专利名称：葡萄球菌属的趋化性抑制蛋白(chips)及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于治疗炎症反应的新蛋白质。本发明进一步涉及一种纯化所述蛋白质的方法。最后，本发明涉及一个筛选试验，应用该筛选试验可检测类似蛋白质。
炎症反应是一种很普遍的过程，其中，防御细胞奔向一个感染源并在此处保证消灭病原。在这里释放不同的介体，它们有助于消灭作用但还产生炎症。可以区别急性炎症(例如脓毒)和潜伏的慢性炎症(例如风湿症)。抵抗力降低了的人更经常而且更严重地出现急性炎症(例如在艾滋病的情况下)。
细菌感染导致趋化因子的形成，趋化因子保证白细胞来到感染源。趋化物质以梯度形式存在，白细胞沿着该梯度定向运动。趋化剂的来源可能是细菌自身。这些趋化剂例如是具有末端甲酰基的小蛋白质，例如fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)。其它趋化剂有活化补体因子(过敏毒素C3a和C5a)，白三烯[例如LTB4(白三烯B4)和PAF(血小板活化因子)，以及由不同类别的细胞产生的趋化因子，例如白细胞介素-8(单核细胞和内皮细胞)，RANTES(活化时调节的、正常T-细胞表达和分泌的)，eotaxin,MCP(单核细胞趋化蛋白)，MIP(巨噬细胞炎性蛋白)和其它趋化因子。
某些趋化因子仅仅对确定类别的白细胞是特异性的，其它的则影响很多细胞。趋化因子的受体被细分为两大类CC受体和CXC受体，它们都属于蛇根碱(跨膜7次的受体)。蛇根碱是视紫红质样的GTP结合蛋白连接的受体。
趋化细胞因子的总科(趋化因子)的特征在于4个保守半胱氨酸。根据前两个半胱氨酸的相对位置可区别两科CXC或α-趋化因子与CC或β-趋化因子。CXC趋化因子尤其对粒细胞有活性，而CC趋化因子则活化宽范围的白细胞(包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、T-淋巴细胞、NK细胞和树枝状细胞)。该科趋化因子和典型性趋化剂(例如fMLP和C5a)结合并活化蛇根碱。
趋化因子的中和已在实验上被应用了，具体地说，发现了施用抗IL-8的抗体在一些动物实验炎症模型中有效。此外，最近证实了一些趋化因子受体(尤其CCR5和CXCR4)在HIV感染细胞中起辅因子的作用。就HIV的T细胞营养株来说，CXCR4已被鉴定为辅因子，就单主寄生株来说，这是CCR5。用抗体或配体封阻这些受体抑制了体外模型中的HIV感染。此外，发现了具有CCR5受体的遗传性变型(包括32个碱基对缺失)的人们能抗HIV感染。
除了趋化性的诱导、白细胞的定向迁移之外，低浓度的一些趋化因子也是其它白细胞功能的有效激活剂或引物。所以，希望实现趋化因子的封阻，于是，可以抑制炎症反应。
因此，本发明的目的是提高一种具有炎症-抑制特性、用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV的新治疗剂。
在导致本发明的研究过程中，在生长的金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(S.aueus)]胞外培养基中发现了一种蛋白质，发现该蛋白质能封阻不同的趋化因子受体。将不同的细胞与培养基保温导致一些趋化因子受体的表达[既包括典型性趋化剂(例如fMLP和C5a)的受体在粒细胞上的表达又包括CXCR4和CCR5受体在淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞上的表达]大为减少。受体表达的减少与趋化性相对于趋化因子的大为降低有关，也与HIV的感染减小有关。
在生长的金黄色葡萄球菌培养物上清液中表现了该蛋白质的活性。然而，按本发明，还通过一些配体染料柱纯化了所述活性蛋白质。首先在所谓的“黄色柱”[“活性黄86”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma)]上进行了预纯化，接着在吸附层析柱[所谓的“绿色柱”(“活性绿19”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma))]和DNA柱[DNA纤维素(Pharmacia)]上进行。后两种柱可以互换。所述DNA柱除去与本发明的蛋白质相同分子量的污染物。所述吸附层析柱浓缩蛋白质并且对该蛋白质是选择性的。最后，还通过凝胶过滤和任选浓缩的方法进行了后纯化。在凝胶过滤中，选定了分子量约为17kD的蛋白质。这就是本发明的蛋白质。
所述纯化方法的每一步都可通过检测不同柱的流过物质或洗出液的活性来监测。这是通过监测流过物质或洗出液是否能防止fMLP与粒细胞结合而进行的。实施例中给出了详尽的试验方案。
