从含紫杉醇物质生产紫杉醇的高产率提取方法

专利名称：从含紫杉醇物质生产紫杉醇的高产率提取方法
技术领域：
本发明涉及从含紫杉醇物质生产紫杉醇的工业化分离方法，以及一种药品级，高纯度紫杉醇组合物的制品。
背景技术：
紫杉醇(paclitaxel)为烷二帖类假生物碱，是近二十年来所发现的最重要的抗癌药。它存在于Taxaceae科植物，尤其见于红豆杉属的几种树和灌木。多数红豆杉烷类化合物均具有的细胞毒性，在治疗癌症上非常有用。其中又以紫杉醇经过最广泛的研究，也是首先得到批准，应用于临床治疗。
从植物分离得来的天然物的药品方剂，有要求非常高的法规标准。包括生产方法的可靠度，产品纯度。尤其当原料含有其他结构和生物活性相似，具细胞毒性的化合物时更是这样。红豆杉的提取物一般均含有数种红豆杉烷类化合物，例如，浆果赤霉素III，cephalomannine，10-脱乙酰红豆杉醇(″10-DAT″)，10-脱乙酰浆果赤霉素III，7-epi-10-脱乙酰红豆杉醇(″7-epi-10-DAT″)，7-epi-paclitaxel和红豆杉醇-C。这些化合物和紫杉醇的分离，很难达到经济规模。供人类用的紫杉醇组合物的分离方法必需要能制备至少98.5％纯度紫杉醇，只含有微量红豆杉烷类化合物不纯物的。而且法规要求极低量的残留溶剂，例如，提取紫杉醇常用的甲醇，己烷，丙酮等。
除了要在重现性和纯度符合法规要求之外，紫杉醇分离方法还要考虑简单，价廉等经济。紫杉醇在红豆杉属植物中的含量极少，因此，即使采用高紫杉醇含量的植物组织，例如T.brevifolia和T.yunnanensis的树皮(约0.02％)，或T.x media Hicksii灌木的针叶及根(0.005-0.15％)。仍然需要大量原料，来得到相对少量的紫杉醇。常规的提取和纯化紫杉醇的方法均缺乏效率，产率低。昂贵的材料、设备，使得以工业规模制备药品级紫杉醇的成本一向高昂。一般而言，依赖较廉价材料的方法，例如溶剂提取和正相硅胶层析法，都会导致低纯度，低产率，或两者都有。其他可能改善纯度，产率的方法不是不切实用，便是其工业化太过昂贵。
大规模的操作需要一简单、价廉、可重现、高产率、高纯度、可靠的方法。但是高产率、高纯度经常是相背离的。在一多步骤的方法中，高产率有赖于每一中间步骤的高收率，但是以溶剂提取和分配法生产紫杉醇时，高收率的组份会含有大量结构相似的不纯物，必须再通过层析分离以得到高纯度。然则较廉价的层析介质，如硅胶(使用后即可弃，不必再生)，对于含少量紫杉醇的进料，并不具有高效的分离能力。因此，经常需要其他中间步骤来提高纯度，但是会以牺牲产率为代价。
Huang等人描述过从8000磅以上的树皮大规模分离紫杉醇的方法。包括利用溶剂提取，微分(differential)结晶和正相硅胶层析法(Joumal ofNatural Products 49(4)665-669，1986)。该法展示了紫杉醇的一般溶解度和层析特性，也显示出以常规技术要得到高产率，高纯度产物的各种困难。之后的多数工艺，基本上都是Huang等人的方法的改进，以提高产率及/或纯度。但是，这些方法多数是实验室规模，难以放大成有效率的大规模生产。
例如Nair在美国专利Nos.5,279,949和5,478,736(亦见于PCTPublication No.WO 97/09443)所描述的实验室级方法中，采用活性碳将70％乙醇/水提取物脱色，再以硅藻土初过滤，接着以乙酸乙酯提取脱色后的提取物，再蒸干得到红豆杉烷类化合物。将此红豆杉烷类化合物再溶于乙酸乙酯，上料于第一硅胶柱，以己烷/乙酸乙酯梯度洗脱。再继续以串联硅胶柱或者反相层析法纯化。可是Nair的方法不容易应用于工业规模的分离。原因之一是它需要大量的活性碳(约5％-15％重量/提取物体积)，将造成加工，清理和液流等困难。此外，活性碳和后续步骤均无法除去主要的不纯物，即使经过串联硅胶柱纯化，仍然难以分离。其结果是，经过三次正相硅胶层析法纯化得到的产品，纯度仍然不足以供药品级制备。必须再用HPLC或反相层析法纯化，无可避免的降低了产率，并且提高了成本。总之，Nair所描述的实验室级方法，在大规模化极不实际，而且昂贵。
ElSohly等人的美国专利5,618,538和5,480,639提出许多实验室级分离紫杉醇，和其他红豆杉烷类化合物的实例，并评估植物品种，植物各部份，粗提取的溶剂系统，机械提取方法，分配分离的溶剂等。溶剂粗提物接着以硅藻土吸附，再分别用己烷/丙酮，甲醇/二氯甲烷和乙酸乙酯/二氯甲烷作洗脱剂，经三次正相硅胶层析法纯化。层析组份蒸干后，再行下一步骤，但是并未经过沉淀或结晶来提高纯度。从紫杉醇含量0.0074％的500公克曼地亚红豆杉中，可生产28毫克HPLC纯度的紫杉醇。因此，本方法的收率为约70％。虽然可得到高产率的紫杉醇，本方法仍然需要重复四次层析步骤，而且比其他方法使用更多的硅藻土，硅胶和溶剂也是其大规模化的明显障碍。
Rao在美国专利5,380,916、5,475,120和5,670,673(亦见于WO92/07842)采用乙醇，氯仿，苯，甲醇等一系列溶剂提取，接着以反相层析法，实例为HPLC，用乙腈洗脱。但是，由于红豆杉植物提取物中含有许多干扰柱效和维修的杂质，反相层析法并不适合大规模制备紫杉醇。而且，反相层析法的介质非常昂贵，且不易再生，更新成本很高。用乙腈洗脱的大规模制备，必须用昂贵的容器，亦不切实际。Rao报告的产率约为0.05％紫杉醇，但是需要再加工才能达到药品级。原则上，只有能够以大规模生产高纯度紫杉醇的方法，才适用于工业化生产，因为方法的放大通常会对小试时所能达到的产品品质有负面影响。
Hong等人在WO 96/34973的方法采用一种合成吸附剂，例如活性碳或黏土，以甲醇/二氯甲烷提取为初步处理，再以多重二氯甲烷冲洗及沉淀。首先以己烷得到23％紫杉醇沉淀，再经多重乙醇/水分级沉淀，产出85％紫杉醇沉淀供最后以HPLC纯化。Hong等人所描述的方法并不适合大规模制备。不仅因为活性碳有前述缺点，而且己烷，乙醇/水沉淀步骤已经被证实难以重现结果。此外，其多重沉淀步骤的每一步骤需时数天，大量溶剂和工业级的HPLC均缺乏效率，而且昂贵。
应该注意的是，Hong等人在摘要中提到″超过90％的高收率″。但是经仔细检查，可以发现这只是最佳步骤的产率，总收率远低于此。Hong等人甚至曾报告产率达100％的步骤。在实验室经常可以通过大量辅助物质，昂贵、高效的技术(例如HPLC)，或费时费工的方法达到高收率。这些显然都是Hong等人所描述的方法的特点。因此，它可能适合实验室操作，但是其大规模生产的应用极为有限。
Zamir在WO 98/07712所描述的方法，采用有机相提取。继以水洗，活性碳处理，再以非极性溶剂如甲苯，乙醚等，将红豆杉烷类化合物沉淀，重结晶。最后利用反相层析法或HPLC分离一系列的红豆杉烷类化合物，包括紫杉醇。此一方法有上述的诸多缺点，包括使用活性碳(需要多一道除去活性碳粉粒的清理步骤)，以及采用昂贵的反相层析法或HPLC。此外，该方法使用大量二氯甲烷及乙腈，也需要昂贵的容器。
