重组改良型安卡拉痘苗病毒(mva)呼吸道合胞病毒(rsv)疫苗的制作方法
【专利说明】重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)呼吸道合胞病毒（RSV) 疫苗
[0001] 领域
[0002] 本发明涉及作为针对呼吸道合胞病毒（RSV病毒）感染的改进的疫苗的重组改良 型安卡拉痘苗病毒（modifiedvacciniavirusAnkara) (MVA病毒），以及相关产物、方法及 用途。具体地说，本发明涉及基因工程化的重组MVA载体，其包含至少一条编码RSV膜糖蛋 白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序 列。本发明还涉及其例如适合于影响受试者的免疫反应或适合于诊断RSV感染以及确定受 试者是否处于复发性RSV感染的风险中的产物、方法以及用途。
[0003] 背景
[0004] RSV是一种重要的呼吸道病原体。在世界范围内，急性下呼吸道（LRT)感染在婴儿 和五岁以下儿童中引发显著发病率和死亡率[A.M.Aliyu等（2010)，BayeroJ.PureAppl.Sci. 3 (1) : 147-155]。呼吸道合胞病毒（RSV)是临床上最重要的LRT感染原因；原发性RSV 感染通常到 2 岁时出现[1.卩.6162611(1987)，？6(1.￥11'01.2:1-4;￥.]\111四七&(2009)，(：1111. Lab.Med. 29 (4) : 725-739]。因为原发性RSV感染不诱发对RSV的完全免疫，所以在一生中 出现频繁的再感染，其中最严重的感染发生于极年轻者、极年老者中以及任何年龄的免疫 缺陷患者中[Y.Murata(2009)]。
[0005] 那些感染RSV者中多达40%最终患有需要住院治疗的严重LRT疾病，其中疾病 的严重性和强度取决于感染的量度和强度以及宿主反应[Aliyu等（2010)]。RSV在任何 年龄的患有免疫、呼吸道或心脏系统缺陷的患者中还可以引起严重的LRT疾病，并且还 可以使儿童预先倾向于较晚患有哮喘。仅在美国，RSV-年引起估计126, 000例住院治 疗和300例婴儿死亡[Y.Murata(2009)]。此外，RSV是每年冬天在年长患者和那些患有 潜在心肺或免疫抑制疾患者之中超过80, 000例住院治疗和超过13, 000例死亡的原因 [Y.Murata(2009)]。然而，尽管RSV作为呼吸道病原体具重要性，但当前市场上没有安全并 且有效的RSV疫苗。
[0006]RSV是副粘病毒科（Paramyxoviridae)、肺病毒亚科（Pneumovirinae)的一种包膜 RNA病毒[Aliyu等（2010)]。各RSV病毒体含有具有约15, 191个核苷酸的非片段、负义、 单链RNA分子，其含有十段编码十一种独立的蛋白质的基因（M2含有两个开放阅读框），所 述i^一种独立的蛋白质包括八种结构蛋白（G、F、SH、M1、N、P、M2. 1以及L)和三种非结构蛋 白（NS1、NS2以及M2. 2)[Y.Murata(2009)]。基因组按以下顺序从NS1到L依序转录：3'_ NS1-NS2-N-P-M1-SH-G-F-M2. 1-M2. 2-L-5'。
[0007] 病毒包膜含有三种跨膜糖蛋白（粘附糖蛋白（G)、融合糖蛋白（F)以及小疏水性蛋 白（SH))以及基质（Ml)蛋白[Y.Murata(2009)]。在RSV复制期间，病毒首先在由高度糖 基化G蛋白介导的过程中粘附于靶细胞。然后病毒在由F蛋白介导的过程中与宿主细胞融 合，从而穿透细胞膜并且进入宿主细胞；F蛋白也是形成RSV感染的细胞的合胞体特征所需 的。粘附和融合过程因SH蛋白而加强。Ml蛋白通过与包膜蛋白F和G以及与核衣壳蛋白 N、P以及M2. 1相互作用调节成熟RSV的组装（参见下文）。在包膜内，病毒RNA由转录酶 复合物壳体化，所述转录酶复合物由核衣壳蛋白（N)、磷蛋白（P)、转录延伸因子（M2. 1)以 及RNA聚合酶（L)蛋白组成[Y.Murata(2009)]。N与基因组RNA缔合，而P是病毒RNA聚 合酶L的辅因子。M2. 1是为病毒转录所必需的延伸因子，且M2. 2调节病毒基因组的转录。 最后，NS1和NS2抑制I型干扰素活性。
[0008] 临床RSV分离株根据抗原组分类（A或B)并且基于各抗原组的病毒基因组内的遗 传变异性进一步再分成多个基因型（例如对于A组，A2或A&;而对于B组，BUCH-18537或 8/60)[Y.Murata(2009)]。分类是基于病毒与针对粘附糖蛋白（G蛋白）的单克隆抗体的反 应性并且通过各种遗传分析来进行。[M.Sato等，J.Clin.Microbiol. 43 (1) : 36-40 (2005)]。 在病毒分离株之中，一些RSV编码蛋白在氨基酸序列层面是高度保守的（例如F)，而其它 蛋白质在两种主要抗原组之间以及其内部彻底改变（例如G) [Y.Murata(2009)]。A和B抗 原组的F蛋白享有相当的同源性。与此相反，G蛋白在两种抗原组之间相当不同。
