并保持7-10天，然后取出该装置或其内容物，并把其中包含的细胞冷冻保存。在放射治疗之后，可把这些细胞重新引入哺乳动物体内，由此，这些细胞将重构免疫系统。在该项应用的另一项实施方案中，可在收集前将协同刺激因子，如能够诱导免疫细胞增殖的细胞因子，引入该装置，以提高装置内的细胞产量。在一项更进一步的实施方案中，从带有抗原的装置中收集的免疫细胞可用于主动免疫，其中的细胞可被储存，而后可在，例如，化疗或其它治疗操作的一个疗程后重新引入哺乳动物。在又一项实施方案中，可将由装置收集的细胞储存，并在此后于引入体内之前将其暴露于抗原(如癌抗原)，使T细胞先体外后体内传播，以此来进行继承性免疫治疗。
在本发明的另一项应用中，该装置可用于以基因转染装置内的免疫细胞。经转染的免疫细胞继而可致敏装置中的免疫细胞，并且/或能够在迁移出该装置后致敏远端的免疫细胞。举例来说，可将编码肿瘤特异性抗原或病毒性、细菌性或寄生虫性抗原的DNA、RNA或cDNA置于含有或不含相应蛋白抗原的装置内。进入该装置的抗原呈递细胞可被基因转染，从而表达抗原蛋白，并且能够迁移至体内的周边部位，在那里它们将刺激免疫细胞。
本发明的装置可通过熟练技术人员所了解的方法加以制备，只要其结构能够使它以上文所述的方式发挥作用，其大小和形状则可各不相同。如上文所述，该装置可作为小分子，如引入装置的抗原、细胞因子及其它由装置内的免疫细胞分泌的因子，的扩散屏障，但它允许免疫细胞进出该装置。因此，蛋白和其它小分子的被动扩散受到限制，而免疫细胞却能够主动移进并移出该装置。在一项实施方案中，可在需要的情况下将装置由一小段中空的生物惰性塑料管，如硅酮管制成，以便于插入皮肤的小切口，并便于以后取出。多孔聚合物基质，即海绵状材料，要配合管孔的尺寸。其开口端封闭或不封闭均可。在管壁上造少量孔洞。孔洞数量、形状及大小的各种变化均处在本发明的范围之内。引入的抗原可采用溶液或悬浮液形式或不具有生物利用率的形式，这些抗原可通过在制造过程中掺入基质或通过管的一端或管壁本身注射入基质。
抗原能够以文中称为生物可用或完全生物可用的形式直接在装置的基质中提供，或能够以随后可变为具有生物利用率的非生物可用形式提供。将抗原掺入提供受控释放、持续释放或延迟释放特性的成分也同样适合；这些方法及成分可包括装入微囊、脂质体和小球体。优选而言，为刺激或加强对抗原的免疫应答，配制的抗原应在植入约3天后在基质内恢复生物利用率。适当的释放剂型均被该领域所了解。
在另一项实施方案中，装置可由聚合基质材料制成预期的最终装置的形状，并可在其表面使用一层不通透的涂层。作为选择，也可将具有一定孔隙度和交联度的聚合基质压塑成预期的装置形状，然后外部用一种可在装置表面与聚合物进一步交联的制剂处理，以有效形成不通透的涂层或容器。随后可将涂层打孔并引入抗原。如果使用一种可由紫外光固化的聚合物，那么表面用紫外光处理也可影响装置表面聚合作用的增加。熟练技术人员在设计具有上述特性的适当装置时均可轻易地实现，因而文中提供的实例均不是限制性的。
构成该装置的材料可选自广泛的天然或合成的适当组合物。在一项实施方案中，聚合基质可以是一种生物相容性材料，如羟基化聚乙酸乙烯酯。另一种可广泛采用的基质是聚氨基甲酸乙脂。其它适当的材料包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚交酯/乙交酯共聚物、胶原蛋白、交连的胶原蛋白以及明胶。
如上文所述，能够通过许多方法在聚合基质周围实现带孔但不通透的屏障或涂层。在一项实施方案中，是将多段聚合基质置于一小段诸如硅酮管等生物相容性塑料管的管腔中，在一项实施例中，是将一段内径0.15cm、外径0.2cm、长2.5cm的管材以相应长度2.5cm的一段预湿的羟基化聚乙酸乙烯酯基质填充。在另一项实施例中，屏障或涂层是由适当的天然或合成材料制成，如塑料或其它聚合物，如聚乙烯、交连的胶原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳胶树脂、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、聚乙烯吡咯烷酮，以及其组合物。有一种可从Dow Corning购得的材料是SILASTIC硅酮。这些非限制性实例仅作为可适用于本发明的广泛组合物中的典型。
在符合可限制小分子扩散但允许免疫细胞进出的上述的该装置预期特性的情况下，作为制备本发明所述装置的一个非限制性实例，可按照以下方法手工制备一种装置。用外径0.047英寸、直径0.0235英寸、长1.125英寸的硅酮管作为本发明所述装置的非通透性容器。孔洞可利用20号皮下注射针头穿过该装置的壁而手工钻成，其产生的孔洞直径约为1/16和1/32英寸。管内钻20个孔。这些参数仅作为该装置的特征的一个参考，熟练技术人员将了解可同样实现上文所提目标，即不限制细胞进出但限制和禁闭装置内诸如细胞因子等小分子的扩散，的其它参数。
本发明的可生物降解装置可包含一种由已知能够在体内缓慢降解的材料制成的基质和容器。这些材料包括明胶、胶原蛋白、交连的胶原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物以及其它为熟练技术人员所了解的材料。因此，用于刺激免疫应答的优选可完全生物降解装置含有一种可生物降解容器、一种可生物降解基质，以及包含于基质的一种可生物降解的延迟释放抗原制剂。末尾提到的制剂可在植入约3天后释放抗原；而基质和容器则在该装置的使用期之后开始明显生物降解，这大约是植入10天后。
