专利名称：用于预防和/或治疗骨质疏松症和因绝经综合征所致病变的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和/或治疗骨质疏松症和绝经综合征所致病变的组合物。
因此，所述组合物可以采取食品添加剂或有效药物的形式并且发挥作用，这取决于该组合物对其所施用的特定个体的关系是支持或预防作用，或是严格的治疗作用。
更具体地说，本发明涉及一种组合物，该组合物含有组合在一起的(a)丙酰基L-肉碱或其可药用盐，任选地与另一种“肉碱”组合，其中“肉碱”是指L-肉碱或烷酰基L-肉碱，所述烷酰基肉碱选自乙酰基L-肉碱、戊酰基L-肉碱和异戊酰基L-肉碱或它们的可药用盐；和(b)4’,5,7-三羟基异黄酮(染料木黄酮)，其任选地与至少另一种选自4’,7-二羟基异黄酮(大豆黄素)、其7-糖苷(大豆苷)和其4,7-二糖苷的异黄酮组合。
新的组合物可以经口服、非肠道、直肠或透皮给药并且由此特别适用于人体和动物作为食品添加剂或作为有效药物。
众所周知，绝经后综合征的特征有许多表现，包括由热潮红到心血管意外危险性增高的血管作用，以及精神与心理障碍，和骨质疏松症的发生。
在此期间肿瘤的危险性增高。
骨质疏松症是一种在老年对象中流行的疾病，但特别是绝经后妇女最受影响。
事实上，骨质疏松症、心血管意外和肿瘤危险性在绝经后妇女中是最常见的疾病。
用于预防和治疗在此期间伴随的病理异常的治疗途径是多种多样的，包括应用无机物如钙、维生素类如维生素D，或降钙素，但最普及的疗法包括激素替代疗法(HRT)。
事实上，雌激素治疗显然在绝经后疾病中被视作替代疗法用于此类激素的严重不足。
然而，这些激素的应用决不是没有风险。公认与雌激素类化合物的应用有关的是血栓栓塞危险，这些是限制其应用的因素之一。但是，其中最严重的因素是致癌因素。实际上，雌二醇和孕酮，以及二氢睾酮受体业已描述在大肠和乳腺的原发性肿瘤中。人们推断这些受体的激活是上述肿瘤的病理诱因之一。
激素替代疗法(HRT)与一系列副作用有关，不但包括血栓栓塞和致癌危险，而且包括体重增加、头痛、恶心、抑郁，和乳腺肿胀和紧张。
另外被视作禁忌症的表现是存在子宫内膜异位、子宫肌瘤或曾患乳腺和子宫肿瘤，它们经常促使医生放弃此类疗法并寻找其它安全的解决方法。
异黄酮和植物雌激素类化合物可能提供有效的改进。
植物衍生物能够具有雌激素样作用的迹象已表现在发现用苜蓿(Medicago sativa)或白三叶(Trifolium repens)饲养的动物出现生殖能力疾病。这种作用的原因可追踪到在此类植物中存在拟雌内酯(香豆雌酚，coumesterol)，一种结构上与雌二醇类似的物质并且分在植物雌激素类中。
在植物世界中自然存在的结构和功能与17β-雌二醇相似的物质被视作植物雌激素类化合物。此类物质包括多种化合物，例如木脂素类化合物、异黄酮类化合物、香豆素(coumestans)类化合物和二羟基苯甲酸的内酯类化合物。植物雌激素存在多种谷类和豆类中。豆类如大豆特别富含异黄酮类化合物，而木脂素类存在于几乎所有谷类中，并且首先存在于亚麻子油中。
植物雌激素可以衍生自存在于饮食中、在胃或肠内经细菌改性的前体。
木脂素类化合物的细菌改性的主要衍生物是肠二醇和肠内酯。而经细菌除去糖苷部分后得到的主要异黄酮类衍生物是染料木黄酮、大豆黄素和牛尿酚。
多数这些植物雌激素类化合物已在人体血浆和唾液中，以及前列腺液和乳房囊肿抽出物中确定。