[0009] G蛋白是最可变的RSV蛋白，其中其超变C端区域是大部分的病毒株特异性表位 的成因。G蛋白的分子流行病学和演化模式已提供关于RSV的临床和流行病学特征的重要 信息。典型地，若干不同基因型立刻循环，并且在一个地区中占主导地位的基因型每年可变 化。然而，病毒株多样性对RSV的临床和流行病学特征的重要性仍了解得不充分。因此，重 组RSV蛋白伴有用于指示用于克隆基因或蛋白质的原始RSV株的病毒株标识。举例来说， 从RSV株A长克隆的G蛋白命名为G(A长）、RSVA长G或RSVA长G蛋白。
[0010] RSV刺激受感染宿主中的多种免疫反应，包括趋化因子和细胞因子的分泌、中 和体液和粘膜抗体的产生以及⑶4+(例如TH1和TH2)和⑶8+(例如CTL)T细胞的产生。 此类宿主免疫反应是RSV感染的临床表现的原因，因为病毒引起有限的体内细胞病变 [Y.Murata(2009) ]。RSV诱发的疾病的表型表现和严重性显然由RSV感染刺激的一系列免 疫反应间的平衡和相互作用介导[Y.Murata(2009)]。
[0011] 许多先前研宄表明细胞和体液免疫反应在对RSV的免疫性的诱导和RSV 感染的消除中以及在疾病进展中发挥不同作用[Y.Murata(2009)和其中的参考文 献]。举例来说，使用人源化抗F抗体的研宄显示，虽然抗RSV抗体足以预防或限制 感染的严重性，但其不是清除病毒感染所需要的[Y.Murata(2009) ;A.F.G.Antonis等 (2007)，Vaccine 25:4818-4827]。与此相反，T细胞反应是清除已确定的RSV感染所必需 的[Y.Murata(2009)]。RSV诱导的T细胞反应还在感染期间的肺病变中发挥关键作用。举 例来说，干扰素-y(IFNY) _分泌TH1细胞（具有或不具有相关CD8+CTL反应）在具有最小 肺病变的情况下清除RSV，而白介素4 (IL-4)-分泌TH2细胞也清除RSV，但经常伴有显著的 肺变化，包括嗜酸性粒细胞浸润，其为在先前疫苗试验期间观测到增强性疾病的标志（参 见下文）。
[0012] 尽管可获得的关于RSV感染的免疫学、病毒学以及生理学的信息是丰富的，然而， 如以下段落中更详细论述，仍远未确切地清楚哪种免疫反应可能最有效诱导持续免疫性， 同时在接种后暴露于RSV时还不产生增强性疾病。
[0013] 现有疫苗开发
[0014] 疫苗典型地使用若干策略中的一种来诱导针对目标感染剂或病原体（例如病毒、 细菌或寄生虫）的保护性免疫，包括：（1)灭活病原体制剂；（2)活减毒病原体制剂，包括 基因减毒病原体菌株；（3)纯化蛋白质亚基疫苗制剂；(4)编码病原体抗原的基于病毒载体 的疫苗和/或佐剂；以及（5)编码病原体抗原的基于DNA的疫苗。
[0015] 初始RSV疫苗开发工作集中在灭活病毒制剂，直到二十世纪六十年代期间在美国 进行了测试福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗的功效的临床试验并且结果极糟[M.R.01son 和S.M.Varga(2007)，J.Immunol. 179:5415-5424]。大量接种患者患有以嗜酸性粒细胞和嗜 中性粒细胞浸润为特征的增强性肺病并且在后续自然感染RSV之后发生大量的炎性反应 [Olson和Varga(2007)，[BlancoJC等（2010)HumVaccin. 6:482-92]。那些患者中有许多 需要住院治疗并且少量垂危患者死亡。因此，研宄者开始搜寻在后续激发之后有助于增强 性疾病的发生的病毒和/或宿主因素，尝试开发更安全的RSV疫苗。所述搜寻已产生许多 关于的RSV生物学和其可诱导的广谱免疫反应的新信息，但安全并且有效的RSV疫苗仍然 难以获得。
[0016]FI后RSV疫苗开发工作已大部分集中于单一抗原疫苗，其使用G、F，在较低程度 上N或M2 (其中由病毒或质粒DNA载体递送的病毒抗原）表达病毒基因或作为纯化蛋白 质。[参见例如W.Olszewska等（2004)，Vaccine23:215-221 ;G.Taylor等（1997)，J.Gen. Virol. 78:3195-3206;以及L.S.Wyatt等（2000)，Vaccine18:392-397]。还已在小牛、棉 鼠以及BALB/c小鼠中测试了使用F+G组合的接种，并且结果不同[Antonis等（2007)(小 牛）；B.Moss的于1986年4月8日提交的美国专利申请No. 06/849,299( '，299申请'） (棉鼠）；以及L.S.Wyatt等（2000) (BALB/c小鼠）]。F与G两者在小牛、小鼠、棉鼠、人 类中以及在至少一些程度上在猕猴婴猴中均具免疫原性[A.F.G.Antonis等（2007)(小 牛）；B.Moss, ' 299 申请（棉鼠）；L.deWaal等（2004)，Vaccine22:923-926 (猕猴婴猴）； L.S.Wyatt等（2000) (BALB/c小鼠）；Y.Murata(2009)(人类）]。