该装置的容器中的孔洞可通过多种方法中的任何一种来形成，如手工方法或自动方法。以少量的孔洞最为适宜，尽管其数量在某种程度上取决于该装置的大小和形状，但优选的数量为每厘米管长约10个。从上述的理论来考虑，孔洞的作用是允许免疫系统细胞进入装置，从而使其能够与抗原和协同刺激分子相接触并被致敏，然后还允许致敏细胞外出。这些目标必须要实现，同时带孔装置还必须容纳并保持装置内预期水平的抗原和免疫系统细胞产生的诸如细胞因子等协同刺激因子。如下文的实施例所示，这些要求可通过适当数量和形状的孔洞来得以实现。在装置由一段管材制成的情况下，管的末端可保持开放以充当孔洞，也可充当植入前或植入后引入针头或其它装载抗原的方法的插孔。
该装置可植入身体的适当部位，使插入、装载抗原及取出能够在患者的不适感最小的情况下得以实现。适当部位之一为上臂内侧面。在另一项实施方案中，该装置由可生物降解材料制成，其程度达到该装置可在使用期后降解而无需取出。
对刺激免疫应答而言，可在植入时或优选的是在植入后将具有生物利用率的抗原置于该装置中；如果是在植入后，则优选的时间约为植入3天后。也可在植入时将能够在植入约3天后向装置的基质中释放抗原的具有延迟释放特性的非生物利用率抗原制剂置于该装置内。约3天后，装置中所含细胞的数量和类型足以对存在的抗原产生应答，并且由这些细胞分泌的细胞因子和其它协同刺激分子通过带孔容器赋予的扩散屏障而被维持在足够高的水平，然后向装置中引入抗原将诱发产生最佳的免疫应答。
如果该装置不是由上述的可生物降解材料构成，那么可在它实现其预期作用后通过简单的手术操作将其取出。一般约10天后，免疫细胞群体已离开装置，而该装置也不再发挥作用。另一方面，也可在此后用抗原重新装填装置以加强免疫应答。
如上所述，为实现对免疫应答的预期刺激或抑制，对装置的基质中抗原的生物利用率进行时间调配显得十分重要，而且依赖于特定抗原的特性。一般而言，在植入时提供高浓度的具有完全生物利用率的抗原将对该抗原引起的免疫应答产生抑制效应。而在装置植入约3天后提供少量的具有生物利用率的抗原通常会产生刺激免疫应答的效应。这些条件在不降低本发明实用性的情况下可有所变化，这将取决于该装置所用特定抗原的特性。熟练技术人员将能够通过标准的体外或体内方法评定特定抗原的免疫原性，并能够确定抗原的适当浓度以实现预期的效应。
利用本发明所述装置来增强或刺激对抗原的免疫应答的方法是希望产生免疫细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞群体，这些细胞将针对该装置所用抗原发动有效的免疫应答。
利用上述方法和装置对一种特定抗原引起的免疫应答进行减量调节是本发明的另一目标。通过在装置中加入高剂量的抗原，可诱导进入装置并与抗原相遇的免疫细胞发生凋亡。如果在植入前或植入后让受者使用一种含有供者抗原的本发明所述装置，则可预防或治疗移植物排斥或移植排异等病症。免疫应答的减量调节可影响的一般病症包括移植，在该病症中可使受者耐受供者的血细胞，以减量调节受者对供者移植物的免疫应答；自身免疫疾病，在该病症中，对自体抗原的耐受可减量调节致病T细胞，并可利用内源性抗原来改善免疫复合物的形成，如在类风湿性关节炎中使用胶原蛋白；糖尿病，在该病症中可使糖尿病患者耐受胰岛素或GAD；以及重症肌无力，在该病症中可使患者产生耐受性，以避免对乙酰胆碱受体的免疫应答。此外，以过敏症和变应性反应为特征的免疫应答可通过诱导那些负责免疫应答的免疫细胞发生凋亡，从而使患者对变应原耐受或脱敏来加以治疗。可在本发明所述装置中使用以抑制免疫应答的过敏症及抗原的实例包括猫过敏症过敏原DERP-1，以及由漆酚修饰肽引起的毒叶藤/毒葛(poison ivy/oak)过敏症。
给出以下实施例是为了能够更充分地阐明本发明的优选实施方案。但它们决不应被认为是限制本发明的广阔范围。
实施例1制备本发明所述装置的一个实例是采用一段内径0.15cm、外径0.2cm、长2.5cm的硅酮管，并用长2.5cm的一段羟基化聚乙酸乙烯酯海绵填充。将该装置浸没于含有磷酸缓冲盐溶液的容器中并高压灭菌。用三溴乙醇麻醉雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)。第1天将该装置通过背侧中线处的一个0.5cm的切口插入。在植入后2天时，取一些动物在装置中引入50μl的1mg/ml流感抗原(FLUSHIELD流感病毒疫苗，三价，A&B型；来自Henry Schein，Melville NY)，方法是用一个注射针头穿透植入装置附近的皮肤，然后靠感觉将针头导入装置的一端。
利用注射针头在植入后2、4、7和9天时各从5只动物的植入装置中吸出流体，然后将流体中的细胞合并、清洗并计数。如图1所示，在植入不含抗原的装置的动物中，细胞群体于第4天开始增加，并在第7天达到峰值。第9天时，装置中的细胞数下降，表明移入装置的细胞正在移出该装置而进入周边。如果在植入后2天时把流感抗原加入该装置，则在植入后4天时装置中的细胞数量增加了数倍，达225,000，相比之下不含抗原的装置中的细胞数为60,000。因此，装置中抗原的存在增加了募集至装置中的细胞数，并/或触发了装置内细胞的增殖。
