专利名称：得到高纯度HMG－CoA还原酶抑制剂的方法
技术领域：
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和类似物已知是HMG-CoA还原酶抑制剂，而且被用做抗高胆固醇血药。它们中的大多数是通过不同物种的微生物发酵而生产的，这些物种属于曲霉属、红曲属、诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属、毛霉菌属或青霉属，一些是通过使用化学合成的方法处理发酵产物而得到，或者它们是全化学合成的产物。
活性成分的纯度是生产安全有效的药物的重要因素，特别是如果该药物产品必须在治疗或预防高血浆胆固醇中长期使用。低纯度药物中的杂质的累积在医疗中可能会引起许多副作用。
本发明涉及使用所谓“顶替色谱法”分离HMG-CoA还原酶抑制剂的一种新的工业方法。使用本发明可以得到高纯度的HMG-CoA还原酶抑制剂，而且收率高，生产成本低，适合生态平衡。
已有技术在以前的专利中公开的抗高胆固醇血药的分离和纯化方法包括萃取、色谱、内酯化和结晶方法的各种组合。经过这些过程得到的终产物的纯度遵守USP标准，但是期望的产物的收率相对较低。另外，它们不仅需要大量有机溶剂，还需要适合这些量级的巨大设备。
WO 92/16276中公开的分离方法提供了使用工业HPLC(高效液相色谱)设备得到纯度高于99.5％的HMG-CoA还原酶抑制剂的方案。根据WO 92/16276，纯度≥85％的粗HMG-CoA还原酶抑制剂被溶解在有机溶剂或有机溶剂和水的溶液中。然后将混合物缓冲至pH值在2-9之间，并置于HPLC柱上。收集所关心的HMG-CoA还原酶抑制剂峰后，除去部分溶剂并加入水，或者三分之二的溶剂混合物被除去，HMG-CoA还原酶抑制剂结晶。最后，通过该方法得到的产物的纯度至少为99.5％，收率约90％。
WO 92/16276中公开的方法能得到高纯度的HMG-CoA还原酶抑制剂，收率相对较高，该方法与常规色谱柱相比的缺点是相对小的每根HPLC柱的载样量。加在柱子上的小量样品也与为得到足够量的期望的物质而增加的分离操作的次数，以及导致更高生产成本的大量溶剂的使用有关。
本发明的基础一顶替色谱法与以前所用的色谱方法没有本质区别。
顶替色谱法是基于加在柱上的样品中的组分对固定相上活性位点的竞争。样品中的各组分象火车(train)一样相互顶替，与固定相有非常高亲和性而在过柱时落在所加样品的后面的顶替剂，驱动与顶替剂移动速度相同的样品组分成为单室区带(one-compartmentzones)。各组分的浓缩与纯化同时进行。
顶替色谱法的原理相对比较古老，它从1943年开始就为人所知，但是由于缺少有效的柱子，它直到1981年才被引入实际应用(Cs.Horvath et al.,J.Chromatogr.,215(1981)295；J.Chromatogr.,330(1985)1；J.Chromatogr.440(1988)157)。这些文章引入本文作参考，它们描述了使用反相高效液相色谱柱，以顶替模式进行生物活性肽和多粘菌素抗生素(多肽)的分析的和制备的分离和纯化。对于多粘菌素，使用250×4.6mm的十八烷基硅胶柱，粒径5μm,10％乙腈在水中作为流动相，不同的卤化四烷基季铵作为顶替剂。
在顶替色谱法领域的最近的研究(S.M.Cramer et al.,EnzymeMicrob.Technol.,11(1989)74；Prep.Chromatogr.,1(1988)29；J.Chromatogr.,394(1987)305；J.Chromatogr.,439(1988)341；J.Chromatogr.,454(1988)1(理论优化)；A.Felinger et al.,J.Chromatogr.,609(1992)35(理论优化)，所有文章引入本文作参考)中，使用了相似的柱子，流动相为甲醇在磷酸盐缓冲液中，顶替剂为乙腈中的2-(2-叔丁氧乙氧基)乙醇(BEE)，蛋白质和抗生素头孢菌素C用作样品。
美国专利第5,043,432号(27.08.1991)和EP 416.416分别描述了用顶替离子交换色谱法纯化某种低分子的(低于1000道尔顿)肽(特别是，促吞噬素及其合成的衍生物)的方法，使用阳离子交换树脂做为固定相，迁移溶剂(transporter solvent)为水或各种强酸的稀溶液，所用的顶替剂为不同浓度的三亚乙基季铵盐。在还未公开的美国专利申请第08/875,422号中，描述了使用顶替色谱法分离和纯化万古霉素。
技术方案有时得到大量高纯度的活性物质是困难的，因为很多适合于实验室规模的技术从其使用而言在大规模生产操作中是不够经济的，或者未达到环境标准。以上事实迫使工业上寻找新的技术，它提供既是高质量又是经济和生态上可接受的产品。
本发明解决了从较早的专利和其它文献中得到的方法的缺点，因为它能够得到纯HMG-CoA还原酶抑制剂，另外，该纯化方法本身是省时的，提供高收率，使用小量溶剂。该方法是有利自然的，另外，它不需要大的空间和能量，因而能够大规模经济生产。
要纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂是，例如，选自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、atorvastatin组成的组。选择的用顶替色谱法进行纯化的抑制剂可以是内酯的形式或酸或其盐的形式。
作为本发明特征的顶替色谱法优选包括以下步骤a)用合适的流动相调节色谱柱，b)将溶解在流动相中的粗HMG-CoA还原酶抑制剂进样，c)引入从柱子上顶替HMG-CoA还原酶抑制剂的顶替剂，以及d)得到纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂。
纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂优选通过以下途径得到d1)收集组分，以及d2)用分析HPLC分析组分以及根据纯度质量合并组分。
得到纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂以后，色谱柱可以通过用醇/水混合物冲洗以洗脱掉顶替剂而再生。
然后，用本文描述的方式得到的HMG-CoA还原酶抑制剂根据从已有技术的陈述中已知的方法从流动相中分离，例如通过冷冻干燥，或者优选地，通过结晶得到内酯的形式、酸的形式或盐的形式(优选是碱或碱土盐)。
除了杂质还含有很高百分比HMG-CoA还原酶抑制剂的组分可以用该方法再处理，使总收率超过95％。
所使用的固定相为反相固定相，天然的(带有不同长度烷基链的硅胶)或合成的(C-8或C-18)有机的固定相是合适的。优选地，使用苯乙烯和二乙烯基苯的合成交联聚合物基质。固定相的粒径在3到20μm之间是合适的，优选在7-15μm之间。
所用的流动相优选选自水、乙腈/水溶液和低级(优选是C1-C4)醇水溶液、有机酸、卤代有机酸或无机酸的稀缓冲液如，蚁酸、醋酸、丙酸、盐酸、硼酸、磷酸、碳酸或硫酸与碱金属阳离子、氨或胺。水、乙腈的水溶液，特别是甲醇或乙醇的水溶液是特别优选的，且水溶液中有机溶剂含量优选是80％或更低，更优选是45％或更低，特别是30％或更低。因为流动相中毒性的甲醇可以被毒性较低的乙醇代替，或者至少部分地被水代替，而结果较好，废溶剂的除去更简单，因而从生态方面而言，与已有技术相比，本发明是显著进步的。
所用的流动相的pH值优选在4.5到10.5之间，更优选在6.5到8之间，特别是约7。流动相通过柱子的流速被适当地调节在1.5到30ml/(min cm2)之间，优选在3到15ml/(min cm2)之间。当顶替剂通过与流动相混合被引入色谱柱的同时，流速优选调节在1.5到15ml/(min cm2)之间，特别是在3到10ml/(min cm2)之间，因为更高的流速会导致要收集的样品的稀释，而且分离也会变差。
合适的顶替剂是具有两亲结构的化合物，如表面活性剂、洗涤剂等。顶替剂的例子是长链醇、长链羧酸、长链烷基铵盐、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇(dioxo-alcohols)、聚亚烷基聚乙二醇醚如二亚乙基乙二醇单(或二)烷基醚、聚芳基醚或聚亚烷基聚芳基醚如TritonX-100等。前述的“长链”指含有至少C4-链，优选是至少C10-链，更优选是至少C14链或更长的烷基链。
流动相中顶替剂的浓度适当地调节在1％到35％之间，优选是2-20％，特别是7-14％。
在控制从色谱柱洗脱下来地的各组分的纯度质量的优选的实施方案中，用于要分析的HMG-CoA还原酶抑制剂的分析HPLC方法可以如下进行。
要分析的样品用含有20mM NH4HCO3溶液和乙腈(乙腈的比例调节到使分析物的保留因子在5到10之间)的流动相稀释100倍。10μl该样品被加到Hypersil ODS柱(Hypersil，英国，粒径3μm，柱尺寸50×4.6mm)进行高效液相色谱分析。柱子用流动相在2ml/min的流速下冲洗。在235nm测定吸光度。样品的HPLC纯度用色谱图上各峰面积的比来计算。
完成色谱后，固定相优选进行再生，例如用20-100％低级醇的水溶液做流动相。
本方法用以下实施例说明，但不限于这些实施例。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.7％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并后的组分的HPLC纯度为99.8％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.9％。
得到的组分用实施例9中描述的方法分析。纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
得到的组分用上述HPLC分析方法分析。
纯度≥99.5％的组分被合并。合并的组分的HPLC纯度为99.8％。
权利要求
1．得到HMG-CoA还原酶抑制剂的方法，特征在于该纯化粗HMG-CoA还原酶抑制剂的方法中的一个步骤包括顶替色谱法。
