离子电渗装置结构体及生物体内成分的检测方法

专利名称：离子电渗装置结构体及生物体内成分的检测方法
技术领域：
本发明涉及医疗领域中诊断或检查时使用的适当离子电渗装置结构体及生物体内成分的检测方法。
另外，肿瘤，特别是恶性黑素瘤是预后效果非常不好、浸润能力和转移能力非常高的疾病，一旦转移或复发，治疗非常困难，所以期待开发出新的治疗手段。这种恶性黑素瘤是通过检查外科中切除的组织中是否存在黑素瘤细胞等肿瘤标记物来进行确诊的。作为检查方法，采用使用由手术后病灶剖面制成的按印涂片的按印荧光法和使用病灶组织的免疫染色法。在组织染色法中，使用各种黑素瘤标记物抗体(抗黑素瘤抗体)。
但是，由于这种外科上切除细胞的方法不仅给患者带来痛苦和恐惧心理，而且能够增加肿瘤转移的危险，因而不希望这样。另外，由于试料的采集必须在特定的场合下由熟练的医生进行，所以不适于集体检查诊断等筛分法。另外，测定血清中和尿中的5-S-半胱氨酰多巴等多巴和肿瘤标记物等的方法虽然作为症状恶化阶段疾病程度和有无转移等症状的指标，但是作为早期诊断方法不合适。在这种状况下，人们期待开发出并不那么需要现有检查中所必须的高度熟练和经验，而且对肿瘤等能够进行安全、早期诊断的方法。
另一方面，目前作为贴剂，已知含有水杨酸类消炎镇痛药和硝酸甘油等心绞痛治疗药等药品的医疗用贴剂、用于刺激性试验的皮肤接触性试验以及用于确定性变应性皮炎等的致敏物的变应原检测用贴剂。特开昭63-106558号公报公开了一种角质层标本的制作方法，将皮肤的角质层附着粘着性物质上之后，贴付于涂敷有粘合剂的透明板上，接着浸渍在有机溶剂中，溶解除去前期的粘着物质，使上述角质层固定在上述透明板上。另外，在同一申请人的特开昭63-113358号公报中公开了使用上述角质层标本检查角质层状态的方法，这里实施的检查主要是测定角质层物性的检查。而且，同一申请人的特开平4-121664号公报中公开了一种通过粘性薄膜剥离角质层，转移，接着用有机溶剂洗涤，提取角质层中含有的脂质，分析该脂质的方法。
但是，上述特开昭63-106558号公报和特开昭63-13358号公报的方法中，为了固定剥离的角质细胞，有必要用有机溶剂溶解粘着层。因此，不能检测出对有机溶剂不稳定的物质。另外，角质层脂质等用有机溶剂提取的物质已不存在于角质层标本中，以与角质层在皮肤中存在状态相同的状态检查是不可能的。另外，上述特开平4-121664号公报的方法中，不用有机溶剂提取的物质是不可能进行分析的。
另外，特开平-76518号公报中公开了一种疾病的诊断方法，它是对用粘着带剥离固定的组织、细胞或其他物质或载体上吸附固定的组织或细胞分泌的物质等用免疫学方法等进行测定。该方法在肿瘤特别是恶性黑素瘤的初期，没有必要对组织等进行外科性切除，而且不会给患者带来痛苦和恐惧心理，采集生物体组织、细胞或其分泌物等诊断肿瘤。
另一方面，离子电渗是使用外界刺激性的电促进头皮吸收的系统，其原理主要是基于通电后阳极和阴极之间产生的电场中，带正电的分子由阳极向阴极移动，带负电的分子由阴极向阳极移动的力量，促进药物分子透过皮肤屏障。[参照Journal of Controlled Release，18卷，1992年，213-220页；Advanced Drug Delivery Review，9卷，1992年，119页；Pharmaceutical Research，3卷，1986年，318-326页]。
作为利用这种离子电渗进行诊断的用例，已知以诊断囊胞性纤维病为目的投给毛果芸香碱((J.Pediatr)69卷，1966年，285页；(SouthMed.J.)59卷，1966年，197页；(Arch.Dis.Child)40卷，1965年，684页)。另外，近年来为了让糖尿病患者自己测定血糖，提出了使用非侵袭性的离子电渗检测血液中的葡萄糖的技术(参照国际公开号WO96/00110号公报；Pharmaceutical Resarch，12卷，1995年，1869-1873页；Journal of Controlled Release，38卷，1996年，159-165页；同一杂志，42卷，1996年，29-36页)。该方法通过离子电渗形成对流，从而使血液中漏出的葡萄糖移动到装置中设置的溶液层中进行采样。