虽然比雌二醇的差，但所有植物雌激素类化合物具有雌激素样活性。
流行病学研究业已证实，在消费含有大量异黄酮类化合物的饮食的人群中乳腺、卵巢和大肠肿瘤的发生率比那些消费少量此类物质的人群的低。
在这方面，亚洲人群和西方人群之间存在明显差异。
预后(例如乳腺肿瘤的预后)在亚洲人群如日本人中也好于那些美国或英国的人群。
此外，体外研究已证实了植物雌激素类化合物的抗增殖活性，如在乳腺肿瘤细胞系中评估。
同样地，在骨质疏松症的情况中，已经发现这种疾病发生率的增高与雌激素缺乏有关，在采用富含异黄酮类化合物的饮食的亚洲人群中该发生率低于西方人群。
目前推断，植物雌激素类化合物在雌激素受体水平可以根据不同的组织表现不同，如同合成雌激素类化合物(如他莫昔芬或4-羟基他莫昔芬)那样的情况(它们在乳腺组织的雌激素受体水平起拮抗剂作用，而在血管和骨骼组织的水平起部分激动剂的作用)。
对于染料木黄酮(4’,5,7-三羟基异黄酮)，我们还应考虑其它作用机理，例如抑制膜ATP酶和抑制酪氨酸激酶和拓扑异构酶Ⅱ。
另外有报导称，染料木黄酮对于骨骼代谢具有直接代谢作用，其在体外股骨干骺端组织的培养物中能够抑制骨骼再摄取。染料木黄酮还可以保护内皮细胞抵抗致动脉粥样化危险并且预防或抑制肿瘤恶化。然而，一般不但通过摄取染料木黄酮而且通过摄取大豆提取物可降低肿瘤危险。
在多种异黄酮类化合物中，染料木黄酮和大豆黄素可能是表现出与雌激素受体最紧密相互反应的化合物。
这些性质使植物雌激素类化合物成为替代雌二醇的适当候选物，不存在后者的任何副作用并且适于实际上无条件的摄取，如在那些其饮食含有大量蔬菜和豆类的人群中那样。
肉碱类化合物的代谢作用为人们所熟知。L-肉碱、乙酰基L-肉碱、丙酰基L-肉碱和异戊酰基L-肉碱实际上在线粒体水平和脂肪酸的β-氧化水平都存在相同的活性，虽然根据其动力学和所作用的组织有所不同。
肉碱类化合物还表现出重要的抗氧化作用，由此提供保护磷脂细胞膜抵抗脂质过氧化作用以及抗心肌和内皮细胞水平诱发的氧化应激的保护作用。
还证明肉碱类化合物在碳水化合物代谢中起作用。在衰老的过程中，组织肉碱浓度减少，由此不同组织的代谢可能性减小。特别不利于组织如需要连续再建的骨骼组织以及部分成骨细胞为维持骨质的代谢机能能力。
令人惊奇的是，现发现一种联合组合物，其中含有作为特征组分的(a)丙酰基L-肉碱或一种其可药用盐；和(b)4’,5,7-三羟基异黄酮(染料木黄酮)；该组合物在预防和/或治疗骨质疏松症和绝经后综合征中极其有效，这归因于其组分的有效协同作用。
另外发现，组分(a)适宜进一步含有另一种“肉碱”，其选自L-肉碱、乙酰基L-肉碱、戊酰基L-肉碱和异戊酰基L-肉碱，或它们的可药用盐或其混合物，并且组分(b)还可以含有选自4’,7-二羟基异黄酮(大豆黄素)、其7-糖苷(大豆苷)和其4,7-二糖苷的异黄酮或其混合物。
组分(a)和组分(b)的重量比例可以是0.01至1∶1。在组合物中，组分(b)可以以含有其的植物产物(如大豆种子或亚麻子)的提取物形式存在。
下文中描述了多个试验，它们证实了本发明组合物的低毒性和良好耐受性以及其组分产生的强协同作用。
毒理学试验单剂量和长效施用肉碱混合物(L-肉碱+乙酰基L-肉碱+丙酰基L-肉碱+异戊酰基L-肉碱，不同肉碱之间以重量与重量比例1∶1混合)，或丙酰基L-肉碱，或大豆异黄酮类的混合物，或染料木黄酮，目的是评估本发明组合物的急性和慢性毒性，证实产物无论单独给药或联合给药时毒性低且耐受性良好。