Liu和Yang在中国专利96102442.9所描述的方法的提取步骤，采用多孔高分子反相层析法。首先将乙醇提取物分配到二氯甲烷相，再经水洗，过滤，并立即上料到一多孔聚苯乙烯反相层析柱，用甲醇/水洗脱。其中一组份含有50-68％紫杉醇和约10％cephalomannine。另一组份含有60％cephalomannine和约10％紫杉醇，另一组份含有30％10-脱乙酰浆果赤霉素III可以用丙酮/水沉淀得到76％10-脱乙酰浆果赤霉素III。进一步的纯化则需要反相层析以产出98％的紫杉醇。即使如此，其纯度仍然未达到药品级。尤其不纯物可能尚含有cephalomannine。
Margraff在美国专利5,393,896和5,736,366和Gaullier等人在美国专利Nos5,453,521和5,393,895所描述的，是关于分离10-脱乙酰浆果赤霉素III的方法。10-脱乙酰浆果赤霉素III可做为合成紫杉醇的前驱物。该方法是针对分离前驱物分子，以乙醇提取含紫杉醇的原料，经水洗，有机相提取及沉淀。这些方法并未说明如何分离紫杉醇，但是显示了从红豆杉提取，分离红豆杉烷类化合物的困难度。
Shibuya在欧洲专利700 910-A1所描述的，是关于用溶剂提取，液液分离，硅胶层析法，Sephadex层析，反相HPLC法从苏门答腊红豆杉分离紫杉醇。但其产率仅有0.006％，如此低的产率再度说明了应用反相HPLC法有效分离紫杉醇的困难度。同时这一方法在大规模化极不实际，而且昂贵。
Cociancich和Pace在美国专利5,744,333和欧洲专利553,780 B1,553,780 B1提出从T.x media Hicksii或T.cuspidata等园艺种，及其细胞培养分离紫杉醇的方法。其步骤包括将植物原料以甲醇提取，真空干燥。甲醇提取液以环己烷，二氯甲烷行液液分离，再以硅胶层析法HPLC纯化紫杉醇。但仍然未达到药品级的纯度。另一类似的专利为Lu等人中国专利94114041.5所描述，从T.floridana或T.mairei等以0.007％产率分离98％紫杉醇的方法，其法采用硅胶层析法或HPLC。应用反相HPLC法的缺点已如前述。
总而言之，分离紫杉醇的工艺需要一新的方法，以符合大规模化，快速，采用常规的中低压，正相层析法和廉价材料，以高重现性，高产率分离生产药品级纯度的紫杉醇。本发明符合这些需求，并且提供其他的优点。
发明概述本发明是关于从含紫杉醇物质生产紫杉醇的高产率、大规模提取方法。含紫杉醇物质包括，但并不限于，含紫杉醇的植物组织，植物细胞或微生物培养物。更具体地，本发明提出一项发现，以丙酮/水沉淀法可以从包含至少5％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液制备出至少20％(重量比)紫杉醇的沉淀，或从包含至少10％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液制备出至少40％(通常可达50％重量比)紫杉醇的沉淀。此方法可以在紫杉醇的初期纯化步骤，即达到高产率和高纯度。并可以经济的、大规模地利用常规的层析法，从含紫杉醇物质分离药品级紫杉醇。
在一方面，本发明提出一种从含紫杉醇提取物分离生产紫杉醇的方法，其步骤包括，加丙酮于紫杉醇提取物中，形成丙酮混合液，令丙酮混合液与一种水性溶剂接触，以形成上清液和沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少3倍，再回收此沉淀。在一具体例中，紫杉醇提取物含有至少5％(重量比)紫杉醇，而沉淀含有至少20％(重量比)的紫杉醇。在另一具体例中，紫杉醇提取物含有至少10％(重量比)紫杉醇，而沉淀含有至少40％(重量比)的紫杉醇。在另一具体例中，沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少4倍。
另一相关方面，为从含紫杉醇物质生产紫杉醇提取物。适当的含紫杉醇物质包括红豆杉属的各部组织，红豆杉属的组织细胞培养或微生物培养。含紫杉醇物质通常包括T.brevifolia，T.yunnanensis，T.x media Hicksii，T.x media″dark green spreader，″T.x media Hill，T.chinensis，T.wallichianaT.canadensis和T.cuspidata等红豆杉品种的各部组织。其中T.brevifolia或T.yunnanensis常利用其树皮。而T.x media Hicksii，T.x media Hill，T.xmedia dark green spreader或T.cuspidata常利用其根部及/或针叶，但其可供提取的各部组织均可能利用。在另一具体例中，含紫杉醇物质可能来自红豆杉属的组织细胞培养物，包括其细胞及生长培养基。在一具体例中，该细胞培养物为根细胞培养物。在一相关具体例中，含紫杉醇物质为Erwinia Taxi或Taxomvces andreanae等微生物。
在一具体例中，制备本发明的丙酮混合液的原料紫杉醇提取物，是以至少一次的层析法洗脱而得，通常是硅胶层析法。在另一具体例中，紫杉醇提取物是以至少两次的结晶法，从包含一有机溶剂的混合液制备而得。其他具体例包括以至少一次的层析法洗脱，以及至少一次的结晶法，从包含一有机溶剂的混合液制备而得。在所有制备紫杉醇提取物的具体例中，通常可能进一步以至少一种有机溶剂进行液液萃取，以形成两相溶液，其中一相富含紫杉醇。
本发明中，丙酮/水沉淀法所采用的水性溶剂，包括任何水含量至少50％(体积比)的溶剂。在多数的具体例中，水性溶剂的水含量至少50％(体积比)，通常至少70％(体积比)或至少90％(体积比)。在一特定具体例中，水性溶剂为纯水。有时水性溶剂为缓冲液。在其他具体例中，丙酮/水沉淀法包括将一至五倍体积的水性溶剂加入一倍体积的丙酮混合液。在一具体例中，丙酮/水沉淀法通常包括将二至三倍体积的水性溶剂加入一倍体积的丙酮混合液。在特定一具体例中，约2.5倍体积的水性溶剂加入一倍体积的丙酮混合液。
另一方面，从丙酮混合液制备的沉淀所包含的不纯物量，低于丙酮混合液的不纯物含量。通常沉淀的不纯物含量低于丙酮混合液的不纯物含量至少约50％。在一具体例中，沉淀的不纯物含量低于丙酮混合液的不纯物含量至少约75％。
另一方面，本发明中丙酮/水沉淀法制备的沉淀，通常包含至少90％存在于丙酮混合液中的紫杉醇，更通常包含至少95％存在于丙酮混合液中的紫杉醇。
另一相关方面，本发明提出一种制备含5％(重量比)紫杉醇的丙酮混合液的方法。其步骤包括以甲醇提取含量至少0.005％(重量比)的含紫杉醇物质以制备甲醇提取物；将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分配成两相。甲醇相包含甲醇/水。二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；除去甲醇相后，得到浓缩提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(体积比)的甲醇，少于1％(体积比)的水；浓缩提取物加入一硅胶基质，经洗脱后，达到至少5％(重量比)紫杉醇，再加入丙酮形成丙酮混合液。在一优选具体例中，该洗脱液先经干燥后，再溶解于丙酮，生成丙酮混合液。通常本发明制备丙酮混合液所采用的含紫杉醇物质含量至少5％(重量比)，包括上述的红豆杉属的组织，细胞培养及微生物。