以前的方法中，使用粘着带的方法在采集特别是生物体组织和细胞的分泌物，即肽或蛋白质等高分子物质时，有必要长时间贴付，在顺应性方面不能说是令人满意的。而且，长时间贴付恐怕也会有皮肤刺激性，这不易给患者施用并会使患者感到不舒适。另外，象这种方法仅依赖于被测物质的被动扩散时，个体间的差异较大，会造成误诊，在性能方面也不能说是充分的。
另外，以前采用离子电渗的方法中，可以检测出低分子物质，但检测出肽和蛋白质等高分子物质时，为了回收被测物质，不仅需要复杂的操作，而且要在试样溶液中将其稀释，因此在测定灵敏度上缺乏实用性。
因而，以前不存在能够迅速而且高灵敏度地检测出目的物质的装置或检测方法。因此，存在不能根据疾病的种类在短时间内进行正确诊断的问题。
因此，本发明的目的在于提供一种能够迅速而且高灵敏度地检测出生物体成分的离子电渗装置结构以及检测方法。
具体地说，例如在诊断肿瘤等疾病时，使用配置有对构成肿瘤等标记物的蛋白质、肽、核苷酸等具有较高吸附性的检测用部件的诊断用装置结构进行离子电渗。而且，通过电的驱动力使生物体内成分吸附固定在检测用部件上，之后从装置中剥离检测用部件，用免疫学方法或化学方法等测定吸附固定的肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或肿瘤相关物质。
也就是说，本发明涉及的离子电渗装置结构体包括离子电渗用电极、通过离子电渗吸附生物体内成分的检测用部件、上述电极和检测用部件之间设置的导电层。这里检测用部件例如由多孔性膜构成，其每1cm2的蛋白质吸附能力为20μg以上，显示较高的吸附性。另外，检测用部件的厚度优选为5-200μm。
另外，检测用部件能够吸附作为生物体内成分的生物体组织、血液和细胞中的至少一种。或者，能够吸附生物体组织、血液和细胞中至少一种分泌的物质。这里分泌的物质例如是肽或蛋白质。
进一步，检测用部件能够吸附肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或其他肿瘤相关物质。这里，肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或其他肿瘤相关物质选自黑素瘤细胞、黑素瘤标记物(NKI/C3)、黑素瘤标记物(PAL/Ml)、黑素瘤标记物(S-100α和β)、癌胎儿性抗原(CEA)、神经芽肿(CE7)、神经芽肿(AD2)、致恶性肿瘤素、α-胎儿性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、碱性胎儿蛋白(BFP)、胰腺癌胎儿性抗原(POA)、胎儿性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相关抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相关抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相关抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相关抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平细胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特异抗原(PA)、铁蛋白、组织多肽抗原(TPA)、肿瘤相关抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素类。
本发明涉及的离子电渗装置用涂药器由具有凹面的衬垫、设置在衬垫凹面底部的电极、设置在衬垫凹面上部的生物体内成分检测用部件以及设置在电极和生物体内成分检测用部件之间设置的导电层构成。与生物体内成分检测用部件相应的部分具备带开口的粘性片材。
本发明涉及的生物体内成分的检测方法中，采用离子电渗使生物体内成分吸附在检测用部件上，通过用免疫学方法或化学方法检测吸附在该检测用部件上的生物体内成分。
本发明涉及的离子电渗系统由离子电渗装置、参比装置以及电源，离子电渗装置包括通过离子电渗吸附生物体内成分的检测用部件、装置用电极以及设置在装置用电极和检测用部件之间的导电层，参比装置包括与装置用电极对应设置的参比电极，电源将上述装置用电极和参比电极之间电连接。这里，检测用部件具有例如平均孔径0.001-20μm的多孔性结构。