对于单剂量给药方案，证明可以给大鼠和小鼠施用600mg/kg的肉碱混合物，或单独600mg/kg的丙酰基L-肉碱，或5g/kg含5％异黄酮类化合物的大豆提取物，或15mg/kg的染料木黄酮，或这些产物的不同组合物，在由此处理的动物中没有出现任何致死和中毒迹象。大鼠同样可以很好耐受30天长期连续施用的2g/kg含5％异黄酮类化合物的大豆提取物和200mg/kg肉碱混合物或采用150mg/kg丙酰基L-肉碱给药，以及5mg/kg染料木黄酮与肉碱混合物或与丙酰基L-肉碱在相同时间内联合给药。在这些试验中，在处理第30天结束时，在不同的血液化学试验中或在血液红细胞和白细胞计数中没有发现异常的毒性。对主要器官的组织学试验也没有发现任何明显的异常。
对骨钙蛋白浓度变化的评估骨钙蛋白的血浆水平和骨组织成骨细胞活性的变化之间存在密切关系，骨钙蛋白血浆浓度降低是成骨细胞活性提高的指征，这可能是老年对象中或绝经期妇女中骨质疏松的基础。这些试验是在一批至少7月龄的小鼠上进行，将它们分为不同的组，每组10只小鼠。
一组用作对照组，其它动物组在给予饲料的同时施用肉碱混合物(100mg/kg)，这些试验如同其它试验一样该肉碱混合物是由L-肉碱+乙酰基L-肉碱+丙酰基L-肉碱+异戊酰基L-肉碱以不同肉碱之间的重量与重量比例为1∶1混合，或施用丙酰基L-肉碱(100mg/kg)，或含5％异黄酮类的大豆提取物(2g/kg)，或染料木黄酮(5mg/kg)，或这些组分的不同混合物。连续每天给药处理共30天或60天。按照Grunhaberg所述方法(grunhaberg等人，酶学方法(Meth.Enzymology),207,516,1984)进行血清骨钙蛋白试验，由对照动物和处理动物的眼眶区采集血样。
由表1的结果可以看出，肉碱混合物，或丙酰基L-肉碱，或大豆提取物，或染料木黄酮的给药能够提高被处理动物的血清骨钙蛋白浓度，而在对照动物中血清骨钙蛋白水平趋于随年龄而降低。但令人惊奇的是，在联合给予肉碱混合物和大豆提取物后，以及在给予丙酰基L-肉碱和染料木黄酮的组合物后，可观察到骨钙蛋白水平最大程度的提高。
骨钙蛋白浓度的提高在连续处理60天小鼠中更加明显，而处理60天的对照动物显示出更明显的与年龄有关的骨钙蛋白水平降低。
因此，这些试验的结果证明，在所用肉碱类化合物和异黄酮类化合物之间，和特别是丙酰基L-肉碱和染料木黄酮之间确实存在可检测到的有效协同作用。组合物的这种协同作用似乎是由本发明组合物中单一组分所得效应所不可预知的和意料之外的。
前列环素合成试验前列环素(PGI2)是在环加氧酶的作用下在脂肪酸如花生四烯酸的水平上形成的一种产物，与(PG)E2或白三烯如(LT)C1不同的是，该化合物不具有前列腺素类的炎性、血管痉挛、破骨细胞或血栓形成类活性，但具有极其适当的细胞保护、血管舒张和成骨细胞活性，并且其形成与COX1而不是与COX2活性有关。
这些试验的目的是建立给大鼠施用的肉碱化合物(L-肉碱+乙酰基L-肉碱+丙酰基L-肉碱+异戊酰基L-肉碱，不同肉碱之间以重量重量比例1∶1混合)，或大豆提取物，或染料木黄酮，或丙酰基L-肉碱，或这些产物的多种混合物，这可能导致前列环素(PGI2)生成的增高。业已证实，事实上，前列腺素类化合物，和特别是前列环素可以调节胰岛素样生长因子(IGF-1)的产生并由此影响软骨细胞代谢。
