专利名称：三环类抗抑郁剂在局部止痛方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗组合物及其使用方法。在一个特定方面，本发明涉及用于缓解疼痛的组合物及其使用方法。
背景技术：
神经病性疼痛是一种损伤后能持续数月、数年或几十年的慢性疼痛，并且是由于周围神经、神经根、脊髓或一些脑区域受损伤所致。其与感受伤害性疼痛在持续时间、特征、发生机制、和治疗方面有所不同(Bennett G.J.(1994a)在Textbook of Pain(Ed.Wall PD，Melzack R)Churchill Livingstone，London 3rd edn，201)。神经病性疼痛可包括自发性疼痛(例如烧伤、割伤、刺痛)、激发性疼痛(例如由非感受伤害性传入神经的刺激所致的异常性疼痛、和由非感受伤害性传入神经的刺激所致的痛觉过敏)和阵发性疼痛(例如源自触发点的阵发性疼痛，表现为剧烈而突然的、刀刺般的、休克样疼痛)(Bennett G.J.(1994a)在Textbook of Pain(Ed.Wall P.D.，Melzack R)Churchill Livingstone，London 3rd edn，201)。神经病性疼痛可伴有感受伤害性疼痛，并且为了最好地缓解疼痛，可能需要复合治疗措施(Portenoy R.K.(1991)在Towards a NewPharmacology of Pain(Ed.Basbaum A.I.，Besson J.M.)John Wiley& Sons Ltd，New York，393；Devor M.等人(1991)在Towards a NewPharmacology of Pain(Ed.Basbaum A.I.，Besson J.M.)John Wiley& Sons，New York，417)。神经病综合征通常是依据导致它们的疾病或病理事件分类的(例如带状疱疹后发生的带状疱疹后神经痛、主干神经部分损伤后发生的灼痛、丘脑梗塞后发生的中枢性疼痛)(Portenoy R.K.(1991)在Towards a New Pharmacology of Pain(Ed.Basbaum A.I.，Besson J.M.)JohnWiley & Sons Ltd，New York，393；Merskey H.，Bogaduk N.(1994)在《慢性疼痛分类，慢性疼痛综合征的描述和疼痛术语的定义》，2nd edn.，IASP Press，Seattle，第40页)。前段时间人们已经认识到在这些病症中涉及交感神经系统。涉及交感神经的疼痛综合征被认为是交感维持性疼痛(反映交感营养不良、灼痛)(Bonica J.J(1990)在The Management of Pain(Ed.Bonica J.J.)Lea & Fibiger，Philadelphia 2nd edn.，220；Blumeberg H.，Janig W.(1994)在Textbook of Pain(Ed.Wall P.D.，Melzack R。)Churchill Livingstone，London 3rd edn，685)。
在临床上神经病性疼痛特别难以治疗。使用类阿片引起了很多争议，所发布的论点是，与感受伤害性疼痛相比，神经病性疼痛相对难治，而为了达到部分效果，就需要较高剂量，这会使副作用发生率提高，并且长期使用类阿片让人担心会产生有害作用(Arner S.，Meyerson B.A.(1988)Pain 2211；Kuypers H.，Konig H.，Adriaenson H.，Gybels J.M.(1991)Pain 475；Portenoy R.K.FoleyK.M.Inturrisi C.E.(1990)Pain 43273；Portenoy R.K.(1994)在Progress in Pain Research and Management(Ed.Fields H.L.，Liebskind J.C.)IASP Press，Seattle，247)。目前治疗神经病性疼痛所使用的主要治疗剂包括系统递送的抗抑郁剂、抗惊厥剂、局麻剂、和专用治疗剂例如肌肉松弛剂、以及抗交感药物(Portenoy R.K.(1991)在Towards a New Pharmacology of Pain(Ed.Basbaum A.I.，Besson J.M.)JohnWiley & Sons Ltd，New York，393；Portenoy R.K.(1993)Drug Therapy 2341；Max M.B.(1994)在Progress in PainResearch and Management(Ed.Fields H.L.，Liebskind J.C.)IASPPress，Seattle，229)。然而，这些治疗有很多仅表现出有限的有效性(很少能达到完全的疼痛缓解)，并且致虚弱副作用的发生率很高(Portenoy R.K.(1993)Drug Therapy 2341；Bennett G.J.(1994a)在Textbook of Pain(Ed.Wall P.D.，Melzack R.)ChurchillLivingstone，London 3edn，201；Mac Farlane等人(1997)Pharmacol.Ther.751)。
神经损伤可导致周围和中枢神经系统变化，这些变化导致神经病性疼痛的特征表现。对于周围神经系统，可能涉及下述机制(Devor M等人(1991)在Towards a New Pharmacology of Pain(Ed.BasbaumA.I.，Besson J.M.)JohnWiley & Sons，New York，417；Devor M.(1994)在Textbook of Pain(Ed.Wall P.D.，Melzack R.)ChurchillLivingstone，London 3edn，79；Blumeberg H.，Janig W.(1994)在Textbook of Pain(Ed.Wall P.D.，Melzack R.)ChurchillLivingstone，London 3edn，685)。(1)损伤后，静止的伤害感受器通常变得敏感，并获得进行性自发活性、激活阈降低、以及对阈上刺激的反应增强。(2)在损伤位点、再生和神经瘤形成位点、或在脊神经节内可能发生异位排放。(3)损伤后，交感神经传入可能刺激感觉神经末梢、再生性神经生长、神经瘤和脊神经节细胞。神经病性疼痛涉及的中枢机制如下(Coderre等人，(1993)Pain 52259；Bennett(1994)在Textbook of Pain(P.D.Wall等人编写，Lond，3rd edn.，201)；Woulff和Doubell(1944)Curr.Opin.Neurobiol.4525)(1)脊髓内的传递神经元对兴奋性氨基酸(EAAs)和P物质(SP)的刺激的敏感性增强。这种情况导致异常性疼痛(Aβ纤维激活后)和痛觉过敏(Aδ和C纤维激活后)。(2)对投射蛋白的抑制性输入的损失所致的抑制解除，和对大直径传入神经激活的异常反应模式。(3)使投射到内部并与浅处板突触连接的深处板衰弱的有髓传入神经。这可能是产生异常性疼痛的机制。
为了给了解神经损伤后发生的神经病性变化提供基础，和提供用于测试新治疗手段的模型系统，已经开发出了多种神经病性疼痛模型(Bennett G.J.(1994b)在Progress in Pain Research andManagement Vol2(Ed.Gebhart C.F.，Hammond D.L.，Jensen T.S.)IASP Press，Seattle，495)。最佳特征确定模型是新近开发出的多种神经损伤模型(由于坐骨神经松散结扎所致的慢性狭窄性损伤，Bennett G.J.，Xie Y.K.(1988)Pain 3387；由于将一部分坐骨神经紧紧结扎所致的部分坐骨神经结扎(Seltzer等人(1990)Pain43205)；将两条坐骨神经紧紧结扎(Kim S.H.，Chung J.M.(1992)Pain 50355))。这些模型系统展现出神经病性疼痛的不同表现(例如自发性疼痛行为的表现程度、机械或热异常性疼痛、机械或热痛觉过敏)和涉及交感神经的程度(Neil A.，等人(1991)Brain Res 565237；Shir Y.，Seltzer Z.(1991)Pain 45309；Kim S.H.，Na H.S.，SheenKi，Chung J.M.(1993)Pain 5585；Kim K.J.，Yoon Y.W.，Chung J.M.(1997)Exp Brain Res 113200)。与部分坐骨神经结扎或慢性狭窄性损伤模型相比，脊神经结扎(SNL)模型展现出更高程度的激发性疼痛(机械异常性疼痛)和交感卷入(在该参数中)，而慢性狭窄性损伤模型展现出更高程度的自发性疼痛。然而应当认识到，这些特征可能是相对的，并且可能随时间而改变(即在动物模型和临床神经病性疼痛中，交感依赖性可能会随时间而改变，Staton-Hicks M，等人(1995)Pain 63127)。
系统施用抗抑郁剂给神经病性和慢性疼痛提供了另一疗法。为了找到系统施用抗抑郁剂的精确机制，已经考虑了与生物体所产生的胺、内源性类阿片、兴奋性氨基酸受体、P物质以及钙和钠通道的相互作用(Eschalier A.等人(1994)CNS Drugs 2261)。弄清楚的是，抗抑郁剂既可作用于脊椎上面位点(Spiegel，K.等人，Ann.Neurol.13(1983)462-465，Eschalier A.等人(1994)CNS Drugs 2261)也可作用于脊椎位点(Hwang，A.S.和Wilcox，G.L.，Pain 28(1987)343-355；Iwashita，T.和Shimizu，T.，Brain Research 581(1992)59-66；Eisenachand J.和Gebhart G.F.，Anesthesiology 83(1995)1046-1054)。
该止痛作用不依赖于抗抑郁作用，因为其是在非抑郁个体中产生的，并且在抑郁个体中是以不依赖于情绪改变的方式发生的(Magni G.(1991)Drugs 42730；Onghena P.和Van Houdenhove B(1992)Pain49205；Max M.B.(1994)在Progress in Pain Research andManagement Vol2(Ed.Fields H.L.，Liebskind J.C.)IASP Press，Seattle，229，McQuay H.J.，Tramer M.，Nye B.A.，Carroll D.，Wiffen P.J.，Moore R.A.(1996)Pain 68217)。既阻断去甲肾上腺素(NA)摄取又阻断5-羟色胺(5-HT)摄取的活性剂例如阿米替林、或阻断NA摄取但不阻断5-HT摄取的活性剂例如去郁敏比对5-HT有选择性的活性剂例如氟西汀更有效(Max M.B.(1994)在Progress in PainResearch and Management Vol2(Ed.Fields H.L.，Liebskind J.C.)IASP Press，Seattle，229)。据报道在治疗一周内有明显的疼痛缓解(McQuay H.J.，Carroll D.，Glynn C.J.，(1992)Anaesthesia47646)。该时间过程与达到稳定血浆水平所需的时间相一致(在人中t1/2为17-36小时，Ziegler V.E.，Biggs J.T.，Aardekani A.B.，Rosen S.H.(1978)J Clin Pharmacol 18462)。与之相反，这些化合物的抗抑郁活性需要4-6周才变得明显(Potter W.Z.，Rudorfer M.，Manji H.(1991)New Eng J Med 325633)。在活性药物、时间过程、以及独立表现方面的不同意味着疼痛缓解和抑郁缓和的机制不同。