这样，本发明的离子电渗装置可以迅速而且高灵敏度地检测出生物体内成分，对于各种疾病的诊断是非常有用的。
图2是说明牛血清白蛋白对诊断用装置所使用的检测用部件的吸附性的图。
图3是说明人胰岛素对诊断用装置所使用的检测用部件的吸附性的图。
图4(a)-(d)是分别表示检测用部件上人癌胎儿性抗原的免疫学染色结果的图。
发明的最佳实施方式以下，参照图面详细地说明本发明。
本发明涉及的离子电渗装置结构体包括离子电渗用电极、通过离子电渗吸附生物体内成分的检测用部件以及设置在离子电渗用电极和检测部件之间的导电层。而且，使用对皮肤或粘膜适用的各种涂药器，采用免疫学方法或化学方法检测通过离子电渗移动的生物体内成分。


图1(a)是具备本发明涉及的离子电渗装置结构体的涂药器的一个实例的剖面图。如图所示，衬垫1形成圆筒状的凹面。例如使用聚丙烯制内径为18mm的物质作为衬垫1。衬垫1的底部设有冲切成圆形的箔型银电极2。箔型银电极2例如直径为10mm，厚度为0.04mm。衬垫1的凹面部分设有电解质层作为导电层3。另外，箔型银电极2上设有连接端子4，它可以通过衬垫1中心部开的小孔与电源相连。在这样构成的装置中设置能够吸附生物体内成分的检测用部件6。检测用部件6的材料等将在后面详细叙述，例如可使用直径20mm，厚度0.016mm的亲水性尼龙膜。检测用部件6预先贴付在比其直径小一些直径为18mm的具有开口的粘性片材5上，离子电渗开始时，使检测用部件6与皮肤或粘膜接触使用。
本发明涉及的离子电渗装置结构体的形态可以是任何一种形态，例如长方形、圆形、椭圆形、正方形、心形、菱形等，对此并没有限定。另外，大小、颜色只要具有实用性并没有特别的限定。
本发明的离子电渗装置的通电可以如图1(b)所示，通过使用电源30在装置10的电极2和与之对应设置的参比装置20的参比电极7之间施加直流电压进行。电源只要是可以施加连续直流电压或脉冲直流电压的物质即可，更优选使用可以施加矩形脉冲直流电压的物质。脉冲直流电压的频率优选在0.1至200kHz，更优选在1至100kHz，特别优选在5至80kHz的范围内适当选择。脉冲直流电压的on/off的比在1/100至20/1，优选在1/50至15/1，更优选在1/30至10/1的范围内适当选择。通电时间为连续通电24小时以下，更优选12小时以下，特别优选6小时以下。
这种离子电渗装置中，例如被测物质是等电点在4附近的蛋白质，在皮肤和粘膜等生物体内具有负电荷，使用离子电渗时向阳极侧移动。因此，检测用装置设置在阳极侧。而且，离子电渗装置通电后，采用免疫学方法或化学方法检测吸附固定在检测用部件上的生物体组织、血液和细胞或其分泌物等。
本发明涉及的装置结构中，其结构的增强方法，即衬垫只要是电绝缘体或实施了绝缘处理的物质，没有特别的限定，优选使用氯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚乙烯醇、偏二氯乙烯聚酰胺以及乙烯-醋酸乙烯共聚物等塑料性薄膜或含有铝的层压箔片等。衬垫的厚度没有特别的限定，优选约为1μm-5000μm，特别优选10μm-600μm。
本发明使用的电极只要是通常离子电渗中可以使用的导电性电极材料即可，没有特别的限定。这种导电材料例如银、氯化银、铝、锌、铜、铁、碳、铂、钛、不锈钢等。其中，银或氯化银的电阻等电特性优良，使用如果使用浆状材料制造，价格便宜而且生产率高。
对本发明的装置结构中的导电层并没有特别的限定。一般优选以对皮肤或粘膜等贴付部位生理性刺激小的组成成分和pH范围使用，为了通过离子电渗使被测物质向诊断用装置移动，优选使用考虑了被测物质即标记物蛋白质、肽等的等电点的电解质组成和pH。而且，本发明所使用的导电层的保持方法可以是凝胶型或溶液型代表的基质型或贮器型等，并没有特别的限定。这种基质型导电性凝胶例如琼脂、明胶、黄原胶、槐树豆胶、角叉菜胶、壳胶、罗望籽果胶、凝胶多糖、果胶、farceleran、瓜尔胶、海藻酸、海藻酸钠、tara gum、刺梧桐胶、纤维素、其衍生物等、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚异丁烯、等合成高分子类和共聚物等，可以单独使用也可以2种以上组合使用。而且，作为溶液型代表的贮器型电解质保持手段，可使用各种具有多孔性或毛细管结构的部件(以下，有时简称为多孔性材料)。