此外，众所周知，IGF-1和生长激素间存在密切的关系，并且业已证实后者在其对生长的其他正面作用中它可在骨骼改造和在成骨细胞活性中起重要作用。前列腺素类化合物还可以调节若干其他激素作用，包括雌激素的那些作用。
这些试验中采用的方法是由G.R.Elliot在英国营养学杂志64,497,1990中所述方法，用于测定自一批大鼠分离出的腹膜巨噬细胞的前列腺素类的释放作用，这批大鼠与其饲料一起连续7天施用肉碱混合物，或大豆提取物，或丙酰基L-肉碱，或染料木黄酮，或这些产物的不同组合物。所给剂量是400mg/kg的肉碱混合物，或，400mg/kg的丙酰基L-肉碱，或8g/kg的大豆提取物，或40mg/kg的染料木黄酮，或相同剂量的不同组合产物。在处理的第一天，用含有2mg角叉菜胶的2cm2溶液腹膜内处理所有动物。最后一天的处理后，由对照和处理动物分离出腹膜巨噬细胞，由此获得2×10-6/cm3细胞混悬液。
将1cm3由此制备的巨噬细胞制备物孵育2小时，用以评价基底释放或在与离子载体如A2318接触30分钟后的释放。将细胞离心，按照Zijstra等人(Zijstra,F.J.,Vincent,J.E.色谱学杂志，311,39,1984)所述方法测定上清液中PGI2的含量。
由表2所示结果可以看出，肉碱混合物和丙酰基L-肉碱的给药导致处理大鼠巨噬细胞中的PGI2合成增高，而在用大豆提取物或用染料木黄酮处理的大鼠中仅有中度增高。然而，在用肉碱类加大豆提取物的混合物，或用丙酰基L-肉碱加大豆提取物或染料木黄酮的混合物处理的大鼠中PGI2合成被很大程度地增高。
用这些组合物处理动物的巨噬细胞的前列环素释放的增高显示出显著的有效协同作用。
成骨细胞生长试验鉴于成骨细胞在调节生长和在骨骼改造中发挥的重要作用，进行一系列试验来评价肉碱类或异黄酮类物质和染料木黄酮的存在是否可影响体外成骨细胞的生长。至此，小鼠成骨细胞(MC3T3成骨细胞样细胞)在接受胰蛋白酶作用并且置于富含热灭活2％胎牛血清的介质中后，在平板(各孔含有约10000个细胞)上生长，所述平板中存在或不存在肉碱混合物(L-肉碱+乙酰基L-肉碱+丙酰基L-肉碱+异戊酰基L-肉碱以重量重量比1∶1的混合物)，或丙酰基L-肉碱，或异黄酮类化合物，或染料木黄酮，在适当溶解得到肉碱浓度为0.05mM至异黄酮类化合物或染料木黄酮浓度为0.005M后将它们加入培养基中。温育72小时后，用比色法通过二甲基噻唑-二苯基四唑的还原按照Riancho所述技术(Riancho,J.A.,骨矿物质研究杂志(J.BoneMineer.Res.)10,439,1995)对细胞的数量进行计数。结果如表3所示。
由这些试验所得结果可以看出，与对照相比，肉碱混合物和丙酰基L-肉碱对用它们培育的细胞的生长具有中度影响，异黄酮类化合物或染料木黄酮对细胞的正常生长速率无影响。
异黄酮类或染料木黄酮与肉碱混合物或与丙酰基L-肉碱的组合物明显加快了成骨细胞的生长，其程度远远大于单独使用肉碱类化合物。
在这些试验中，肉碱类化合物和大豆提取物或染料木黄酮之间可以产生显著的、出乎意料的协同作用。