[0017] 然而，取决于所用疫苗、所选抗原、施用途径以及甚至所用模型生物的类型，由RSV 疫苗候选者诱导的免疫反应的性质和类型显著不同（常常相当不同）。举例来说，使用活 RSV或用编码RSVF蛋白的复制载体的免疫诱导了伴随中和抗F抗体和⑶8+CTL产生的主 导TH1反应，两者均与在接种后病毒激发时的最小肺病变有关[Y.Murata(2009)和其中所 引用的参考文献]。与此相反，使用FI灭活RSV制剂的免疫诱导完全缺乏CD8+CTL反应 的主导TH2反应，其在肺中产生了增加的病变变化[Y.Murata(2009)和其中所引用的参考 文献]。有趣的是，施用呈纯化亚单位疫苗形式或于复制载体中的RSVG蛋白诱导主导Th2 反应，其在接种后病毒激发之后最终产生嗜酸性粒细胞肺部浸润和气道超反应性，这是一 种类似于在FI-RSV情况下的增强性疾病的反应[Y.Murata(2009)和其中所引用的参考文 献]。此外，虽然使用编码RSVF蛋白的改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)接种在小牛中诱导抗 F抗体和F特异性⑶8+T细胞，但是用MVA-F+MVA-G接种诱导抗F和抗G抗体，但不诱导F 特异性或G特异性CD8+T细胞[A.F.G.Antonis等（2007)]。
[0018] 用表达F蛋白的痘苗病毒（VV) (VV-F)接种小鼠诱导强⑶8+T细胞反应，其引起复 制RSV从肺部清除，伴随与用FI-RSV免疫的小鼠相比类似或更大的重量减轻[W.Olszewska 等（2004)]。然而，其不涉及由诸如IL-4和IL-5等TH2细胞因子分泌增强引起的由FI-RSV 或VV表达G蛋白（VV-G)诱导的增强性疾病（组合的！^反应肺嗜酸性粒细胞增多和重量 减轻）。本领域中的一些研宄表明能够诱导包括细胞与体液组分的相对平衡的免疫反应的 RSV疫苗在接种后激发时将更少会展示增强性免疫病变[W.Olszewska等（2004)].。
[0019] 然而，虽然用编码F、G或F+G的改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)接种BALB/c小鼠 正是诱导了此类平衡免疫反应，包括体液反应（即平衡的IgGl和IgG2a反应）和TH1反应 (即IFNY/白介素-12 (IL-12)水平上升和白介素-4 (IL-4) /白介素-5 (IL-5)水平降低）， 然而所接种的动物仍表现出某种程度的重量减轻[W.Olszewska等（2004)]。
[0020] 尽管耗费大量努力来表征在若干不同模型系统中由各种疫苗候选者诱导的免疫 反应的性质和程度，但是仍不确切地清楚哪种免疫反应是传送针对RSV的持续和完全免疫 而不使疫苗接受者预先倾向于患有增强性疾病所需要的。因为RSV与可获得的治疗剂和预 防性选择的临床负担之间明显不平衡，所以开发RSV疫苗仍然是未得到满足的医疗需要。
[0021] 描述
[0022] 虽然为开发RSV疫苗而作出的现有不成功努力主要集中于用RSV-F或RSV-G膜糖 蛋白或者两者进行接种，但是本发明人已发现用表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇 和RSV核衣壳蛋白的至少一种抗原决定簇的重组安卡拉痘苗病毒（MVA)进行接种诱导了更 佳保护。此外，此类构建体当与皮下施加相比或甚至当与由Wyatt和同事使用的肌内施用 途径相比时通过鼻内途径施加时诱导几乎完全无菌免疫[L.S.Wyatt等（2000)]。与肌内施 用相比，通过鼻内施用候选RSV疫苗可获得增强的保护。
[0023] 使用表达RSVF或RSVG膜糖蛋白（或两者）的重组MVA(例如MVA-mBN199B)或 使用表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋白的至少一种抗原决定簇的 重组MVA(例如MVA-mBN201B)，本发明人在激发后4天在肺中未观测到复制RSV，尽管通过 RT-qPCR仍可检测RSV基因组。表达RSV膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇和RSV核衣壳蛋 白的至少一种抗原决定簇的重组MVA(例如MVA-mBN201B)诱导更佳保护和通过RT-qPCR可 检测的RSV病毒负荷的更大降低，因为它们诱导了针对RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的更 强的CD8+T细胞反应。此外，通过鼻内途径施用此类重组病毒诱导了几乎完全的无菌免疫 (通过RT-qPCR几乎不可检测RSV病毒负荷），因为其诱导粘膜免疫反应和IgA抗体分泌， 当皮下施用此类构建体时不存在此类反应。