这种多孔性材料可以使用有机多孔性材料(例如由纤维素等天然纤维、醋酸纤维素等半合成纤维、聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚酯等合成纤维等形成的纤维集合体，纸等片材，纺布或无纺布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龙、多孔性聚砜、多孔性氟树脂等多孔性合成树脂，海绵等吸水性树脂等)以及无机多孔性材料(例如陶瓷多孔体、具有多孔性或毛细管结构的陶瓷等)等。在上述各种保持手段中，必要时也可以添加电解质、pH调节剂、稳定剂、增粘剂、润湿剂、表面活性剂、溶解助剂等，或使之含浸在其中。
本发明涉及的装置结构的检测用部件可以吸附固定生物体组织、血液或细胞或它们的分泌物等，更优选处于电场时也可以维持其吸附力。另外，检测用部件是亲水性的，对蛋白质、肽等具有较高的吸附性能，对用来检测吸附固定的物质所使用的水、醇、甲醛等稳定，优选在这些溶液中不会从检测用部件上脱离、溶解的物质。对于这种检测用部件没有特别的限定，可以使用对蛋白质、肽等有高吸附力的具有多孔性或毛细管结构的各种亲水性多孔材料或实施了亲水处理的疏水性多孔材料。
优选的检测用部件可以举出有机多孔性材料(例如由纤维素等天然纤维、硝酸纤维素或醋酸纤维素等半合成纤维、聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚酯等合成纤维等形成的纤维集合体，纸等片材，纺布或无纺布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龙、多孔性聚砜、多孔性氟树脂、多孔性聚偏二氟乙烯等多孔性合成树脂等)。
本发明所使用的检测用部件具有对蛋白质、肽显示较高吸附性，其吸附量也大的特点。检测用部件对蛋白质的吸附量每1cm2为20μg以上，优选每1cm2为40μg以上，更优选每1cm2为50μg以上。另外，蛋白质的吸附量可以通过使用代表性蛋白质能够简便测定的惯用方法，例如将1.3cm2的检测用部件在室温下浸渍于含有示踪量的用125I标识的牛血清白蛋白或人胰岛素的溶液(蛋白质浓度为1mg/ml磷酸盐缓冲液)400μl中90分钟后，用磷酸盐缓冲液洗涤，通过测定残留放射活性计算出来。另外，也可以使用被测物质计算吸附量。
这些检测用部件具有多孔性结构，其细孔径只要在被测物质的保持量和目的物质的测定方面不会损害检测性能即可，可以在生物体可接受的范围内选择，例如平均孔径为0.001-20μm，优选0.01-10μm，更优选0.01-1μm。
另外，检测用部件的厚度只要在被测物质的保持量和目的物质的测定方面不会损害检测性能即可，可以在生物体可接受的范围选择，最好是约0.1-500μm，优选约1-300μm，更优选约5-200μm。
其次，说明本发明涉及的检测方法。采用本发明的装置结构，检测用部件上吸附固定的生物体组织、血液或细胞或它们的分泌物是肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或其他肿瘤相关物质等，通过用免疫学方法或化学方法对上述检测用部件进行染色或测定，可以诊断肿瘤等。采用本发明的装置结构以及检查方法可以检测出的肿瘤的例子有皮肤癌、口腔癌、乳腺癌以及直肠癌等。皮肤癌的例子可以举出恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平上皮癌等，口腔癌的例子可以举出舌癌、颊粘膜癌、喉癌等。
另外，上述肿瘤相关抗原、肿瘤标记物和其他肿瘤相关物质可以选自黑素瘤细胞、黑素瘤标记物(NKI/C3)、黑素瘤标记物(PAL/Ml)、黑素瘤标记物(S-100α和β)、癌胎儿性抗原(CEA)、神经芽肿(CE7)、神经芽肿(AD2)、致恶性肿瘤素、α-胎儿性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、碱性胎儿蛋白(BFP)、胰腺癌胎儿性抗原(POA)、胎儿性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相关抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