专利名称：通过异种间的核移植产生的胚细胞或干细胞样细胞系的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及通过将动物或人细胞的细胞核植入与供体核不同种的动物的去核卵母细胞而产生胚细胞或干细胞样细胞。本发明更具体地涉及通过将灵长类动物或人细胞的核植入去核的动物卵母细胞，如灵长类动物或具爪动物的卵母细胞，在优选的实施方案中为牛去核卵母细胞而产生灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞。
本发明还涉及所得的胚细胞或干细胞样细胞，优选为灵长类动物或人的胚细胞或干细胞样细胞用于治疗，诊断，产生可用于治疗或诊断的分化细胞，和产生转基因的胚或转基因的分化细胞，细胞系，组织和器官的用途。另外，本发明所得的胚细胞或干细胞样细胞本身也可在用于产生嵌合体或无性系，优选为转基因的克隆或嵌合动物的核移植或核转移方法中用作核供体。
据报道，ES细胞具有多种用途，例如，ES细胞可用作体外分化模型，尤其是可用作研究参与早期发育调节之基因的体外模型。当将小鼠ES细胞导入植入前的小鼠胚胎时可产生种系嵌合体，从而阐明了其多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。
由于ES细胞能将其基因组转移至下一代，因此，ES细胞具有潜在的实用性，通过使用具有或不具有所需基因修饰的ES细胞可以对家畜进行种系操作。另外，对家畜，如具爪动物而言，从诸如植入前的家畜胚胎中得到的核能支持去核卵母细胞的按期发育(Smith等，生物繁殖，401027-1035(1989)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994))。这与得自小鼠胚胎的核相反，据报道得自小鼠胚胎的核在转移后的8-细胞阶段后仍不能支持去核卵母细胞的发育(Cheong等，生物繁殖，48958(1993))。因此，得自家畜的ES细胞非常合乎需要，因为它们可提供潜在的经基因操作的或要不然可用于核转移法的全能性供体核来源。
一些研究小组已报道了据称为多能性的胚细胞系的分离。例如，据Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,43255-260(1991)报道，由猪和绵羊胚泡建立了据称为稳定的，多能性的细胞系，其中所述胚泡表现出的一些形态学和生长特性类似于通过免疫切除由绵羊胚泡分离出的内细胞团原代培养物的细胞。另外，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl,41:51-56(1990)公开了得自猪胚泡的推定的多能性胚细胞系的维持和分化。另外，Gerfen等，动物生物技术，6(1)1-14(1995)公开了由猪胚泡分离胚细胞系。无需使用条件培养基，这些细胞可在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上稳定维持。据报道，这些细胞在培养的过程中分化为几个不同的细胞类型(Gerfen等，文献同上)。
另外，Saito等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,201134-141(1992)报道了经培养的牛胚胎干细胞-样细胞系，该细胞系可存活3代，但第4代后即消失。Handyside等，Roux’s Arch.Dev.Biol.,196185-190(1987)公开了在允许分离得自小鼠ICM的小鼠ES细胞系的条件下培养经免疫切除分离的绵羊胚胎内细胞团。据Handyside等，(1987)(文献同上)报道，在上述条件下，绵羊ICM附着，扩散和产生ES细胞样和内胚层样细胞区域，但经延长培养之后，只有内胚层样细胞清晰可见。
最近，Cherny等，Theriogenology,41175(1994)报道了可在长期培养物中维持的据称为多能性的衍生自牛原生殖细胞的细胞系。培养约7天之后，这些细胞产生了ES样集落，其碱性磷酸酶(AP)的染色为阳性，所述细胞还表现出形成胚状体并自动分化成至少两种不同细胞类型的能力。据报道，这些细胞还表达了转录因子OCT4,OCT6和HES1的mRNA，而据信只有ES细胞能表达该同源框基因模式。
最近，据Campbell等，自然，38064-68(1996)报道，对经培养的胚盘(ED)细胞进行核转移之后产生了活的羔羊，其中所述ED细胞得自在促使分离小鼠ES细胞系的条件下培养的9天龄绵羊胚胎，作者根据实验结果得出下列结论即通过核转移，得自9天龄绵羊胚胎的ED细胞是全能性的，并且该全能性能在培养中维持。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.,40444-454(1995)报道了得自牛胚泡内细胞团细胞的据称为永久细胞系的分离和鉴定。作者在不同的条件下分离并培养了得自8或9天龄牛胚泡的ICM以确定何种饲养细胞和培养基能最有效地支持牛ICM细胞的附着和过度生长。他们根据实验结果得出结论使用STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(以替代牛子宫上皮细胞)和使用炭-剥离的血清(而不是正常血清)添加至培养基中可以增强经培养的ICM细胞的附着和过度生长。然而，据Van Stekelenburg等报道，上述细胞系更类似于上皮细胞而不是多能性的ICM细胞。
另外，Smith等(WO94/24274,1994年10月27日公开)，Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公开)和Wheeler等(WO94/26889,1994年11月24日公开)报道了动物干细胞的分离，选择和增殖，据称该干细胞可用于得到转基因动物。Evans等(WO90/03432,1990年4月5日公开)还报道了由猪和牛衍生得到据称为多能性的胚胎干细胞，该胚胎干细胞据称可用于产生转基因动物。另外，Wheeler等(WO94/26884,1994年11月24日公开)公开了据称可用于制备嵌合和转基因的具爪动物的胚胎干细胞。因此，根据上述，很多研究小组显然想尝试产生ES细胞系，因为ES细胞系能潜在地用于产生克隆的或转基因的胚胎并可用于核移植。
也有人报道了使用具爪动物的ICM细胞进行核移植。例如，Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994)公开了通过将经裂解的供体细胞微量注射至去核的成熟卵母细胞而对牛ICM进行核移植。该文献公开了在体外将胚胎培养7天以产生15个胚泡，通过转移至牛受体，导致4个妊娠和2个出生。Keefer等.，生物繁殖，50935-939(1994)公开了在核转移方法中使用牛ICM细胞为供体核以产生胚泡，通过移植至牛受体，导致产生几个活的后代。另外，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,906143-6147(1993)公开了通过将经短期体外培养的牛ICM细胞的核转移至去核的成熟卵母细胞中而产生小牛。
另外，也有人报道了对经培养的胚盘细胞进行核转移之后产生了活的羔羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。还有人报道在核转移中使用牛多能性胚细胞并产生嵌合的胎儿(Stice等，生物繁殖，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994))。
另外，也有人尝试产生异种间的(cross species)NT单位(Wolfe等，Theriogenology,33350(1990))。具体地说，是将牛胚细胞与野牛的卵母细胞融合以产生一些可能具有内细胞团的异种间的NT单位。然而，在核转移方法中使用的供体核源自胚细胞而不是成年细胞。理论上，胚细胞比成年细胞更易于重编程序。该项研究与早期在蛙中进行的NT研究属于同一个时期(参见Diberardino，分化，1717-30(1980))。该项研究包括在系统发育上非常类似的动物(牛细胞核和野牛的卵母细胞)。与此相反，当在NT过程中融合更具多样性的种时(牛细胞核移植至仓鼠卵母细胞)，未得到内细胞团结构。另外，以前无人报道得自NT单位的内细胞团能用于形成可被增殖的ES细胞样集落。
Collas等(文献同上)教导了使用颗粒细胞(成年体细胞)产生牛核转移胚胎。然而，与本发明不同的是，这些实验不涉及异种间的核转移，而且与本发明不同的是，未得到ES样细胞集落。