在动物实验中，在多种非感受伤害性疼痛实验中，系统和脊柱施用抗抑郁剂都表现出固有效力，并增强了类阿片产生的镇痛作用(Eschalier A，Mestre C，Dubray C，Ardid D(1994)CNS Drugs2261)。然而，这种特性可变化，并且在一些病例中观察到了抑制吗啡活性的作用(上文所述Eschalier等人的综述)。有人报道采用组织方法分析(例如测试范例、刺激强度、剂量、急性和慢性施用方案)来解释这些不同(Kellstein D.E.，Malseed R.T.，Goldstein F.J.(1984)Pain 60275；Kellstein D.E.，Malseed R.T.，Ossipov M.H.，Goldstein F.J.(1988)Neuropharmacology 271；Fialip J.，MartyH.，Makambila M.C.，CiViate M.A.，Eschalier A.(1989)JPharmacol Exp Ther 248747)。在包括神经处理(Seltzer Z.，TalM.，Sherav Y.(1989)Pain 37245)、单神经病(Ardid D，GilbaudG(1992)Pain 49279)和糖尿病性神经病模型(C.Courteix等人(1994)Pain 57153-160)的多种神经病性疼痛测试中，系统施用抗抑郁剂也表现出了固有活性。有人试验了慢性和急性施用方案(Ardid D，Gilbaud G(1992)Pain 49279)，观察到似乎是累积剂量而不是定性差异可解释采用慢性施用方式的活性。
发明简述依据本发明，已经发现局部施用三环类、第二代或第三代抗抑郁剂能产生局部抗感受伤害性作用、尤其是抗炎性和神经病性疼痛。当对炎性(福尔马林试验)和神经病性疼痛(脊髓神经结扎)动物模型局部施用阿米替林—一种非选择性去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂与去郁敏—一种选择性NA再摄取抑制剂时，可产生局部抗感受伤害性作用。
因此，一方面，本发明提供了在惰性载体中含有治疗有效量三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的组合物。所述组合物优选配制成局部施用剂型，例如在盐水溶液中配制，或配制成霜剂、凝胶剂、软膏剂、或喷雾剂。
局部施用制剂的优点是，与系统施用抗抑郁剂相比，可在感觉神经末梢区域获得更高和更有效浓度的抗抑郁剂。此外，局部施用能大大减轻系统施用三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的副作用。
另一方面，本发明提供了在具有局部不适位点、例如由炎症或神经病性病症引起的不适的个体中产生局部止痛作用的方法。在本发明方法中，是通过将有效量的三环类、第二代或第三代抗抑郁剂局部施用到不适位点，例如通过注射、超声波粉末注射、透皮电穿孔、局部涂敷、或包封在缓释载体中来施用到不适位点而获得局部止痛效果的。
附图简要说明附
图1是表示在进行过神经结扎的大鼠的同侧和对侧爪子中、阈疼痛反应在22天期间的差异的图。该附图后面的一行棒形图表示的是神经结扎大鼠的静电机械异常性疼痛50％收回阈(克)，该附图前面的一行棒形图表示的是脊髓神经结扎后在连续各天的热痛觉过敏(秒)。值是指组平均值(n＝6/组)。
附图2A-C是表示在神经结扎大鼠的同侧爪子中不同剂量的系统施用的阿米替林(AMI)对热痛觉过敏的影响(附图2A)、和在对侧爪子中的热收回阈(附图2B)的时间过程的一系列图，其中●＝盐水对照；■＝1mg/kg AMIT；▲＝3mg/kg AMI，且＝10mg/kg AMI。附图2C表示的是，对于同侧(ipsi)和对侧(contra)爪子、最大可能作用随时间的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照，具有右倾斜线的棒形图代表1mg/kg AMIT，具有左倾斜线的棒形图代表3mg/kgAMI，具有交叉线的棒形图代表10mg/kg AMI。值代表MPE±s.e.m.(对于1和3mg/kg，n＝5，对于10mg/kg，n＝15)。与盐水对照相比，*＝P＜.05。
附图3A-C是表示在同侧爪子中脊椎施用的阿米替林(60μg)对热痛觉过敏的影响(附图3A)、和在对侧爪子中的热收回阈(附图3B)的时间过程的一系列图，其中●＝盐水对照；■＝60μg AMIT。附图3C表示的是，对于同侧(ipsi)和对侧(contra)爪子、MPE随时间的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照，具有右倾斜线的棒形图代表100nmol AMI(ipsi)，具有左倾斜线的棒形图代表100nmolAMI(contra)。值代表MPE±s.e.m.(对于这两组n＝6)。与盐水对照相比，*＝P＜.05。
附图4A-C是表示局部注射100nmol阿米替林对痛觉过敏的影响的时间过程的一系列图。附图4A表示的是，当把该抗抑郁剂注射到神经损伤爪子(ipsi)和未损伤爪子(contra)内时同侧爪子中的作用，附图4B表示的是，当把该抗抑郁剂注射到神经损伤爪子(ipsi)和未损伤爪子(contra)内时在对侧爪子中热收回潜伏随时间的改变，其中●＝盐水对照；■＝AMI ipsi；且▲＝AMI contra。附图4C表示的是MPE值随时间的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照(ipsi)，具有右倾斜线的棒形图代表100nmol AMI(ipsi)，具有左倾斜线的棒形图代表100nmol AMI(contra)。值代表MPE±s.e.m.(对于所有组n＝9)。与盐水对照相比，*＝P＜.05，与对侧对照相比，t＝P＜.01。
附图5A-C是表示系统施用的阿米替林在同侧爪子中对静电机械异常性疼痛的影响(附图5A)、和在对侧爪子中对静电机械刺激的收回阈的影响(附图5B)的时间过程的一系列图，其中●＝盐水对照；■＝1.5mg/kg AMI；▲＝5mg/kg AMI，且＝10mg/kg AMI。附图5C表示的是MPE的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照，具有右倾斜线的棒形图代表1.5mg/kg AMI，具有左倾斜线的棒形图代表5mg/kg AMI，具有交叉线的棒形图代表10mg/kg AMI。值代表MPE±s.e.m.(对于1.5和5mg/kg，n＝5，对于10mg/kg，n＝15)。与盐水对照相比，*＝P＜.05，与1.5和5.0mg/kg相比，t＝P＜.05。
附图6A-C是表示脊椎施用的阿米替林在同侧爪子中对静电机械异常性疼痛的影响(附图6A)、和在对侧爪子中对静电机械刺激的收回阈的影响(附图6B)的时间过程的一系列图，其中●＝盐水对照；■＝30μg AMI；▲＝60μg AMI，且＝90μg AMI。附图6C表示的是MPE的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照，具有右倾斜线的棒形图代表30μg AMI，具有左倾斜线的棒形图代表60μg AMI，具有交叉线的棒形图代表90μg AMI。值代表MPE±s.e.m.(对于30μg和90μg，n＝3，对于60μg，n＝5)。与盐水对照相比，*＝P＜.05。
附图7A-C是表示局部外周注射阿米替林(100nmol)对痛觉过敏的影响的时间过程的一系列图。附图7A表示的是，当把该抗抑郁剂局部注射到神经损伤爪子(ipsi)和未损伤爪子(contra)内时同侧爪子中的作用。附图7B表示的是，当把该抗抑郁剂注射到神经损伤爪子(ipsi)和未损伤爪子(contra)内时在对侧爪子中机械阈随时间的改变，其中●＝盐水对照；■＝AMI(ipsi)；且▲＝AMI(contra)。附图7C表示的是MPE值随时间的累积变化(ΔMPE)，其中中空棒形图代表盐水对照(ipsi)，具有右倾斜线的棒形图代表100nmol AMI(ipsi)，具有左倾斜线的棒形图代表100nmol AMI(contra)。值代表MPE±s.e.m.(对于所有组n＝9)。与盐水对照相比，*＝P＜.05，与对侧对照相比，t＝P＜.01。
附图8A-B是表示将阿米替林(AMI)与2.5％福尔马林对大鼠共施用所产生的、通过退缩数目测定的(附图8A)或通过咬和舔时间消耗测定的(附图8B)、局部抗感受伤害性作用的时间过程的两个图。●＝2.5％福尔马林；中空三角形＝2.5％福尔马林+10nm AMI；中空正方形＝2.5％福尔马林+30nm AMI；中空菱形＝2.5％福尔马林+100nmAMI。值是组平均值(n＝5-11/组)；为了清楚起见，省略s.e.m.的误差线。
附图9A-C是表示将阿米替林(100nmol)与2.5％福尔马林(F)对大鼠共施用后1期退缩(附图9A)、2期退缩(附图9B)和咬/舔时间(附图9C)的累积得分的一系列棒形图。将阿米替林施用到对侧(CONT)后爪内没有再产生施用阿米替林对同侧爪子的抗感受伤害性作用(局部作用)。值代表±s.e.m.值(n＝5-11)。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，和***＝P＜0.001。
附图10A-C是表示对大鼠共施用后阿米替林(100nmol)(中空菱形)对不同浓度福尔马林诱导的行为(实心园环)的抑制作用、即对1期退缩(附图10A)、2期退缩(附图10B)和咬与舔时间消耗(附图10C)的抑制作用的一系列图。n＝6-11/组。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，和***＝P＜0.001。
附图11A-C是表示在2.5％福尔马林(F)测试中通过与咖啡因(CAFF)共施用、通过1期退缩(附图11A)、2期退缩(附图11B)和咬与舔时间消耗(附图11C)测定的阿米替林局部抗感受伤害性作用的部分逆转的一系列图。除了咖啡因(1500nmol)组n＝5之外，n＝10-15。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05，***＝P＜0.001；与福尔马林/阿米替林组相比，t＝P＜0.05，tt＝P＜0.01。实心棒形图表示单独施用的2.5％福尔马林，空心棒形图表示单独施用的AMI，具有左倾斜线的棒形图表示AMI+500nmol CAFF，具有交叉线的棒形图表示单独施用或与100nmol AMI一起施用的1500nmol咖啡因。