在某些具体例中，丙酮混合液的紫杉醇含量至少10％(重量比)，通常至少12.5％(重量比)。在另一具体例中，丙酮混合液包含至少90％的存在于浓缩提取物的紫杉醇。在另一具体例中，浓缩提取物的甲醇含量为2.5至5％(体积比)，水的含量为0.1至1％(体积比)。
另一方面，本发明提出一种从含紫杉醇物质分离生产紫杉醇的综合方法，适合工业规模的应用，其步骤包括a)以甲醇提取含紫杉醇物质，以制备甲醇提取物；b)将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分配成两相，甲醇相包含水、甲醇，二氯甲烷相包含紫杉醇；c)除去甲醇相后，得到浓缩提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(体积比)的甲醇，少于0.5％(体积比)的水；d)浓缩提取物加入第一硅胶基质，经洗脱后，达到至少10％(重量比)紫杉醇的第一洗脱液；e)将丙酮加入第一洗脱液，生成丙酮混合液；f)将丙酮混合液与一水性溶剂接触，以生成紫杉醇含量至少40％(重量比)的沉淀；g)以第二硅胶层析柱，将该沉淀纯化，洗脱，生成第二洗脱液，紫杉醇含量至少65％(重量比)；h)将第二洗脱液以戊烷结晶，生成第一结晶固体，紫杉醇含量至少85％(重量比)；i)以第三硅胶层析柱将该第一结晶固体纯化，洗脱生成第三洗脱液，紫杉醇含量至少90％(重量比)；j)第三洗脱液浓缩后，溶解于丙酮，以戊烷结晶，生成第二结晶固体，紫杉醇含量至少98.5％(重量比)。
在一优选实例中，含紫杉醇物质的紫杉醇含量至少0.005％(重量比)，最好至少0.02％(重量比)。在某些实例中，第一洗脱液先经浓缩干燥，再加入丙酮。在多数实例中，第一、第二、第三洗脱液至少有一种先经浓缩干燥，再进入下一步骤，通常至少有一种浓缩干燥后，溶解于丙酮中。
在综合方法的某些具体例中，第二结晶固体(终产物)包含至少40％的存在于起始的含紫杉醇物质的紫杉醇。在一具体例中，第二结晶固体通常包含至少60％的存在于起始的含紫杉醇物质的紫杉醇。另一方面，本发明的综合方法的第二结晶固体组合物为至少98.5％(重量比)紫杉醇。在一具体例中，第二结晶固体组合物通常为至少99％(重量比)紫杉醇，更可能高于99.5％(重量比)。另一方面，第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.2％。在某些具体例中，第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.1％，在某些具体例中，第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.05％。另一方面，综合方法的各步骤的收率，通常可回收至少90％存在于前一步骤的紫杉醇。
另一方面，本发明可提出一种紫杉醇组合物，包含至少99.5％紫杉醇，总红豆杉烷类化合物不纯物从0.05到0.14％，通常从0.06到0.09％。在某些具体例中，紫杉醇组合物为至少99.5％紫杉醇和0.01到0.05％cephalomannine，优选为0.01到0.03％cephalomannine。在相关具体例中，紫杉醇组合物为前述的紫杉醇和cephalomannine，并且未包含任何可测量的(低于0.01％)10-DAT，7-epi-10-DAT，或7-epi-paclitaxel。在另一具体例中，以本发明提出的方法制备前述的组合物。本发明更进一步提出将前述的组合物与一医药用载体或稀释液配方，制备成含有紫杉醇的药品组合物，适合施用于温血动物，特别是人类。
本发明提出的所有要项，可以参考下文的详述后得以证明。下文中也引用某些参考文献以求清楚及完整。
发明详述除非另行定义，本文所使用的名词的意义，均为本领域通常理解的那些，包括下述的名词定义″紫杉醇提取物″为从含紫杉醇物质以至少一种溶剂处理，所制备的一种成份。
″浓缩残留物″是一种浓缩的产物，其起始物质通常是一种提取物，组份或洗脱液(一种包含所需物质的溶剂)，通常是将起始物质浓缩干燥而得，浓缩残留物可以有各种浓度成份。
″纯度″是衡量某一特定成份在一个由多成份构成的组合物中的相对比例。除非另行定义，纯度的衡量法为，某一特定成份的重量除以所有固体的总重量，以百分比(％)表示。
″百分比″或″％″，除非另行定义，百分比是指紫杉醇的重量比，纯度或者层析法分析中，红豆杉烷类化合物不纯物的紫杉醇峰面积(在波长227nm测量)与一提取物或终产物的紫杉醇峰面积的比值。″百分比″或″％″的计算，并不包括(加入或自提取物除去的)溶剂重量。举例而言，一个含10％紫杉醇的提取物，可能被稀释，溶解于大量溶剂，可能浓缩于少量溶剂，或被干燥成粉末。在这些情况下均为含10％紫杉醇的提取物。
″红豆杉烷类化合物不纯物″是指存在于含紫杉醇物质或其提取物之中的任一非紫杉醇红豆杉烷类化合物，而红豆杉烷类化合物类不纯物则是指两种以上的该类化合物。通常红豆杉烷类化合物不纯物包括浆果赤霉素III，cephalomannine，10-脱乙酰红豆杉醇(″10-DAT″)，10-脱乙酰浆果赤霉素III，7-epi-10-脱乙酰红豆杉醇(7-epi-1-DAT″)，7-epi-paclitaxel或红豆杉醇-C，以及相关的代谢物，异构物，衍生物。
″总红豆杉烷类化合物不纯物″是指一种红豆杉烷类化合物或所有红豆杉烷类化合物的总量。
″沉淀″是指将溶质与溶剂分离，并凝聚成为固相，所得到的固态物质。同时亦指将溶质凝聚成为固相的操作。沉淀是得自低于98.5％纯度，通常低于50％纯度的起始物质。
″结晶物″及″结晶″为一般所理解的意义，是指从一溶液中，将一具有相对规则性，空间排列的化学物质分离生成固态。本名词亦可取代沉淀，尤其当溶液纯度高于50％时。虽然本文中尽力区别沉淀与结晶两惯用词的差异，本发明在此所有的描述并不局限于此定义。应了解的是一沉淀物可能包含结晶物，一结晶物亦可能包含非结晶型的沉淀。沉淀与结晶可能常被混用，意指从一溶液中生成固态物质。
″硅胶基质″是指一种硅氧化物固体介质，用做吸附剂或层析分离中层析柱填充物，包括，但并不局限于，一般的硅胶，Florisil，多孔硅胶或任何应用于层析分离的硅氧化物的物理配方。
″洗脱液″是指将吸附剂或硅胶基质与一种流动相洗脱剂接触，所分离出的物质。
″水性溶剂″是指一种含水量至少50％体积比的溶剂，亦可能包含溶质，其他溶剂，或两者都有。
″上料″是指即将以一特定纯化步骤处理前的该物质。
″含紫杉醇物质″是指含有可提取的紫杉醇的植物特定部位，植物组织，细胞培养，或微生物培养。
″药品级紫杉醇″是指一种符合法规单位所订的纯度标准的紫杉醇组合物。纯度标准的一种实例为，至少98.5％紫杉醇，少于1％水，单独红豆杉烷类化合物不纯物低于0.2％的组合物。
如前所述，本发明提出一种采用常规的正相硅胶层析法，从起始的含紫杉醇物质以高产率分离生产药品级紫杉醇的方法，适合工业规模的应用。本发明的一关键方面，是采用一种丙酮/水沉淀法得到高纯度、高产率的紫杉醇。本发明的优点包括采用正相液态硅胶层析法，并有能力将存在于起始的含紫杉醇物质中，至少40％的紫杉醇制备成为药品级紫杉醇，通常至少60％。这些优点可以综合而成一种以工业规模生产紫杉醇的经济方法，实例如下述大规模分离生产紫杉醇的方法。