最近，美国专利5,843,780(1998年12月1日授权于James A.Thomson，随后转让于Wisconsin Alumni研究基金会)声称公开了纯化的灵长类动物胚胎干细胞制品，它能(ⅰ)在体外培养中增殖1年以上；(ⅱ)保持核型，其中灵长类动物的所有染色体特性都存在并且在延长培养的过程中没有显著的变化；(ⅲ)在培养过程中保持分化成内胚层，中胚层和外胚层组织衍生物的潜力；和(ⅳ)当在成纤维细胞饲养层上培养时不能分化。据以前的报道，这些细胞的SSEA-1标记为阴性，SEA-3标记为阳性，SSEA-4标记为阳性，而现在这些细胞可表达碱性磷酸酶活性，是多能性的，并具有包括灵长类动物的所有染色体特性的存在且其中无一染色体有所变化的核型。另外，这些细胞的TRA-1-60和TRA-1-81标记为阳性。据称，当注射至SCID小鼠时，该细胞可分化成内胚层，中胚层和外胚层细胞。Thomson等在科学，2821145-1147和Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927844-7848(1995)中也讨论了据称衍生自人或灵长类动物胚细胞的胚胎干细胞系。
因此，Thomson公开了据称为非人灵长类动物和人的胚细胞或干细胞样细胞及其生产方法。然而，目前仍需要研究移植受体自身的人胚细胞或干细胞样细胞的生产方法，因为所述细胞具有显著的治疗和诊断潜力。
在此方面，已鉴定出多种可由细胞移植治疗的人类疾病。例如，帕金森氏病是由黑质中的多巴胺能神经元退化引起的。帕金森氏病的标准疗法包括施用L-DOPA，这可以暂时缓解多巴胺的损失，但可导致严重的副作用，最终并不能逆转疾病的进程。另一种治疗帕金森氏病的不同方法据称在治疗很多脑病和中枢神经系统损伤方面有广泛的用途，该方法包括将胎儿或新生动物的细胞或组织植入成年的脑中。得自胎儿多个脑区的神经元可掺入成年脑中。这种移植物可以缓解实验室动物经实验诱导的行为缺陷，包括复杂的认知功能缺陷。由人临床试验得到的最初的试验结果也是有希望的。然而，由流产得到的人胎儿细胞或组织供给十分有限，另外，由流产胎儿得到细胞或组织引起了人们广泛的争论。
目前，还没有由患者产生“胎儿-样”细胞的方法。另外，同种异体移植组织也不容易得到，同种异体移植和异种移植的组织都要遭受移植物排斥。另外，在某些情况下，在移植前对细胞或组织进行基因修饰是有利的。然而，很多经过必需的基因修饰的细胞或组织在培养过程中不能较好地分裂，而大多数的基因转化类型需要快速分裂的细胞。
因此，本领域中显然需要供应人胚细胞或干细胞样非分化的细胞以用于移植以及细胞和基因治疗。
发明目的本发明的目的是提供新的和改良的产生胚细胞或干细胞样细胞的方法。
本发明更具体的目的是提供新的产生胚细胞或干细胞样细胞的方法，所述方法包括将哺乳动物或人细胞的核植入异种去核卵母细胞中。
本发明的另一个更具体的目的是提供新的产生非人灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞的方法，所述方法包括将非人灵长类动物或人细胞的核植入去核的动物或人卵母细胞中，如具爪动物，人或灵长类动物去核的卵母细胞中。
本发明的另一个更具体的目的是提供新的产生谱系-缺损的非人灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞的方法，所述方法包括将非人灵长类动物或人细胞，如成人细胞的核植入去核的非人灵长类动物或人卵母细胞中，其中该细胞经基因改造而不能分化成特定的细胞谱系，或者通过例如表达反义DNA或核酶端粒酶基因进行修饰而使细胞变为“死亡的”，从而不能产生存活的后代。
本发明的另一个目的是增强核转移的效力，尤其是通过对核转移所用的供体体细胞进行基因工程改造以提供增强胚胎发育之基因(如MHC Ⅰ家族的基因，尤其是Ped基因，如Q7和/或Q9)的表达从而增强通过核转移产生的植入前胚胎的发育。
本发明的另一个目的是通过IVP增强核转移胚胎的产生，更具体地为通过对核转移所用的供体细胞进行基因改造而使细胞对细胞凋亡具有抗性以增强核转移胚胎的产生，例如通过导入可提供抑制细胞凋亡之基因(如Bcl-2或Bcl-2家族成员)表达的DNA构建体和/或通过表达特异于可在胚胎早期发育过程中诱导细胞凋亡之基因的反义核酶以增强核转移胚胎的产生。
本发明的另一个目的是通过对供体细胞进行基因改造而使它们表达编码与可测标记(如肉眼可见的荧光标记蛋白)相连的特定细胞周期蛋白的DNA构建体，从而改善对特定细胞周期，如G1期的供体细胞的选择而最终改善核转移的效力。
本发明的另一个目的是通过在一种或多种蛋白酶抑制剂，优选为一种或多种capsase抑制剂的存在下培养体外产生的胚胎，从而抑制细胞凋亡以增强所述胚胎的发育。
本发明的另一个目的是提供通过将动物或人细胞的核植入异种去核卵母细胞中而产生的胚细胞或干细胞样细胞。
本发明的另一个更具体的目的是提供通过将灵长类动物或人细胞的核植入去核的动物卵母细胞，如人，灵长类动物或具爪动物的去核卵母细胞中而产生的灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞。
本发明的另一个目的是将所述胚细胞或干细胞样细胞用于治疗或诊断。
本发明的具体目的是使用所述灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞治疗或诊断任何进行细胞，组织或器官移植对其治疗或诊断有利的疾病。
本发明的另一个具体的目的是使用本发明产生的胚细胞或干细胞样细胞产生分化的细胞，组织或器官。
本发明更具体的目的是使用本发明产生的灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞产生分化的人细胞，组织或器官。
本发明的另一个具体的目的是使用本发明产生的胚细胞或干细胞样细胞产生经基因工程改造的胚细胞或干细胞样细胞，该细胞可用于产生经基因工程改造的或转基因的分化的人细胞，组织或器官，例如用于基因治疗。
本发明的另一个具体的目的是将本发明体外产生的胚细胞或干细胞样细胞用于例如研究细胞分化和检测用途(如用于药物研究)。
本发明的另一个目的是提供改良的移植疗法，所述方法包括使用由本发明产生的胚细胞或干细胞样细胞产生的等基因或同基因细胞，组织或器官。所述疗法可以治疗的疾病包括例如帕金森氏病，杭廷顿氏舞蹈病，早老性痴呆，ALS，脊髓损伤，多发性硬化，肌营养不良，糖尿病，肝病，心脏病，软骨替换，烧伤，血管病，泌尿道病，以及免疫缺损，骨髓移植，癌症等疾病。
本发明的另一个目的是将本发明产生的转基因的或经基因改造的胚细胞或干细胞样细胞用于基因治疗，尤其是用于治疗和/或预防上述疾病和损伤。
本发明的另一个目的是将本发明产生的胚细胞或干细胞样细胞或本发明产生的转基因的或经基因改造的胚细胞或干细胞样细胞用作核移植中所用的核供体。
本发明的另一个目的是使用本发明产生的经基因改造的ES细胞来产生转基因动物，如非人灵长类动物，啮齿类动物，具爪动物等。所述转基因动物可用于产生例如研究人类疾病或生产所需多肽，如治疗剂或营养药物所需的动物模型。
本发明的上述和其它目的，优点和特征将在下文中具体体现，因此，参照下列有关本发明优选实施方案的详细描述和所附权利要求书将会更清楚地理解本发明的特征。
图2至5是得自
图1所示NT单位的胚胎干细胞样细胞的照片。
发明详述本发明提供了通过核转移或核移植产生胚细胞或干细胞样细胞，更具体地为非人灵长类动物或人的胚细胞或干细胞样细胞的新方法。在本申请中，核转移或核移植或NT可以互换使用。
如上所述，通过核转移或核移植分离真正的胚细胞或干细胞样细胞尚无人报道。相反，以前报道的ES-样细胞分离自受精的胚胎。另外，从未有人报道过包括基因不相似的种的细胞或DNA，更具体地为包括一个种(如人)的成年细胞或DNA和另一个不相关种的卵母细胞的成功的核转移。相反，尽管有人报道通过融合密切相关种的细胞产生了胚胎，如牛-山羊和牛-野牛，但它们不能产生ES细胞(Wolfe等，Theriogenology,33(1)350(1990))。另外，也无人报道过由非胎儿组织来源产生灵长类动物或人的ES细胞的方法。相反，目前可以得到的有限的人胎儿细胞和组织必须得自或衍生自自发流产的组织和流产的胎儿。
在本发明之前，无人可通过异种间的核移植得到胚细胞或于细胞样细胞。