实施例2该实验利用BALB/c小鼠检测装置中出现的细胞的数量和表型。在如实施例1所述将装置植入后的4天里，各从5只动物的装置中吸出细胞，并将其合并、清洗，再分装至几个试管中。加入对以下标记物(CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD62P、CD62E、CD3和I-Ad)具有特异性的经异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的单克隆抗体，于4℃保温30-45分钟，然后清洗细胞并利用流式细胞光度计测定荧光的几何平均值。为了进行比较，还利用同组特异抗体测定来自同系未处理的小鼠的外周血淋巴细胞的荧光值，并将各抗体的所得结果表示为来自装置的细胞相对于外周血淋巴细胞的荧光值增加百分率。
图2给出在插入后4天时由装置吸出的细胞的表型。在装置中明显迁入并聚集有高密度的T细胞(CD3、CD40)、巨噬细胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、树突状细胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B细胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。
实施例3通过在植入后3、7和10天时从装置中收集细胞来计算如实施例1所述的装置中细胞群体随时间的变化。在第一次实验中，装置内不含任何抗原。将每个时间点由5只小鼠的植入装置中吸出的细胞合并，并按照实施例2所述的相同方法测定带有CD3、CD8、CD80、CD44、CD11c、CD45R/B220和CD14标记物的细胞的密度，测定值表示为相对于未处理的小鼠外周血淋巴细胞的增加百分率。
图3给出在植入后3、7和10天时计算的各表型细胞的密度。对所有标记物而言，装置中各细胞类型的富集明显发生在第3天和第7天，而第10天时，细胞群体已迁出该装置。
实施例4在与上例完全相同的第二次实验中于植入后2天时将流感抗原引入该装置。如图4所示，装置中抗原的存在进一步加大了T细胞和抗原呈递细胞(CD3、CD80或CD14)的密度，而且导致第10天时仍存留有这3种类型的细胞。加入抗原可延缓免疫细胞离开该装置。
实施例5通过测定植入动物的脾脏中CD4和CD8 T细胞的表达变化，对植入含流感抗原装置的远端效应进行了评估。方法如上文所述，并利用实施例2的方法测定T细胞的表型。在植入后2天时，装置中引入0、5、10或50μg流感疫苗，并在免疫后10天(植入后12天)时收集脾脏。将脾脏置玻片粗面轻轻磨碎以分离脾细胞。细胞用PBS清洗并在红细胞裂解缓冲液(Sigma)中保温5分钟以去除红细胞。如上所述用流式细胞光度计测定CD4和CD8的荧光。作为对照，还采用了传统的标准免疫方案，将小鼠经爪垫注射相同剂量的流感抗原和Ribi佐剂R-700，一种由RibiImmunoChem Research,Inc.制造的含有单磷酰基脂A及合成海藻糖dicrynomycolate(MPLA+TDM)的乳剂。对照鼠亦在免疫后10天时取血。
如图5所示，在装置中装载抗原后，来源于已植入装置小鼠脾细胞的T细胞显示出CD4和CD8分子的密度增加。来自以传统方法用50μg抗原加佐剂免疫的动物脾脏的细胞毒性T细胞(CD8)的水平与利用本发明所述装置用10μg抗原诱导的水平相等。此外，不含抗原的装置中也显示出脾脏内CD8细胞的增加，这是该装置诱导的无菌性炎症的结果。值得注意的是，在动物中植入含有50μg抗原(与对照动物中经爪垫注射含佐剂的抗原的量相等)的本发明所述装置显示出脾脏内CD8细胞表达的丧失。一种解释是在装置中加入高剂量的抗原导致抗原特异性细胞的凋亡。过强刺激的使用可能触发了一种滋扰效应，而其最终结果是清除已处理小鼠的脾脏中所有的CD4+CD8+T细胞。在免疫应答被认为有害，如移植排异，的情况下，这可应用于对免疫应答的预期减量调节。
有关利用本发明所述装置可提高免疫效率的解释且认为是在把抗原注射于周边部位后真正到达动物的淋巴节的抗原量要比免疫所提供的量少几个数量级。因此，利用本发明所述装置诱发出阳性免疫应答所需的最佳剂量会比传统免疫法所采用的剂量少得多(即少几个数量级)。
实施例6以脾脏T细胞分泌的γ-干扰素为标记物来确定由本发明所述装置提供的对流感抗原的免疫应答的强度。分泌γ-干扰素是Th1型和CD8细胞毒性T淋巴细胞应答的主要特征之一，它被认为是对抗细胞内病原体和癌症的保护性武器。如上所述将装置植入小鼠，并在植入后3天时提供5μg的流感疫苗。对照组则通过爪垫以50μg抗原加Ribi佐剂免疫。免疫后10天时，按前例中的方法将脾细胞分离，涂片，并在以一定剂量范围的抗原(1.4-180μg/ml)刺激之后利用ELISA试剂盒(Endogen)检测产生的γ-干扰素。
图6表明，利用含5μg抗原的本发明所述装置对动物进行免疫与利用50μg抗原加佐剂经爪垫免疫所产生的活化T细胞水平相同。因此，利用本发明所述装置无需使用佐剂即可实现强免疫应答，并且所用抗原的量要少得多。
将分离自相同动物的腘淋巴节的T细胞暴露类似浓度范围的抗原之后，对这些T细胞的γ-干扰素分泌进行了测定。如图7所示，来自利用抗原加佐剂经爪垫免疫的动物的T细胞的γ-干扰素分泌并不象利用本发明所述装置免疫的动物的脾T细胞所产生的那样强烈(与图6对比)。由于腘淋巴节可对爪垫区域进行引流并因而认为可通过提供抗原而被致敏，因此该结果进一步表明本发明所述装置无需佐剂即可用来产生强烈免疫应答的效能。在进一步的测定中，针对植入10天后仍保留在装置中(已于第3天引入抗原)的细胞群体评定了γ-干扰素分泌随暴露于抗原的反应。图8显示，与记录的脾细胞应答水平相比，在对流感抗原体外诱发的应答中只分泌了极少量的γ-干扰素。这一结果意味着，由装置内免疫法致敏的效应细胞已移出该部位，并且第10天时(此时由装置中吸出)大多数效应细胞群体已丧失。图1和图3显示第9天和第10天时装置中带有B细胞和T细胞表型的细胞的丧失，也证明了这些细胞移出至外周器官的可能性。