通过微量测序测定了纯化了的蛋白质的前(N-末端)15个氨基酸。在图4中给出了该序列。序列分析表明，未发现与数据库中已知细菌的或真核生物的氨基酸序列的同源性。所以，这是一种新的、独特的蛋白质。
由于该蛋白质是从金黄色葡萄球菌的上清液中分离的并且给出趋化性的抑制作用，所以，本文还将所述蛋白质称为“CHIPS”得自金黄色葡萄球菌的趋化性抑制蛋白。
因此，本发明的第一方面涉及CHIPS蛋白质，其特征在于a)约为17kD的分子量；b)图4中给出的N-末端氨基酸序列；以及c)一种生物活性，它包括在实施例1中描述的试验中防止fMLP与粒细胞结合的能力，及其生物活性片段。
CHIPS蛋白质影响白细胞对化学引诱物源(例如细菌)的趋化性。发现了按本发明，白细胞(尤其是粒细胞)上至少两种受体(fMLP和C5a)的数量被下调了。该减量调节是可逆的。
本发明进一步涉及一种治疗组合物，它包含合适的赋形剂和CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段。所述组合物可被用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV感染。所述蛋白质保证封阻提供白细胞向趋化物质运动的受体。
本发明也涉及用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV感染的CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段，以及CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段在生产用于治疗所述症状的治疗制剂方面的应用。
按本发明的后续方面，提供了用于治疗葡萄球菌(Staphylococcus)感染的、抗CHIPS蛋白质和/或其片段的抗体。所述蛋白质将封阻CHIPS或其片段的活性，所以再起动被细菌终止的趋化性，于是恢复了对细菌的自然防御。
所述治疗组合物(按本发明，它包含作为活性组分的CHIPS或抗它的抗体)特别希望被胃肠外(更具体地说，静脉内)施用。所述治疗组合物可通过将CHIPS与适合静脉内施用的、药物上可接受的赋形剂复合(即，混合、溶解等)而制备。治疗组合物中活性组分的浓度可在0.001％～100％之间变化，取决于治疗的性质和施药方法。施用的活性组分剂量同样取决于施药途径和用途，但例如可在0.001～1mg/kg体重、优选在1μg～100μg/kg体重的范围内变化。
本发明进一步涉及一种纯化CHIPS蛋白质的方法，该方法包括a)将金黄色葡萄球菌的培养物上清液或预纯化后从其获得的液体导引经过吸附层析柱；b1)接着将吸附层析柱的流过物质首先导引经过亲和层析柱，再将亲和层析柱的洗出液导引经过DNA柱；或者b2)接着将吸附层析柱的流过物质首先导引经过DNA柱，再将DNA柱的流过物质导引经过吸附层析柱；c)将步骤b)的最后那个柱的流过物质或洗出液导引流过凝胶过滤柱并选择分子量约为17kD的级分。
“流过物质”在本文应被理解为那部分装填的液体，即，该装填的液体中具有从柱中流出未另外处理的组分。该流过物质中的组分不与柱结合。“洗出液”应被理解为洗脱后从柱中流出的液体，它包含得自装填到柱上的液体的、与柱结合并在洗脱后又从柱中释放的组分。在本发明的方法中，吸附柱结合装填的培养基或预纯化后从其中获得的液体的大部分组分。所述亲和柱结合CHIPS和Snase(葡萄球菌核酸酶)，Snase具有与CHIPS相同的分子量以及分别对于亲和柱、吸附柱相同的亲和性(或其缺乏)。所述DNA柱只结合Snase，于是将它与CHIPS分离。
如果第一个亲和层析柱是所谓的配体染料“黄”柱，第二个亲和层析柱是所谓的配体染料“绿”柱，并且，所述DNA柱是DNA纤维素柱，那么，本方法特别奏效。
最后，本发明还涉及一种测定CHIPS蛋白质或具有类似功能的蛋白质的活性的测定或分析方法，该方法包括a)在第一个区室引入容许趋化性的标记细胞(尤其是白细胞)；b)将一种或多种化学引诱物引入通过至少能渗透细胞的膜与第一个区室隔离的第二个区室；c)将需测试的蛋白质置于第一个区室中；d)在一定的时间后测定第二个区室中的标记量。
细胞能朝化学引诱物的方向运动通过所述膜。CHIPS或类似蛋白质的存在通过钝化化学引诱物的受体而阻止这种迁移。该测试还能更普遍地用于测定其它物质的趋化性调节活性。那么，方法步骤是相同的。
按这种方式发现与CHIPS类似的蛋白质能经历与CHIPS相同的纯化，于是，能测定这二者之间的同源性。
本发明的CHIPS蛋白质还见于表皮葡萄球菌(S.epidermis)和金黄色葡萄球菌中。
在下文的实施例中，除了描述CHIPS对不同的白细胞上不同趋化因子受体的活性的测试与T细胞和巨噬细胞中HIV感染的抑制作用的测试之外，还描述了这种方法其中，经过配体染料亲和层析与吸附层析、凝胶过滤和浓缩这些步骤从金黄色葡萄球菌的培养物上清液分离CHIPS，给出这些实施例只是为了阐述而决不是以任何方式限制本发明。