本发明人十分出乎意料地发现通过将人细胞(如成年分化的人细胞)的核植入去核的动物卵母细胞中，用于产生核转移(NT)单位，其中的细胞通过培养可产生人胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落，即可得到人胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落。此结果非常令人惊奇，因为该结果首次阐明了有效的异种间核移植，它包括将分化的供体细胞或核导入基因上不相似的种的去核卵母细胞，例如将分化的动物或人细胞，如成年细胞的细胞核植入不同动物种的去核卵中以产生核转移单位，当在适当条件下培养其中所含的细胞时即可产生胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落。
优选将用于产生ES样细胞的NT单位培养至大小至少为2至400个细胞，更优选为4至128个细胞，最优选大小至少约为50个细胞。
在本发明中，胚细胞或干细胞样细胞指的是本发明产生的细胞。本申请中将这些细胞称为干细胞样细胞而不是干细胞的原因是它们一般是通过异种间的核转移产生的。尽管预期这些细胞具有与正常干细胞相似的分化能力，但由于它们产生的方式的特殊性而使它们也具有一些不显著的差异。例如，这些干细胞样细胞具有核转移所用卵母细胞的线粒体，因此，其行为方式与常规的胚胎干细胞不同。
本发现基于下列观察结果将成人细胞，尤其是得自人供体口腔的人上皮细胞的细胞核植入去核的牛卵母细胞时，导致形成核转移单位，通过培养其中的细胞可产生人干细胞样细胞或胚细胞和人胚细胞或干细胞样细胞集落。最近，通过将成人角质细胞植入去核的牛卵母细胞中，成功地产生了胚泡和ES细胞系而再现了上述结果。根据上述结果，本发明人提出下列假说，即牛卵母细胞和人卵母细胞和可能是普遍的哺乳动物卵母细胞在胚胎发育过程中必须经过成熟的过程，该成熟过程足够相似或保守以使牛卵母细胞能用作人卵母细胞的有效替代物。显然，卵母细胞实际上普遍含有蛋白质或核酸类因子，可在适当条件下诱导胚胎发育，不同种中的这些功能相同或非常类似。这些因子可含有物质RNA和/或端粒酶。
根据人细胞核可有效植入牛卵母细胞这一事实，可合理地预期人细胞可植入其它非相关种，如其它具爪动物以及其它动物的卵母细胞中。尤其是，其它具爪动物的卵母细胞应该是适合的，例如猪，绵羊，马，山羊等。另外，其它来源的卵母细胞应该是适合的，例如得自其它灵长类动物，两栖类动物，啮齿类动物，兔，豚鼠等的卵母细胞。另外，使用类似的方法，应该可以将人细胞或细胞核转移至人卵母细胞中并使用所得的胚细胞产生人ES细胞。
因此，在最宽的实施方案中，本发明包括通过注射或融合将动物或人细胞核或动物或人细胞植入不同于供体核之动物种的去核卵母细胞中以产生NT单位，该NT单位中所含的细胞可用于得到胚细胞或干细胞样细胞和/或细胞培养物。例如，本发明包括通过注射或融合将具爪动物的细胞核或具爪动物的细胞植入另一种，如另一种具爪动物或非具爪动物的去核卵母细胞中，细胞和/或核混合产生NT单位，在适当条件下培养NT单位的细胞可得到多细胞的NT单位，优选其含有至少约2至400个细胞，更优选为4至128个细胞，最优选至少约为50个细胞。该NT单位的细胞经培养后可用于产生胚细胞或干细胞样细胞或细胞集落。
然而，本发明的优选实施方案包括通过将供体人细胞的核或人细胞植入去核的人，灵长类动物或非灵长类动物的卵母细胞，如具爪动物的卵母细胞，在优选实施方案中为牛去核的卵母细胞中而产生非人灵长类动物或人胚细胞或干细胞样细胞。
通常，可通过包括下列步骤的核转移方法产生胚细胞或干细胞样细胞(ⅰ)得到所需的人或动物细胞以用作供体核的来源(可对其进行基因修饰)；(ⅱ)从适当来源，如哺乳动物和最优选为灵长类动物或具爪动物来源，如牛得到卵母细胞；(ⅲ)使所述卵母细胞去核；(ⅳ)通过融合或注射将人或动物细胞或核转移至不同于供体细胞或核之动物种的去核的卵母细胞中；(ⅴ)培养所得的NT产物或NT单位以产生多细胞结构；和(ⅵ)培养得自所述胚胎的细胞以得到胚细胞或干细胞样细胞和干细胞样细胞集落。
核转移技术或核移植技术已在文献中公开并描述于发明背景中提及的很多参考文献中。例见Campbell等，Theriogenology,43181(1995)；Collas等，Mol.Report Dev.,38264-267(1994)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)；Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,906143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432(皆全文列入本文作为参考)。另外，美国专利4,944,384和5,057,420中描述了牛核移植的方法，该方法也见Cibelli等，科学，Vol.2801256-1258(1998)。
通过众所周知的方法可得到和培养人或动物细胞，优选为哺乳动物细胞。可用于本发明的人和动物细胞包括例如上皮细胞，神经细胞，表皮细胞，角质细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，淋巴细胞(B和T淋巴细胞)，其它免疫细胞，红细胞，巨噬细胞，黑素细胞，单核细胞，成纤维细胞，心肌细胞和其它肌细胞等。另外，用于核转移的人细胞可得自不同器官，如皮肤，肺，胰腺，肝脏，胃，肠，心脏，生殖器官，膀胱，肾脏，尿道和其它泌尿器官等。这些只是适当供体细胞的例子。适当供体细胞，即可用于本发明的细胞可得自身体的任何细胞或器官，它包括所有体细胞或生殖细胞。优选地，供体细胞或核可含有活跃分裂的，即非休眠的细胞，因为据报道这样可以增强克隆效力。另外，也优选这种供体细胞处于G1细胞周期。
根据Thomson等，科学，2821145-1147(1998)和Thomson等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927544-7848(1995)(皆全文列入本文作为参考)报道的培养方法，可使用所得的胚细胞得到胚胎干细胞系。
可用作核转移供体的细胞的例子是得自人供体口腔的上皮细胞和成人角质细胞。然而，如上文所讨论的，公开的方法也适用于其它人细胞或核。另外，细胞核可得自人体细胞和生殖细胞。
也可以在核转移之前，使用本领域已知的适当技术使供体细胞停滞于有丝分裂阶段。将细胞周期终止于不同阶段的方法详细描述于美国专利5,262,409(列入本文作为参考)。具体地说，尽管据报道环己酰亚胺对有丝分裂具有抑制作用(Bowen和Wilson(1995)J.Heredity453-9)，但当其与电脉冲处理联合使用时，仍可用于改善对成熟的牛泡内卵母细胞的激活(Yang等(1992)，生物繁殖，42(Suppl.1)117)。
接合子基因激活与组蛋白H4的超乙酰化有关。与其它化合物一样，制滴菌素-A能以可逆的方式抑制组蛋白脱乙酰基酶(Adenot等，在1-细胞小鼠胚胎的原核中，父本和母本染色质的差异性的H4乙酰化优先于DNA复制和示差转录活性，发育(1997,11)124(22)4615-4625；Yoshida等，制滴菌素A和trapoxin探测组蛋白乙酰化对染色质结构和功能之作用的新的化学探针(1995,5)17(5)423-430)。
例如，据信丁酸也可通过抑制组蛋白脱乙酰基酶而导致组蛋白的超乙酰化。一般说来，丁酸似乎能修饰基因表达，在几乎所有的情况下，在培养的细胞中加入丁酸似乎能抑制细胞生长。丁酸在此方面的用途描述于美国专利5,681,718(列入本文作为参考)。因此，在融合之前可将供体细胞暴露于制滴菌素A或另一种适当的脱乙酰基酶抑制剂中，或者在激活基因组之前将这种化合物加入培养基中。
另外，据认为，转录因子适当接近DNA调节序列也需要DNA的脱甲基化。已有人描述了DNA从植入前胚胎的8细胞阶段至胚泡阶段的完全脱甲基化(Stein等，Mol.Reprod.＆ Dev.47(4)421-429)。另外，据Jaenisch等(1997)报道，可使用5-氮胞苷降低细胞中的DNA甲基化水平，潜在地导致转录因子更易于接近DNA调节序列。因此，可在融合前将供体细胞暴露于5-氮胞苷(5-Aza)，或从8细胞阶段至胚泡阶段在培养基中加入5-Aza。或者，也可使用其它已知的方法来实现DNA的脱甲基化。
用于核转移的卵母细胞可得自包括哺乳动物和两栖类动物的动物。卵母细胞适当的哺乳动物来源包括羊，牛，绵羊，猪，马，兔，山羊，豚鼠，小鼠，仓鼠，大鼠，灵长类动物，人等。在优选的实施方案中，卵母细胞得自灵长类动物或具爪动物，如牛。
分离卵母细胞的方法是本领域众所周知的。实质上，该方法包括从哺乳动物或两栖类动物，如牛的卵巢或生殖道中分离卵母细胞。牛卵母细胞易于获得的来源是屠宰场。