实施例7在进一步的实验中测定了脾细胞的增殖，目的是明确检验植入装置并装载抗原后由本发明所述装置诱导的对抗原的免疫应答的强度。采用的方案与前例所述相同。该实验中使用的抗原为卵清蛋白；装置中含有不同剂量的卵清蛋白，范围为10pg-50μg；对照动物则利用相同剂量的抗原加Ribi佐剂经爪垫注射免疫。
植入后10天时，将小鼠无痛致死，并除去脾脏。增殖测定在96孔板中进行。于37℃下将每孔20万个细胞暴露于180μg/ml的抗原，时间为72小时；对照采用相同剂量的Epstein-Barr病毒抗原。在暴露于抗原或对照抗原后，用3H-胸腺嘧啶核苷将细胞脉冲标记6小时，测量掺入的标记，并表示为刺激指数。
图9显示，利用含有卵清蛋白的装置对小鼠进行免疫可引起强烈的抗原特异性脾细胞增殖应答。在利用低至几皮克的抗原免疫的动物中亦检测到了应答。而来源于由传统方法加佐剂免疫的动物的脾细胞要在高出5-7个数量级的抗原浓度下才产生增殖应答。对照(Epstein-Barr病毒)抗原的刺激水平可以忽略(数据未给出)，表明由卵清蛋白诱发的免疫应答具有高度特异性。
在以卵清蛋白为抗原的进一步实验中，利用本发明所述装置或通过爪垫，以单独存在于装置中、与BCG佐剂同存在于装置中或与Ribi佐剂一同经爪垫免疫的50μg、50ng或50pg卵清蛋白对小鼠进行免疫。这些实验中使用的BCG(卡介苗)佐剂TheraCys(R)为Connaught LaboratoriesLimited制备的减毒牛结核菌株冻干悬浮液，可用于膀胱癌的治疗。免疫10天后时收集脾细胞，并在体外将其暴露于不同浓度的抗原(1.4-180μg/ml)，或同样范围的对照抗原，Epstein-Barr病毒。保温72小时后，细胞用3H-胸腺嘧啶核苷脉冲标记6小时，标记的掺入以刺激指数表示，并作为T细胞刺激和增殖的量度标准。
图10显示，利用本发明所述装置可实现以低剂量抗原诱导强烈的抗原特异性T细胞应答。将脾细胞暴露于对照抗原后所检测到的刺激水平可以忽略，进一步表明该应答对免疫原具有特异性。
实施例8将极低剂量的HIV gp120肽(315-322位残基，RIQRGPGRAFVTIGK)抗原装载到本发明所述装置中后，评定对该抗原的抗原特异性抗体应答。利用不同剂量的HIV肽经装置或与佐剂经爪垫对BALB/c小鼠进行免疫。免疫10天后收集血液，测定抗体对该肽的效价。四天后，用初次免疫原量的10％对动物进行加强注射，10天后收集二次血液并测定效价。
根据常规方法通过ELISA对抗原特异性IgG2a亚类抗体进行检测。简单地说，即4℃下用溶于磷酸缓冲盐溶液的抗原(1g/ml)包被微量滴定板，时间为16小时。将板清洗，并在孔中加入100μl血清样品，从1∶50的稀释度开始，每步再进一步稀释3倍。样品的测试一式两份。室温保温1小时后，如上所述清洗板，并在孔中加入生物素标记的抗鼠IgG2a抗体溶液(1μg/ml)。保温1小时后，如上所述充分清洗，并在孔中加入以1∶4000稀释于阻断缓冲液的抗生蛋白链菌素偶联的辣根过氧化物酶。室温保温30分钟后加入底物(每孔加入100μl四甲基联苯胺)。将板保温30分钟。每孔加入100μl 2N的H2SO4以终止反应。利用ELISA板阅读仪在450nm波长下读板。
图11显示抗HIV gp120肽的特异性IgG2a的水平，该图表明，在利用本发明所述装置进行单次免疫后，诱导出高浓度的抗原特异性抗体(IgG2a)，而利用传统方案经单次爪垫免疫后却没有产生应答。二次爪垫免疫(加强)后，由传统方法免疫的动物中产生了抗体应答，而起初用本发明所述装置免疫然后再加强(以装置内提供的最初剂量的10％)的动物却显示出IgG2a水平的增加，并且在较低的抗原水平下还诱导出显然更加强烈的应答(图12)。
实施例9在比较由本发明所述装置免疫和由传统爪垫免疫法免疫而产生的所得免疫应答的基础上对不同佐剂的效应进行了评定。如上所述，利用装置或经爪垫用不同剂量的HIV gp120肽(如前例)单独或与Ribi或BCG佐剂一同免疫BALB/c小鼠。植入后3天时将免疫原引入装置，并在免疫后10天时测定抗体的效价。如上例所述通过ELISA测定IgG2a抗体对gp120肽抗原的特异性。
使用了Ribi或BCG佐剂的传统免疫法产生低水平的肽特异性IgG2a(图13)。相比之下，由不含佐剂的本发明所述装置(50ng肽)进行的免疫明显产生了高水平的肽特异性IgG2a。肽与任一种佐剂(Ribi或BCG)共同使用均产生低水平的应答。这些数据表明，在已经很强的抗原性刺激物中加入佐剂则导致免疫应答的降低。为了证明佐剂与抗原的加合效应或协同作用，也许应该以较低范围(低于飞克剂量)的抗原和较低浓度的佐剂来检验免疫方案。
检验单纯疱疹病毒糖蛋白B的一种15元肽(497-507位残基TSSIEFARLQF)时获得了类似的结果。
实施例10在检验由本发明所述装置中的抗原诱导的体液免疫应答强度的进一步测试中，将装置植入小鼠，并在3天后引入不同剂量的细胞色素C。对照是将不同剂量的相同抗原经爪垫与Ribi佐剂一同给药。植入后10天时或爪垫接种后10天时，取动物血液并对血清进行ELISA以检测可特异识别该抗原的IgG2a。除进行ELISA时血清系列稀释度为1∶50-1∶6400之外，方法与前例中采用的方法相似。