[0024] 与FI-RSV相反，此类构建体诱导平衡的Thl免疫反应，从而产生针对RSV抗原的 良好抗体反应以及强的特异性细胞免疫反应。在除诱导良好IgA抗体反应之外，鼻内施用 疫苗产生与由常规皮下施用引起的那些IgG抗体水平相比甚至更高的IgG抗体水平的的情 况下，保护得以改善并且体重损失降低。然而，细胞免疫反应的大小与施用途径无关。有趣 的是，本发明人观察到由表达至少一条编码RSV膜糖蛋白抗原决定簇的异源核苷酸序列和 至少一条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的异源核苷酸序列的重组MVA(例如表达RSVF、 G、N以及M2蛋白的MVA-mBN201B)诱导的T细胞反应模式，其类似于由RSV施用诱导的T细 胞反应，虽然要高得多。
[0025] 因此，在第一方面中，本发明提供一种重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，其包含 至少一条编码呼吸道合胞病毒（RSV)膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编 码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
[0026] 改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)
[0027] 已通过在鸡胚胎成纤维细胞上对真皮痘苗株安卡拉进行超过570次连续传代产 生了MVA[绒毛膜尿囊安卡拉痘苗病毒病毒，CVA;综述可参见Mayr等（1975)，Infection 3, 6-14]，其保存在VaccinationInstitute,Ankara,Turkey中多年并且用作人类接种的基 础。然而，由于与痘苗病毒相关的时常的严重接种后并发症，为产生更减毒、更安全的天花 疫苗而进行了若干尝试。
[0028] 在1960年至1974年期间，AntonMayr教授通过在CEF细胞中进行超过 570次连续传代成功使CVA减毒[Mayr等（1975)]。已在多种动物模型中显示所得 MVA是无毒力的[Mayr,A?和Danner,K. (I978)，Dev.Biol.Stand. 41:225_234]。作 为早期开发MVA作为先前天花疫苗的一部分，在处于痘苗的有害反应的危险中的 受试者中存在与ListerElstree[Stickl(1974)，Prev.Med. 3:97-101;Stickl和 Hochstein-Mintzel(1971)，MunichMed.Wochenschr. 113:1149-1153]组合使用MVA-517 的临床试验。在1976年，在德国将来源于MVA-571种苗储备的MVA(对应于第571代） 注册作为二阶段肠胃外天花接种计划中的初免疫苗。随后，MVA-572用于约120, 000个 高加索个体中，大多数是1岁至3岁的儿童，并且未报导严重副作用，尽管许多受试者是 在患有与痘苗相关的并发症的高风险群体之中（Mayr等（1978)，Zentralbl.Bacteriol. (B) 167:375-390)。MVA-572以ECACCV94012707保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心 (EuropeanCollectionofAnimalCellCultures)〇
[0029] 作为用于减弱MVA毒性的传代的结果，存在取决于在CEF细胞中传代的次数的许 多不同病毒株或分离株。举例来说，在德国在天花根除计划期间使用MVA-572,而MVA-575 广泛用作兽用疫苗。MVA-575于2000年12月7日以保藏号V00120707保藏于欧洲动物细 胞培养物保藏中心（ECACC)。减毒的CVA病毒MVA(改良型安卡拉痘苗病毒）是通过在原代 鸡胚胎成纤维细胞上CVA的连续繁殖（超过570次传代）来获得的。
[0030] 尽管Mayr等证实，在二十世纪七十年代期间MVA在人类和哺乳动物中是高度减 毒的和无毒力的，但是某些研宄者已报导MVA在哺乳动物和人类细胞系中未充分减毒，因 为在这些细胞中可能发生残余复制[Blanchard等（1998)，JGenVirol79:1159-1167; Carroll和Moss(1997),Virology238:198-211 ;美国专利No. 5, 185,