附图12A-B是表示对于附图4A-C所示实验、在2.5％福尔马林(F)测试中通过退缩数目测定的(附图12A)和通过咬和舔时间消耗测定的(附图12B)咖啡因逆转阿米替林(AMI)作用的时间过程的两个图。●＝2.5％福尔马林；中空朝上三角形＝2.5％F+10nmol AMIT；■＝2.5％F+100nmol AMI+1500nmol CAFF；◆＝2.5％F+1500nmol CAFF。值是组平均值(n＝5-11/组)；为了清楚起见，省略s.e.m.的误差线。
附图13A-B是表示咖啡因(CAFF)(附图13A)和8-环戊基-1，3-二甲基黄嘌呤(CPT)(附图13B)逆转阿米替林(AMI)抗1.5％福尔马林(F)的抗感受伤害作用的图。n＝5-6/组。与仅用福尔马林的组相比，**＝P＜0.05，***＝P＜0.001；与福尔马林/阿米替林组相比，t＝P＜0.05，ttt＝P＜0.001。实心棒形图表示单独施用的1.5％福尔马林，具有下倾斜线的棒形图表示单独施用或与AMI一起施用的CAFF，中空棒形图表示单独施用的AMI的作用。
附图14表示在福尔马林测试中、通过2期退缩测定的、由共施用的腺激酶抑制剂NH2dAD(100nmol)(具有右倾斜线的棒形图)而不是腺脱氨基酶抑制剂2′-去氧助间型霉素(DCF)(100nmol)(具有交叉线的棒形图)所引起的、30nM和100nM阿米替林(中空棒形图)抗2.5％(实心棒形图)的局部抗感受伤害性作用的增强的棒形图。n＝6-8/组。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05；与福尔马林/阿米替林组合相比，t＝P＜0.05。
附图15A-B是表明当与MK-801(20nM或100nM)(中空棒形图)共施用到同侧(I)爪子或对侧(C)爪子内时抑制大鼠对2.5％福尔马林(实心棒形图)的反应的棒形图。n＝6-8/组。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，和***＝P＜0.001。
附图16A-B是表明阿米替林(20nmol和100nmol)抗2.5％福尔马林(F)(深色棒形图)的抗感受伤害作用没有被共施用酚妥拉明(PTA)(100nmol和500nmol)(具有交叉线的棒形图)和纳洛酮(NLX)(100nmol和300nmol)(具有水平线的棒形图)降低的棒形图。n＝5-8/组。与仅用福尔马林的组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.001；与福尔马林/阿米替林组合相比，t＝P＜0.05。
附图17A-C是表明局部施用三环类抗抑郁剂对福尔马林诱导的疼痛反应行为的剂量相关抑制的一系列棒形图。这些棒形图描述了当对侧注射时福尔马林(实心棒形图)和盐水(中空棒形图)的对照值；这些剂量图描述了当注射抗抑郁剂而不是对照时的结果。附图17A和17B分别表示了1期和2期退缩行为的改善，附图17C表示，当把福尔马林与去郁敏(DES)或氟西汀(FLUOX)共施用到背侧后爪内(局部作用)或注射到对侧后爪内(系统作用)时，由注射到大鼠背侧后爪内的2.5％福尔马林(■)引起的咬/舔行为得到了改善。▲＝同侧DES；中空三角形＝对侧DES；●＝同侧FLUOX；○＝对侧FLUOX。数据是平均值±s.e.m.(n＝5-6；对于同侧对照，n＝8)。与相应的福尔马林组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，和***＝P＜0.001。
附图18A-D是表示通过将去郁敏与2.5％福尔马林共施用而抑制疼痛相关行为的一系列图。附图18A和18B表示的是通过将DES与福尔马林共施用到同侧(附图18A)或对侧(附图18B)爪子内而抑制退缩行为的时间过程。附图18C和18D表示的是将最高剂量注射到同侧(附图18C)或对侧(附图18D)爪子内而抑制咬/甜行为的时间过程。值是平均值，为了清楚起见，省略误差线。数据与附图17一致。
附图19A-C是表示局部注射去郁敏(DES)(100nmol)与氟西汀(FLX)(100nmol)的结果的一系列图。附图19A描述了当注射到相当于脊髓神经结扎的同侧(ipsi)爪子内时去郁敏而不是氟西汀的局部抗感受伤害作用，附图19B描述了在对侧爪子(contra)中缺乏该作用，●＝盐水对照；■＝DES；▲＝FLUOX。附图19C表示的是MPE的累积改变，其中中空棒形图代表盐水对照，具有右倾斜线的棒形图代表DES，具有左倾斜线的棒形图代表FLUOX。n＝9/组。与盐水组相比，*＝P＜0.05。
附图20A-B是表示当共施用到相当于脊椎结扎的同侧爪子内时咖啡因(1500nmol)(CAFF)抑制去郁敏的抗感受伤害作用的效果的两个图。附图20A表示的是在一定时间的抗痛觉过敏MPE，其中●＝100nmolDES；■＝1500nmol CAFF；且▲＝DES+CAFF。附图20B表示的是MPE的累积变化(ΔMPE)，中空棒形图代表100nmol DES；具有右倾斜线的棒形图代表1500nmol CAFF；具有交叉线的棒形图代表DES+CAFF。n＝9/组；与盐水组相比，*＝P＜0.05。
附图21A-C是表明在1.5％福尔马林测试中、共施用咖啡因(CAFF)(1500nmol)没有抑制去郁敏(DES)或氟西汀(FLUOX)的局部抗感受伤害作用的一系列图。附图21A表示的是对1期退缩的影响，附图21B表示的是对2期退缩的影响，附图21C表示的是对2期咬/舔时间的影响。中空棒形图代表盐水对照；具有右倾斜线的棒形图代表单独施用或与测试药物联合施用的咖啡因(CAFF)的作用。值是平均值±s.e.m.(n＝6/组)。与相应的福尔马林组相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，和***＝P＜0.001。NS是指与相应的抗抑郁剂组没有显著差异。
附图22A-B是表示在福尔马林存在下局部施用的去郁敏和氟西汀对爪子体积的影响的图。附图22A表示的是与福尔马林共施用到同侧爪子内之后在福尔马林存在下盐水(对照)、去郁敏、或氟西汀对爪子体积的影响。●＝福尔马林+盐水；中空菱形＝福尔马林+100nmolFLUOX；中空朝下的三角形＝福尔马林+300nmol DES；中空正方形＝福尔马林+300nmol FLUOX。附图22B表示的是以在附图22A中使用的浓度注射到对侧后爪内(系统作用)的去郁敏或氟西汀对爪子膨胀的影响。爪子体积是在行为观察期间结束时测定的。n＝5-6/组。与盐水处理组相比，***＝P＜0.001。
附图23A-C是表明当注射到大鼠背侧后爪内时、与盐水对照相比去郁敏、氟西汀、和阿米替林对爪子体积的影响的图。附图23A表示的是100nmol DES(中空菱形)和300nmol DES(中空正方形)的作用。附图23B表示的是10nmol FLUOX(中空朝上的三角形)、30nmolFLUOX(中空朝下的三角形)、100nmol FLUOX(中空菱形)、和300nmol FLUOX(中空正方形)的作用。附图23C表示的是100nmol(中空三角形)和300nmol(中空正方形)阿米替林对背侧爪子体积的影响。n＝6/组。与盐水注射组相比，*＝P＜0.05，***＝P＜0.001。
附图24A-B是表示选择性5-HT受体拮抗剂普萘洛尔(5-HT1)、酮舍林(5-HT2)、托吡西隆(5-HT3/4)和GR1l3808A(5-HT4)对由于局部注射氟西汀(FLX)(100nmol)引起的爪子体积增长的作用的图。附图24A表示的是在施用单独的100nmol FLX(●)、FLX+300nmol普萘洛尔(中空菱形)、FLX+500nmol酮舍林(□)、FLX+300nmol托吡西隆(中空朝上的三角形)、和FLX+500nmol GR113808A(中空朝下的三角形)的3个小时期间内爪子体积的增长百分比。附图24B表示的是在相同时间内附图24A的增加的累积效应，其中中空棒形图代表单独的FLX；具有水平线的棒形图代表FLX+普萘洛尔；具有垂直线的棒形图代表FLX+酮舍林；具有右倾斜线的棒形图代表FLX+托吡西隆；具有左倾斜线的棒形图代表FLX+GLR113808A。n＝5/组，与氟西汀相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，***＝P＜0.001。
附图25是表示在大鼠1％福尔马林测试中、剂量为50nmol、150nmol和500nmol的酮舍林(KET)—一种选择性5-HT受体拮抗剂对福尔马林激起的行为(2期退缩)没有影响的图。值是每组6个测定值的平均值。●＝2.5％福尔马林对照；□＝普萘洛尔；△＝酮舍林；中空菱形＝托吡西隆；中空六角形＝GR113808A。与福尔马林对照相比，*＝P＜0.05。
附图26是表示在大鼠1％福尔马林测试中、剂量为50nmol和500nmol的酮舍林(KET)对福尔马林激起的行为(退缩)没有影响的图。值是每组6个测定值的平均值。■＝1％福尔马林对照；□＝50nmolKET；▲＝500nmol KET。
附图27A和B是表示通过将3nmol或30nmol酮舍林与5-HT共施用而阻断由于局部注射3nmol 5-HT所致的大鼠爪子水肿的图。附图27A是表明180分钟期间内爪子体积累积增加的图。中空棒形图＝单独的5-HT；具有交叉线的棒形图＝5-HT+KET(3nmol 5-HT＝左边栏；30nmol 5-HT＝右边栏)。附图27B是表示按照180分钟期间内爪子体积的％增加表示的作用时间过程的图。■＝单独的3nmol 5-HT；□＝3nmol 5-HT+500nmol KET；●＝单独的30nmol 5-HT；○＝30nmol5-HT+500nmol KET。与5-HT反应相比，**＝P＜0.01，***＝P＜0.001。
附图28A-C是表示剂量为10、30、100、300和1000nmol的阿托品、美加明和d-筒箭毒碱对大鼠中由2.5％福尔马林导致的退缩和咬/舔行为的影响的一系列图。附图28A表示的是药物对1期退缩数目的影响，附图28B表示的是药物对2期退缩数目的影响，附图28C表示的是药物对2期咬/舔时间的影响。暗色六角形＝2.5％福尔马林；○＝阿米替林；□＝美加明；△＝阿托品(同侧)；暗色三角形＝阿托品(对侧)；中空菱形＝d-筒箭毒碱。与各自的福尔马林对照相比，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，***＝P＜0.001。
发明详述依据本发明，已经发现了通过将三环类、第二代或第三代抗抑郁剂局部施用到局部不适身体位点上来产生局部止痛作用的新方法。
可用于实施本发明的三环类抗抑郁剂的实例是具有下述结构的化合物Ar1-Z(R)-Ar2其中Z是任选包含1个或2个生物可相容杂原子的7元环、或8元二环，Ar1和Ar2是稠合到Z上的任选被取代的芳香环，且R是烷基氨基或芳基氨基取代基。
作为8元二环的Z的实例包括(2，2，2)二环辛烷和(3，2，1)二环辛烷等。对于任选包含在Z-三环结构的中央环中的杂原子，氧和氮是优选的，但是也可包含硫。R可以是烷基氨基或芳基氨基取代基、或它们的N-氧化物，并且通常包含4-5个碳原子，但是R中也可包含少至2个碳原子、或多至7个碳原子、甚至多至10个碳原子。如果R是烷基氨基取代基，则在一些实施方案中该烷基氨基是叔氨基或仲氨基。例如，R可以是-(CH2)3N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、-(CH2)3N(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)2、＝CH(CH2)2N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、＝CH(CH2)2NHCH3等。