相关抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相关抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相关抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平细胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特异抗原(PA)、铁蛋白、组织多肽抗原(TPA)、肿瘤相关抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素类。
黑素瘤标记物的检测可以考虑特异性和灵敏度使用各种黑素瘤抗体。黑素瘤抗体只要是恶性黑素瘤特异性高的抗体即可，可以是任意一种物质。通过贴付在病变部位，剥离固定或吸附固定有组织、血液和细胞等的本发明的诊断用装置结构，采用使用上述抗体的EIA法、使用各种标识粒子(胶乳、金胶体)的免疫测定法以及荧光免疫测定法，以细胞染色的形式可以检测出组织、血液或细胞中有无肿瘤标记物。另外，5-S-半胱氨酰多巴的场合，本发明的诊断用装置结构的检测用部件经甲醛处理后，可以用荧光显微镜检测出来。这时，通过被染色的细胞的颜色浓度及其个数可以进行定性的判断。另外，也可以使用上述方法以外的任意一种公知检测方法，测定本发明装置结构上吸附固定的组织、细胞、蛋白质、肽等。
以下结合试验例更详细地说明本发明的实施例、比较例，但是本发明并不仅限于这些实施例。试验例1-3中讨论了诊断用装置所使用的检测用部件对蛋白质的吸附特性、扩散性以及在电场中的保持性能。试验例4中选择试验例1-3中的诊断用装置的检测用部件，评价对乳腺癌肿瘤标记物—人癌胎儿性抗原(人CEA)的免疫学染色法的染色性能带来的影响。而且，试验例5中使用本发明的诊断用离子电渗装置，讨论从皮肤检测乳腺癌标记物—人CEA。另外，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司生产)、人胰岛素(Sigma公司产生产)和人CEA(生化学工业)作为代表性蛋白质、肽以及诊断用标记物的例子。(试验例1)为了评价诊断用装置的检测用部件的特性，选择由各种材料构成的多孔膜，讨论对蛋白质的吸附特性。另外，蛋白质的吸附量是通过使用代表性蛋白质能够简便测定的惯用方法，将1.3cm2的各种检测用部件在室温下浸渍于含有示踪量的用125I标识的牛血清白蛋白(I-BSA，0.827mCi/mg，ICN Pharmaceutical Inc.)或人胰岛素(0.912μ Ci/μg，ICN Pharmaceutical Inc.)的溶液(蛋白质浓度为1mg/ml磷酸盐缓冲液)400μl中90分钟后，用磷酸盐缓冲液洗涤，通过用γ-计数器测定残留放射活性从而计算出来。各实施例以及比较例中所采用的检测用部件的材料如下所示。
实施例1硝酸纤维素膜(Biolad公司生产，硝酸纤维素薄膜)实施例2尼龙膜(Pall公司生产，Biodyne A)实施例3疏水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biolad公司生产，PVDF薄膜)比较例1亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司生产，亲水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在试验之前在100％的甲醇中浸润数秒进行亲水处理，之后用磷酸盐缓冲液浸润。
图2是表示实施例1-3和比较例1中牛血清白蛋白(BSA)对诊断用装置所使用的检测用部件的吸附性的图(平均±标准偏差，n＝3)。另外，图3是表示同样在实施例1-3和比较例1中人胰岛素对诊断用装置所使用的检测用部件的吸附性的图(平均±标准偏差，n＝3)。BSA的吸附量如图2所示，在实施例1中为约80μg/cm2，实施例2中为约50μg/cm2，实施例3中为约170μg/cm2。另外，使用蛋白质吸附性低的部件的比较例1中为5μg/cm2以下。另一方面，人胰岛素的吸附量如图3所示，在实施例1中为约100μg/cm2，实施例2中为约80μg/cm2，实施例3中为约150μg/cm2。另外，比较例1中为5μg/cm2以下。硝酸纤维素、尼龙、疏水性PVDF对代表性蛋白质和肽-BSA和人胰岛素具有高吸附能力。(试验例2)其次，讨论各种检测用部件中各种蛋白质的扩散性。采用与试验例1相同的方法，也就是将1.3cm2的各种检测用部件在室温下浸渍于含有示踪量的用125I标识的BSA的溶液(蛋白质浓度为1mg/ml磷酸盐缓冲液)400μl中90分钟后，用磷酸盐缓冲液洗涤，用γ-计数器测定残留放射活性。之后，再在磷酸盐缓冲液中浸渍24小时，同样用γ-计数器测定残留的放射活性。各实施例和比较例中使用的检测用部件的材料如下所示。