在实施例中参考了下列图
图1示出了粒细胞与一系列浓度葡萄球菌上清液(SaS)保温以及对fMLP受体和C5a受体的影响。
图2示出了一系列浓度SaS对于粒细胞向fMLP的趋化性的影响。
图3示出了凝胶过滤柱的级分与光密度(OD)(菱形线)和fMLP受体分析中以抑制百分数表示的活性(条形线)。
图4示出了CHIPS的前15个(N-末端)氨基酸的序列(预计总共125个中的)。
图5a示出了粒细胞与一系列浓度纯化了的CHIPS保温以及对fMLP受体和C5a受体的影响。
图5b示出了粒细胞与一系列浓度纯化了的CHIPS保温以及对定向迁移至fMLP的影响。
图6示出了CXCR4在淋巴细胞上的表达。
将2升的SaS导引经过前后偶联的三个柱(25ml)。这三个柱相继是“活性黄86”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma)、DNA纤维素(Pharmacia)和“活性绿19”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma)。洗涤后，用2M NaCl洗脱所述绿(活性绿19)柱，汇集活性级分，用聚乙二醇浓缩10x。在Pharmacia Superdex-200凝胶过滤柱上分离浓缩后的物质，然后汇集活性级分，浓缩，透析并冻干。将最终纯化的物质重悬浮于少量无菌水中，特别用于微量测序分析。
为此，将一个样品在12.5％SDS-PAGE(Mini-ProteanⅡ；BioRad)上分析，再通过Mini Trans-Blotter(BioRad)转移到Immobilon-PPVDF膜(Millipore)上。用考马斯蓝将蛋白质染色，切除约17kD的蛋白质。按自动Edman操作法(其中，应用了Perkin Elmer/AppliedBiosystems 476A)测定该样品的N-末端氨基酸序列。通过HPLC分析了氨基酸衍生物。1.2fMLP与粒细胞的结合从健康志愿者的肝素化血液分离了粒细胞，即，按标准方法[Troelstra等，白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Biol.)61:173～178(1997)]经过Histopaque-Ficoll梯度分离的。用无菌水溶解粒细胞级分中的残余红细胞(达30sec)，在恢复等渗性后洗涤。最后将细胞重悬浮于含0.05％人血清白蛋白的RPMI(Gibco)(RPMI/HSA)中。
在Falcon管中，在37℃下将50μl细胞(5×106个细胞/ml)与50μl含CHIPS的原料(SaS，纯化的CHIPS或柱级分)保温30min。将细胞置于冰上，用RPMI/HSA洗涤一次(在4℃下)，重悬浮于50μl新鲜培养基中。然后，添加5μl BODIPY标记的fMLP(最终浓度0.1μM；Molecular Probes)，将样品在冰上保温60分钟。洗涤后，用流式细胞器(FACScan；Beeton Dickinson)分析与粒细胞结合的荧光fMLP。用LysisⅡ软件计算5000个粒细胞的平均荧光值。1.3趋化性为了测定定向迁移，应用了Transwel系统(Costar)，它包括由3μm聚碳酸酯膜隔离的一个上区室和一个下区室。用BCECF[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基荧光素；Molecular Probes](一种进入细胞的细胞质的荧光标记)标记粒细胞。在22℃下将细胞(5×106个)与3μMBCECF-AM[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基荧光素的乙酰甲基酯]保温20分钟，接着，洗涤三次，以5×106个细胞/ml重悬浮于RPMI/HSA中。将100μl细胞和所需量的CHIPS蛋白质引入Transwel系统的上区室，将整个区室悬浮于标准24孔微量滴定板(Costar)的孔中。每个孔含有600μl RPMI/HSA(添加了或未添加测试用的化学引诱物)。所述化学引诱物是重组C5a(Sigma)、重组白细胞介素-8(Pepro Tech)、血小板活化因子-16(PAF-16；Calbiochem)或fMLP(Sigma)。在37℃下保温60分钟后，从孔中移出所述Transwel容器，在CyoFluorⅡ(PerSeptiveBiosystems)中分析微量滴定板的荧光。荧光度是迁移穿过了膜的粒细胞数的直接量度，以添加的细胞数的荧光百分数表示荧光度。结果图1示出了粒细胞与一系列浓度葡萄球菌上清液(SaS)保温对fMLP受体和C5a受体的影响。可见C5A受体和fMLP受体的急剧减量调节。
图2示出了向引诱剂(fMLP)的趋化性(细胞运动)被强烈抑制了。