为了成功地使用诸如基因工程，核转移和克隆的技术，一般必须在将卵母细胞用作核转移的受体细胞之前，或在卵母细胞与精细胞受精以发育成胚胎之前，在体外使卵母细胞成熟。该方法一般需要从动物卵巢(如在屠宰场得到的牛卵巢)中收集不成熟(前期Ⅰ)的卵母细胞，并于受精或去核之前在成熟培养基中使卵母细胞成熟直至卵母细胞达到中期Ⅱ阶段，对牛卵母细胞而言，该阶段一般发生在吸出后约18至24小时。本发明中将这段时间称为“成熟期”。为了计算时间，本文所用的“吸出”指的是从卵泡中吸出不成熟的卵母细胞。
另外，核转移技术中成功使用了已在体内成熟的中期Ⅱ阶段的卵母细胞。实质上，可通过外科手术从开始发情后或注射人绒膜促性腺激素(hCG)或类似激素之后35至48小时的未超排卵或超排卵的奶牛或小母牛体内采集成熟的中期Ⅱ卵母细胞。
据报道，去核和核转移时使卵母细胞成熟对NT法的成功意义重大(例见Prather等，分化，481-8,1991)。一般说来，以前成功的哺乳动物胚胎克隆实践使用中期Ⅱ阶段的卵母细胞作为受体卵母细胞，因为据信在此阶段，卵母细胞可以被或足以被“激活”以象处理受精的精子一样处理导入的核。对家畜，尤其是牛而言，卵母细胞的激活期一般在吸出后约16-52小时，优选约28-42小时。
例如，可按Seshagine等，生物繁殖，40,544-606,1989所述用HEPES缓冲的仓鼠胚胎培养基(HECM)洗涤不成熟的卵母细胞，然后于39℃，将卵母细胞置于数滴成熟培养基中，该培养基由50μl含有10％胎牛血清的组织培养基(TCM)199组成，其中还含有适当的促性腺素，如促黄体素(LH)和促滤泡激素(FSH)和雌二醇，所述培养基上覆盖了一层轻量石蜡或硅。
在时间固定不变的成熟期之后，一般约为10至40小时，优选约为16至18小时之后，使卵母细胞去核。在去核之前，优选取出卵母细胞，并在取出一堆细胞之前将其置于含有1mg透明质酸酶/ml的HECM中。通过重复地用孔非常细的移液管进行移液或通过短暂地涡旋可以实现此目的。然后筛选剥离的卵母细胞的极体，选择通过极体的存在测定的中期Ⅱ卵母细胞，然后用于核转移。按下述进行去核。
通过如美国专利4,994,384(列入本文作为参考)所述的已知方法可进行去核。例如，将中期Ⅱ卵母细胞置于任选含有7.5μg松胞菌素B/ml的HECM中立即去核，或者将所述卵母细胞置于含有10％发情期奶牛血清的适当培养基，如CRlaa中，随后再进行去核，优选不超过24小时之后，更优选在16至18小时之后进行去核。
使用显微外科技术，用微型移液管除去极体和邻近的胞质即可实现去核的目的，然后进行筛选以鉴定出已被成功去核的卵母细胞。通过用1μg 33342 Hoechst染料/ml HECM染色卵母细胞以进行筛选，然后在紫外光照射(少于10秒)下观察卵母细胞，将已成功去核的卵母细胞置于适当培养基中。
在本发明中，优选在体外成熟开始之后约10小时至约40小时，更优选在体外成熟开始之后约16小时至约24小时，最优选在体外成熟开始之后约16至18小时使受体卵母细胞去核。
然后将一般异源于去核卵母细胞的单个动物或人细胞或细胞核转移至去核卵母细胞的卵周隙，以用于产生NT单位。可根据本领域已知的方法，使用动物或人细胞或细胞核和去核的卵母细胞产生NT单位。例如，可通过电融合融合细胞。通过提供足以导致质膜瞬时击穿的电脉冲即可完成电融合。质膜的击穿非常短暂，因为膜能快速地重新形成。实质上，如果两个邻接的膜被诱导击穿的话，通过重新形成脂质双层混合体，两个细胞之间的小通道即可开放。由于小开口在热动力学上的不稳定性，它会扩大直至两个细胞变成一个细胞。有关此方法的进一步讨论可参照Prather等的美国专利4,997,384(全文列入本文作为参考)。可使用多种电融合介质，包括例如蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇和磷酸盐缓冲溶液。也可使用仙台病毒为融合剂进行融合(Graham,Wister Inot.Symp.Monogr.,9,19,1969)。
在某些情况下(如供体核较小)，优选将核直接注射至卵母细胞而不是使用电穿孔融合。该技术公开于Collas和Barnes,Mol.Reprod.Dev.,38264-267(1994)(全文列入本文作为参考)。
优选地，在卵母细胞开始成熟之后约24小时，通过使用90-120V的电脉冲约15微秒，在500μm的槽中电融合人或动物细胞和卵母细胞。融合之后，将所得融合的NT单位置于适当培养基中直至激活，如下文所鉴定的激活。一般很快即可激活，一般在少于24小时之后，优选约在4至9小时之后即可激活。
通过已知方法可激活NT单位，所述方法包括例如在低于生理温度下培养NT单位，实质上是对NT单位实施冷的，或实际上凉的温度休克。通过在室温下培养NT单位可最方便地实现这一目的，因为室温比胚胎正常暴露的生理温度条件更低。
或者，使用已知的激活剂进行激活。例如，已证实精子在受精过程中穿入卵母细胞可激活预融合的卵母细胞，在核转移之后产生更多数目的活的妊娠和多个基因相同的小牛。诸如电和化学休克的处理或环己酰亚胺处理也可用于激活融合后的NT胚胎。适当的卵母细胞激活法是Susko-Parrish等的美国专利5,496,720(列入本文作为参考)的主题。
例如，通过同时或依次进行下列步骤即可激活卵母细胞(ⅰ)增加卵母细胞中的二价阳离子水平，和(ⅱ)降低卵母细胞中的细胞蛋白质的磷酸化。
通过以离子载体的形式，将二价阳离子，如镁，锶，钡或钙导入卵母细胞的胞质中一般即可实现上述目的。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电休克，乙醇处理和笼形螯合剂处理。
通过已知方法可降低磷酸化，例如通过加入激酶抑制剂，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-二甲基-氨基-嘌呤，星形孢菌素，2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
或者，通过将磷酸酶，如磷酸酶2A和磷酸酶2B导入卵母细胞中也可抑制细胞蛋白质的磷酸化。
可在适当的体外培养基中培养激活的NT单位直至产生胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落。适于培养和使胚胎成熟的培养基是本领域众所周知的。可用于培养和维持牛胚胎的已知培养基的例子包括Ham’sF-10+10％胎牛血清(FCS)，组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清，Tyrodes-白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐(TALP)，Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Eagle’s和Whitten’s培养基。用于收集卵母细胞并使其成熟的一个最常用的培养基是TCM-199，其中添加的1至20％血清包括胎牛血清，新生儿血清，发情期的奶牛血清，羔羊血清或小公牛血清。优选的维持培养基包括含有Earl盐，10％胎牛血清，0.2MM Ma丙酮酸盐和50μg/ml硫酸庆大霉素的TCM-199。上述任何培养基也包括与多种细胞类型的共培养，所述细胞如颗粒细胞，输卵管细胞，BRL细胞，子宫细胞和STO细胞。
尤其是，人子宫内膜的上皮细胞可在植入前期和植入期分泌白血病抑制因子(LIF)。因此，在培养基中加入LIF对于增强重构胚胎的体外发育至关重要。给胚细胞或干细胞样细胞培养物使用LIF描述于美国专利5,712,156(列入本文作为参考)。
另一种维持培养基描述于Rosenkrans,Jr等的美国专利5,096,822(列入本文作为参考)。被称为CR1的该胚胎培养基含有支持胚胎所必需的营养物质。CR1含有L-乳酸半钙，其量为1.0mM至10mM，优选为1.0mM至5.0mM。L-乳酸半钙是其中掺有半钙盐的L-乳酸盐。
在培养中维持人胚细胞的适当培养基描述于Thomson等，科学2821145-1147(1998)和Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 927844-7848(1995)。