R与三环结构连接的点优选为5位碳，或者连接在环结构的5位杂原子上。
Ar1和/或Ar2上的任选的生物可相容卤素取代基的实例是氯、溴和氟，氯是优选的。例如Ar1和/或Ar2可被1个或2个生物相容性卤素原子取代。
可用于实施本发明的三环类抗抑郁剂的非限制性实例是氯丙咪嗪、丙咪嗪、阿米替林、去郁敏、去甲替林、阿莫沙平、马普替林、曲米帕明等，以及它们当中两种或更多种的合适组合。阿米替林和去郁敏是优选的。
其它可用于本发明的抗抑郁剂包括具有与本文所述三环类抗抑郁剂相似的药动学特征和效力的、有时称为“第二代”或“第三代”抗抑郁剂的化合物。可用于实施本发明的第二代或第三代抗抑郁剂是具有下述结构的化合物Ar3(Y)-X-Ar4(Q)其中Ar3是含氮杂环，例如取代的1，2，4-三唑或三嗪酮，Y是稠合到杂环上的芳基，或选自下述基团的1个或2个取代基包含总共约4-8个碳原子的连接在Ar3上的烷基、烷氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基和杂芳基取代基，X是连接Ar3和Ar4的包含2-5个碳原子的烷基，Ar4是通过Ar4上的第一个氮原子连接在X上的哌嗪，且Q是任选被生物可相容卤素取代、并且连接在Ar4上的另一个氮原子的苯环。
例如，X可包含3个碳原子，且Ar3可以是在4位被包含6-8个碳原子的芳基烷氧基取代的1，2，4-三嗪酮。在本发明优选的实施方案中，Y是包含氧原子的杂芳基烷基取代基。
对于Q，优选的生物可相容卤素取代基选自氯、溴和氟。
可用于实施本发明的第二代或第三代抗抑郁剂的代表性实例是曲唑酮、安非他酮、米尔塔扎平(mirtazapine)、文拉法辛(venlafaxine)、fefazodone等。
一方面，本发明包括用于将三环类、第二代或第三代抗抑郁剂局部施用到具有局部不适位点的个体中的组合物。本发明组合物尤其是配制成保证基本上局部而不是系统施用抗抑郁剂。除了一种或多种本文所述抗抑郁剂之外，本发明组合物可含有一种或多种促进递送的辅料，例如插入载体、渗透促进剂、胶态分散系统。
这种惰性载体的代表性且非限制性实例可选自水、异丙醇、气态碳氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、香料、凝胶生成材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、脱水山梨醇一油酸酯、甲基纤维素、以及它们当中两种或更多种的组合。
局部施用制剂还可包含具有最小变应性或刺激作用的一种或多种已知的渗透促进剂。已知的渗透促进剂包括DMSO和氮杂环化合物，例如在US 4755535、US 4801586、US 4808414和US 4920101中公开的渗透促进剂，这些文献全文引入本发明以作参考。局部施用组合物中包含的渗透促进剂至多与基本上达到局部递送而不是系统递送三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的目标一致。本领域技术人员应当能选择适用于所需特定渗透度的渗透促进剂。
在另一实施方案中，本发明组合物是配制成局部注射制剂。在该实施方案中，组合物通常包含生理可相容盐水溶液，并且可任选包封在适于局部注射的缓释载体例如胶态分散系统或聚合物稳定晶体内。胶态分散系统包括毫微胶囊、微球、小珠、和以脂质为基质的系统、包括水包油型乳剂、微胶粒、混合微胶粒、以及脂质体。优选的本发明胶态分散系统是脂质体或微球。脂质体是当注射或植入时或者当包含在局部施用制剂中时用作缓释载体的人造膜小囊。适用于局部注射的包囊药物的微球是如D.Fletcher在Anesth.Analg.8490-94，1997中所述的聚(D，L)交酯微球。
本发明组合物可配制成适于局部施用的剂型，例如霜剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、喷雾剂、或气雾剂。三环类、第二代或第三代抗抑郁剂自身是完全脂溶性药物，能轻易穿过脂质屏障以到达中枢神经系统位点。该同一特性使得它们能穿过环绕外周神经末梢的神经周屏障(该屏障限制一些治疗剂到达这些位点，I.Antonijevic等人，炎症中的神经周缺损和外周类阿片止痛，J.Neurosci 15(1995)165-172)，使得它们能轻易到达外周神经末梢和相邻位点。还可以通过缓释“贴剂”递送本发明组合物来进行局部施用。因此，在另一实施方案中，本发明组合物还包括用于施用在皮肤或粘膜上以缓释、具有被螯合的抗抑郁剂的贴剂递送系统。
另一方面，本发明提供了通过将有效量的三环类、第二代或第三代抗抑郁剂局部施用到局部不适位点、来在个体例如哺乳动物中产生局部止痛作用的方法。术语“局部施用”包括本领域已知的任一局部施用方法。在本发明实施过程中使用的抗抑郁剂可局部注射，例如皮下或关节内注射。或者，三环类、第二代或第三代抗抑郁剂可通过将包含任一适用于本发明的抗抑郁剂的霜剂、软膏剂、喷雾剂或凝胶剂施用到疼痛位点来局部给药。其它本发明所述局部施用途径包括局部涂敷、局部注射或皮下植入包封在缓释载体例如脂质体或微球中的抗抑郁剂。
术语“有效量”是指预防、治愈、或至少部分抑制个体中局部疼痛症状或不适所需的本发明化合物的量。个体是所有哺乳动物、优选是人。产生基本上局部疗效的有效量当然取决于引起疼痛症状的疾病的严重程度、个体体重和身体一般状况。动物模型，例如在本说明书背景技术和实施例中描述的动物模型一般可用于确定为了实现基本上局部递送三环类、第二代或第三代抗抑郁剂所需要使用的合适剂量。Galer等人(特定用于神经病性疼痛的疼痛测定的发展和初步确认神经病性疼痛评分体系，Neurology 48(1997)332-338)最近开发出的、使用神经病性疼痛特定术语的疼痛评分体系能更好地描绘综合征中的症状。此外，在确定“治疗有效量”中考虑的各种一般因素是本领域技术人员已知的，并且描述在例如Gilman等人eds.，Goodman AndGilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；和Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990，这两篇文献都引入本发明以作参考。
本发明方法和组合物特别适于对本领域称为“神经病性疼痛”的疼痛症状产生局部止痛作用。本说明书所用术语“神经病性疼痛”是指属于神经病的疼痛症状(即由神经系统的损害或功能障碍引起的)，包括一些相当广义的综合征，例如外周神经病、幻觉疼痛、反射交感性营养不良、灼痛、中枢性疼痛、脊髓空洞症、疼痛性瘢痕等。一些相当局部化的综合征也被认为是神经病。在这些病症当中有在身体、头部或面部任意位点的特定神经痛；糖尿病性、酒精性、代谢性或炎性神经病；疱疹后的神经痛；创伤后和牙髓受伤后的牙痛；胸廓出口综合征；具有神经压迫的颈、胸、或腰神经根病；侵袭神经的癌症；创伤后撕脱损伤；乳房切除术后的疼痛、胸廓切开术后的疼痛；脊髓损伤后的疼痛；中风后的疼痛；腹部皮下神经包埋；神经组织的原发性肿瘤；和蛛网膜炎等。
据信具有神经病性组成的其它疼痛综合征是残肢疼痛、纤维瘤(fibromyalgia)、局部扭伤或劳损(压碎性损伤)、肌筋膜疼痛、牛皮癣性关节病、结节性多动脉炎、骨髓炎、涉及神经损伤的烧伤、AIDS相关疼痛综合征、和结缔组织障碍例如全身性红斑狼疮、全身性硬化、多肌炎、和皮肤肌炎等。
本发明组合物和方法还可特别适于对由炎性病症引起的局部疼痛和不适症状产生局部止痛作用。可采用本发明治疗的炎性病症包括急性炎症(例如创伤、手术和感染)或慢性炎症(例如关节炎和痛风)。
采用本发明组合物和方法治疗伴有炎性或神经病性疼痛的不适时，通过局部施用可获得相当高浓度的药物，并且副作用(是系统吸收的特征)的发生率很低，产生了特别的益处。
如本说明书实施例中详细描述，使用大鼠脊髓神经结扎(SNL)模型来确定三环类、第二代或第三代抗抑郁剂抗神经病性疼痛的作用。在该模型中，局部施用三环类抗抑郁剂阿米替林和去郁敏在减缓热痛觉过敏中表现出作用。观察到了施用到神经损伤后爪的阿米替林和去郁敏的局部抗痛觉过敏作用，对于对侧爪子没有共存的止痛作用。局部施用的阿米替林的最大作用在大小方面与系统注射的阿米替林相同，但是神经病性疼痛的缓解表现所持续的时间比系统施用该药物长。局部施用后，局部作用在幼小动物的对侧爪子或爪子的热阈方面没有导致任何改变。此外，当注射到对侧爪子内时，发现对同侧反应潜伏期没有任何显著影响，这证实了该作用的局部性质。
与局部施用的阿米替林抗热痛觉过敏的有益作用相反，观察到阿米替林在神经损伤诱导的机械异常性疼痛的治疗中无效。脊椎施用阿米替林(60μg)后，甚至可能有轻度事与愿违的作用，当分析最大可能作用的累积变化(ΔMPE)时(附图6C)，这种作用在统计学上有显著意义。然而，将阿米替林的脊椎剂量增加至90μg时，引起了显著的镇静作用，因此动物在测试装置中表现出软弱无力，该结果阻碍它们对刺激作出反应。在异常性疼痛测试中使用阿米替林所观察到的值得关注的结果是在对侧爪子中观察到反应阈下降了(附图5A-C、6A-C、和附图7A-C)，这是在本说明书中称为“感觉过敏触觉反应”的作用。虽然该感觉过敏反应阈与神经损伤爪子的感觉过敏反应阈在性质上相似，但是观察到的行为反应(活力收回)与正常神经病性疼痛反应表现出的行为反应(即咬、舔、和防卫动作)不同。该实验的结果表明，通过所有施用途径给予的阿米替林良好地缓解了热痛觉过敏，但是对异常性疼痛没有作用。
这些发现意味着，热痛觉过敏和触觉异常性疼痛的病生理是通过不同机制维持的，关于这一点，已经有人通过其它药物例如右甲吗南对这两个终点具有不同作用特性而提出过暗示(M.Tal和G.J.Bebbett(1994)Neuroreport 51438-1440)。因此，三环类抗抑郁剂例如阿米替林在患者中的效力可通过其中神经病性症状被最强地表现出的实验来确定。例如，在表现出严重异常性疼痛样症状的患者中，阿米替林和具有类似活性的抗抑郁剂可能在疼痛方面没有导致任何可觉察的不同。然而，如果主要病情的特征是痛觉过敏，则阿米替林和具有类似活性的药物可缓解病情。
本发明所基于的实验还证实了抗抑郁剂例如三环类、第二代和第三代抗抑郁剂抗炎症的局部外周抗感受伤害作用。在大鼠福尔马林测试—一个众所周知的炎症动物模型中，是通过减轻由于将福尔马林注射到大鼠爪子中所致的疼痛反应(退缩行为和咬/舔时间)来表明该抗感受伤害作用的。在该动物模型中，注射到对侧后爪中的阿米替林没有作用，这证实了该作用的局部性质。局部注射高达100nmol(相当于0.22mg/kg系统剂量(对于142g大鼠))剂量的阿米替林时，观察到了抗感受伤害作用。在2.5％福尔马林测试中，当与炎症刺激剂福尔马林共施用时，阿米替林、去郁敏和氟西汀10-300nmol使2期(16-60分钟)退缩和咬/舔行为表现出与剂量相关的减轻。在最高剂量时，使1期退缩行为(0-12分钟)减轻。该作用是局部介导的，这是因为当把这些抗抑郁剂(100和300nmol)注射到对侧后爪内时，没有观察到该作用。通过与1500nmol咖啡因共施用，去郁敏和氟西汀的局部作用被部分改变了，但是阿米替林的作用被咖啡因逆转了。