实施例4硝酸纤维素膜(Biolad公司生产，硝酸纤维素薄膜)实施例5尼龙膜(Pall公司生产，Biodyne A)实施例6疏水性PVDF膜(Biolad公司生产，PVDF薄膜)比较例2亲水性PVDF膜(Millipore公司生产，亲水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在试验前与上述试验例1同样进行亲水处理。
实施例4-6和比较例2得到的结果如表1所示。
表1

表1表示牛血清白蛋白对诊断用装置所使用的检测用部件的扩散性(平均±标准偏差，n＝3)。如表1所示，实施例4、5、6中，24小时后的吸附量都几乎不减少，确认吸附的蛋白质在溶液中不扩散。另外，比较例2确认几乎没有初期吸附，24小时后吸附量进一步减少。(试验例3)另外，讨论诊断用装置中检测用部件的吸附性能，特别是在电场中的特性。使用作为代表性蛋白质的BSA、人胰岛素，以及一种诊断用标记物人CEA，评价各种检测用部件在电场中的吸附性能。对于BSA、人胰岛素、人CEA，在100-150V下进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(使用10-25％聚丙烯酰胺梯度凝胶)。另外，电泳时各种蛋白质的用量为2.5μg。使电泳后的凝胶与实施例和比较例的2张转印膜重叠，再放上第3张作为支持膜的硝酸纤维素膜，在150mA下转印3小时。转印的蛋白质用酰氨黑染色液染色。各实施例和比较例所使用的检测用部件的材料如下所示。
实施例7硝酸纤维素膜(Biolad公司生产，硝酸纤维素薄膜)实施例8尼龙膜(Pall公司生产，Biodyne A)实施例9疏水性PVDF膜(Biolad公司生产，PVDF薄膜)比较例3亲水性PVDF膜(Millipore公司生产，亲水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在试验前与上述试验例1和2同样进行亲水处理。
实施例7-9和比较例3得到的结果如表2所示。
表2

表2表示诊断用装置所使用的检测用部件对于牛血清白蛋白、人胰岛素和人癌胎儿性抗原在电场中的保持能力。如表2所示，对于BSA(分子量约6万)，在实施例7-9中，主要保持在转印膜(1)上，转印膜(2)上仅能检测出少量。对于人胰岛素(分子量约6000)，与BSA具有同样的趋势，主要保持在转印膜(1)上，转印膜(2)上仅能检测出少量。而且，对于人CEA(分子量约18万)，保持在转印膜(1)上，在转印膜(2)上检测不出来。另一方面，比较例3在电场中BSA、人胰岛素和人CEA通过转印膜，完全不能吸附保持。因此，硝酸纤维素、尼龙、疏水性PVDF对任何蛋白质和肽都具有高吸附性、低扩散性，并在电场中也具有较强的保持能力。(试验例4)其次，讨论各种检测用部件对人CEA的免疫学染色的影响。分别将人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在各种检测用部件上，干燥固定后，进行下述免疫学染色。对固定有人CEA的各种检测用部件进行阻滞处理后，浸润在一次抗体溶液(小鼠抗人CEA单克隆抗体、克隆EB-016，日本生物实验研究所)中。用硼酸缓冲液洗涤后，浸润在生物素标识二次抗体溶液(生物素标识抗小鼠IgF(ab’)2、DAKO JAPAN Co.、Ltd.)中。洗涤后，浸渍在过氧化物酶标识链球菌抗生物素蛋白(streptoavidin)溶液(生化学工业)中，用硼酸洗涤后，用DAB(diaminobenzidinetetrahydrochloride)作为基质，使之显色。各实施例和比较例所使用的检测用部件的材料如下所示。