随后，优选用适当培养基洗涤经培养的一个或多个NT单位，然后将细胞置于该培养基中，所述培养基如CRIaa培养基，Ham’s F-10，组织培养基-199(TCM-199)，Tyrodes-白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐(TALP)，Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Eagle’s或Whitten’s培养基，优选上述培养基中还含有约10％FCS。优选在含有适当的铺满饲养层的孔板中进行培养。适当的饲养层包括例如成纤维细胞和上皮细胞，如得自具爪动物的成纤维细胞和子宫上皮细胞，鸡成纤维细胞，鼠(如小鼠或大鼠)成纤维细胞，STO和SI-m220饲养细胞系和BRL细胞。
在优选的实施方案中，饲养细胞含有小鼠胚胎成纤维细胞。制备适当成纤维细胞饲养层的方法描述于下文实施例中，并且是本领域技术人员众所周知的。
在饲养层上培养NT单位直至NT单位的大小适于得到可用于产生胚胎干细胞样细胞或细胞集落的细胞。优选将这些NT单位培养至大小至少约为2至400个细胞，更优选约为4至128个细胞，最优选至少约为50个细胞。可在适当条件下，即在约38.5℃和5％CO2中进行培养，培养时可更换培养基以使生长最优化，一般每隔2至5天，优选约每隔3天更换1次培养基。
对使用人细胞/去核的牛卵母细胞得到的NT单位而言，约在开始激活卵母细胞之后12天得到足以产生ES细胞集落的细胞，一般约为50个细胞。然而，随着用作核供体的特定细胞，特定卵母细胞的种和培养条件的不同，上述情况会有所不同。本领域技术人员根据经培养的NT单位的形态学，易于通过肉眼确定何时已得到所需的足够数目的细胞。
对人/人核转移胚胎而言，使用已知可用于维持组织培养中的人细胞的培养基是有利的。适用于培养人胚胎的培养基的例子包括Jones等，人类生殖.，13(1)169-177(1998)报道的培养基，P1-目录号为#99242的培养基和P-1目录号为#99292的培养基(这两种培养基都可得自Irvine Scientific,Santa Ana,California)，以及Thomson等(1998)和(1995)(文献同上)所用的培养基。
如上所述，本发明所用的细胞优选包括哺乳动物体细胞，最优选包括得自活跃增殖(非休眠)的哺乳动物细胞培养物的细胞。在特别优选的实施方案中，一般通过添加，缺失或取代所需的DNA序列而对供体细胞进行基因修饰。例如，可用提供所需基因产物，如治疗性多肽表达的DNA构建体转染或转化来源于例如人，灵长类动物或牛的供体细胞，如角质细胞或成纤维细胞。所述治疗性多肽的例子包括淋巴因子，如IGF-Ⅰ,IGF-Ⅱ，干扰素，集落刺激因子，结缔组织多肽(如胶原)，遗传因子，凝血因子，酶，酶抑制剂等。
如上所述，在核转移之前可对供体细胞进行修饰以获得其它所需的效果，例如破坏细胞谱系发育，增强胚胎发育和/或抑制细胞凋亡。下文将进一步讨论合乎需要的修饰的例子。
本发明一方面包括对供体细胞，如人细胞进行基因修饰以使其谱系存在缺陷，因此当用于核转移时不能产生存活的后代。这对于人核转移胚胎尤其有用，因为出于伦理学的原因，产生存活的胚胎不是人们想要的结果。通过对人细胞进行基因工程改造，使其用于核转移时不能分化成特定的细胞谱系即可实现上述目的。具体地说，可对细胞进行基因修饰，以使当该细胞用作核转移供体时，所得“胚胎”不含有或基本上缺乏中胚层，内胚层或外胚层组织中的至少一个。
希望通过敲除或破坏一个或多个中胚层，内胚层或外胚层特定基因的表达来实现上述目的，所述基因的例子包括中胚层SRF,MESP-1,HNF-4,β-l整联蛋白，MSD；内胚层GATA-6,GATA-4；外胚层RNA解旋酶A,H β58。
上面列出的是参与中胚层，内胚层和外胚层发育之已知基因的非限制性例子。以前的文献中报道了中胚层缺损，内胚层缺损和外胚层缺损细胞和胚胎的产生。例见Arsenian等，EMBO J.,Vol.17(2)6289-6299(1998)；Saga Y,Mech.Dev.,Vol.75(1-2)53-66(1998)；Holdener等，发育，Vol1 120(5)1355-1346(1994)；Chen等，Genes Dev.Vol.8(20)2466-2477(1994)；Rohwedel等，发育生物学，201(2)167-189(1998)(中胚层)；Morrisey等，Genes Dev.Vol.12(22)3579-3590(1998)；Soudais等，发育，Vol.121(11)3877-3888(1995)(内胚层)；和Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95(23)13709-13713(1998)；和Radice等，发育，Vol.111(3)801-811(1991)(外胚层)。
一般说来，可对所需体细胞，如人角质细胞，上皮细胞或成纤维细胞进行基因工程改造以使一个或多个特异于特定细胞谱系的基因被“敲除”和/或所述基因的表达被显著削弱。通过已知方法，如同源重组可实现此目的。“敲除”所需基因所用的优选基因系统公开于Capecchi等的美国专利5,631,153和5,464,764，其中报道了正-负选择(PNS)载体，该载体能靶向修饰所需哺乳动物基因组中的DNA序列。这种基因修饰可导致细胞当用作核转移供体时不能分化成特定的细胞谱系。
经基因修饰的细胞可用于产生谱系-缺损的核转移胚胎，即该胚胎不能产生至少一个功能性的中胚层，内胚层或外胚层。因此，即使将所得胚胎植入例如人子宫中，也不会产生存活的后代。然而，由这种核转移产生的ES细胞仍是有用的，因为它们能产生一个或两个残留的未被破坏的谱系的细胞。例如，外胚层缺损的人核转移胚胎仍可产生得自中胚层和内胚层的分化细胞。通过缺失和/或破坏RNA解旋酶A或H β58基因中的一个或两个可产生外胚层缺损的细胞。
也可对这些谱系缺损的供体细胞进行基因修饰以表达另一种所需的DNA序列。
因此，经基因修饰的供体细胞可产生谱系缺损的胚泡，当铺平生长时，最多能分化成两个胚原基层。
或者，可修饰供体细胞以使其“死亡”。通过表达反义DNA或核酶端粒酶基因可实现此目的。通过提供反义DNA或核酶表达的已知基因工程方法或通过基因敲除可实现此目的。当这些“死亡”细胞用于核转移时不能分化成存活的后代。
本发明的另一个优选实施方案是产生能在组织培养中更有效生长的核转移胚胎。它之所以有利的原因是它应该能减少产生ES细胞和/或后代(如果将胚泡植入雌性替代物的话)所需的时间和必需的融合。它之所以合乎需要的另一个原因是据观察，核转移产生的胚泡和ES细胞具有被削弱的发育潜力。尽管通过改变组织培养条件经常可以缓解这些问题，但另一种解决办法是通过增强参与胚胎发育之基因的表达来增强胚胎发育。
例如，据报道，MHC Ⅰ家族成员Ped型基因产物对胚胎发育非常重要。更具体地说，据报道，对小鼠植入前胚胎而言，Q7和Q9基因负责“快速生长”表型。因此，希望将提供这些和相关基因，或其人或其它哺乳动物对应物之表达的DNA导入供体细胞会产生生长更加快速的核转移胚胎。相对于通过融合同种细胞或细胞核而产生的核转移胚胎而言，异种间核转移产生的胚胎在组织培养中发育得较慢，因此，上述方法对其特别有用。
尤其是，可在核转移之前将含有Q7和/或Q9基因的DNA构建体导入供体体细胞。例如，可构建表达构建体，其含有与Q7和/或Q9基因可操作相连的强组成型哺乳动物启动子，IRES，一个或多个适当的选择标记(如新霉素，ADA,DHFR)和poly-A-序列，如bGH polyA序列。另外，通过包含隔离物(insulate)而进一步增强Q7和Q9基因的表达也是有利的。希望能在胚泡发育的早期表达这些基因，因为不同种(如牛，山羊，猪，狗，猫和人)中的这些基因是高度保守的。也希望对供体细胞进行改造以插入能增强胚胎发育的其它基因。因此，这些经基因修饰的供体细胞应该能更有效地产生胚泡和植入前期的胚胎。
本发明的另一方面包括构建对细胞凋亡，即编程性细胞死亡具有抗性的供体细胞。据文献报道，与细胞死亡相关的基因存在于植入前期的胚胎中(Adams等，科学，281(5381)1322-1326(1998))。据报道可诱导细胞凋亡的基因包括例如Bad,Bok,BH3,Bik,Hrk,BNIP3,BimL,Bad,Bid和EGL-1。相反，据报道可保护细胞免受编程性细胞死亡的基因包括例如BcL-XL,Bcl-w,Mcl-1,A1,Nr-13,BHRF-1,LMW5-HL,ORF16,Ks-Bel-2,E1B-19K和CED-9。
因此，可构建供体细胞，其中诱导细胞凋亡的基因被“敲除”或其中保护细胞免受细胞凋亡的基因的表达在胚胎发育过程中被增强或开启。
例如，通过导入DNA构建体即可实现此目的，该构建体可在胚胎发育过程中提供上述保护性基因，如Bcl-2或相关基因的调控表达。因此，通过在特定的生长条件下培养胚胎即可“开启”基因。或者，也可将上述基因与组成型启动子相连。