如本说明书实施例所示，阿米替林的外周作用涉及与内源性腺苷系统的相互作用。在大鼠福尔马林测试中也表现出了通过改变腺苷细胞外可利用性而起作用的NH2dAD-腺苷激酶抑制剂的类似外周抗感受伤害作用。
在该福尔马林测试中证实的局部施用的三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的局部作用很强，1期和2期退缩行为和总的咬/舔时间被显著抑制。
虽然抗抑郁剂的作用机制不构成本发明一部分，但是已经证实阿米替林的外周抗感受伤害作用涉及内源性腺苷，随后在感觉神经末梢激活腺苷A1受体(Sawynok J.(1997)在Purinergic Approaches toExperimental Therapeutics(Ed.Jacobsen K.，Jarvis M.)Wiley-Liss Inc.，New York，495)。该观测是基于咖啡因—一种非选择性腺苷A1和A2受体拮抗剂、和CPT—一种选择性腺苷A1受体拮抗剂抑制阿米替林对2期退缩反应和咬/舔时间的影响的能力作出的。1期反应不受咖啡因的影响，这可能是因为另一机制。
本发明所基于的实验还证实了腺苷激酶抑制剂(NH2dAD)可增强阿米替林的局部作用。腺苷激酶是细胞内酶(J.D.Geiger等人，作为治疗剂的内源性腺苷水平调节剂Purinergic approaches inExperimental Therapeutics，Ed.Jacobsen，K.A.和Jarvis，M.F.，Wiley-Liss Inc.，New York(1997)55-84)，并且将其抑制会导致腺苷在细胞内积聚，腺苷沿着浓度梯度从细胞中流出。这种作用将增强细胞外腺苷的摄取、和与阿米替林的相互作用。用2′-去氧助间型霉素抑制腺苷脱氨基酶不会产生相同反应，这与这两种活性剂表现出的相对内在作用一致。
需要指出，在本说明书描述的所有实验中，对腺苷可利用性的所有这些影响都附加在炎性刺激(福尔马林)上。内源性腺苷通常是由于福尔马林的作用(Doak GJ，Sawynok J.(1995)Eur J Pharmacol 281311)以及炎症过程(Cronstein，1994)在外周释放的。因此，该刺激产生与阿米替林相互作用的物质(腺苷及其摄取)。在低浓度福尔马林模型中没有观察到或观察到很有限的阿米替林的作用(附图10A-C)可能是由于在较低刺激强度下内源性腺苷的释放不充分所致。
同样，本发明所基于的实验表明在1.5％福尔马林存在下咖啡因和CPT没有内在作用，或轻微降低了2.5％的福尔马林的作用(参见附图11A-C、12A-B和13A-B)。缺乏CPT作用表明由福尔马林产生的内源性腺苷的量不足以产生抗感受伤害作用；只有当施用阿米替林并抑制腺苷摄取时才表现出该反应。在2.5％福尔马林测试中，咖啡因的适度作用可反映出在该实验中腺苷A2受体激活占轻微的主导地位。已表明咖啡因由于阻断腺苷A1和A2受体的相反影响而缺乏外周内在活性(Doak GJ，Sawynok J.(1995，上文))。
在脊髓神经模型中，当用热爪刺激器测定阈值时，阿米替林(100nmol)和去郁敏(100nmol)在与结扎一侧相一致的后爪中产生了局部和完全的抗痛觉过敏作用，氟西汀(100nmol)则没有。最大有效剂量(100和300nmol)的去郁敏和阿米替林使爪子体积有轻微增加，但是在整个剂量范围内(10-300nmol)的氟西汀使爪子体积有显著和持续增加。在该炎性疼痛模型中，当与福尔马林共注射时，没有一种治疗剂改变了福尔马林导致的爪子膨胀程度。酮舍林—一种选择性5-HT2受体拈抗剂抑制了氟西汀导致的爪子体积增加，但是其它选择性5-HT受体拈抗剂则没有。在福尔马林测试和脊髓神经结扎模型中，三环类抗抑郁剂去郁敏和阿米替林产生了显著局部疼痛缓解作用，同时没有导致爪子体积有明显改变，这表明三环类、第二代或第三代抗抑郁剂可用于产生局部止痛作用，例如在炎性和神经病性疼痛中产生局部止痛作用。
通过下述非限制性实施例来更详细地描述本发明。
实施例1用雄性Sprague-Dawley大鼠(100-120g)(Charles River，Quebec，Canada)进行实验。将动物成对饲养，在22±1℃维持12∶12小时光照-黑暗循环，并使它们能任意摄取食物和水。A.制备脊髓神经结扎动物模型用无菌技术在解剖显微镜下对雄性大鼠进行手术，并粘合上在疼痛研究动物实验中使用的IASP导线。通过将腰神经后根L-5和L-6紧紧结扎来产生神经病性症状。用氟烷(1.5-2.0％)将SpragueDawley大鼠(100-125g)麻醉并在手术期间维持麻醉。将动物在背部骨盆区域进行修剪，将抗菌滴眼剂滴到眼睛中以防止手术操作期间变干燥。将动物置于热水垫上(37±0.5℃)。将手术切开区域洗净，并用乙醇和碘灭菌。沿着背部中线切开长3cm的切口，以髂骨嵴的位置指示切口中线。在椎骨柱的左侧骶骨水平上切一个穿刺切口。将粘附在脊髓上的韧带朝着穿刺切口方向切2cm。采用钝器解剖法来进一步将剩余组织从脊髓上断开和分离。将一个牵开器置于L-4脊椎上，使用另一个牵开器来将肌肉从骶髂嵴上计数缩回。采用钝器解剖法来清除骶髂嵴、L-6/S-1关节(小平面)关节、和L-6椎骨横突。用咬骨钳将小平面夹住。使用第三个牵开器将肌肉从L-6椎骨横突上缩回。
在解剖显微镜下，使用珠宝商用的镊子，除去L-6椎骨横突和骶髂嵴之间的结缔组织。使用咬骨钳缓慢地将L-6椎骨横突夹住，并暴露出接近L-5/L-6神经束的区域。使用玻璃探针将L-4/L-5神经束钩住，并操作以分离L-5神经。一旦与L-4神经分开，即用6-0丝线将L-5神经紧紧结扎，从而使神经在结扎线两侧凸出。修剪缝线末端，将神经放置回其原来位置。再使用玻璃探针将L-6神经从骶髂嵴下钩住，紧紧结扎(6-0丝线)，并放回骶髂嵴下面位置。清除所有损伤组织，擦干净切口位点的所有血液。将肌肉和组织轻轻地反绕回原来位置以防止出现任何皮下气疱。将肌肉筋膜和皮肤先后缝合(都使用3-0 Vicryl)。
手术后，将动物置于具有热灯的恢复箱中以进行观察。进行完成功的手术后，大鼠能完全走动，没有表现出任何自发性疼痛的迹象(舔、咬、或神经病性脚自主性、或发音)。如果大鼠起初表现出神经病性足下垂，这种症状在手术后1-2天内就消失了。用过量氟烷将手术后2天内表现出行动不足或自发性疼痛的动物迅速实施安乐死。B.行为测试每天所有行为测试都在0800-1400进行，并在神经损伤后第7、12、17和22天进行。但是插套管的动物例外，其在插套管后第7和12天(分别是神经损伤后第14和19天)进行测试。7天的恢复期后，将大鼠从动物室中取出，称重，并在测试室中适应40分钟环境。然后将大鼠在测试装置中放置30-40分钟或者直至行为测试停止。
B.1.在测试期间建立和维持神经病性疼痛为了确定由于将L5和L6脊髓神经结扎所致的外周单神经病，进行静态机械异常性疼痛和热痛觉过敏测试。
B.2.测定热痛觉过敏用Paw Thermal Stimulator System评价手术诱导的热痛觉过敏。在测试前让动物适应2次环境(从饲养设施中取出后30分钟；在单独测试室中20分钟)。将大鼠成对置于刺激器保温玻璃面(30±1℃)顶上的有机玻璃箱中。初始环境适应之后，测试大鼠两个爪子的基线收回潜伏期(秒)，每20分钟测定一次，直至达到3个稳定的基线为止。然后在施用药物前，将动物在其笼子中放置30-40分钟，并让它们能自由摄取食物和水。施用药物后，将动物放回测试箱中以进行测试。
B.3.静态机械异常性疼痛称重并适应测试室的环境之后，将大鼠置于升高的有机玻璃容器中，该容器具有金属丝网底部，以使后爪的腹侧表面能通过。再次让大鼠适应测试室的环境，并用Semmes-Weinstein单丝(StoeltingComp.，Wood Dale IL.)测定实验基线(在一个小时内测定2次)。用Dixons上下法(Chaplan等人，1994)测定50％收回阈。简言之，将单丝置于爪子腹侧表面上，从4.31丝(2.04g)开始，并记录反应。阳性反应(爪子退缩，表现出疼痛行为特征)之后，施加较低重量的单丝。如果没有表现出反应，增加所施加单丝的重量。然后从列成表的关于反应方式的值(k)、最后的单丝值(Xf，对数单位)确定收回阈，并用下述公式进行内插值替换50％g阈＝(10[X+kδ]f)/10000其中δ是刺激之间的平均差异。确定出基准值后，将大鼠放回其最初的笼子中，并让它们任意摄取食物和水，放置30-40分钟。施用药物后，将大鼠再次置于测试室中，并监测取决于药物施用途径的适当行为期限。测试结果如附图1所示。
B.4.数据分析对于每一实验，记录关于每一动物两只爪子的反应阈的原始数据，并填入电子表格(Microsoft Excel 5.0)。然后依据所测试的神经病性症状的逆转(MPE(抗痛觉过敏或抗异常性疼痛))或依据对侧爪子的止痛作用(MPE(止痛))将每一动物的数据归一成最大可能作用(MPE)。如下所述计算这些值MPE(抗神经病)＝(PDR-IBR)/(CBR-IBR)其中PDR是同侧爪子的给药后反应，IBR是同侧爪子的基准反应，CBR是对侧爪子的基准反应。同样，如下所述计算MPE(止痛)MPE(止痛)＝(PDR-CBR)/(截距-CBR)其中截距是从热刺激开始算起的20秒，对于触觉异常性疼痛，是15g，PDR是对侧爪子给药后的收回阈。因此，所报道或描述的各单个值是MPE±SEM。对于每一治疗和给药途径，还以MPE中的累积变化(ΔMPE)表示药物作用的时间过程。该值计算为整个时间过程中的各MPE值的总和(∑n)，假定对于基准值MPE值为0(附图中没有显示)。采用进行成对比较的单向ANOVA(用于重复测定)(Dunnetts后hoc分析)对数据进行统计学分析。为了比较多个治疗组的ΔMPE，采用进行成对比较的单向ANOVA(Student-Neuman-Keuls后hoc分析)。当比较在各时间点或ΔMPE值中的平均值时，使用进行Student-Neuman-Keuls后hoc校正的Student′s T-检验。对于所有测试，认为小于.05(P＜.05)的P值是显著的。
这些测试表明，在大鼠中进行脊髓结扎导致神经病性疼痛，表现出静态机械异常性疼痛和热痛觉过敏症状，并在整个测试期间维持该症状(第7、12、17、22天)。如总结在附图1中的数据所示，对于同侧爪子，热痛觉过敏的阈值为7.98±0.48秒，对于对侧爪子，热痛觉过敏的阈值为10.35±0.63秒。对于同侧爪子，异常性疼痛表现的50％收回阈为2.20±0.28g，对于对侧爪子，为13.37±0.37g。在每一随后测试天，对于同侧或对侧爪子，阈值保持相当的稳定性，并且在基准值中没有统计学意义上的显著差异。
B.5.药物治疗在结扎大鼠模型中进行测试以确定三环类抗抑郁剂阿米替林的抗感受伤害作用。所有药物治疗都是盲的。在这两个行为测试中，阿米替林(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)或盐水都是系统施用(通过腹膜内(i.p.)注射)、脊椎施用(通过植入鞘内插管(i.t.))、或局部施用(通过皮下注射(s.c.)到爪子的背侧表面内)。对于系统注射，药物注射体积为5ml/kg，对于鞘内注射，总体积为20μl(10μl药物+10μl盐水)。对于局部注射，用氟烷将大鼠短暂麻醉，将50μl溶液皮下注射到同侧或对侧爪子的背侧表面内。