图3示出了最强烈抑制活性处于240和280ml之间的洗出范围内。该体积级分在这里相应于约17kD的蛋白质。
图4示出了CHIPS的前35个(N-末端)氨基酸的序列(预计总共125个中的)。基于该序列，按标准Fmoc化学[尤其按De Haas等在免疫学杂志(J.Immunol.)161:3607～3615(1998)以及Alonso de Velasco等在传染与免疫(Infect.Immun.)62:799～808(1994)中描述的那样]制备了所述前15个氨基酸的合成肽。在兔中产生的抗该肽的抗体(按生产商Pierce的指示偶联到KLH上，用弗氏完全佐剂进行皮下免疫，接着用弗氏不完全佐剂强化注射)(例如Alonso de Velasco等在上文描述的那样)中和了CHIPS的活性。
粒细胞的平均荧光值是细胞表面上受体量的量度。以同对比缓冲剂保温的细胞百分数表示扣除背景值之后的相对表达量。结果图5a示出了由于纯化了的CHIPS,C5a受体和fMLP受体二者也从细胞表面消失了。
图5b示出了粒细胞与一系列浓度纯化了的CHIPS保温以及对定向迁移至fMLP的影响。可见，向fMLP的趋化性(细胞运动)被纯化了的CHIPS完全地而且剂量依赖性地抑制了。
权利要求
1．葡萄球菌属的趋化性抑制蛋白质(CHIPS蛋白质)，其特征在于a)约为17kD的分子量；b)图4中给出的N-末端氨基酸序列；以及c)一种生物活性，它包括在实施例1描述的试验中防止fMLP与粒细胞结合的能力，及其生物活性片段。
2．用作生物活性物质的、权利要求1的CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段。
3．用作药物的、权利要求1或2的CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段。
4．用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV感染的、权利要求1的CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段。
5．权利要求1的CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段在生产用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV感染的治疗制剂方面的应用。
6．抗CHIPS蛋白质和/或其片段的抗体。
7．用于治疗葡萄球菌属感染的权利要求6的抗体。
8．治疗组合物，它包含合适的赋形剂和CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段。
9．用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV感染的、权利要求8的组合物。
10．治疗组合物，它包含合适的赋形剂和一种或多种抗CHIPS蛋白质和/或其生物活性片段的抗体。
11．纯化CHIPS蛋白质的方法，它包括a)将金黄色葡萄球菌的培养物上清液或预纯化后从其获得的液体导引经过吸附层析柱；b1)接着将吸附层析柱的流过物质首先导引经过亲和层析柱，再将亲和层析柱的洗出液导引经过DNA柱；或者b2)接着将吸附层析柱的流过物质首先导引经过DNA柱，再将DNA柱的流过物质导引经过吸附层析柱；c)将步骤b1)最后那个柱的流过物质或步骤b2)最后那个柱的洗出液导引流过凝胶过滤柱并选择分子量约为17kD的级分。
12．权利要求11的方法，其特征在于，所述亲和层析柱是所谓的配体染料“黄”柱，所述吸附层析柱是所谓的配体染料“绿”柱，并且，所述DNA柱是DNA纤维素柱。
13．测定CHIPS蛋白质或具有类似功能的蛋白质的活性的方法，该方法包括a)在第一个区室引入容许趋化性的标记细胞，尤其是白细胞；b)将一种或多种化学引诱物引入通过至少能渗透细胞的膜与第一个区室隔离的第二个区室；c)将需测试的蛋白质置于第一个区室中；d)在一定的时间后测定第二个区室中的标记量。
14．测定物质的趋化性调节活性的方法，该方法包括权利要求13的方法步骤，其中，需测试的物质替代步骤c)中的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种新的、具有免疫调节特性的、细菌金黄色葡萄球菌的蛋白质。本发明进一步涉及一种治疗组合物的生产,该组合物可作为一般性的炎症抑制剂和用于治疗艾滋病,本发明还涉及抗CHIPS的抗体在治疗葡萄球菌属感染方面的应用。
文档编号A61P31/04GK1309662SQ99808416
公开日2001年8月22日 申请日期1999年7月12日 优先权日1998年7月10日
发明者J·A·G·范斯特里吉普, C·P·M·范凯瑟尔 申请人:亚利制药有限公司