在某些具体例中，丙酮/水沉淀步骤可在分离生产紫杉醇的方法初期实施，以减少生产药品级紫杉醇所需的后续步骤。在某些具体例中，丙酮/水沉淀步骤可能在一分离方法的末期实施，以协助除去残留的不纯物。在一具体例中，丙酮/水沉淀步骤可能在一分离方法的中期实施，其间有些不纯物已被除去，有些不纯物仍残留。当其在一分离方法的中期实施时，丙酮/水沉淀步骤可提供一个四至五倍的高纯化率的单步骤，以及至少90％，通常95％，的高产率单步骤，并且可具体除去不纯物。
由于分离生产紫杉醇是一多步骤的方法，当提取物为含至少10％紫杉醇时，在分离方法的中期实施丙酮/水沉淀步骤最为有效。因此，最好用一具体例，从提取起始的含紫杉醇物质开始，来描述本发明。应了解的是，此公开方式仅为阐述的方便，本发明并不局限于此描述。
1)起始的含紫杉醇物质本发明中，适合用来分离生产紫杉醇的含紫杉醇物质，为任何高紫杉醇含量，最好至少为0.005％干燥重量的植物组织。适合用的植物组织包括红豆杉属的各部组织，优选为T.brevifolia或T.yunnanensis，的树皮，和园艺种红豆杉如T.cuspidata，T.x media spp Hicksii，T.x dark greenspreader和Hill.，T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa，T.sumatrana和T.floridana的根部及针叶。其他适用的物质包括红豆杉属的植物组织培养。植物组织培养的方法可见于Cociancich和Pace的美国专利5,744,333和欧洲专利553,780 B1和Strobel等人的美国专利5,451,392。Strobel等人的专利进一步提供一种自细胞生长培养基提取紫杉醇的方法，该法也适合用于本发明。微生物若表现出可供提取的紫杉醇的，亦适合用于本发明，例如细胞饼或发酵液。实例之一为Page等人在美国专利5,451,392所描述的，从某些红豆杉属分离出的Erwinia微生物。另一实例为Taxomyces属微生物，更确切的说，为紫杉醇产生菌Taxomyces andreana。其他实例包括利用基因重组技术改良的紫杉醇产生菌。
虽然紫杉醇含量至少为0.005％的含紫杉醇物质为优选，本发明的丙酮/水沉淀法可应用于以任何起始的含紫杉醇物质所产生的，至少为5％紫杉醇含量的提取物。(关于这一点本发明的背景对适合用于本发明的植物组织，红豆杉属的植物及/或提取物的制备方法均有描述)。
在一种通常的操作中，常将含紫杉醇物质粉碎，切碎，或磨碎成小块以增高溶剂提取的效率。含紫杉醇物质亦可被干燥。含紫杉醇的细胞培养细胞，微生物，或发酵液在溶剂提取之前通常先经浓缩。细胞及微生物可能以全细胞，细胞饼，或粉碎物进行加工。
2)提取含紫杉醇物质常与一种溶剂接触，进行初提取。通常至少8小时或者约三天。物理搅拌可促进含紫杉醇粗提取物的生成，但是可有可无。提取时，可以采用任何曾经被描述过的，用来提取紫杉醇的溶剂系统。包括，但并不局限于，丙酮，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，氯甲烷，氯仿，其混合液以及含高达60％水相成份的各混合液。这些溶剂通常以每公斤含紫杉醇物质约4-20 L的比例加入，以制备粗提取物。实例为背景篇所引用Nair、ElSohly、Zamir、Rao、Slot、Hong、Lu、Liu和Yang的专利，其中提供了制备含紫杉醇粗提取物的许多种溶剂系统的描述。
在本发明的一项实践中，该有机溶剂为一种极性有机溶剂，通常为一种醇类。在某些实例中，优选甲醇，因为其低成本，易于除去，并具有提取紫杉醇的高效率。在一实例中，以每公斤含紫杉醇物质约6-15 L甲醇的比例加入，以制备粗提取物。提取可以通过搅拌含紫杉醇物质来加速。例如，通过搅拌或浸透甲醇与含紫杉醇物质1至5天，温度在室温至约60℃，通常维持在约60℃。取前述紫杉醇含量至少为0.005％的含紫杉醇物质，以甲醇采用上述方法提取3天，可以回收至少90％的紫杉醇，产生的甲醇粗提取物中，紫杉醇含量约为0.1-0.5％，总固体含量约为0.5-5％(重量/体积比)。
大量的甲醇粗提取物亦可以浓缩。通常以蒸发浓缩10-30倍，产生的固体含量约为100-400公克/L。
3)液液萃取粗提取物通常接着实施1-3次液液萃取，以增稠其紫杉醇。液液萃取是将粗提取物与一不互溶的有机溶剂混合，以形成一两相系统。其中一相含有紫杉醇。通常该两相系统包括一极性相。亦可选择将含紫杉醇相蒸发浓缩，以达到固体含量约为100-400公克/L。紫杉醇含量约为1-4％。在某些具体例中，采用水以协助除去水溶物。选用极性较差的溶剂以除去蜡，脂类，色素，脂醇等不需要的物质。通常液液萃取采用的溶剂包括己烷，二氯甲烷。当粗提物取采用的溶剂为一醇类时，二氯甲烷特别适合含紫杉醇物质的液液萃取。
液液萃取可以增稠浓缩提物液的紫杉醇纯度十倍，约达1-4％，其产率至少90％。浓缩提物液可能蒸发浓缩，浓缩残留物再溶解于一溶剂，做为第一硅胶层析柱的上料。
液液萃取的其他实例，可见于Rao在美国专利5,380,916、5,475,120和5,670,673，ElSohly等人的美国专利5,618,538和5,480,639及其文献。这些方法或其变化，均可应用于本发明的具体例。唯一的要求是，最后的浓缩提物液的紫杉醇纯度至少约1％。关于这一点，当提物液的紫杉醇纯度通过由其他中间步骤，如沉淀，结晶，或层析而提高到约1％以上时，液液萃取步骤则可以完全省略。实例之一可见于Zamir的WO98/07712在有机相提取之后，立即进行沉淀，而提高到约1％以上的紫杉醇组份。
4)第一硅胶层析柱以制备10％丙酮混合液含紫杉醇1-4％的浓缩提物液接着以正相的硅胶层析法纯化。此处，硅胶层析法是关于将试样溶解于一上料溶剂，上料于一硅胶基质，然后以洗脱剂洗脱此硅胶基质，以得到含有所要物质的组份的一种方法。
第一硅胶层析柱的尺寸，是依据待分离的固体量和纯度来决定。在本发明的一具体例中，有一先导级方法采用约250公克固体，溶解于一约0.75 L上料溶剂，再以一1.5英寸×10英尺的硅胶层析柱层析。在另一具体例中，有一先导级方法采用约40-50公斤固体，溶解于一约100-200 L上料溶剂，再以一18英寸×10英尺的硅胶层析柱层析。
据本发明公开，在硅胶层析柱上端最好加一层约1-15公分的硅藻土，优选为2-8公分，做为一预滤剂，以便具体减低上料时间。本发明亦公开，该硅胶层析柱的最佳洗脱剂，为约3∶1的己烷/丙酮混合液，而″核心组份″为包括第一个含有至少2％的紫杉醇组份到最后一个含有至少2％的紫杉醇组份。这些组份收集后，可得到第一硅胶层析柱洗脱液，含有至少5％的紫杉醇，通常为至少10％，更通常为至少12.5％的紫杉醇。相关资料可见于例3及4。
本发明的一项意外发现，是采用硅胶层析柱，以己烷/丙酮溶剂系统纯化紫杉醇时，会受上料浓缩提取液的甲醇及水含量的影响。通常，假如甲醇含量超过10％，水含量超过2％时，对收率及纯度均有不良的影响。此一发现对于采用粗提取液作上料的大规模层析非常重要。在浓缩时，该粗提取液经常会凝胶化，因而影响柱流动。添加少量甲醇及水可以提高上料的流动性质，但太多甲醇及水反而会影响柱效，因此最佳的甲醇及水含量是本发明的另一方面。