C1.系统施用的阿米替林对神经损伤诱导的热痛觉过敏的影响如附图2A-C中总结的数据所示，通过腹膜内注射将剂量为1、3和10mg/kg体重的阿米替林系统施用到神经损伤大鼠中，结果对神经损伤爪子的热阈产生了抗痛觉过敏作用。该作用在10mg/kg时最大；注射后60-80分钟，热痛觉过敏几乎达到了完全逆转(MPE＝0.94±-0.17)(附图2A)。对于10mg/kg剂量，在对侧爪子中观察到阈值有轻微但是有统计学显著意义的提高(附图2B)。比较同侧爪子的ΔMPE值(附图2C)，结果发现与盐水对照相比，10mg/kg阿米替林表现出有统计学显著意义的抗感受伤害作用，对于1mg/kg和3mg/kg剂量也是如此。虽然1mg/kg和3mg/kg剂量产生的结果与盐水对照相比有显著差异，但是它们彼此之间没有显著差异。在少数几只大鼠中观察到了10mg/kg剂量的轻微镇静作用，但是对于其它剂量没有观察到任何这种镇静作用。该作用没有影响动物对刺激作出反应的能力，在阈值的反应强度与在基准确定期间观察到的反应相似。
C2.鞘内插管在用于测定脊椎施用阿米替林的作用的动物中，神经损伤后7天植入鞘内插管。为了植入鞘内插管以脊椎递送药物，用氟烷将大鼠麻醉，并固定在定向装置的耳杆上。暴露出在脑壳基质上的脑池膜，切一个小口，并把插管(7.5cm PE-10管)插到蛛网膜下空间。将该插管充满盐水，用小线塞将外端封闭。给大鼠注射Penlong XLR(0.15mli.m.)和乳酸盐林格氏溶液(10ml s.c.)，同时维持麻醉。在测试当天，将大鼠置于塑料容器中以进行鞘内注射(10μl体积，然后用10μl盐水冲洗插管)。
C3.脊椎施用的阿米替林对神经损伤诱导的热痛觉过敏的影响如附图3A-C中的数据所示，鞘内注射阿米替林(60μg)使得神经损伤大鼠对侧爪子的热痛觉过敏部分逆转，这种作用在注射20分钟后变明显，并持续60分钟测试期间。因为30μg剂量在异常性疼痛测试中无效，并且90μg剂量产生高度镇静作用，因此没有使用这些剂量来测试热痛觉过敏作用。虽然各时间点的值自身之间没有显著差异(附图3A)，但是盐水和阿米替林(60μg)的ΔMPE值有显著差异(附图3C)。在对侧爪子收回阈中，无论是各时间点的值还是ΔMPE值的比较，都没有观察到显著差异(附图3B和3C)。
C4.局部注射的阿米替林对神经损伤诱导的热痛觉过敏的影响当局部注射到神经病性爪子内时，如本说明书实施例2所述在大鼠福尔马林测试中产生了局部抗感受伤害作用(附图8)的剂量为100nmol的阿米替林在神经损伤大鼠中具有迅速的有统计学显著意义的抗感受伤害作用，几乎将热痛觉过敏完全逆转(附图4A)。在前120分钟，这些MPE值与盐水的MPE值有显著差异。对侧局部注射阿米替林(100nmol)对同侧爪子的收回潜伏期没有任何显著影响(附图4A)，该结果表明没有系统作用。对于注射盐水(同侧爪子)的大鼠或在对侧爪子中注射阿米替林(100nmol)的大鼠，没有观察到注射爪子的任何局部作用。
局部注射阿米替林100nmol后，幼小动物的收回阈中没有任何显著改变(n＝4，没有给出数据)。此外，同侧和对侧局部注射都没有对对侧爪子收回潜伏期表现出任何显著影响(附图4B)。比较ΔMPE值表明，在对热痛觉过敏的影响方面，局部注射的阿米替林与盐水对照和对侧注射对照相比有统计学显著意义的差异(附图4C)。
C5.系统施用的阿米替林对神经损伤诱导的机械异常性疼痛的影响将阿米替林以1.5、5.0、和10.0mg/kg体重的剂量对神经损伤大鼠系统给药。对于任一剂量，在同侧爪子中都没有观察到对神经损伤诱导的异常性疼痛的任何显著影响(附图5A)。因为10mg/kg剂量在一些大鼠中产生轻度镇静作用，所以没有使用较高剂量。在对侧爪子中，所有剂量的阿米替林都引起了感觉过敏反应，使得MPE(止痛)值下降，为-0.4--0.8(附图5B)。每一剂量的ΔMPE值都与盐水有显著差异(附图5C)。观察到感觉过敏反应表现为对单丝的强烈收回，没有任何局部神经病性疼痛的征兆例如咬、舔、发声或爪子有防卫动作。虽然未损伤爪子中的反应阈值与损伤爪子中的反应阈值非常相似，但是这些反应没有归为“神经病性疼痛反应”。给药24小时后测定的阈值表明同侧和对侧基准返回给药前的值(没有给出数据)。
C6.脊椎施用的阿米替林对神经损伤诱导的机械异常性疼痛的影响还对脊椎施用阿米替林来测试其在同侧爪子中抗神经损伤诱导的机械异常性疼痛的抗感受伤害作用。以30、60和90μg的剂量脊椎施用时，阿米替林在同侧爪子中对异常性疼痛没能产生显著作用(附图5A和6C)。然而，比较这3组的ΔMPE表明，60μg组与30μg和90μg组以及盐水组之间有显著差异(附图6C)。脊椎施用的阿米替林(60μg)在对侧爪子中引起了感觉过敏反应(附图6B和6C)，该反应在大小方面与系统给药后观察到的反应相似。虽然90μg剂量(n＝3)看上去不能促进感觉过敏，这种结果很可能是由于该剂量的阿米替林具有显著的镇静作用、该镇静作用干扰收回阈值的精确测定所致。
C7.局部施用的阿米替林对神经损伤诱导的机械异常性疼痛的影响还局部注射阿米替林来测试对神经损伤诱导的机械异常性疼痛的局部作用。局部注射阿米替林(100nmol)对于神经损伤爪子对触觉刺激的收回反应没有表现出任何显著作用(附图7A和7C)。然而，将阿米替林局部注射到神经损伤爪子内使对侧爪子的反应阈下降。将阿米替林(100nmol)直接局部注射到未损伤对侧爪子内之后也产生了该作用(附图7B)。在对侧爪子中观察到的对局部施用的药物的反应与对盐水的反应有显著差异，但是在各时间点与注射到未损伤爪子内之后的反应没有不同(附图7B)，并且比较ΔMPE也没有发现不同(附图7C)。
实施例2用雄性Sprague-Dawley大鼠(120-160g；组平均142±4g)(CharlesRiver，Quebec，Canada)进行实验。将动物成对饲养，在22±1℃维持12∶12小时光照/黑暗循环，并使它们能任意摄取食物和水。
测试药物是阿米替林、咖啡因、5′-氨基-5′-去氧腺苷(NH2dAD)、盐酸酚妥拉明、二甲亚砜(DMSO)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、8-环戊基-1，3-二甲基黄嘌呤(CPT)、N6-苄基-N-乙基甲酰胺腺苷(N6-苄基-NECA)、MK-801马来酸氢盐、盐酸纳洛酮(ResearchBiochemicals Inc.，Natick，NJ)、2′-去氧助间型霉素(Parke DavisPharmaceutical Research Division，Ann Arbor，MI)。福尔马林(37％甲醛)(British Drug House，Toronto，Ontario)是对照刺激剂。除了CPT外所有药物都溶于盐水，并用福尔马林稀释至适当剂量。将CPT以15％的终浓度溶于DMSO，并包括合适的对照组。A.福尔马林测试在测试当天，将大鼠在28×28×28cm有机玻璃观察室中放置20分钟，以使它们熟悉环境。将在50μl体积内的指定剂量的福尔马林(0.5-2.5％)和福尔马林/药物组合皮下注射到大鼠背侧后爪内。为了确定是否疼痛反应的抑制是由于系统作用而不是局部作用，将测试药物施用到对侧爪子内。为了注射到对侧爪子内，在将福尔马林注射到另一爪子内之前，立即注射药物。注射后，将大鼠放回观察室中，在2个时间期间-1期(给药后0-12分钟)和2期(给药后16-60分钟)内监测退缩行为(抬高、摇动或轻晃臀部)。还监测咬/舔时间。记录是迅速事件的退缩作为不连续的发作，累积记录咬或舔所消耗的时间。同时观察在相邻观察室中的两只大鼠，以交替的2分钟二进制位进行观察。记录的发作和时间没有校正，结果是获得的值代表约一半总表现行为。
依次采用差异分析、和Student-Neuman-Keuls检验(对于多组)或Student t-检验分析数据。B.阿米替林的局部抗感受伤害作用为了测试局部施用的抗抑郁剂的抗感受伤害作用，将阿米替林以10、30、和100nmol的剂量与2.5％福尔马林一起施用。在注射后1期和2期内都观察到退缩行为表现出剂量依赖性减少。这些作用的时间过程呈现在附图8A中，2个时期的累积分数呈现在附图9A和9B中。获得了对咬/舔行为的类似剂量依赖性抑制(附图8B和9C)；然而，在咬/舔行为中没有观察到任何显著1期作用(附图8B)。将阿米替林施用到对侧后爪内之后，阿米替林对这两个参数都没有表现出抑制作用(附图9A-B)。缺乏对对侧后爪的抑制作用表明阿米替林的抗感受伤害作用是局部作用。
在较高浓度福尔马林存在下，疼痛抑制非常明显。例如对于0.75％福尔马林，仅在退缩行为方面观察到疼痛抑制作用，而对于0.5％的福尔马林，根本没有观察到这种作用(附图3)。C.腺苷参与阿米替林的局部抗感受伤害作用为了测定腺苷参与阿米替林的抗感受伤害作用，将咖啡因—一种非选择性腺苷拮抗剂以500和1500nmol的剂量与阿米替林一起施用。在2期退缩和总的咬/舔时间中观察到阿米替林的抗感受伤害作用被显著逆转，但是1期退缩没有受到影响(附图11A-C)。虽然在2.5％福尔马林存在下咖啡因仅使阿米替林的作用被部分逆转，但是咖啡因清楚地逆转了腺苷的局部作用。因此，可推测腺苷的表达可取决于疼痛刺激的强度。为了检验该假设，用低浓度福尔马林进行一些实验。100nmol浓度的阿米替林在1.5％福尔马林测试中使2期退缩减轻的程度比在2.5％福尔马林测试中减轻的程度低，但是咖啡因使阿米替林的抗感受伤害作用完全逆转(附图13A)。然而，在2.5％福尔马林测试中，更高剂量的阿米替林(300nmol)产生的抑制程度可比100nmol阿米替林相比，咖啡因的逆转程度仍然仅是部分逆转(附图13A)。
在1.5％福尔马林测试中，将CPT—一种选择性腺苷A1受体拮抗剂以150nmol的剂量与100nmol阿米替林一起施用，结果使阿米替林的作用被逆转到施用咖啡因所达到的类似程度(图13B)。对于1.5％福尔马林，在许多实验中阿米替林对1期退缩的作用没有被逆转，只有与100nmol阿米替林一起施用的咖啡因逆转了对咬/舔的作用(没有显示数据)。在1.5％福尔马林测试中，咖啡因和CPT没有产生内在作用(附图13A-B)，但是在2.5％福尔马林浓度下，如比较数据所示，咖啡因使退缩轻微下降(附图11A-C和附图12A-B)。
在2.5％福尔马林测试中，将NH2dAD—一种腺苷激酶抑制剂以100nmol一起施用，结果增强了部分有效剂量的阿米替林对2期退缩的作用(附图14)，但是对1期退缩和咬/舔时间没有影响(没有显示数据)。在该福尔马林浓度下，该剂量水平的NH2dAD对福尔马林行为没有内在作用。D.与阿米替林的局部抗感受伤害作用有关的其它机制已知阿米替林具有多种药理作用。进行实验，通过测定各自受体拮抗剂的作用来确定潜在涉及与兴奋性氨基酸受体、生物所产生的胺(去甲肾上腺素、5-羟色胺或5-HT、组胺)和内源性类阿片的相互作用。将非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801以20和100nmol的剂量与福尔马林一起施用，结果使2期退缩行为和咬/舔时间产生剂量依赖性下降(附图15A-B)，其中后一行为对抑制产生了更强的敏感性。没有观察到对1期退缩行为有任何显著作用(没有显示数据)。将MK-810施用到对侧后爪内之后观察到了相同作用(附图15A-B)，这表明MK-801的作用不是局部介导的。这些结果表明MK-801是通过系统途径起作用的。在同侧和对侧后爪内注射100nmol(不是20nmol)还在观察间隔内产生了行为活动过强。与福尔马林一起施用的较低剂量的MK-810(0.03和0.3nmol)对任何测试都没有影响(n＝4，没有显示数据)。