表1用100mg/kg肉碱混合物(L-肉碱25mg+酰基L-肉碱25mg+丙酰基L-肉碱25mg+异戊酰基L-肉碱25mg)，或用100mg/kg丙酰基L-肉碱，或用100mg/kg含5％异黄酮类化合物的大豆提取物，或用100mg/kg染料木黄酮，或用这些产物的不同组合物处理的小鼠中骨钙蛋白的血清浓度骨钙蛋白(ng/ml)处理时间处理30 60天对照 120.4±8.690.5±7.9肉碱混合物 136.2±9.5109.4±8.7丙酰基L-肉碱 130.7±10.1 98.5±8.1大豆提取物 139.4±11.6 112.7±9.4染料木黄酮 135.9±10.2 100.1±10.2肉碱混合物+大豆提取物295.6±19.8250.5±20.3肉碱混合物+染料木黄酮285±20.1 245.9±19.8丙酰基L-肉碱+染料木黄酮 289±20.9 258.1±20.6表2评价肉碱混合物、丙酰基L-肉碱、大豆提取物或染料木黄酮，或这些产物的不同组合物的给药对大鼠腹膜巨噬细胞中前列环素合成的作用与对照相比的巨噬细胞PGI2释放值处理(ng/2×10-6细胞)对照 0.25±0.03肉碱混合物2.7±0.15丙酰基L-肉碱 3.0±0.22大豆提取物0.35±0.15染料木黄酮0.39±0.27肉碱混合物+大豆提取物 4.7±0.31肉碱混合物+染料木黄酮 4.8±0.51丙酰基L-肉碱+大豆提取物 7.2±0.45丙酰基L-肉碱+染料木黄酮 6.6±0.55表3肉碱混合物、丙酰基L-肉碱、大豆提取物或染料木黄酮单独或不同的组合物对MC3T3成骨细胞样细胞的作用处理与对照相比的百分生长值肉碱混合物+15±0.9丙酰基L-肉碱 +18±1.2大豆提取物-8±0.5染料木黄酮+5±1.5肉碱混合物+大豆提取物 +26±2.5肉碱混合物+染料木黄酮 +28±3.3丙酰基L-肉碱+大豆提取物+25±6.0丙酰基L-肉碱+染料木黄酮+31±4.0本发明的配方的举例性的、非限定实例如下所述1) 肉碱混合物 500mg(L-肉碱125mg+乙酰基L-肉碱125mg+丙酰基L-肉碱125mg+异戊酰基L-肉碱125mg)大豆提取物(标示5％异黄酮) 500mg2) 肉碱混合物200mg(L-肉碱50mg+乙酰基L-肉碱50mg+丙酰基L-肉碱50mg+异戊酰基L-肉碱50mg)大豆提取物(标示5％异黄酮) 200mg3) 丙酰基L-肉碱 500mg大豆提取物(标示5％异黄酮) 500mg4) 丙酰基L-肉碱 200mg大豆提取物(标示5％异黄酮) 200mg5) 肉碱混合物500mg(L-肉碱125mg+乙酰基L-肉碱125mg+丙酰基L-肉碱125mg+异戊酰基L-肉碱L25mg)染料木黄酮25mg6) 肉碱混合物 200mg
(L-肉碱50mg+乙酰基L-肉碱50mg+丙酰基L-肉碱50mg+异戊酰基L-肉碱50mg)染料木黄酮 10mg7) 丙酰基L-肉碱 500mg染料木黄酮 10mg8) 丙酰基L-肉碱 200mg染料木黄酮 10mg9) 肉碱混合物 200mg(L-肉碱50mg+乙酰基L-肉碱50mg+丙酰基L-肉碱50mg+异戊酰基L-肉碱50mg)大豆种子提取物(标示5％异黄酮)200mg亚麻子的异黄酮提取物 50mg维生素D 5mg钙 50mg维生素E 20mgCoQ 10 10mg铬 5mg锌 5mg镁 5mg甲硫氨酸硒 0.1mg吡哆醇 20mg维生素C 50mg10)丙酰基L-肉碱 250mg(L-肉碱75mg+乙酰基L-肉碱75mg+丙酰基L-肉碱75mg+异戊酰基L-肉碱75mg)
大豆种子提取物(标示5％异黄酮) 250mg二十碳五烯酸 50mg二十二碳六烯 25mg亚麻子的异黄酮提取物 50mg白藜芦醇 2mg维生素D5mg钙 50mg维生素E10mgCoQ 10 10mg5mg锌 5mg镁 5mg甲硫氨酸硒 0.1mg吡哆醇 50mg维生素C50mgL-肉碱或烷酰基L-肉碱的可药用盐的含义是这些活性成分与不产生有害毒性或副作用的酸形成的任何盐。这些酸为制药专业人员熟知。