图14显示，在本发明所述装置中使用极低剂量的抗原即实现了对该抗原的极强的特异性体液免疫应答。在装置中使用低至50飞克的抗原所产生的抗体应答类似于在传统爪垫加佐剂免疫法中使用高出4个数量级的5ng抗原所产生的抗体应答。
实施例11利用由流感A病毒裂解并纯化的血细胞凝集素蛋白抗原(断裂血细胞凝集素抗原，BHA)对体液应答的发展作进一步的评定。利用在植入后3天时被引入0.1μg和10μg剂量抗原的本发明所述装置对BALB/c小鼠进行免疫。对照鼠则利用相同剂量的抗原及Ribi佐剂经尾基部皮下注射进行免疫。免疫后7、14、21和28天时取动物血液，并通过ELISA检测血清中的抗原特异性总IgG抗体。
如图15所示，免疫后2周时，由0.1μg抗原获得了强体液应答，并实现了高浓度的HA-特异性抗体。而第2周时，利用传统方案与佐剂一同免疫的小鼠显示出低水平的抗原特异性体液应答，并且其水平在免疫后3周和4周时有所增加。在利用装置免疫的小鼠的血清中，BHA-特异性抗体的水平比使用更高剂量的抗原且使用佐剂的传统免疫法所实现的水平高出75-80％。在该实验中，装置含有低剂量的抗原所产生的体液应答要优于含更高剂量抗原所产生的应答。由前述实验可看出，高于5μg的剂量可导致免疫应答的抑制，这可能是由于过量刺激诱发了凋亡。
实施例12利用包含于完整的上述装置，或仅包含于植入到一段带孔管旁边的海绵基质的流感抗原对小鼠进行免疫，由此来评定在本发明所述装置的海绵基质周围加上带孔但不通透的生物惰性涂层或容器的重要性。在植入3天后，将评定的一定范围剂量的抗原(0、50pg、500pg、5μg和50μg)引入装置，或仅引入海绵。作为对照，用相同剂量的抗原与Ribi佐剂一同对小鼠爪垫进行免疫。植入后或爪垫免疫后10天时，收集动物脾脏，并如上所述进行T细胞增殖测定，所用抗原量的范围为0.1-180μg/ml。作为特异性的对照，还于体外使用Epstein-Barr病毒。3H-胸腺嘧啶核苷的掺入表示为刺激指数，以说明T细胞刺激和增殖。
如图16所示，与抗原由不处在带孔但不通透容器中的海绵提供时相比，由完整装置免疫的动物显示出的T细胞活化应答明显更强。图18表明对无关抗原的应答及其微弱。
实施例13通过进行扩散测试来评定在本发明所述装置的海绵基质周围加上带孔但不通透的生物惰性涂层或容器的重要性。将200μg牛血清白蛋白(BSA)注入装置或海绵。将装置或海绵放在含有1.5ml PBS的管中。在不同时间点取样，并测定BSA浓度。
如图18所示，在5分钟的保温时间内，海绵完全释放了其内容物。而本发明所述装置控制着抗原的释放，并且在960分钟后仍保留有65％以上的抗原。保持一道扩散屏障，以维持装置内有高水平的抗原、细胞因子、趋化因子和其它协同刺激分子与免疫细胞相接触，这被认为是该装置在强烈免疫应答的激发中对传统免疫方法做出明显改进的一种重要机制。
因此以上实例可证明，与传统爪垫免疫法和仅将抗原装载于植入的海绵基质相比，本发明所述装置能够刺激更优越的对不同抗原的T细胞应答及体液应答。
实施例14测定植入后不加抗原的本发明所述装置中出现的细胞的表型。将植入后4天时由本发明所述装置中吸出的细胞收集，清洗，并利用经异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的对以下标记物有特异性的单克隆抗体染色CD14、CD45/B220、CD11b、CD40、CD11c、CD80、CD86、CD3和I-Ad(PharMingen，CA)。利用流式细胞光度计测定荧光的几何平均值。为了进行比较，还利用同组特异抗体测定来自同系未处理小鼠的周围血淋巴细胞(PBL)的荧光值，并将各抗体的所得结果表示为平均荧光强度(MFI)。
图19给出在插入后4天时由装置吸出的细胞的表型。装置中明显迁入并聚集有高密度的T细胞(CD3、CD40)、巨噬细胞(CD14、CD11b、Ⅱ型MHC、CD80)、树突状细胞(CD40、CD11c、Ⅱ型MHC、CD80)和B细胞(Ⅱ型MHC、CD45/B220、CD11b)。因此，装置中存在产生免疫应答所必需的免疫细胞。与PBL(数据未给出)相比，由本发明所述装置吸出的免疫细胞上协同刺激分子(CD80和CD86)及粘连分子(CD44)的表达明显增加。有趣的是，对本发明所述装置的切面进行的电镜分析结果表明存在含有大量溶酶体的巨噬细胞，在是其细胞活化的强化状态。
实施例15将植入后不含抗原的本发明所述装置中包含的细胞因子的浓度与未处理的鼠血清中的细胞因子浓度进行比较。如图20所示，装置中含有更高浓度的刺激性细胞因子L-2、IL-4和TNF-α以及约1/7浓度的TGF-β(数据未给出)。因此，本发明所述装置一旦用抗原“点燃”，将为免疫应答的爆发准备好一个可引起强烈反应的环境。
实施例16细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答被认为是对流感病毒产生免疫所必需的。为评价本发明所述装置在引发抗原特异性CTLs方面的能力，利用含有500pg流感病毒的本发明所述装置对小鼠进行免疫。作为对照，还利用500pg疫苗加Ribi佐剂经皮下注射对小鼠进行免疫。获得免疫动物的淋巴细胞，并通过经流感病毒感染的靶细胞的裂解来检测其对流感病毒的特异性。CTLs的制备如下。将小鼠无痛致死并去除脾脏。制备单细胞悬浮液并用PBS清洗细胞。利用红细胞裂解缓冲液(Sigma,MO)去除红细胞。在体外将脾细胞(5×106)与5×106个已被病毒感染(100 HAU/107个细胞/ml，37℃,60分钟)并经过照射(3000Rad)的同系脾细胞共培养，并在37℃和5％CO2条件下保温5天。