实施例3显示不同的甲醇及水组合的实验资料。在本发明的一具体例中，第一硅胶层析柱的上料的甲醇含量，被降低到5％以下。在另一具体例中，甲醇含量被降低到约2.5％-5％，水含量被降低到约0.1到1％。如此可以从上料回收90％到95％的紫杉醇，纯度10％到16.8％。通常的收率为95％的紫杉醇，纯度至少12.5％。这些组份收集后，经蒸发浓缩，浓缩残留物再溶解于丙酮，以制备丙酮混合液。
常见的工艺中，均可能以其他的纯化方法来制备至少5％丙酮混合液。例如，本发明的背景所提供的实例方法，可制备至少5％可溶于丙酮的组份。通常，其他的纯化方法会包括后续纯化步骤。在某些具体例中，这些步骤包括其他层析步骤例如反相HPLC或离子交换柱。更常有的情况是，该层析柱会含有硅胶基质。虽然其他介质亦可。其他方法并不需要采用柱层析来制备5％提取液。这些方法通常包括至少两次的沉淀或结晶。其他方法需要一次层析步骤，和至少一次的沉淀步骤来制备5％提取液。在一典型的方法中，上述的任何一方法和液液萃取结合后可以制备10％提取液。任何提取液均可能再溶解于丙酮，以制备丙酮混合液，供本发明的各具体例使用。
5)丙酮/水沉淀法如前所述，本发明的一关键方面为，发现将含有至少5％紫杉醇的丙酮混合液与一水性溶剂接触沉淀，可产生至少20％的沉淀。将含有至少10％紫杉醇的丙酮混合液与一水性溶剂接触沉淀，可产生至少40％的沉淀，通常可产生至少50％的沉淀。此外沉淀法可以达到至少90％收率的高效率。在一具体例中，采用此一发现将紫杉醇的纯度提高至少3倍，通常可达4倍。水性溶剂应包含至少50-100％(体积比)的水。通常水性溶剂应包含至少70％(体积比)的水，优选水性溶剂应包含至少90％(体积比)的水。在一具体例中，水性溶剂为水。有时候水性溶剂为缓冲液。通常以1-5体积水性溶剂加入一体积的丙酮混合液。更确定的说，水性溶剂体积视丙酮混合液成份，和其他溶剂的存在而定。通常以2-3体积水性溶剂加入一体积的丙酮混合液，在一优选操作中，以2。5体积水性溶剂加入一体积的丙酮混合液。在其他具体例中，水性溶剂可能为缓冲液。
在一具体例中，丙酮/水沉淀步骤中丙酮/水的比例约为2-3时，可以达到高收率。在一具体例中，丙酮/水的比例约为1比2.5时，可以达到较本例稍高的收率。表一列举的实验，采用得自同一第一硅胶层析柱的丙酮混合液，丙酮/水的比例约为1比2时，可以达到至少约90％的收率。丙酮/水的比例约为1比2.5时，可以达到至少约95％的收率。表一中，各种丙酮/水的比例所达的高收率显示，丙酮/水沉淀法中的水含量仍然可以最佳化，以应用于其他的紫杉醇分离法。
表一

在丙酮/水沉淀步骤中，水性溶剂用量的最佳化非常重要。尤其当丙酮混合液不同于前述得自硅胶层析柱的丙酮混合液，或者当水性溶剂的含水量少于90％的情况。常用一法来立即评估一丙酮混合液中丙酮/水的最佳比例。其法为将该丙酮混合液与各不同量的水性溶剂混合，回收其沉淀，再以HPLC或TLC分析其收率，纯度及组合物份。估计丙酮/水的最佳比例应受到几种变数的影响，包括含紫杉醇物质的来源，制备提取液的溶剂系统，制备丙酮混合液前段的纯化步骤，以及丙酮混合液中的固体组合物组份。举例来说，Nair在美国专利5,279,949和5,478,736的描述，以70％乙醇提取含紫杉醇物质以制备丙酮混合液，应该较Zamir在WO98/07712的描述，以甲苯或乙醚所沉淀处理得到的提取液，含有更多的水溶性成份。同理，Hong在WO 96/34973的描述，以多重醇/水沉淀得到的提取液，应该比本发明的描述，得自硅胶层析柱洗脱液的丙酮混合液，含有较少的水溶性成份。
丙酮/水沉淀法的最佳化的一重要变数为，用来溶解10％提取物的丙酮量。其浓度必须能保证好的收率，和增稠沉淀中的紫杉醇。表二列举的实验，采用得自同一丙酮/水的比例约为1比2，当丙酮用量为固体浓度1公克/5毫升时，紫杉醇无法沉淀，当固体浓度稍降低到1公克/10毫升时，可得高的收率，但纯度略低(42.5％)。固体浓度至少1公克/20毫升时，可得约97％的收率，51.1％纯度。固体浓度降低到1公克/25毫升时，收率降低至约90％。因此，在一丙酮/水沉淀法的典型具体例中，通常将固体溶于丙酮以达到1公克/20毫升(50公克/L)的固体浓度。
表二

本发明的另一观察发现，丙酮/水沉淀法中的产品收率和纯度，依赖于丙酮混合液含有的的紫杉醇的纯度。表三列举的实验中，纯度11-16％的丙酮混合液的产品收率为91-96％，纯度46-56％，当丙酮混合液的纯度低于10％时，产品收率低于93％，纯度低于43％。因此，在本发明的各具体例中，均包括采用一丙酮/水沉淀步骤使沉淀的紫杉醇收率至少90％，优选收率95％。
表三

在先前方法中，曾采用含有丙酮的一种双溶剂沉淀法，但效果不好。原因可能是，这些方法中采用丙酮/己烷来沉淀不纯物，而不是沉淀紫杉醇。可能是这些方法中，采用纯度低于5％紫杉醇的提取物，可能采用丙酮搭配其他溶剂，例如戊烷，因而无法有效的纯化。例如13.8％紫杉醇的粗提取物，在一丙酮/戊烷溶剂系统中即无法沉淀。当紫杉醇的含量提高到29.3％或50％，在戊烷中可得纯度45％或50％沉淀，但是收率50％或77％很差，令该方法不切实用。同理，采用丙酮/己烷来沉淀粗提取物中不纯物的尝试，也缺乏效率。虽然可将粗提取物中不要的化合物，蜡、脂类、色素、脂醇等除去，所除去的不纯物仍然很少量，使得该方法不符合生产的要求。其他结果则显示，丙酮/己烷处理不足以提高纯度，通常只提高10％，从1.65％到1.8％。因此，本发明的丙酮/水沉淀法，较先前各种采用丙酮的沉淀法，具备更明显的优点。
本发明的丙酮/水沉淀法，可以应用于各种产紫杉醇分离程序之中。在一具体例中，先进行至少一次层析法，再进行丙酮/水沉淀法。在另一具体例中，丙酮/水沉淀法是应用于紫杉醇分离程序的中段。例如，在第一硅胶层析柱和第二硅胶层析柱之间。在其他具体例中，丙酮水沉淀法可以应用于一种制备至少5％紫杉醇的程序之中。当其应用于分离程序的中段时，本丙酮/水沉淀步骤可在紫杉醇分离早期，即提供高产率、高纯度，有助于其后的纯化步骤。由于丙酮/水沉淀法具有这些简易、低成本、高效率的优点，使其应用于大规模的紫杉醇生产经济可行。
6)第二硅胶层析柱和第一结晶在本发明的一具体例中，采用一丙酮/水沉淀步骤得到至少40％紫杉醇，再以常规的硅胶层析纯化。采用二氯甲烷/乙酸乙酯作洗脱剂，相似于ElSohly等人在美国专利5,618,538和5,480,639的描述。本发明的第二硅胶层析柱的特点，在于其上料和操作规模。在本发明中，第二硅胶层析柱上料是以丙酮/水沉淀法大规模制备，含有至少40％紫杉醇，通常含有1.5-2.0公斤的固体。该上料先溶解于5-7 L二氯甲烷，再加入一12英寸×10英尺，不锈钢制的硅胶层析柱。柱上端最好加一层硅藻土，以初过滤该上料。层析柱的洗脱流动相，包括二氯甲烷到50％二氯甲烷/乙酸乙酯的梯度洗脱，再收集其组份，得到核心组份至少65％紫杉醇，低于1％的cephalomannine，紫杉醇的收率为92％-95％。
第二硅胶层析柱的洗脱液，接着再浓缩，蒸发，干燥，再溶解于丙酮，以两倍戊烷稀释，在4℃搅拌，得到第一结晶固体。并以过滤，干燥，收集第一结晶固体。通常第一结晶固体可自第二硅胶层析柱的洗脱液回收紫杉醇90-95％％，纯度为85-96％紫杉醇，和低于1％的cephalomannine。