实施例10硝酸纤维素膜(Biolad公司生产，硝酸纤维素薄膜)实施例11尼龙膜(Pall公司生产，Biodyne A)实施例12疏水性PVDF膜(Biolad公司生产，PVDF薄膜)比较例4亲水性PVDF膜(Millipore公司生产，亲水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在试验前与上述试验例1和2同样进行亲水处理。
实施例10-12和比较例4得到的结果如表3所示。
表3

表3表示各种检测用部件对人癌胎儿性抗原(人CEA)的免疫学染色法的染色性能的影响。如表3所示，实施例10、11中可以检测出lng以上的人CEA。实施例12中，可以检测出10ng以上的人CEA，但在1ng以下则检测不出来。另外，比较例4中完全没有染色，可以认为是在免疫染色的操作过程中流出造成的。(试验例5)使用本发明涉及的装置，通过体外实验研究从皮肤检测人CEA。另外，使用Yucatan Micropigs的表皮层作为皮肤模型。在角质层一侧使用诊断用装置(阳极，银电极)，真皮层一侧设置添加有人CEA(10μg/ml，磷酸盐缓冲液(pH＝7.4))的无纺布层，再与参比电极(阴极氯化银电极)连接。另外，作为诊断用装置的检测用部件，使用具有高吸附能力、低扩散性、高保持能力以及高染色性能尼龙膜(Pall公司生产，Biodyne A)。以频率50kHz、on/off比为50％的脉冲直流电压、0.5mA/cm2通电1小时。免疫学检测采用与上述试验例4同样的染色方法进行。另外，将人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在检测用部件上，作为基准值。
实施例13添加人CEA，实施离子电渗的场合比较例5添加人CEA，不实施离子电渗的场合比较例6仅用磷酸盐缓冲液实施离子电渗的场合实施例13和比较例5、6得到的结果如表4所示。
表4

表4表示使用本发明的诊断用离子电渗装置，人癌胎儿性抗原(人CEA)从皮肤检测出的人CEA浓度和染色性。另外，图4(a)-(b)是表示检测用部件上人癌胎儿性抗原的免疫学染色结果的图。如表4和图4(a)-(b)所示，实施例13中检测用部件的多个部位检测出人CEA，与基准值相比判断检测量，检测出10ng以上的人CEA。染色结果表明通过Yucatan Micropigs表皮内的毛孔或汗腺等，人CEA转移到检测用部件上。另一方面，比较例5、6中没有检测出人CEA(基准值0.1ng以下)。这样，通过皮肤也可以检测出肿瘤标记物，表明本诊断用装置结构以及染色方法具有实用性。
因此，本发明提供的采用离子电渗的装置结构对诊断肿瘤等是有用的。使用本发明的装置结构，不需要进行皮肤或粘膜表面的外科切除或穿刺吸引，不会给患者带来痛苦，可以在短时间内非常容易地采集试样。因此，可以检查诊断皮肤癌、口腔癌、乳腺癌和直肠癌等肿瘤块。而且，可以减少外科处理等引起的复发。另外，使用本发明的装置结构，对于难以判断的极初期肿瘤，也可以确认肿瘤相关抗原、肿瘤相关标记物或其他肿瘤相关物质的有无，使肿瘤的早期诊断成为可能。而且，采用本发明的装置结构，将皮肤或粘膜表面的组织、细胞或它们的分泌物或其他物质吸附固定在检测用部件上，将其直接作为试样使用，因此与现有技术相比可以迅速而且容易地进行诊断，在经济上也是实用的。
工业实用性本发明涉及的离子电渗装置结构和检测方法对迅速而且高灵敏度地检测出生物体内成分是有用的，适用于医疗领域的离子电渗。
权利要求
1.离子电渗装置结构体，其特征在于，包括离子电渗用电极、通过离子电渗吸附生物体内成分的检测用部件、上述电极和检测用部件之间设置的导电层。
2.如权利要求1所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件由多孔性膜构成。
3.如权利要求1或2所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件每1cm2的蛋白质吸附能力为20μg以上。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件的厚度为5-200μm。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件能够吸附生物体组织、血液和细胞中的至少一种。