以PR8感染(500HAU/106细胞)的P1.HTR细胞和未经感染的P1.HTR细胞作为细胞毒性的靶。用100mCi的Na251CrO4将细胞标记90分钟，然后清洗3次。在效应细胞中以不同的浓度加入悬浮于100ml RPMI 1640的靶细胞(104/ml)及5％的FCS培养基，浓度由100∶1的比率(E∶T)开始，并在96孔圆底微量滴定板中滴定为两倍。保温6小时后收集上清。结果根据以下公式表示为51Cr特异释放的百分率〔(实验释放量)-(自发释放量)〕×100/〔(最大释放量)-(自发释放量)〕。
如图21所示，利用含有500pg流感病毒疫苗的本发明所述装置进行的免疫触发了强有力的流感特异性CTLs，它在裂解经流感感染的靶细胞方面明显优于对同时使用Ribi佐剂进行传统皮下免疫的应答中所产生的CTLs。产生的CTL在体外不杀死非感染靶细胞，这表明了激发的应答的特异性。在本发明所述装置中使用更高剂量的抗原则未见到刺激。
实施例17为确定利用本发明所述装置进行免疫还可调节体液免疫应答，利用一些不同剂量的流感病毒疫苗经本发明所述装置给药或与Ribi佐剂一同经皮下注射给药来对小鼠进行免疫。与结合Ribi经皮下免疫的方法(数据未给出)相比，在利用本发明所述装置以更低剂量的疫苗进行免疫的小鼠的血清中产生了高水平的流感特异性IgM、IgG1和IgG2a抗体。通过逐步提高血清稀释度并记录吸光度的方法对病毒特异性IgG1进行测量，检测结果显示出更高的结合(图22)。由IgG2a抗体亦观测到类似的结果。
实施例18为确定抗体对流感抗原的相对亲和力，把利用本发明所述装置进行免疫而产生的血清抗体以及作为比较的经传统方案并使用佐剂而产生的血清抗体与摩尔浓度逐渐增加的KSCN(硫氰酸钾)混合，KSCN可从结合在由抗原包被的微量滴定板上的复合物中洗脱抗原特异性抗体。如上文所述采用一种基于微量滴定板的标准ELISA方法。在加入生物素标记的抗鼠IgG之前，要先将板清洗并在孔中加入不同浓度的KSCN。室温下将板保温30分钟。清洗板，然后在孔中加入生物素标记的抗鼠IgG抗体溶液(0.5μg/ml)。不断增加KSCN的浓度是分解由高亲和力抗体与抗原结合所形成的复合物所必需的。如图23所示，产生的抗体对病毒性抗原具有更高的亲和力。因此，若利用本发明所述装置，则极少量的疫苗已足以刺激强有力的免疫应答。
实施例19在小鼠流感模型中测试利用本发明所述装置进行的免疫在保护哺乳动物免受感染性疾病侵害方面的能力。利用本发明所述装置或结合Ribi佐剂经皮下给药以两种剂量的流感病毒疫苗流感疫苗(5pg和500pg)对小鼠进行免疫。约免疫12周后，用致死剂量的流感疫苗对动物进行攻击。如图24所示，利用本发明所述装置以5pg和500pg剂量的流感疫苗进行接种均产生了完全的保护性，而利用500pg流感疫苗加Ribi佐剂经皮下免疫的小鼠中只有60％存活下来。到第14天时，所有用5pg剂量加佐剂免疫的动物均死于该疾病。引人注意的是，不但利用本发明所述装置进行免疫可提供完全的保护，而且使用1/100的抗原剂量且无需佐剂亦可实现完全的保护。用病毒攻击后，由本发明所述装置免疫的小鼠还表现出稳定的体重，表明产生了一种与其对急性感染的相对抵抗力相关的更轻度的疾病。
实施例20通过植入含有流感病毒疫苗的本发明所述装置来评定该装置在含有人免疫细胞的重度复合性免疫缺陷(SCID)小鼠中产生特异性人IgG的效用。在SCID Beige CD17(6-8周龄雌性)小鼠中注入(腹膜内方式)20×106个来自正常人供体的PBMC。3天后通过肌内注射或通过植入预注有50ng流感病毒疫苗的本发明所述装置对小鼠进行免疫。免疫3周后取小鼠血液，并利用传统ELISA测试血清的流感特异性体液应答。如图25所示，用疫苗免疫产生了流感特异性人IgG。此外还如图所示，利用摩尔浓度逐渐增加的KSCN来测定血清抗体对流感抗原的相对亲和力(按照上文实施例18所述)，与传统的肌内免疫相比，本发明所述装置产生了更高效价的人流感特异性抗体(图26)。该方法还可用来生成能够产生人单克隆抗体的人杂交瘤。
实施例21在本发明所述装置中提供更高剂量的抗原可导致免疫应答的抑制。在Balb/c小鼠体内植入装载了5-50μg流感疫苗的装置，或利用混有Ribi佐剂的抗原进行爪垫内免疫。免疫后10天时将小鼠无痛致死，分离脾细胞并铺在96孔板内(2×105细胞/孔)。37℃下将细胞暴露于流感抗原72小时。用抗原刺激后，去除培养物中的上清，并利用ELISA试剂盒(Endogen)测定γ-干扰素的产生。如图27所示，利用抗原结合Ribi佐剂免疫的小鼠产生一种直接随抗原剂量而增加的免疫应答。相比之下，由装置中的抗原免疫的小鼠在低剂量抗原情况下显示出对免疫应答的刺激(如前文中的实施例所述)，但在更高剂量抗原的情况下却显示出免疫应答的下降。因此，在植入的本发明所述装置中含有大量抗原会导致免疫应答的减量调节。在特定免疫抑制被认为有益，如移植、过敏症等，的治疗策略中可使用该方法。
实施例22本发明所述装置还可用来产生对多糖抗原的免疫应答。利用装载有肺炎球菌抗原(Pneumovax-23)的装置进行单次免疫可产生一种特异的免疫应答。在23种最流行的或侵袭性的肺炎球菌类型中，Pneumovax是一种多价的肺炎球菌疫苗，它含有高纯度的荚膜多糖。用5μg或40pgPneumovax疫苗通过如上文所述植入皮下的装置，或通过与Ribi佐剂混合并注入垫脚对小鼠进行免疫。第10天时取所有小鼠的血液，并通过ELISA测定总IgG应答(图29)、IgG1应答(图30)和IgG2a应答(图31)。这些结果表明，利用本发明所述装置可实现对多糖抗原的免疫应答。