以100nmol的剂量共施用的酚妥拉明(PTA)—一种非选择性肾上腺受体拮抗剂阿米替林的作用没有任何显著影响，但是以500nmol的剂量共施用增强了阿米替林的作用(附图16A)。这种加强是由于酚妥拉明的内在作用与阿米替林的内在作用有加和效果，因为该剂量的酚妥拉明也能独自抑制福尔马林的作用(附图16A)。对于2期咬/舔时间也观察到了相同的作用模式，但是没有观察到酚妥拉明对1期退缩有任何显著作用(没有显示数据)。
为了测定阿米替林的抗组胺或抗血清素激活作用，设计实验来确定阿米替林是否能够改变N6-苄基NECA—一种腺苷A3受体激动剂(该激动剂是通过从肥大细胞中释放组胺和5-HT而产生内在感受伤害性行为)所导致的退缩行为。在这些测试中，100nmol阿米替林没有改变由N6-苄基-NECA导致的退缩数目(不存在阿米替林时25.5±6.3次退缩，存在阿米替林时27.8±4.3次退缩，n＝6/组)。纳洛酮—一种类阿片受体拮抗剂没有改变阿米替林抗2期退缩(附图16B)、1期退缩、或咬/舔时间的局部作用(没有显示数据)。
实施例3测试药物是去郁敏、氟西汀、咖啡因和普萘洛尔(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)、酮舍林和托吡西隆(Research BiochemicalsInc.，Natick，NJ)、和GR113808A(Glaxo Research Group，Greenford，Middlesex，U.K.)。福尔马林(37％甲醛)(British Drug House，Toronto，Ontario)是对照刺激剂。所有药物都在盐水中制备，并且当共同施用时用福尔马林稀释至指定剂量。
如实施例1所述饲养大鼠并通过将第5和6条脊髓神经结扎来进行手术改变。预测试表明该脊髓结扎手术在与结扎相对应的爪子中产生了2-3秒的热痛觉过敏(未结扎一侧基准为10-12秒，结扎一侧为710秒)，手术后该作用至少维持22天。A.福尔马林测试如实施例2所述进行该福尔马林测试。注射后，将大鼠放回观察室中，并对退缩行为(抬高、摇动或轻晃臀部)和咬/舔时间评分。同时观察在相邻观察室中的两只大鼠，以交替的2分钟二进制位进行观察。记录的发作没有校正，因此获得的值代表约一半总表现行为。B.去郁敏和氟西汀的局部抗感受伤害性作用当以2.5％福尔马林独立注射到未手术改变大鼠的背侧后爪内时，去郁敏(10-300nmol)和氟西汀(30-300nmol)都产生了抗2期退缩行为(附图17B)和2期咬/舔行为(附图17C)的剂量依赖性抗感受伤害作用。1期退缩行为表现出更大的变异性，并且仅在最高剂量时有显著下降(附图17A)。咬/舔行为没有任何1期表现(附图18C)。在整个观察期间内，去郁敏以始终如一的方式抑制了这两种疼痛反应行为(如附图18A-B所示)。使用氟西汀也观察到了类似模式的行为抑制(没有显示数据)。然而，当把在同侧爪子中最有效力的剂量注射到对侧后爪中时，没有观察到由于将去郁敏或氟西汀与福尔马林一起施用所产生的抗感受伤害作用(附图17A-C、18B和18C)。这些结果表明，局部注射的抗抑郁剂的抗感受伤害作用仅是局部作用。C.将去郁敏或氟西汀与咖啡因一起施用为了测试咖啡因对抗抑郁药物的抗感受伤害作用的影响，使用1.5％浓度的福尔马林，因为该浓度的福尔马林最清楚地显示了腺苷参与阿米替林的作用(参见上文中实施例2)。将咖啡因(1500nmol)与去郁敏或氟西汀一起施用，结果在福尔马林测试的任一方面都没有对抗抑郁剂的抗感受伤害作用表现出显著影响(附图20A-C)。D.在热痛觉过敏测试中局部施用去郁敏和氟西汀将神经损伤大鼠(SNL)简单麻醉，以将药物注射(以50μl体积)到手术位点(结扎位点)同侧的后爪背侧部位来测试局部作用，或者注射到对侧后爪内来测试系统介导的作用。让不知道该特定治疗的测定人员测定热阈值。
将去郁敏(100nmol)但不是氟西汀(100nmol)局部施用到与手术位点一致的后爪内，结果当用热爪子刺激器确定反应阈值时，产生了局部抗痛觉过敏作用(附图19A和4B)。注射到与未手术位点一致的对侧爪子内，没有观察到任何作用(附图19B)。这些结果表明，在同侧位点中观察到的抗感受伤害作用是局部的。将剂量分别为100nmol的去郁敏或氟西汀局部注射到正常大鼠爪子(对照)内，结果对热阈值没有任何影响(n＝4，未显示数据)。在脊髓神经结扎模型中，将抑制阿米替林对脊髓神经结扎后热痛觉过敏的局部作用(实施例1)的咖啡因(1500nmol)一起施用，结果也阻断了去郁敏的抗痛觉过敏作用(附图21A-C)。E.去郁敏、氟西汀和阿米替林对爪子体积的影响使用市售装置(Ugo，Basile)通过器官充满度测量法测定爪子体积。将后爪插到溶液中至长毛皮肤与无毛皮肤的接合处，通过置换确定爪子体积。在注射福尔马林前确定基准值(一式三份)，然后立即进行持续至少60分钟的行为观察间隔。为了测定时间过程，在各组大鼠中(各组间是分开的)如上所述在高达3小时期间内以30分钟的时间间隔测定体积。
通过将去郁敏和氟西汀(剂量为100或300nmol)与福尔马林一起施用，来测试去郁敏和氟西汀的抗炎作用。结果发现这些抗抑郁剂对仅由1.5％福尔马林引起的爪子体积增大没有任何显著影响，但是有这样的趋势，即在2.5％福尔马林存在下氟西汀导致爪子体积增大(附图22A)。在没有炎性刺激存在的情况下，当施用到对侧后爪内时，氟西汀还显著地使爪子体积增加(附图22B)。还确定了去郁敏和氟西汀作用的时间过程。在这些测试中，去郁敏对爪子体积产生了有限的影响(附图23A)，但是氟西汀在整个3小时观察期间内使爪子体积表现出清楚的剂量相关性增加(附图23B)。该爪子体积增加不伴有爪子变红或自发性不适行为迹象(例如抬高、舔、摇动)。阿米替林还导致爪子体积有有限增加(附图23C)，并且没有显著改变由1.5％福尔马林引起的爪子膨胀的程度(没有显示数据)。F.受体亚型在去郁敏和氟西汀的感受伤害性作用中的作用为了测定5-HT受体亚型涉及氟西汀(100nmol)的作用，以已知能阻断5-HT作用的剂量测定当注射到后爪内时普萘洛尔(5-HT1受体拮抗剂)(300nmol)、酮舍林(5-HT2受体拮抗剂)(500nmol)、托吡西隆(5-HT3/4受体拮抗剂)(300nmol)、和GR113808A(5-HT4受体拮抗剂)(500nmol)对爪子体积的影响(G.J.Doak和J.Sawynok(1997)Neuroscience 80939-949)。这些测试结果表明，酮舍林阻断了由于氟西汀引起的爪子体积增加，但是所有其它拮抗剂则没有阻断，这表明在该作用中涉及5-HT2受体亚型(附图24A-B)。
实施例4A. 5-HT2受体拮抗作用在阿米替林外周止痛中的作用进行实验来解决本领域内关于本发明阿米替林和其它三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的止痛机制的明显的前后矛盾。H.Hall等人首先提出有多种抗抑郁剂可阻断5-HT2受体((1984)Acta PharmacolToxicol，54379-384)。最近，F.V.Abott等人证实外周5-HT2受体阻断剂可阻断福尔马林引起的行为(如上所述使用福尔马林测试，只是使用的是1％福尔马林)，并且根据该低剂量实验结果提出5-HT2受体拮抗剂可用作止痛剂((1996)Neuropharmacology 3599-110)。然而，当上文中Doak和Sawynok(1997)采用2.5％福尔马林测试详细研究5-HT受体亚型参与福尔马林引起的行为时，获得的证据表明是5-HT1、5-HT3和5-HT4而不是5-HT2受体参与这种行为。附图25总结了Doak和Sawynok在1997年的实验结果。
在福尔马林实验中，已知有多种药物作用是强度依赖性的(在其表现中)(例如Sawynok J.，Reid AR(1996)Eur J Pharmacol，298105-111)。由于在使用1％福尔马林的Abott实验和使用2.5％福尔马林的Doak和Sawynok实验中获得的结果有明显矛盾，因此进行实验来重新评价在这两项实验中使用的酮舍林—选择性5-HT2受体拮抗剂的作用。
因为在Abbott实验中使用的是1％福尔马林而不是在Doak和Sawynok实验中所用的2.5％福尔马林，因此采用该较低剂量的福尔马林、使用雄性Spague Dawley大鼠(n＝6/组)、如上述实施例2A所述进行1％福尔马林实验。附图26所示的该重新评价结果表明，甚至在1％福尔马林存在下，剂量为50nmol和500nmol(该剂量等于或大于在Abott实验中使用的9.5-50μg或0.92-92nmol)的酮舍林也不能阻断福尔马林在Spague Dawley大鼠中引起的退缩行为。与之相反，将剂量为3nmol和30nmol的酮舍林共施用来阻断由于把5-HT注射到Spague Dawley大鼠后爪内而引起的爪子体积改变。将药物以50μl的体积注射，通过器官充满度测量法(体积置换法)测定爪子水肿。在附图27A和B中显示的这些实验结果清楚地表明，不能阻止1％福尔马林诱导的退缩行为的该剂量酮舍林能足以阻断由于局部注射5-HT所致的爪子水肿。
Abbott实验与Doak和Sawynok实验之间的唯一其它不同是所用大鼠的种类，Abbott实验使用的是Long Evans大鼠，而Doak和Sawynok实验使用的是Spague Dawley大鼠。可能5-HT受体在这两种大鼠中的感觉传入神经末梢上有不同表达。然而，需要指出的是，在使用其中观察到阿米替林显著止痛作用的大鼠和条件所进行的试验中(2.5％福尔马林，Spague Dawley大鼠)，不能证明5-HT2拮抗作用是在本说明书实验中观察到的阿米替林和其它三环类、第二代或第三代抗抑郁剂的止痛作用的原因。B.胆碱能毒蕈碱和烟碱受体在阿米替林的外周止痛作用中的阻断作用已知阿米替林能结合中枢毒蕈碱胆碱能受体(Hall H，Ogren SO.(1981)Eur.J.Pharmacol，70393-407；Choi A，Mitchelson F.(1994)Pharmacology，48293-300)，并且有人提出其对这类受体的亲和力涉及临床上观察到的阿米替林的一些副作用(Baldessarini R.J.(1990)The Pharmacological Basis of Therapeutics，383-435)。阿米替林还阻断烟碱受体介导的反应(Schofiled G.G.等人(1981)Proc Natl Acad Sci USA，785420-5244Fryer J.D.，Lukas R.J.(1999)J Neurochem，721117-1124)，只是在这种情况下阻断作用似乎是由于抑制其自身离子通道所致而不是在受体结合位点竞争性抑制所致。乙酰胆碱可刺激感觉神经末梢而产生疼痛(Steen K.H.，ReehP.W.(1993)J Neurophysiol，70397-405；Bauer M.B.等人(1994)Neuroscience，62351-359)，并且烟碱和毒蕈碱受体是位于脊神经后根神经节神经元和感觉神经末梢上(Ninkovic M.，Hunt S.P.(1983)Brain Research，27257-69；Wamsley J.K.等人(1981)BrainResearch，217155-161)。由于这些发现，我们进行实验来确定毒蕈碱和烟碱胆碱能受体拮抗剂是否能模拟阿米替林的作用。