2．根据权利要求1的方法，特征在于HMG-CoA还原酶抑制剂选自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和atorvastatin组成的组。
3．根据权利要求1或2的方法，特征在于HMG-CoA还原酶抑制剂是内酯的形式或其酸或盐的形式。
4．根据权利要求1到3中任一项权利要求的方法，特征在于顶替色谱法包括以下步骤a)用流动相调节色谱柱，b)将溶解在流动相中的HMG-CoA还原酶抑制剂进样，c)引入从柱子上顶替HMG-CoA还原酶抑制剂的顶替剂，以及d)得到纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂。
5．根据权利要求4的方法，特征在于纯化的HMG-CoA还原酶抑制剂通过以下途径得到d1)收集组分，以及d2)用分析HPLC分析组分并根据纯度质量合并组分。
6．根据权利要求4或5的方法，特征在于顶替色谱法另外包括接着的步骤e)通过用醇/水混合物冲洗柱子洗脱掉顶替剂而再生色谱柱。
7．根据权利要求4的方法，特征在于流动相选自由水、乙腈/水溶液或低级醇水溶液，以及有机酸、卤代有机酸或无机酸与碱金属阳离子、氨或胺的稀缓冲液组成的溶剂组。
8．根据权利要求7的方法，特征在于流动相是水、乙腈/水溶液或低级醇水溶液中的任一种。
9．根据权利要求4的方法，特征在于所用流动相的pH值在4.5到10.5之间。
10．根据权利要求9的方法，特征在于所用流动相的pH值在6.5到8之间。
11．根据权利要求10的方法，特征在于所用流动相的pH值为7。
12．根据权利要求4的方法，特征在于流动相通过色谱柱的流速在1.5到30ml/(min cm2)之间。
13．根据权利要求4的方法，特征在于所用流动相/顶替剂混合物通过色谱柱的流速在3到15ml/(min cm2)之间。
14．根据权利要求6的方法，特征在于色谱结束后，用20-100％的低级醇水溶液再生固定相。
15．根据权利要求4的方法，特征在于固定相为反相。
16．根据权利要求15的方法，特征在于固定相为天然的反相，如带有不同长度烷基链的硅胶。
17．根据权利要求15的方法，特征在于固定相为C-8或C-18。
18．根据权利要求15的方法，特征在于固定相为合成交联聚合物基质。
19．根据权利要求18的方法，特征在于交联聚合物基质为苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
20．根据权利要求4的方法，特征在于固定相粒径在3到20μm之间。
21．根据权利要求20的方法，特征在于固定相粒径在7-15μm之间。
22．根据权利要求4的方法，特征在于顶替剂选自由长链醇、长链羧酸、长链烷基铵盐、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇、聚亚烷基聚乙二醇醚和聚芳基醚或聚亚烷基聚芳基醚组成的组。
23．根据权利要求4的方法，特征在于流动相中顶替剂的浓度在1％到35％之间。
24．根据权利要求23的方法，特征在于流动相中顶替剂的浓度在2-20％之间。
25．根据权利要求1到24中任一项的方法，用以生产HPLC纯度超过99.7％的HMG-CoA还原酶抑制剂的用途。
26．通过包括顶替色谱法的纯化方法纯化粗HMG-CoA还原酶抑制剂而得到的HPLC纯度超过99.7％的HMG-CoA还原酶抑制剂。
27．根据权利要求26的物质，特征在于HMG-CoA还原酶抑制剂选自由洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、atorvastatin、美伐他汀和氟伐他汀组成的组。
28．根据权利要求27的物质，特征在于所选择的HMG-CoA还原酶抑制剂为洛伐他汀、辛伐他汀或普伐他汀。
29．根据权利要求26的物质，特征在于所选择的HMG-CoA还原酶抑制剂是内酯的形式或酸或其盐的形式。
全文摘要
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和类似物已知是HMG－CoA还原酶抑制剂，而且被用做抗高胆固醇血药。它们中的大多数是通过不同物种的微生物发酵而生产的，这些物种属于曲霉属、红曲属、诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属、毛霉菌属或青霉属，一些是通过使用化学合成的方法处理发酵产物而得到，或者它们是全化学合成的产物。活性成分的纯度是生产安全有效的药物的重要因素，特别是如果该药物产品必须在治疗或预防高血浆胆固醇中长期使用。低纯度药物中的杂质的累积在医疗中可能会引起许多副作用。本发明涉及使用所谓“顶替色谱法”分离HMG－CoA还原酶抑制剂的一种新的工业方法。使用本发明能够得到高纯度的HMG－CoA还原酶抑制剂，而且收率高，生产成本低，适合生态平衡。
文档编号A61K31/22GK1318063SQ99811076
公开日2001年10月17日 申请日期1999年9月17日 优先权日1998年9月18日
发明者罗克·格拉海克, 杜尚·米利沃耶维奇, 安德烈·巴斯塔达 申请人:莱克制药与化学公司