实施例23本发明所述装置可用来对高保守性抗原产生免疫应答。在这些实验中选择亲环蛋白作为模型蛋白，这是因为该蛋白在哺乳动物物种中高度保守，因而产生对亲环蛋白的免疫应答一直难以实现。将5μg、50ng或0.5ng人亲环蛋白装载入本发明所述装置并植入，或将其与Ribi佐剂混合并皮下注射，由此对小鼠进行免疫。取小鼠血液，并通过ELISA测定血清对人亲环蛋白的IgG2a应答。如图32所示，与利用亲环蛋白加Ribi佐剂经皮下免疫的小鼠相比，利用本发明所述装置以两种较低剂量的抗原进行免疫的小鼠显示出更优越的对抗原的应答。这一结果表明，该装置可诱导对高保守抗原的免疫应答，而这些抗原在其它方面可能不具有免疫原性。利用本发明所述装置中含有的高剂量抗原进行的免疫未能诱导出免疫应答。
实施例24本发明所述装置可用来产生对完整活组织的免疫应答。在该实验中使用活钩虫幼虫对小鼠进行免疫，方法是利用植入皮下的本发明所述装置提供5只幼虫，或2周中分别皮下注射1000只活幼虫。如图33所示，由ELISA测定发现两种方案均诱导出L3特异性总IgG。分别利用照射后的幼虫和孢子体可能会产生对多种寄生生物的免疫，如钩虫和疟疾；文中的研究结果表明，利用本发明所述装置可通过较少量的生物来实现免疫。
本发明可在不偏离其实质或基本特征的情况下通过其它形式体现，或通过其它方式加以实施。因此无论从哪方面来看，本公开内容都将被认为是说明性的和非限定性的，本发明的范围通过所附的权利要求书表示，并且所有处在同等含义和界限的范围内的变化都将被认为包含在本文中。
文中引用多种出版物，其公开内容将被全面包括在内以作为参考。
权利要求
1．一种调节哺乳动物中对抗原的免疫应答的方法，该方法是通过在所述哺乳动物身体中植入一种装置，该装置含有一种多孔基质，基质则包含在一种带孔但不通透的容器中，所述基质含有一定量的所述抗原，其中该装置可吸引免疫系统细胞与所述抗原相遇并调节所述免疫应答。
2．权利要求1的方法，其中所述多孔基质内的抗原在将所述装置植入所述哺乳动物时具有生物利用率。
3．权利要求1的方法，其中所述多孔基体内的抗原在装置已植入所述哺乳动物之后变为具有生物利用率。
4．权利要求3的方法，其中所述抗原在植入所述哺乳动物后约3天时变为具有生物利用率。
5．权利要求1的方法，其中所述抗原在植入后约3天时被引入所述装置。
6．权利要求1的方法，其中所述抗原以延迟释放剂型提供。
7．权利要求1的方法，其中所述多孔基质含有一种聚合材料。
8．权利要求7的方法，其中所述聚合材料选自天然原料和合成原料。
9．权利要求8的方法，其中所述聚合材料的选择集合包括羟基化聚乙酸乙烯酯、聚氨基甲酸乙脂、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、明胶、胶原蛋白、交连的胶原蛋白及其组合物。
10．权利要求1的方法，其中所述容器包含的聚合材料选自天然原料和合成原料。
11．权利要求1的方法，其中多孔聚合基质含有羟基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段带孔管。
12．权利要求1的方法，其中与所述装置植入所述哺乳动物的时间相关的该装置中的所述抗原量和该抗原的生物利用率的时间安排可导致对该抗原的免疫应答的诱发或增强。
13．权利要求12的方法，其中所述装置内的所述抗原在该装置植入所述哺乳动物之后具有生物利用率。
14．权利要求13的方法，其中所述抗原在所述装置植入所述哺乳动物后约2-4天时被引入该装置。
15．权利要求1的方法，其中与所述装置植入所述哺乳动物的时间相关的该装置中的所述抗原量和该抗原的生物利用率的时间安排可导致对该抗原的已有或潜在免疫应答的抑制或减量调节。
16．权利要求15的方法，其中所述装置中的所述抗原在植入所述哺乳动物时具有生物利用率。
17．权利要求1的方法，其中所述装置可在约10天的周期后由所述哺乳动物的体内取出。
18．权利要求1的方法，其中第二种量的所述抗原可被再次引人所述装置。
19．权利要求18的方法，其中所述第二种量的所述抗原是通过植入时装置中存在的该第二种量的该抗原的延迟释放而被再次引人所述装置。
20．一种用于调节对抗原的免疫应答的可植入装置，该装置含有多孔基质，基体则包含在一种带孔但不通透的容器中。
21．权利要求20的装置，其中所述抗原存在于所述多孔基质中。
22．权利要求20的装置，该装置进一步包含用于在植入前或植入后将所述抗原引入并接触所述多孔基质的工具。
23．权利要求20的装置，其中所述多孔基质含有一种聚合材料。
24．权利要求23的装置，其中所述聚合材料选自天然原料和合成原料。
25．权利要求24的装置，其中所述聚合材料的选择集合包括羟基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明胶、胶原蛋白、交连的胶原蛋白及其组合物。
26．权利要求20的装置，其中所述容器含有一段带孔管。
27．权利要求20的装置，其中所述容器含有一种带孔但不通透的涂层并安排在所述多孔基质的周围。
28．权利要求27的装置，其中所述涂层含有一种聚合材料。
29．权利要求28的装置，其中所述聚合材料选自天然原料和合成原料。