在这些实验中，在2.5％福尔马林测试中使雄性Sprague Dawley大鼠(n＝5-8/组)接受与福尔马林一起施用的剂量为10-1000nmol的阿托品(毒蕈碱受体拮抗剂)、美加明(神经节烟碱受体拮抗剂)和d-筒箭毒碱(神经肌肉烟碱受体拮抗剂)。附图28A-C表示了如上所述测定的、药物对1期(附图28A)和2期退缩(附图28B)以及2期咬/舔行为(附图28C)的影响。
在这些测试中，阿托品只有在最高测试剂量(1000nmol)时才使退缩行为减轻。该作用是局部外周作用，这是因为把阿托品施用到对侧后爪内之后没有观察到作用。阿托品还使咬/舔行为产生剂量依赖性减轻，并且该作用看上去似乎是外周和中枢作用的复合作用，因为将阿托品施用到对侧后爪内在最高剂量也使该行为减轻(附图28C)。美加明在最高剂量下对这两种行为都没有显著影响。d-筒箭毒碱在10nmol的剂量下对福尔马林引起的行为没有任何影响，在100nmol剂量下d-筒箭毒碱是致死的，这可能是因为该药物对呼吸系统肌肉的系统活性引起呼吸停止所致。
这些结果表明，当外周施用时，既定的胆碱能受体拮抗剂在抑制福尔马林引起的行为方面仅有很弱的活性(阿托品)或没有活性(美加明和d-筒箭毒碱)。根据这些结果可以推断，阿米替林对福尔马林行为的影响是由于阻断感觉神经末梢上的外周胆碱能受体所致。C.结论在大鼠福尔马林测试中，实验结果没有提供任何证据来支持阿米替林的止痛作用中涉及阻断外周5-HT2、毒蕈碱胆碱能或烟碱胆碱能受体。迄今为止，尽管认为在阿米替林的作用中可能涉及抗组胺、抗肾上腺素能、抗血清素激活和抗胆碱能作用，但是唯一清楚地涉及阿米替林作用的机制是与腺苷受体的一些形式的相互作用，因为腺苷受体拮抗剂咖啡因部分阻断了外周止痛作用。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明实质和范围的情况下可对本发明作出各种改变，因此本发明还包括除在说明书中具体公开的实施方案之外的其它方案，并且本发明范围仅由权利要求书限定。
权利要求
1.一种在具有局部不适位点的个体中产生局部止痛作用的方法，所述方法包括将有效量的三环类、第二代或第三代抗抑郁剂施用到所述位点。
2.权利要求1的方法，其中所述抗抑郁剂是三环类抗抑郁剂。
3.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂具有下述结构Ar1-Z(R)-Ar2其中Z是任选包含1个或2个生物可相容杂原子的7元环、或8元二环，Ar1和Ar2是稠合到Z上的任选被取代的芳香环，且R是烷基氨基或芳基氨基取代基或它们的N-氧化物衍生物。
4.权利要求3的方法，其中所述杂原子是氧或氮。
5.权利要求3的方法，其中Ar1和Ar2独立地任选被生物可相容卤素取代。
6.权利要求3的方法，其中所述烷基氨基或芳基氨基取代基是它们的N-氧化物衍生物。
7.权利要求3的方法，其中所述烷基氨基取代基包含4-5个碳原子。
8.权利要求7的方法，其中所述烷基氨基是叔氨基或仲氨基。
9.权利要求3的方法，其中R选自-(CH2)3N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、-(CH2)3N(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)2、＝CH(CH2)2N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、和＝CH(CH2)2NHCH3。
10.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂选自氯丙咪嗪、丙咪嗪、阿米替林、多塞平、去郁敏、去甲替林、阿莫沙平、马普替林、曲米帕明、和它们当中任意两种或多种的合适组合。
11.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂是阿米替林或去郁敏。
12.权利要求1的方法，其中所述第二代或第三代抗抑郁剂选自米尔塔扎平、文拉法辛、曲唑酮、安非他酮、fefazodone、和它们当中任意两种或多种的合适组合。
13.权利要求12的方法，其中所述第二代或第三代抗抑郁剂具有下述结构Ar3(Y)-X-Ar4(Q)其中Ar3是含氮杂环，Y是稠合到杂环上的芳基，或选自下述基团的1个或2个取代基包含总共约4-8个碳原子的连接在Ar3上的烷基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基和杂芳基取代基，并且Q连接在Ar4上的另一个氮原子上。
14.权利要求13的方法，其中X是包含3个碳原子的烷基。
15.权利要求13的方法，其中Ar3是1，2，4-三嗪酮、Q是包含6-8个碳原子的杂芳基烷基取代基，并且在Q的4位被取代。
16.权利要求13的方法，其中所述烷基取代基包含3个碳原子。
17.权利要求13的方法，其中苯环被选自氯、溴和氟的卤素取代。
18.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂是去郁敏。
19.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂是阿米替林。
20.权利要求1的方法，其中所述三环类抗抑郁剂是局部施用。
21.权利要求1的方法，其中所述抗抑郁剂是作为选自霜剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、喷雾剂、聚合物稳定的晶体、粉剂、和气雾剂的制剂施用的。
22.权利要求17的方法，其中所述抗抑郁剂是通过选自注射、超声粉末注射、和透皮电穿孔的方法施用的。
23.权利要求1的方法，其中所述抗抑郁剂是通过包封在选自微球、聚合物稳定的晶体和脂质体的递送系统中施用的。
24.权利要求1的方法，其中所述止痛作用是抑制由炎症引起的疼痛。
25.权利要求1的方法，其中所述止痛作用是抑制神经病性疼痛。
26.一种局部施用组合物，包含不是多塞平的三环或杂环类抗抑郁剂、和适于局部施用的载体。
27.权利要求26的组合物，其中所述抗抑郁剂是三环类抗抑郁剂。
28.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂具有下述结构Ar1-Z(R)-Ar2其中Z是任选包含1个或2个生物可相容杂原子的7元环、或8元二环，Ar1和Ar2是稠合到Z上的任选被取代的芳香环，且R是烷基氨基或芳基氨基取代基和它们的N-氧化物衍生物。
29.权利要求28的组合物，其中所述杂原子是氧或氮。
30.权利要求28的组合物，其中Ar1和Ar2独立地任选被生物可相容卤素取代。
31.权利要求28的组合物，其中所述烷基氨基或芳基氨基取代基是它们的N-氧化物衍生物。
32.权利要求28的组合物，其中所述烷基氨基取代基包含4-5个碳原子。
33.权利要求32的组合物，其中所述烷基氨基是叔氨基或仲氨基。
34.权利要求28的组合物，其中R选自-(CH2)3N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、-(CH2)3N(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)2、＝CH(CH2)2N(CH3)2、-(CH2)3NHCH3、和＝CH(CH2)2NHCH3。
35.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂选自氯丙咪嗪、丙咪嗪、阿米替林、去郁敏、去甲替林、阿莫沙平、马普替林、曲米帕明、和它们当中任意两种或多种的合适组合。
36.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂是阿米替林或去郁敏。
37.权利要求26的组合物，其中所述第二代或第三代抗抑郁剂具有下述结构Ar3(Y)-X-Ar4(Q)其中Ar3是含氮取代杂环，Y是稠合到杂环上的芳基，或选自下述基团的1个或2个取代基包含总共约4-8个碳原子的连接在Ar3上的烷基、烷氧基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基、杂芳基取代基、和它们的组合，X是连接Ar3和Ar4的包含2-5个碳原子的烷基，Ar4是通过Ar4上的第一个氮原子连接在X上的哌嗪，且Q是任选被生物可相容卤素取代、并且连接在Ar4上的第一个氮原子的苯环。
38.权利要求37的组合物，其中X是包含3个碳原子的烷基。
39.权利要求37的组合物，其中Ar3是在4位被包含6-8个碳原子的芳基烷氧基取代基取代的1，2，4-三嗪酮。
40.权利要求39的组合物，其中所述杂芳基烷基取代基包含氧原子。
41.权利要求37的组合物，其中所述苯环被选自氯、溴和氟的卤素取代。
42.权利要求23的组合物，其中所述组合物还包含惰性载体。
43.权利要求42的组合物，其中所述惰性载体选自水、异丙醇、气态碳氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、香料、凝胶生成材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、脱水山梨醇一油酸酯、甲基纤维素、以及它们的合适组合。
44.权利要求26的组合物，其中所述组合物还包含渗透促进剂。
45.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂选自去郁敏、阿米替林和它们的合适组合。
46.权利要求26的组合物，其中所述组合物还包含渗透促进剂。
47.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂是去郁敏。
48.权利要求26的组合物，其中所述三环类抗抑郁剂是阿米替林。
49.权利要求26的组合物，其中所述组合物是在选自霜剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、喷雾剂、粉剂、聚合物稳定的晶体、和气雾剂的制剂中。
50.权利要求26的组合物，其中所述组合物还包含中和剂。
51.权利要求26的组合物，其中所述组合物是配制成局部注射制剂。
52.权利要求26的组合物，其中所述抗抑郁剂包封在缓释递送载体中。
53.权利要求52的组合物，其中所述递送载体选自脂质体、微胶囊、聚合物稳定的晶体。
全文摘要
已经证明,当局部施用时,三环类、第二代或第三代抗抑郁剂能在具有局部不适位点的个体中产生止痛作用。当局部施用时,这类抗抑郁剂的止痛作用与通过系统施用所达到的止痛作用相当,并且持续时间更长。本发明提供了含有三环类、第二代和第三代抗抑郁剂的局部施用组合物,例如在缓释递送载体中配制成用于局部涂敷或注射的制剂,和使用它们产生局部止痛作用的方法。
文档编号A61P29/02GK1308530SQ99808408
公开日2001年8月15日 申请日期1999年5月19日 优先权日1998年5月19日
发明者J·索伊诺克, M·埃瑟, A·雷德 申请人:达尔豪榭大学