7)第三硅胶层析柱和第二结晶第二硅胶层析柱得到的第一结晶固体，含有至少85％紫杉醇。接着再以第三硅胶层析柱，以二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱剂纯化。本发明中，第三硅胶层析柱上料，是以大规模分离含有600-900克固体的一种设计。在一具体例中，该上料先溶解于2-4L二氯甲烷，再加入一12英寸×10英尺，不锈钢制的硅胶层析柱。层析柱的洗脱流动相包括100％二氯甲烷到50％乙酸乙酯/二氯甲烷的梯度洗脱，或等度洗脱，再收集其高于90％紫杉醇组份。得第三硅胶层析柱洗脱液。通常，第三硅胶层析柱的紫杉醇收率92％-95％，紫杉醇纯度为90-98％，cephalomannine低于1％。
第三硅胶层析柱洗脱液接着再浓缩，蒸发，干燥，，再溶解于丙酮，以两倍戊烷稀释在4℃搅拌，得到第二结晶固体。并以过滤，干燥，收集第二结晶固体，通常第二结晶固体可自第三硅胶层析柱的洗脱液回收紫杉醇90-95％％，纯度为98.5％紫杉醇，任一红豆杉烷类化合物不纯物均低于0.2％。
8)有代表性的综合方法如前所述，在本发明的某些方法，例如，与第一硅胶层析柱相关的制备含10％紫杉醇的丙酮混合液，制备含至少40％紫杉醇的丙酮/水沉淀法，均可能附属于其他紫杉醇的分离步骤，而成为本发明个别的具体例。在另一具体例中，本发明的方法经组合成一综合方法，以提供自含紫杉醇物质分离生产药品级紫杉醇的完整的方法。
关于这一点，本发明在一具体例中，提供包含下列步骤的分离方法a)用甲醇提取含紫杉醇物质，得到甲醇提取液；b)以液液萃取，将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分离成两相，甲醇相包含甲醇/水。二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇/水相后，得到浓缩提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％(体积比)的甲醇，少于0.5％(体积比)的水；d)浓缩提取物加入第一硅胶基质，经洗脱后，达到至少10％紫杉醇；e)将丙酮加入第一洗脱液，生成丙酮混合液；f)将丙酮混合液与一水性溶剂接触，以生成紫杉醇含量至少40％的沉淀；g)以第二硅胶层析柱将该沉淀纯化，洗脱，生成第二洗脱液，紫杉醇含量至少65％；h)将第二洗脱液以戊烷结晶，生成第一结晶固体，紫杉醇含量至少85％；
i)以第三硅胶层析柱将该第一结晶固体纯化，洗脱生成第三洗脱液，紫杉醇含量至少90％；j)第三洗脱液以戊烷结晶，生成第二结晶固体，紫杉醇含量至少98.5％。
此一综合方法具有高产率，高纯度，优于常规方法。因此适合大规模生产。表四例举应用此一综合方法所得到的产率和纯度范围。
表四

本发明的另一优点，为提供一种高重现性、生产高纯度、独特组合物的紫杉醇制备方法。关于这一点，本发明的紫杉醇组合物中，紫杉醇与红豆杉烷类化合物不纯物独特的比例是其他已知的方法所不能提供。尤其是，本发明的紫杉醇组合物不同于，并且优于现存的各种大规模，分离生产或半合成法制备的药品级紫杉醇组合物。为说明此一差异，表五列举本发明的紫杉醇组合物，分析，并与其他来源(例如Bristol-Myers Squibb(″BMS″)，Princeton，N.J.)的药品级紫杉醇组合物相比较。在表五中，IDP表示采用BMS的方法分离生产的药品级紫杉醇，而SDP表示采用BMS的半合成方法(qi为分离天然物和至少一次合成步骤)生产的药品级紫杉醇。BDS表示采用本发明的方法分离生产的药品级紫杉醇。
表五

*总红豆杉烷类化合物不纯物包括浆果赤霉素-III及其他本表未列举的红豆杉烷类化合物的未知波峰。
表五中的资料说明，除了提供一分离生产至少99.5％纯度的紫杉醇的方法之外，本发明亦提供一种独特紫杉醇组合物。在一方面，本发明的紫杉醇组合物包括至少99.5％纯度的紫杉醇，和低于0.14％总红豆杉烷类化合物不纯物。更确定的说，约0.05％至0.14％总红豆杉烷类化合物不纯物。通常，总红豆杉烷类化合物不纯物为0.06％至0.09％。在某具体例中，紫杉醇组合物包括至少99.5％纯度的紫杉醇，和0.01％至0.05％cephalomannine，通常0.01％至0.03％cephalomannine。在相关方面，紫杉醇组合物包括前述浓度的紫杉醇和cephalomannine，不包括可测得的10-DAT，7-epi-10 DAT，和红豆杉醇C。这些组合物均可经由本发明的综合方法制备，这些组合物亦可以和药用级的载体制成方剂，以提供一适合于医疗用药传输的药品级组合物。
本发明提供的组合物，并未见于其他的实验室级纯化方法(目的在制备100％纯度的紫杉醇)。实验室级纯化方法，是通过一步骤将cephalomannine减至低于0.01％，总红豆杉烷类化合物不纯物减至低于0.05％。实验室级纯化方法中，常用的含紫杉醇物质″进料″的不纯物并未含有范围0.05％至0.14％的总红豆杉烷类化合物不纯物，和0.01％至0.05％的cephalomannine，反而更高。因此，如前所讨论者，实验室级纯化方法应用于大规模生产并不经济。
同理，本发明提供的组合物并未见于其他的大规模生产方法。如表五所示，其他的方法虽可生产至少98.5％纯度的紫杉醇，但其红豆杉烷类化合物不纯物组合物不同于(并且逊于)本发明提供的组合物。
9)大规模层析法本发明的一相关方面，为采用适合于工业用、高效、中压的大尺寸层析柱。在本发明中，该大尺寸层析柱的内径至少一英寸。在一具体例中，层析柱的直径1.25-1.35英寸。在一大规模具体例中，该大规模层析柱的直径6-18英寸，柱长可能1-20英尺。大规模层析柱的优选柱长10英尺。大尺寸层析柱一向不适用于工业化规模生产。原因包括制造成本，建立可重现的柱填充方法的困难，再生填充介质的困难，高压操作，移除溶剂的安全考虑等。实验室级方法通常不会遇到这一类实用性的问题，因其规模允许较弹性的设计，和较宽松的经济要求。
本发明提供一种设计，可以采用商品化材料，或简易制作法，以经济制作大尺寸、高效的层析柱。该设计还包括安全需求，柱填充方法，提供一效能可重现的，可经济操作的大尺寸层析柱。
为提供一可重现的柱填充方法，层析柱上可安装一个以上的震动器，以协助柱填充介质的均匀填充。可重现的柱填充方法，对于大尺寸层析柱的高层析效能至关重要。在一优选的具体例中，层析柱每次使用前均填充新鲜硅胶。
快速有效的移除柱填充介质，有赖于一可靠的柱填充介质干燥法。当使用有机溶剂洗脱介质时，尤其重要。本发明的层析柱安装有自调控的加热缆线，可提供层析柱热量，以安全地蒸干有机溶剂。再以一气体，优选氮气，通过层析柱，移除有机溶剂，以吹干柱填充介质。有时，干燥步骤可能包括以热空气，氮气从柱进出口之一通过填充介质，或对层析柱施真空。干燥之后可以打开任一法兰，并在相反端均匀加压以有效移除柱填充介质。有时，可以吸出填充介质以进行移除。
从前文的描述可知，本发明的实施具体例，包括从含紫杉醇物质分离生产紫杉醇，及各种组合物。下文的实施例目的在于说明，但并不局限于此。
实施例实施例1用甲醇大规模提取红豆杉树皮从红豆杉树皮提取紫杉醇，是在一特制的22,000升温控、夹层、提取罐进行。该罐装有纤维过滤系统，是一种浸透方法的设计。本系统可做为一反应器，使用大量易燃溶剂，安全，定量地提取紫杉醇。提取罐上方有一喷口，可将树皮直接从储存容器导入提取罐，从而避免碎树皮散逸。在罐底部装有粗过滤系统，可承担树皮，而让甲醇液流通。该过滤系统则以一不锈钢制的支架支撑。