30．权利要求29的装置，其中所述聚合材料的选择集合包括交连的胶原蛋白、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯、硅酮、乳胶树脂、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、聚乙烯吡咯烷酮及其组合物。
31．权利要求20的装置，其中多孔基质含有羟基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段带孔管。
32．一种从哺乳动物中获得免疫细胞的方法，其中所述免疫细胞收集自植入在所述哺乳动物中的一种装置，该装置含有一种多孔基质，基质则包含在一种带孔但不通透的容器中。
33．权利要求32的方法，其中所述收集的细胞被重新引入所述哺乳动物。
34．权利要求33的方法，其中所述收集的细胞在被重新引入所述哺乳动物之前被冷冻保存。
35．权利要求32的方法，其中在所述装置的多孔基质内存在一种抗原。
36．权利要求35的方法，其中所述免疫细胞被重新引入所述哺乳动物。
37．权利要求35的方法，其中所述免疫细胞在体外接触所述抗原后被重新引入所述哺乳动物。
38．权利要求32的装置，其中所述基质含有一种聚合材料。
39．权利要求38的装置，其中所述聚合材料选自天然原料和合成原料。
40．权利要求39的装置，其中所述聚合材料的选择集合包括羟基化聚乙酸乙烯酯、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚氨基甲酸乙脂、明胶、胶原蛋白、交连的胶原蛋白及其组合物。
41．权利要求32的装置，其中所述容器含有一段带孔管。
42．权利要求32的装置，其中所述容器含有一种带孔但不通透的涂层并安排在所述多孔基质的周围。
43．权利要求42的装置，其中所述涂层含有一种聚合材料。
44．权利要求43的装置，其中所述聚合材料选自天然原料和合成原料。
45．权利要求44的装置，其中所述聚合材料的选择集合包括交连的胶原蛋白、聚乙烯、硅酮、乳胶树脂、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、多聚乳酸、聚交酯/乙交酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮及其组合物。
46．权利要求32的装置，其中多孔基质含有羟基化聚乙酸乙烯酯，并且容器包含有一段带孔管。
47．权利要求35的方法，其中所述免疫细胞用于制备一种为产生抗所述抗原的单克隆抗体的杂交瘤。
48．一种用抗原免疫哺乳动物用于制备一种为产生抗所述抗原的单克隆抗体的杂交瘤的方法，其中哺乳动物是利用权利要求12的方法进行免疫。
49．一种用抗原免疫哺乳动物用于制备一种为产生抗所述抗原的单克隆抗体的杂交瘤的方法，其中哺乳动物是利用权利要求21的装置进行免疫。
50．权利要求12的方法，其中针对所述抗原的所述免疫应答选自预防性接种、治疗性接种、细胞免疫、体液免疫、粘膜免疫、长期免疫及其组合。
51．一种用于产生杂交瘤的方法，该杂交瘤可产生针对选定抗原的人单克隆抗体，该方法的连续步骤包括(a)将人外周血淋巴细胞引入一种严重复合性免疫缺陷(SCID)小鼠的循环，并使该淋巴细胞在该小鼠的免疫系统中增殖；(b)在该小鼠中植入权利要求21的装置，该装置的抗原包括所述的选定抗原；(c)从该装置中收集免疫细胞；(d)从该收集的免疫细胞中的B淋巴细胞制备杂交瘤；以及(e)通过筛选法鉴定那些可产生能够识别所述选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤。
52．一种用遗传物质转染哺乳动物免疫细胞的方法，该方法包括将所述遗传物质引入一种装置的基质中，该装置含有多孔基质，基质则包含在一种带孔但不通透的容器中，将该装置植入所述哺乳动物的体内。
53．权利要求52的方法，其中所述遗传物质的选择集合包括DNA、RNA和cDNA。
54．权利要求52的方法，其中所述遗传物质可编码一种抗原。
55．一种对免疫应答引起的疾病或病症进行治疗或预防的方法，该方法包括根据权利要求15的对免疫应答的抑制。
56．权利要求55的方法，其中所述疾病或病症的选择集合包括过敏症、移植排异和自身免疫疾病。
57．一种调节哺乳动物中对抗原的免疫应答的方法，该方法是通过在所述哺乳动物体内植入一种装置，该装置含有所述抗原，并进一步包含一种用于限制分子被动扩散到该装置外，但不限制免疫细胞主动移入或移出该装置的工具。
全文摘要
本发明提供了用于诱导、刺激、封闭、和减弱对于抗原的免疫应答的方法和装置,采用一种可植入装置,将抗原以受控方式暴露于免疫系统细胞。该装置包含放置在带孔但不通透的容器中的多孔基质。通过调节该抗原的生物利用率,以及相对于装置植入动物的时间抗原导入装置的时间安排,可以诱导针对所述抗原的强烈的长期的应答,或减量调节或封闭现存的或潜在的免疫应答。该方法和装置可用治疗接种,以及未暴露的动物的预防接种。免疫可以细胞的,体液的,粘膜的。免疫应答的抑制可用于变态反应,自身免疫病的预防和治疗,以及使动物耐受以抑制移植性抗原的免疫应答。该装置亦可用于收获免疫细胞,以稍后再导入动物,及制备免疫血清和杂交瘤。
文档编号A61K9/00GK1299272SQ99805765
公开日2001年6月13日 申请日期1999年3月2日 优先权日1998年3月2日
发明者A·切拉米, C·切拉米, C·格尔贝尔, D·达夫 申请人:应用疫苗技术公司