更具体地说，可构建含有与可调节的或组成型的启动子(如PGK,SV40,CMV，遍在蛋白或β-肌动蛋白)，IRES，适当选择标记和poly-A序列可操作相连的Bcl-2基因的DNA构建体，并将其导入所需的供体哺乳动物细胞，如人角质细胞或成纤维细胞中。
当这些供体细胞用于产生核转移胚胎时，它们应该对细胞凋亡具有抗性，从而能在组织培养中更有效地分化，因而，由核转移产生的适当植入前胚胎的速度和/或数目有所增加。
另一种可得到相同结果的方法是破坏可诱导细胞凋亡的一个或多个基因的表达。通过敲除这些基因或通过使用针对在胚胎发育早期表达并诱导细胞凋亡之基因的反义DNA或核酶即可实现此目的，其例子见上文。或者，可构建供体细胞，使其含有两种修饰，即破坏能诱导细胞凋亡的基因和增强可阻止或防止细胞凋亡之基因的表达。影响细胞凋亡之基因的构建和选择，和表达所述基因的细胞系公开于发明人为Craig B.Thompson等，受让人为密执根大学的美国专利5,646,008(列入本文作为参考)。
增强核转移效力的一种方法是选择处于特定细胞周期阶段的细胞为供体细胞。据报道，这对核转移效力有显著影响(Barnes等，Mol.Reprod.Devel.,36(1)33-41(1993))。选择处于特定细胞周期阶段的细胞的不同方法已有人报道，所述方法包括血清饥饿法(Campbell等，自然，38064-66(1996)；Wilmut等，自然，385810-813(1997))和化学同步化(Urbani等，Exp.Cell Res.,219(1)159-168(1995))。例如，可将特定的细胞周期蛋白DNA与调节序列以及可测标记，如绿色荧光蛋白(GFP)可操作相连，后面再连接细胞周期蛋白破坏盒，并任选连接有隔离序列以增强细胞周期蛋白和标记蛋白的表达。籍此，易于用肉眼检测和选择所需细胞周期的细胞并将其用作核转移供体。例如，为了选择处于G1期的细胞，需使用细胞周期蛋白D1基因。然而，任何细胞周期蛋白基因都应适用于本发明(例见King等，细胞分子生物学，Vol.7(9)1343-1357(1996))。
然而，需要以侵害性较小或更有效的方法来产生处于所需细胞周期阶段的细胞。希望通过对供体细胞进行基因修饰，使其在可测的条件下表达特定的细胞周期蛋白来实现上述目的。籍此，易于从其它细胞周期中分辨出特定细胞周期的细胞。
细胞周期蛋白是仅在特定的细胞周期阶段表达的蛋白质。它们包括G1期的细胞周期蛋白D1,D2和D3,G2/M期的细胞周期蛋白B1和B2和S期的细胞周期蛋白E,A和H。这些蛋白质易于在cytogolcytosol中被翻译和破坏。所述蛋白质的“瞬时”表达部分归功于“破坏盒”的存在，此破坏盒是短的氨基酸序列，是可用作标记物以介导经由遍在蛋白途径迅速破坏上述细胞周期蛋白的蛋白质的一部分(Adams等，科学，281(5321)1322-1326(1998))。
在本发明中，可构建供体细胞，使其在易于检测的条件下(优选肉眼可见，如通过使用荧光标记)表达一个或多个上述细胞周期蛋白基因。例如，可将特定的细胞周期蛋白DNA与调节序列以及可测标记，如绿色荧光蛋白(GFP)可操作相连，后面再连接细胞周期蛋白破坏盒，并任选连接有隔离序列以增强细胞周期蛋白和/或标记蛋白的表达。籍此，易于用肉眼检测和选择所需细胞周期的细胞并将其用作核转移供体。例如，为了选择处于G1期的细胞，需使用细胞周期蛋白D1基因。然而，任何细胞周期蛋白基因都应适用于本发明(例见King等，细胞分子生物学，Vol.7(9)1343-1357(1996))。
本发明的另一方面是增强核转移效力的方法，优选为增强异种间核转移效力的方法。尽管本发明人已阐明当将一个种的细胞核或细胞插入或融合于另一个种的去核卵母细胞时可得到能产生胚泡的核转移胚胎，所述胚胎能产生ES细胞系，此方法的效力十分低。因此，一般需要进行很多次融合来产生胚泡，培养所述胚泡的细胞才能产生ES细胞和ES细胞系。
另一种增强核转移胚胎之体外发育的方法是使培养条件最优化。获得此结果的一个方法是在阻止细胞凋亡的条件下培养NT胚胎。关于本发明的此实施方案，已发现诸如capsases的蛋白酶可通过类似于其它细胞类型的细胞凋亡导致卵母细胞死亡(例见Jurisicosva等，Mol.Reprod.Devel.,51(3)243-253(1998))。
希望通过在用于核转移和维持胚泡或培养植入前期的胚胎的培养基中加入一种或多种capsase抑制剂来增强胚泡的发育。所述抑制剂包括例如capsase-4抑制剂Ⅰ，capsase-3抑制剂Ⅰ，capsase-6抑制剂Ⅱ，capsase-9抑制剂Ⅱ和capsase-1抑制剂Ⅰ，其量是能有效抑制细胞凋亡的量，如占培养基重量的0.00001至5.0％；更优选占培养基重量的0.01％至1.0％。因此，可使用上述方法，通过增强胚泡和胚胎随后在组织培养中的发育来提高核转移的效力。
得到所需大小的NT单位之后，用器械从区带(zone)中取出细胞，然后用于产生胚细胞或干细胞样细胞和细胞系。优选通过下列步骤实现此目的，即取出含有NT单位的细胞团，其一般含有至少约50个细胞，洗涤该细胞，将细胞铺于饲养层，如经照射的成纤维细胞上。用于得到干细胞样细胞或细胞集落的细胞一般得自经培养的NT单位的内层绝大部分，其大小优选为至少50个细胞。然而，细胞数目较小或较大的NT单位以及得自NT单位其它部分的细胞也可用于得到ES-样细胞和细胞集落。
将供体细胞DNA在卵母细胞的胞质溶胶中暴露较长时间将有利于去分化的过程。在此方面，通过从重构的胚胎中取出卵裂球并将其与新去核的卵母细胞融合即可实现再克隆。或者，可将供体细胞与去核的卵母细胞融合，4至6小时之后，无需激活，取出染色体并与较年幼的卵母细胞融合，随后再进行激活。
在适当生长培养基，如添加有10％FCS和0.1mmβ-巯基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM中的饲养层中维持细胞。按需要经常更换生长培养基以使生长最优化，如约每隔2至3天更换一次培养基。
这种培养方法可以形成胚细胞或干细胞样细胞或细胞系。对衍生自人细胞/牛卵母细胞的NT胚胎而言，在αMEM培养基中培养约1天多即可观察到集落。然而，随着特定的核供体细胞，特定的卵母细胞和培养条件的不同，培养时间也有所不同。本领域技术人员在必要时可改变培养条件以使特定胚细胞或干细胞样细胞的生长最优化。
所得胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落表现出来的外观与用作核细胞供体之种而不是用作供体卵母细胞之种的胚细胞或干细胞样细胞类似。例如，对于通过将人核供体细胞转移至去核的牛卵母细胞得到的胚细胞或干细胞样细胞而言，细胞现出的形态更类似于小鼠胚胎干细胞而不是牛ES-样细胞。
更具体地说，尚未较详尽地定义人ES-系细胞集落的各个细胞，所述集落的周边可以折射且外表光滑。另外，细胞集落的倍增时间较长，约为小鼠ES细胞的两倍。与衍生自牛和猪的ES细胞不同的是，所述集落不具有上皮细胞样外观。
如上所述，据Thomson在美国专利5,843,780中的报道，灵长类动物干细胞是SSEA-1(-),SSEA-4(+),TRA-1-60(+),TRA-1-81(+)和碱性磷酸酶(+)。希望根据本发明方法产生的人和灵长类动物ES细胞能表现出类似的或相同的标记物表达。
或者，可根据细胞产生所有中胚层，外胚层和内胚层组织的能力证实该细胞确实是人或灵长类动物胚胎干细胞。通过在适当条件下培养本发明产生的ES细胞即可阐明这一点，所述培养条件公开于例如Thomson的美国专利5,843,780(列入本文作为参考)。
所得的胚细胞或干细胞样细胞和细胞系，优选为人胚细胞或干细胞样细胞和细胞系具有多种治疗和诊断应用。最特别的是，所述胚细胞或干细胞样细胞可用于细胞移植疗法。人胚细胞或干细胞样细胞可用于治疗多种疾病。
在此方面，已知小鼠胚胎干(ES)细胞几乎能分化成任何细胞类型，如造血干细胞。因此，本发明产生的人胚细胞或干细胞样细胞应该具有类似的分化能力。可根据已知方法诱导本发明的胚细胞或干细胞样细胞以分化得到所需的细胞类型。例如，通过在分化培养基中并在允许细胞分化的条件下培养本发明的胚细胞或干细胞样细胞，即可诱导其分化产生造血干细胞，肌细胞，心肌细胞，肝细胞，软骨细胞，上皮细胞，尿道细胞等。导致胚胎干细胞分化的培养基和方法是本领域的已知方法，适当的培养条件也是本领域众所周知的。
例如，Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,927530-7537(1995)公开了通过对干细胞进行诱导而由胚细胞系产生造血干细胞，所述诱导法包括起初在缺乏视黄酸的悬浮培养基中培养干细胞聚集体，接着在含有视黄酸的相同培养基中进行培养，然后将细胞聚集体转移至可提供细胞附着的底物中。