一套气动传输系统可传输新鲜及废树皮。另一喷口则用来导入氮气，覆盖于甲醇上以达到安全。在罐顶部中央的6寸喷口，装有一套螺旋传输系统，用来将干树皮导入提取罐。
在罐顶中央的内部，6寸喷口下方，装有一树皮分布盘，用来将树皮均匀分布到提取罐。将树皮以12,000升，40℃甲醇浸透3天，可以有效提取，产生10,000升甲醇提取液。此大量体积的提取液再以一种蒸发器蒸发减量。
实施例2大规模液液萃取在一装有搅拌器，6000 L的分配槽中，将浓缩的甲醇提取液以二氯甲烷萃取。以分离开甲醇/水可溶化合物与二氯甲烷可溶化合物。
各溶剂比例为924 L的浓缩甲醇提取液，1103 L的二氯甲烷，450 L的水。分配形成后，946 L含紫杉醇的二氯甲烷相会分离成两层。下层深红色，透明的二氯甲烷相保留，上层橄榄绿色的则丢弃。分析发现，此一二氯甲烷浓缩液含有2-3％的紫杉醇，产率高于90％。
实施例3以第一硅胶层析柱生产10％紫杉醇提取物本实验的目的，在于评估影响层析效能的某些重要参数。包括梯度流动相的组合物，及数量，含紫杉醇上料的纯度，流动相的流速等。研究这些参数的目的，在于找到简单，廉价的方法，以生产符合纯度要求的提取物。初步实验在玻璃柱以重力进行，待参数的范围窄化后，再移到不锈钢柱进行。
表6综合一组实验结果，目的在探讨最佳化层析方法的溶剂组合物。这些实验采用70∶30至75∶25己烷/丙酮的等度溶剂系统表6

下列实验室级实验的目的，在于探讨甲醇和水对柱效能的影响。将含有2.3％、5.0％和9.9％甲醇的上料，加入一先导级层析柱分离。实验结果包括核心组份，纯化和收率，见表7。结论是，甲醇含量高的上料对层析分离有不利影响。上料的甲醇含量低于5％时，分离效果最佳。实验亦探讨甲醇和水的组合，发现含甲醇0-5％和水0-2％的上料组合效果最佳。一种典型的的理想上料包含310毫克/L固体，4％甲醇和0.5％水。
表7

实施例4放大实验放大实验是以一全尺寸柱(1.35英寸×10英尺)，采用以下条件实施1)等度溶剂系统己烷/丙酮74∶262)上料包含约2％紫杉醇3)上料包含总固体252g4)上料的固体含量310g/L5)上料的甲醇浓度4.0％(体积比)6)上料的水浓度0.5％(体积比)7)柱填充介质为硅胶柱，上端填一层硅藻土。8)核心组份规格含2.0％(重量比)以上紫杉醇的组份表8综合实验结果
表8

以一1.35英寸×10英尺不锈钢柱进行放大实验时，发生许多上料的困难。针对2％紫杉醇粗提物的上料，所采取的改善包括增加一预过滤步骤，以二氯甲烷先饱和层析柱，硅藻土过滤。最成功的方法为，在硅胶柱上端填一层硅藻土。
表8的结果显示，所有四次实验的核心组份纯度范围11.5％至13.8％，收率均高于95％。
实施例5以丙酮/水沉淀法从10％紫杉醇提取物制备50％紫杉醇将715g的15.7％(重量比)紫杉醇提取物溶解于14.3L丙酮。将该溶液与35.75L水混合，搅拌过夜。过滤收集该沉淀，并以2L水洗，干燥后沉淀重197g含55.85％(重量比)紫杉醇。
权利要求
1.一种从紫杉醇提取物生产紫杉醇的分离方法，其步骤包括将丙酮加入紫杉醇提取物以生成丙酮混合液；再将丙酮混合液与一种水性溶剂接触，以形成沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少3倍；以及回收该沉淀。
2.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少5％重量紫杉醇，沉淀含有至少20％重量紫杉醇。
3.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物含有至少10％重量紫杉醇，沉淀含有至少40％重量紫杉醇。
4.如权利要求1的方法，其中沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少4倍。
5.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是包括各种含紫杉醇物质。
6.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质是包括各种红豆杉属的植物组织。
7.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质来源于一种细胞培养物，包括红豆杉属的植物组织细胞培养物。
8.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是包括一种根细胞培养物。
9.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是该细胞培养物的组织。
10.如权利要求7的方法，其中含紫杉醇物质是细胞培养物的生长培养基。
11.如权利要求6的方法，其中含紫杉醇物质是包括T.brevifolia，T.yunnanensis，T.x media dark green spreader，T.x media Hill，T.x mediaHicksii，T.cuspidata T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa和T.sumatrana或其混合物的植物组织。
12.如权利要求11的方法，其中植物组织包括树皮，树种包括T.brevifolia或T.yunnanensis。
13.如权利要求11的方法，其中植物组织包括根，树种包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii或T.cuspidata。
14.如权利要求11的方法，其中植物组织包括针叶，树种包括T.xmedia dark green spreader，T.x media Hill，T.x media Hicksii，T.cuspidata或T.canadensis。
15.如权利要求5的方法，其中含紫杉醇物质是一种生产紫杉醇的微生物。
16.如权利要求15的方法，其中该微生物是一种Erwinia taxi或Taxomyces andreanae。
17.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是进行至少一次的层析\洗脱紫杉醇而制得。
18.如权利要求17的方法，其中层析介质为硅胶基质。
19.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物来自将含有一种有机溶剂的紫杉醇混合液进行至少两次的沉淀。
20.如权利要求1的方法，其中紫杉醇提取物是进行至少一次的层析，洗脱紫杉醇，以及将溶于一种有机溶剂的紫杉醇混合液进行至少一次的沉淀来制备。
21.如权利要求17-20的任何一项的方法，其中紫杉醇提取物是进一步进行至少一次有机溶剂的液液萃取，以形成两相溶液，其中一相富含紫杉醇。
22.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少50％体积的水。
23.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少70％体积的水。