适用盐的非限定实例如下氯化物；溴化物；碘化物；天门冬氨酸盐，酸式天门冬氨酸盐；柠檬酸盐，酸式柠檬酸盐；酒石酸盐；磷酸盐，酸式磷酸盐；富马酸盐，酸式富马酸盐；甘油磷酸盐；葡糖磷酸盐；乳酸盐；马来酸盐，酸式马来酸盐；乳清酸盐；草酸盐，酸式草酸盐；硫酸盐，酸式硫酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐和甲磺酸盐。
FDA许可的可药用盐的目录列于国际药理学杂志(Int.J.ofPharm.)33,(1986),201-217中；后者在此引入作为参考。
本发明的组合物还可以含有维生素类、辅酶类、无机物和抗氧剂。
用于制备适于特定给药途径的组合物的适当赋形剂对于药学和食品工业的专业人员而言是显而易见的。
权利要求
1．一种组合物，它组合地包括(a)丙酰基L-肉碱或其可药用盐；和(b)4’,5,7-三羟基异黄酮(染料木黄酮)。
2．权利要求1的组合物，其中组分(a)进一步含有选自L-肉碱、乙酰基L-肉碱、戊酰基L-肉碱、异戊酰基L-肉碱或其可药用盐或其混合物的“肉碱”。
3．权利要求1或2的组合物，其中组分(b)进一步含有选自4’,7-二羟基异黄酮(大豆黄素)、其7-糖苷(大豆苷)和其4,7-二糖苷或其混合物的异黄酮。
4．权利要求1-3的组合物，其中(a)∶(b)的重量比例是1∶0.01至1∶1。
5．上述权利要求任一项所述的组合物，其中组分(b)是以含有组分本身的植物提取物的形式。
6．权利要求5的组合物，其中该植物提取物包括大豆种子或亚麻子。
7．上述权利要求任一项所述的组合物，其中L-肉碱或烷酰基L-肉碱的可药用盐选自氯化物；溴化物；碘化物；天门冬氨酸盐，酸式天门冬氨酸盐；柠檬酸盐，酸式柠檬酸盐；酒石酸盐；磷酸盐，酸式磷酸盐；富马酸盐，酸式富马酸盐；甘油磷酸盐；葡糖磷酸盐；乳酸盐；马来酸盐，酸式马来酸盐；乳清酸盐；酸式草酸盐；硫酸盐，酸式硫酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐和甲磺酸盐。
8．上述权利要求任一项的组合物，其中进一步含有维生素类物质、辅酶类物质、无机物和抗氧剂。
9．上述权利要求任一项的组合物，以食品添加剂的形式口服施用。
10．上述权利要求任一项的组合物，以药物的形式经口服、非肠道、直肠或经皮施用。
11．权利要求9的食品添加剂，用于预防骨质疏松症和绝经综合征。
12．权利要求10的药物，用于治疗骨质疏松症和绝经综合征。
13．权利要求9或11的食品添加剂，其制备为固体、半固体或液体形式。
14．权利要求10或12的药物，其制备为固体、半固体或液体形式。
15．权利要求13的食品添加剂，其是丸剂、片剂、胶囊、颗粒剂或糖浆剂形式。
16．权利要求14的药物，其是丸剂、片剂、胶囊、颗粒剂、糖浆剂、瓶装剂或滴剂。
全文摘要
本发明公开了一种可以采取食品添加剂或有效药物的形式的组合物,该组合物含有丙酰基L－肉碱和异黄酮染料木黄酮作为特征活性成分,用于预防和/或治疗骨质疏松症和绝经综合征。
文档编号A61K36/18GK1306434SQ99807767
公开日2001年8月1日 申请日期1999年6月17日 优先权日1998年6月23日
发明者C·卡瓦扎 申请人:希格马托保健科学股份公司