另外，Pedersen.J.Reprod.Fertil.Dev.,6543-552(1994)是一篇综述，该文中提到的多篇论文公开了体外分化胚胎干细胞以产生多种分化细胞类型的分化，所述细胞类型包括造血细胞，肌细胞，心肌细胞，神经细胞等。
另外，Bain等，发育生物学，168342-357(1995)公开了体外分化胚胎干细胞以产生具有神经元特性的神经细胞的方法。这些参考文献是已报道的由胚细胞或干细胞样细胞获得分化细胞的方法的例子。这些参考文献，尤其是其中公开的有关分化胚胎于细胞之方法的内容都全文列入本文作为参考。
因此，本领域技术人员使用已知方法和培养基可培养本发明的胚细胞或干细胞样细胞以得到所需的分化细胞类型，如神经细胞，肌细胞，造血细胞等。
另外，使用可诱导的Bcl-2或Bcl-xl对增强特定细胞谱系的体外发育可能是有用的。在体内，Bcl-2可防止淋巴和神经发育过程中的很多(但不是全部的)细胞凋亡型细胞死亡。美国专利5,646,008(列入本文作为参考)中详细讨论了在转染供体细胞之后，如何将Bcl-2的表达用于抑制相关细胞谱系的细胞凋亡。
可使用本发明的胚细胞或干细胞样细胞得到任何所需的分化细胞类型。这种分化的人细胞的治疗用途是无与伦比的。例如，在需要骨髓移植的治疗过程中可使用人造血干细胞。可使用该方法治疗很多种疾病，例如晚期癌症(卵巢癌和白血病)以及危及免疫系统的疾病，如AIDS。通过例如将癌症或AIDS患者的成年体细胞，如上皮细胞或淋巴细胞与去核的卵母细胞，如牛卵母细胞融合，得到上文所述的胚细胞或干细胞样细胞，并在有利于分化的条件下培养该细胞直至获得造血干细胞，籍此可得到造血干细胞。可使用这种造血干细胞治疗包括癌症和AIDS的疾病。
或者，可将神经病患者的成年体细胞与去核的动物卵母细胞，如灵长类动物或牛卵母细胞融合，从中得到人胚细胞或干细胞样细胞，在分化条件下培养该细胞以产生神经细胞系。通过移植这种人神经细胞可以治疗的特定疾病包括例如帕金森氏病，早老性痴呆，ALS和大脑麻痹等。具体到帕金森氏病，已阐明植入的胎儿脑神经细胞可与周围的细胞建立良好的联系并可产生多巴胺，这样就可以长期逆转帕金森氏病的症状。
为了特异性选择分化细胞，可用经由诱导型启动子表达的选择标记转染供体细胞，当诱导分化时即可选择或富集特定的细胞谱系。例如，可使用CD34-neo选择造血干细胞，Pw1-neo选择肌细胞，Mash-1-neo选择交感神经元，Mal-neo选择人大脑皮层灰质的CNS神经元等。
本发明的一大优点是实质上可无限量地供应适于移植的等基因或同基因的人细胞。因此，可以避免目前的移植方法所带来的严重问题，即由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而发生的对移植组织的排斥现象。通常，通过施用诸如环孢菌素的抗排斥药物即可预防或减轻排斥现象。然而，所述药物具有显著有害的副作用，如免疫抑制，致癌特性并且非常昂贵。本发明应该能消除或至少大大降低对抗排斥药物的需求。
等基因细胞疗法可以治疗的其它疾病和病症包括例如脊髓损伤，多发性硬化，肌营养不良，糖尿病，肝病，即高胆固醇血症，心脏病，软骨替换，烧伤，足溃疡，胃肠病，血管病，肾病，泌尿道病和与年龄增大有关的疾病和病症。
本发明产生的人胚细胞或干细胞样细胞可用于产生经基因工程改造的或转基因的人分化细胞。实质上，通过导入所需的一个或多个基因(所述基因可以是异源基因)，或除去本发明产生的人胚细胞或干细胞样细胞的全部或部分内源性基因，使该细胞分化成所需的细胞类型即可达到上述目的。获得这种修饰的优选方法是通过同源重组，因为可使用该技术插入，缺失或修饰干细胞样细胞基因组之一个或多个特定位点处的一个或多个基因。
可使用该方法学取代缺损基因，例如缺损的免疫系统基因，囊性纤维化基因，或导入导致具有治疗作用之蛋白质的表达的基因，所述蛋白质如生长因子，淋巴因子，细胞因子，酶等。例如，可将编码得自脑的生长因子的基因导入人胚细胞或干细胞样细胞，细胞分化成神经细胞，将该细胞植入帕金森氏病患者体内可阻止患病过程中神经细胞的损失。
以前，被BDNF转染的细胞类型从原代细胞到无限增殖细胞系各不相同，可以是得自神经的细胞，也可以不是得自神经的细胞(成肌细胞和成纤维细胞)。例如，可使用逆转录病毒载体用BDNF基因转染星形细胞，并将细胞植入帕金森氏病的大鼠模型中(Yoshi-moto等，脑研究，69125-36(1995))。
这一体内疗法可在转移后32天将大鼠的帕金森氏病-样症状减轻45％。另外，将酪蛋白羟化酶基因置于星形细胞也能得到类似的结果(Lundberg等，Develop.Neurol.,13939-53(1996)和其中提及的参考文献)。
然而，这种体内系统也存在问题。尤其是，目前使用的逆转录病毒载体在体内被下调，转基因仅能瞬时表达(Mulligan，科学，260926-932(1993))。而且，该项研究使用的原代细胞，星形细胞寿命有限，复制缓慢。这些特性对转染速率有不利影响，并阻碍了对稳定转染之细胞的选择。另外，几乎不可能增殖同源重组技术所用的大的基因靶向原代细胞群体。
相反，通过使用人胚细胞或干细胞样细胞应该能消除与逆转录病毒系统相关的问题。本发明的受让人以前已阐明牛和猪的胚细胞系可被转染并选择用于稳定整合异源DNA。该方法也描述于1996年4月1日提交的共同受让的美国流水号08/626,054(全文列入本文作为参考)。因此，使用该方法或其它已知的方法可将所需基因导入本发明的人胚细胞或干细胞样细胞中，细胞分化成所需的细胞类型，如造血细胞，神经细胞，胰腺细胞，软骨细胞等。
可导入本发明的人胚细胞或干细胞样细胞的基因包括例如表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，得自神经胶质的神经营养生长因子，胰岛素-样生长因子(Ⅰ和Ⅱ)，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4/5，睫状神经营养因子，AFT-1，细胞因子基因(白细胞介素，干扰素，集落刺激因子，肿瘤坏死因子(α和β)，等)，编码治疗性的酶，胶原，人血清白蛋白的基因等。
另外，必要时也可以使用本领域目前已知的一个负选择系统以清除患者的治疗性细胞。例如，被胸苷激酶(TK)基因转染的供体细胞可导致产生含有TK基因的胚细胞。这些细胞的分化可导致也表达TK基因的所需治疗性细胞的分离。通过施用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤可在任何时间从患者体内选择性清除治疗性细胞。该负选择系统描述于美国专利5,698,446(列入本文作为参考)。
本发明的胚细胞或干细胞样细胞，优选为人细胞也可用作体外分化模型，尤其是用于研究参与调节早期发育的基因。
使用本发明的胚细胞或干细胞样细胞得到的分化细胞组织和器官也可用于药物研究。
另外，本发明的胚细胞或干细胞样细胞可用作核供体以产生其它胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落。
为了更清楚地描述本发明，特给出下列实施例。
用于人工激活卵母细胞的方法已描述于别处。NT单位激活于28hpm进行。激活方法的简单描述如下将NT单位暴露于添加有1mg/ml BSA的TL-HEPES中的离子霉素(5μM；CalBiochem,La Jolla,CA)达4分钟，然后用添加有30mg/ml BSA的TL-HEPES洗涤5分钟。再将NT单位转移至含有0.2mM DMAP(Sigma)的CRlaa培养基微滴中，于38.5℃，5％CO2中培养4至5小时。洗涤NT单位，然后将其置于含有铺满的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(将在下文描述)的4孔培养板中的CRlaa培养基+10％FCS+6mg/ml BSA中。于38.5℃，5％CO2中将NT单位培养3天以上。每隔3天更换一次培养基直至激活期第12天为止。此时，用器械从带中取出达到所需细胞数目，即约50个细胞数目的NT单位，并用于产生胚细胞系。按上述得到的NT单位的照片示于图1。成纤维细胞饲养层胚胎成纤维细胞的原代培养物得自14至16天龄的胎鼠。无菌取出头，肝脏，心脏和消化道之后，将胚胎铰碎，于37℃在预温的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO,Grand Island,NY)中保温30分钟。