6.如权利要求1至4中任意一项所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件能够吸附生物体组织、血液和细胞中至少一种分泌的物质。
7.如权利要求6所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述分泌的物质是肽或蛋白质。
8.如权利要求1至4中任意一项所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述检测用部件能够吸附肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或其他肿瘤相关物质。
9.如权利要求8所述的离子电渗装置结构体，其特征在于，上述肿瘤相关抗原、肿瘤标记物或其他肿瘤相关物质选自黑素瘤细胞、黑素瘤标记物(NKI/C3)、黑素瘤标记物(PAL/Ml)、黑素瘤标记物(S-100α和β)、癌胎儿性抗原(CEA)、神经芽肿(CE7)、神经芽肿(AD2)、致恶性肿瘤素、α-胎儿性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、碱性胎儿蛋白(BFP)、胰腺癌胎儿性抗原(POA)、胎儿性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相关抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相关抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相关抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相关抗原(SPan-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平细胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特异抗原(PA)、铁蛋白、组织多肽抗原(TPA)、肿瘤相关抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、酶、氨基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素类。
10.离子电渗用涂药器，其特征在于，由具有凹面的衬垫、设置在上述衬垫凹面底部的电极、设置在上述衬垫凹面上部的生物体内成分检测用部件以及设置在电极和生物体内成分检测用部件之间的导电层构成。
11.如权利要求11所述的离子电渗用涂药器，其特征在于与上述生物体内成分检测用部件相应的部分具备带开口的粘性片材。
12.生物体内成分的检测方法，其特征在于，采用离子电渗使生物体内成分吸附在检测用部件上，通过用免疫学方法或化学方法检测吸附在该检测用部件上的生物体内成分。
13.如权利要求12所述的生物体内成分检测方法，其特征在于上述检测是通过对上述生物体内成分染色或测定进行的。
14.离子电渗系统，其特征在于，由离子电渗装置、参比装置以及电源构成，离子电渗装置包括通过离子电渗吸附生物体内成分的检测用部件、装置用电极以及设置在上述装置用电极和检测用部件之间的导电层，参比装置包括与上述装置用电极对应设置的参比电极，电源将上述装置用电极和上述参比电极之间电连接起来。
15.如权利要求14所述的离子电渗系统，上述检测用部件具有平均孔径0.001-20μm的多孔性结构。
全文摘要
本发明涉及可以迅速而且高灵敏度检测出生物体内成分的离子电渗装置结构体。在这种结构中,具有凹面的衬垫(1)的底部设有电极(2),凹面部分设有导电层(3)。电极(2)上设有连接端子(4),它可以通过衬垫(1)底部开的小孔与电源相连。在这样结构中,设置能够吸附生物体内成分的检测用部件(6)。检测用部件(6)预先贴付在其相应部分具有开口的粘性片材(5)上,离子电渗开始时,使检测用部件(6)与皮肤或粘膜接触使用。
文档编号A61B5/1477GK1308503SQ99808414
公开日2001年8月15日 申请日期1999年5月19日 优先权日1998年6月5日
发明者肥后成人, 安达博敏, 葛卷纪行 申请人:久光制药株式会社