24.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有至少90％体积的水。
25.如权利要求1的方法，其中水性溶剂含有纯水。
26.如权利要求22-25的任何一项的方法，其中水性溶剂为缓冲液。
27.如权利要求1的方法，其中以1-5体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。
28.如权利要求1的方法，其中以2-3体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。
29.如权利要求1的方法，其中以2.5体积水性溶剂加入1体积的丙酮混合液。
30.如权利要求1的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量。
31.如权利要求30的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量的至少50％。
32.如权利要求30的方法，其中沉淀所包含的不纯物量低于丙酮混合液的不纯物含量的至少75％。
33.如权利要求1的方法，其中沉淀包含至少90％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。
34.如权利要求1的方法，其中沉淀包含至少95％的存在于丙酮混合液的紫杉醇。
35.一种制备至少5％重量紫杉醇的丙酮混合液的方法，其步骤包括a)以甲醇提取含至少0.005％紫杉醇的紫杉醇物质，以制备甲醇提取物；b)将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分离成两相，甲醇相包含水/甲醇，二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇/水相后，得到一种浓缩提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％体积的甲醇，少于1％体积的水；d)浓缩提取物加入第一硅胶基质，经洗脱后，达到至少5％重量紫杉醇；e)将丙酮加入第一洗脱液，生成丙酮混合液。
36.如权利要求35的方法，其中含紫杉醇物质包括自T.brevifolia，T.yunnanensis，T.X.media dark green spreader，T.x media Hill，T.xmedia Hicksii，T.cuspidata，T.chinensis，T.wallichiana，T.canadensis，T.globosa和T.sumatrana等树种选得的植物组织以及能表现、生产紫杉醇的微生物和细胞培养。
37.如权利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少10％重量紫杉醇。
38.如权利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少12.5％重量紫杉醇。
39.如权利要求35的方法，其中丙酮混合液含有至少90％的存在于浓缩提取物的紫杉醇。
40.如权利要求35的方法，其中浓缩提取物的甲醇含量为2.5％至5％体积，水含量为0.1％至1％体积。
41.如权利要求35的方法，其中在d)步骤之后，e)步骤之前含有至少5％重量紫杉醇的洗脱液被干燥成浓缩残留物，在步骤e)将丙酮加入以溶解浓缩残留物中的紫杉醇。
42.一种从含紫杉醇物质分离紫杉醇的方法，其步骤包括a)以甲醇提取含紫杉醇物质，以制备甲醇提取物；b)将甲醇提取物与二氯甲烷、水进行液液萃取，分离成两相，甲醇相包含水/甲醇，二氯甲烷相包含二氯甲烷及紫杉醇；c)除去甲醇相后，得到浓缩提取物，成份包含至少1％的紫杉醇，少于5％体积的甲醇，少于1％体积的水；d)浓缩提取物加入第一硅胶基质，经洗脱后，达到至少10％重量紫杉醇的第一洗脱液；e)将丙酮加入第一洗脱液，生成丙酮混合液；f)将丙酮混合液与一水性溶剂接触，以生成紫杉醇含量至少40％重量的沉淀；g)以第二硅胶层析柱，将该沉淀纯化，洗脱，生成第二洗脱液，紫杉醇含量至少65％重量；h)将第二洗脱液与戊烷混合，结晶生成第一结晶固体，紫杉醇含量至少85％重量；i)以第三硅胶层析柱将该第一结晶固体纯化，洗脱生成第三洗脱液，紫杉醇含量至少90％重量；j)第三洗脱液与戊烷混合，结晶生成第二结晶固体，紫杉醇含量至少98.5％。
43.如权利要求42的方法，其中含紫杉醇物质的紫杉醇含量为至少0.005％重量。
44.如权利要求42的方法，其中含紫杉醇物质的紫杉醇含量为至少0.02％重量。
45.如权利要求42的方法，其中将丙酮加入第一洗脱液的一种浓缩残留物中。
46.如权利要求42的方法，其中第一、第二、第三洗脱液至少有一种先经浓缩干燥成为浓缩残留物。
47.如权利要求46的方法，其中至少有一种浓缩残留物溶解于一种有机溶剂中。
48.如权利要求42的方法，其中第二结晶固体的紫杉醇含量为至少99.0％重量。
49.如权利要求42的方法，其中第二结晶固体的紫杉醇含量为至少99.5％重量。
50.如权利要求42的方法，其中第二结晶固体含有至少40％的存在于起始含紫杉醇物质的紫杉醇。
51.如权利要求42的方法，其中第二结晶固体含有至少60％的存在于起始含紫杉醇物质的紫杉醇。
52.如权利要求42-51中任何一项的方法，其中第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.2％。
53.如权利要求52的方法，其中第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.1％重量。
54.如权利要求52的方法，其中第二结晶固体含有的任何一种红豆杉烷类化合物不纯物均少于0.05％重量。
55.如权利要求42的方法，其中b-j步骤的每一步骤可回收至少90％存在于其前一步骤的紫杉醇。
56.一种紫杉醇组合物，含有至少99.5％的紫杉醇、从0.05到0.14％的总红豆杉烷类化合物不纯物。
57.如权利要求56的组合物，其中总红豆杉烷类化合物不纯物的量为从0.06到0.09％。
58.如权利要求56的组合物，其中红豆杉烷类化合物不纯物为从0.01到0.05％的cephalomannine。
59.如权利要求58的组合物，其中红豆杉烷类化合物不纯物为从0.01到0.03％的cephalomannine。
60.如权利要求56的组合物，其中含有少于0.1％的10-DAT、7-epi-10-DAT和7-epi-paclitaxel。
61.以权利要求56的组合物与一医药用载体或稀释液配方制备成的一种药品级组合物。
全文摘要
本发明涉及从含紫杉醇物质生产紫杉醇的分离方法,其步骤包括:从含紫杉醇物质制备丙酮混合液,再将丙酮混合液与水性溶剂接触,以形成水相上清液和沉淀。此沉淀的紫杉醇纯度高于紫杉醇提取物至少3倍。丙酮/水沉淀法以高产率制备高纯度紫杉醇,适合采用常规正相硅胶层析柱分离法进行工业规模的分离,以及药品级紫杉醇组合物的制品。
文档编号A61K35/74GK1342155SQ99815315
公开日2002年3月27日 申请日期1999年12月30日 优先权日1998年12月30日
发明者胡祥海, 白玉里, 马丁·艾略特 申请人:加拿大植原药物公司