将成纤维细胞铺于组织培养瓶中，在添加有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)，青霉素(100IU/ml)和链霉素(50μl/ml)的α-MEM培养基(BioWhittaker,Walkersville,MD)中培养。传代后3至4天，照射35×10Nunc培养皿(Baxter Scientific,McGaw Park,IL)中的胚胎成纤维细胞。于37℃，在含有5％CO2的潮湿空气中培养和维持经照射的成纤维细胞。然后使用具有均一细胞单层的培养板培养胚细胞系。产生胚细胞系洗涤按上述得到的NT单位细胞，将其直接铺于经照射的饲养成纤维细胞上。这些细胞包括NT单位的内层部分。在由添加有10％FCS和0.1mM β巯基乙醇(Sigma)的α MEM组成的生长培养基中维持细胞，每隔2至3天更换一次生长培养基。培养1天多即可观察到最初的集落。集落不断增殖，并表现出与以前公开的小鼠胚胎干(ES)细胞相似的形态。尚未较详尽地定义集落中的各个细胞，所述集落的周边可以折射且外表光滑。另外，细胞集落的倍增时间比小鼠ES细胞的慢。与衍生自牛和猪的ES细胞不同的是，所述集落至今仍不具有上皮细胞样外观。图2至5是按上述得到的ES样细胞集落的照片。产生分化的人细胞将所得的人胚细胞转移至分化培养基中，并进行培养直至得到分化的人细胞类型。结果表1.在NT单位的产生和发育中以人细胞为供体核
将发育成具有大于16细胞的结构的一个NT单位铺于成纤维细胞饲养层上。此结构附着于饲养层，并开始增殖形成具有ES细胞样形态的集落(例见图2)。另外，尽管未尝试使用4至16细胞阶段的结构产生ES细胞集落，但前人已证明此阶段能产生ES或ES样细胞系(小鼠，Eistetter等，Devel.Growth and Differ.,31275-282(1989)；牛，Stice等，1996)。因此，预期4至16细胞阶段的NT单位应该也能产生胚细胞或干细胞样细胞和细胞集落。
通过将成人角质细胞的细胞系与在含有ACM，尿苷，葡萄糖和1000IU LIF的培养基中培养的去核牛卵母细胞融合也可得到相似的结果。在50个重构的胚胎中，有22个被裂解，有1个在约第12天发育成胚泡，将该胚泡铺平，即开始产生ES细胞系。
尽管参照多种特定的材料，方法和实施例描述和阐明了本发明，但应理解本发明并不局限于特定的材料，材料组合和为此选定的方法。多种如此详细的变化是本领域技术人员可以预见和了解的。
权利要求
1．产生胚细胞或干细胞样细胞的方法，所述方法包括下列步骤(ⅰ)在适于形成核转移(NT)单位的条件下，将所需的分化的人或哺乳动物细胞或细胞核插入去核的动物卵母细胞中，其中所述卵母细胞得自与人或哺乳动物细胞不同的动物种；(ⅱ)激活所得的核转移单位；(ⅲ)培养所述经激活的核转移单位直至大于2细胞发育阶段；和(ⅳ)培养得自所述经培养的NT单位的细胞以获得胚细胞或干细胞样细胞。
2．权利要求1的方法，其中插入去核动物卵母细胞的细胞是人细胞。
3．权利要求2的方法，其中所述人细胞是成年细胞。
4．权利要求2的方法，其中所述人细胞是上皮细胞，角质细胞，淋巴细胞或成纤维细胞。
5．权利要求2的方法，其中卵母细胞得自哺乳动物。
6．权利要求5的方法，其中动物卵母细胞得自具爪动物。
7．权利要求6的方法，其中所述具爪动物选自牛，绵羊，猪，马，狗和野牛。
8．权利要求1的方法，其中去核卵母细胞在去核之前已成熟。
9．权利要求1的方法，其中融合的核转移单位在体外被激活。
10．权利要求1的方法，其中在饲养层培养物上培养激活的核转移单位。
11．权利要求10的方法，其中饲养层含有成纤维细胞。
12．权利要求1的方法，其中的步骤(ⅳ)是在饲养细胞层上培养具有16个或更多细胞的NT单位中的细胞。
13．权利要求12的方法，其中所述饲养细胞层含有成纤维细胞。
14．权利要求13的方法，其中所述成纤维细胞含有小鼠胚胎成纤维细胞。
15．权利要求1的方法，其中所得胚细胞或干细胞样细胞经诱导可以分化。
16．权利要求2的方法，其中所得胚细胞或干细胞样细胞经诱导可以分化。
17．权利要求1的方法，其中融合是通过电融合实现的。
18．根据权利要求1的方法得到的胚细胞或干细胞样细胞。
19．根据权利要求2的方法得到的人胚细胞或干细胞样细胞。
20．根据权利要求3的方法得到的人胚细胞或干细胞样细胞。
21．根据权利要求4的方法得到的人胚细胞或干细胞样细胞。
22．根据权利要求6的方法得到的人胚细胞或干细胞样细胞。
23．根据权利要求7的方法得到的人胚细胞或干细胞样细胞。
24．通过权利要求16的方法得到的分化的人细胞。
25．权利要求24的分化的人细胞，其选自神经细胞，造血细胞，胰腺细胞，肌细胞，软骨细胞，尿道细胞，肝细胞，脾细胞，生殖细胞，皮肤细胞，肠细胞和胃细胞。
26．治疗方法，所述方法包括给需要细胞移植疗法的患者施用权利要求24的同基因分化的人细胞。
27．权利要求26的方法，其中实施所述细胞移植疗法可治疗的疾病或病症选自帕金森氏病，杭廷顿氏舞蹈病，早老性痴呆，ALS，脊髓缺陷或损伤，多发性硬化，肌营养不良，囊性纤维化，肝病，糖尿病，心脏病，软骨缺陷或损伤，烧伤，足溃疡，血管病，泌尿道病，AIDS和癌症。
28．权利要求26的方法，其中分化的人细胞是造血细胞或神经细胞。
29．权利要求26的方法，其中的治疗方法可治疗帕金森氏病，分化的细胞是神经细胞。
30．权利要求26的方法，其中的治疗方法可治疗癌症，分化的细胞是造血细胞。
31．权利要求24的分化的人细胞，其含有并表达插入的基因。
32．权利要求1的方法，其中在所述胚细胞或干细胞样细胞中插入，除去或修饰所需基因。
33．权利要求32的方法，其中所需基因编码治疗性的酶，生长因子或细胞因子。
34．权利要求32的方法，其中所述胚细胞或干细胞样细胞是人胚细胞或干细胞样细胞。
35．权利要求32的方法，其中通过同源重组除去，修饰或缺失所需基因。
36．权利要求1的方法，其中对供体细胞进行基因工程改造以破坏内胚层，外胚层和中胚层中的至少一个的发育。
37．权利要求1的方法，其中对供体细胞进行基因修饰以增强分化效力。
38．权利要求36的方法，其中在含有至少一种capsase抑制剂的培养基中培养经培养的核转移单位。
39．权利要求1的方法，其中供体细胞表达能显示出特定细胞周期蛋白表达的可测标记。
40．权利要求36的方法，其中供体细胞经修饰后改变了选自下列的基因的表达SRF,MESP-1,HNF-4,β-1整联蛋白，MSD,GATA-6,GATA-4,RNA解旋酶A和H β58。
41．权利要求37的方法，其中已对所述供体细胞进行基因修饰以导入可提供Q7和/或Q9基因表达的DNA。
42．权利要求41的方法，其中所述基因与可调节的启动子可操作相连。
43．权利要求1的方法，其中供体细胞经基因修饰后可抑制细胞凋亡。
44．权利要求43的方法，其中通过改变选自下列的一个或多个基因的表达可提供减少的细胞凋亡Bad,Bok,BH3,Bik,Blk,Hrk,BNIP3,GimL,Bid,EGL-1,Bcl-XL,Bcl-w,Mcl-1,A1,Nr-13,BHRF-1,LMW5-HL,ORF16,Ks-Bcl-2,E1B-19K和CED-9。
45．权利要求44的方法，其中至少一个所述基因与诱导型启动子可操作相连。
46．哺乳动物体细胞，所述细胞表达编码可测标记的DNA，所述可测标记的表达与特定细胞周期蛋白相连。
47．权利要求46的细胞，其中细胞周期蛋白选自细胞周期蛋白D1,D2,D3,B1,B2,E,A和H。
48．权利要求46的细胞，其中可测标记是荧光多肽。
49．权利要求48的细胞，其中所述哺乳动物细胞选自人，灵长类动物，啮齿类动物，具爪动物，狗和猫细胞。
50．权利要求48的细胞，其中所述细胞是人，牛或灵长类动物的细胞。
全文摘要
本发明提供了改良的核转移方法,所述方法包括将分化的供体细胞核植入与供体细胞不同种的去核卵母细胞中。所得的核转移单位可用于产生同基因的胚胎干细胞,尤其是人同基因的胚细胞或干细胞。这些胚细胞或干细胞样细胞可用于产生所需的分化细胞,并可用于通过同源重组在所述细胞基因组的特定位点处导入,除去或修饰所需基因。可含有异源基因的这些细胞对细胞移植疗法和体外细胞分化研究特别有用。本发明还提供了通过对供体细胞进行基因修饰而抑制细胞凋亡,选择特定的细胞周期和/或增强胚胎生长和发育而改善核转移效力的方法。
文档编号A61K35/12GK1299408SQ9980569
公开日2001年6月13日 申请日期1999年3月2日 优先权日1998年3月2日
发明者J·罗贝尔, J·西柏利, S·L·史蒂斯 申请人:马萨诸塞大学