理想 候选物。因此，本文提供了用作活性药物物质的根据本发明的重组MVA，以及药物组合物和 疫苗，其全部旨在用于诱导包括人类的活动物体中的免疫反应。
[0091] 为此，重组MVA、疫苗或药物组合物可以104至109TCID5Q/ml、105至5X108TCID5Q/ ml、106至108TCID5(l/ml或107至108TCID5(l/ml的浓度范围配制成溶液形式。用于人类的优 选剂量包含 1〇6至 10 9TCID5Q之间，包括 10 6TCID5Q、107TCID5(I、108TCID5Q或 5X10 8TCID5Q的剂 量。
[0092] 本文所提供的药物组合物通常可包含一种或多种药学上可接受的和/或批准的 载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类助剂物质可以是水、盐水、 甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适合的载体典型地是大的缓慢代谢的分子， 诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
[0093] 对于疫苗的制备，可使本文所提供的重组MVA病毒转化成生理学上可接受的形 式。这可基于如由H.Stickl等，Dtsch.med.Wschr. 99:2386-2392(1974)所描述的在制备 用于针对天花接种的痘病毒疫苗方面的经验来进行。
[0094] 举例来说，可将纯化病毒储存在-80°C下，其中滴度是5X108TCID5(l/ml，于约10mM Tris、140mMNaClpH7. 7中配制。对于疫苗注射物的制备，可将例如102-108或10 2-109个 病毒粒子在安瓿、优选玻璃安瓿中在2%蛋白胨和1 %人白蛋白的存在下在100ml磷酸盐缓 冲盐水（PBS)中冻干。或者，疫苗注射物可通过将制剂中的病毒逐渐冷冻干燥来制备。此 制剂可含有适合用于体内施用的其它添加剂，诸如甘露糖醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或 聚乙烯吡咯烷酮；或其它助剂（诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白（例如人血清 白蛋白））。然后，将玻璃安瓿密封并且可将其储存在4°C与室温之间数月。然而，只要不存 在需要，就可将安瓿优选地储存在_20°C下的温度下。
[0095] 对于接种或治疗，可将冻干剂溶解于水溶液、优选地生理盐水或Tris缓冲液中， 并且全身或局部施用，即胃肠外、皮下、静脉内、肌内、鼻内或熟练从业者已知的任何其它施 用途径。施用模式、剂量以及施用次数可由本领域技术人员以已知方式优化。然而，最常见 的是，在第一次接种注射之后约一个月至六周用第二次注射物接种患者。
[0096] 包含重组MVA病毒的试剂盒
[0097] 本文还提供包含任何一种或多种的本文所描述的重组MVA的试剂盒。所述试剂盒 可包括重组MVA的一个或多个容器或小瓶，以及向处于RSV感染风险中的受试者施用重组 MVA的说明书。在某些实施方案中，受试者是人类。说明书可指示向受试者施用单剂量或多 (即2、3、4等）剂量的重组MVA。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA病毒是以第一次 (初免）和第二次（加强）施用向初次接受试验或非初次接受试验的受试者施用。
[0098] 进一步提供包括于第一小瓶或容器中的用于第一次施用（初免）和于第二小瓶或 容器中的用于第二次施用（加强）的重组MVA病毒的试剂盒。所述试剂盒还可以包括用于 第三次、第四次或进一步施用（加强）的第三、第四或其它小瓶或容器中的重组MVA。
[0099] 方法和重组MVA病毒的用途
[0100] 本文还提供免疫受试动物的方法，以及用于免疫受试动物方法中的重组MVA，以及 本文所提供的重组MVA在用于免疫受试动物的药剂或疫苗的制备中的用途。在某些实施方 案中，所述动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是大鼠、兔、猪、小鼠或人类，并且 所述方法包括向受试者施用一定剂量的本文所提供的重组MVA的任何一种或多种。
[0101] 受试者优选地是人类并且可为成人，其中所述成人可以是免疫缺陷的。在某些实 施方案中，所述成人超过50、55、60、65、70、75、80或85岁。在其它实施方案中，受试者的年 龄小于5岁、小于3岁、小于2岁、小于15个月、小于12个月、小于9个月、小于6个月或小 于3个月。受试者的年龄还可以在0-3个月、3-6个月、6-9个月、9-12个月、1-2岁或2-5 岁范围内。
[0102] 在某些实施方案中，本文所提供的重组MVA中的任一者是以106至10 9TCID5(I的剂 量、以106至5X10 8TCID5(I或10 7至10 8TCID5(I的剂量向受试者施用。本文所提供的重组MVA 还可以106、107TCID5Q、108或5X10 8TCID5Q的剂量向受试者施用。在某些实施方案中，本文所 提供的重组MVA中的任一者是以107TCID5(I、108或5X10 8TCID5(I的剂量向人类受试者施用。
[0103] 本文所提供的重组MVA是以单剂量或以多（即2、3、4等）剂量向受试者施用。在 某些实施方案中，重组MVA是以第一次（初免）和第二次（加强）施用来进行施用。在 某些实施方案中，第一剂量包含107至10 81'(：105(|的重组1^4病毒并且第二剂量包含107至 10 8TCID5Q的重组MVA病毒。
[0104] 重组MVA可全身或局部、肠胃外、皮下、静脉内、肌内或鼻内施用，优选皮下或鼻内 施用。重组MVA还可以通过熟练从业者已知的任何其它施用途径来施用。
[0105] 在另一个方面中，本文提供诊断RSV感染的方法和确定受试者是否处于复发性 RSV感染的风险中的方法，所述复发性RSV感染特别是对于新生儿、介于1岁与6岁之间的 儿童和/或老年人来说可能是一种严重威胁。
[0106] 本发明人已发现当前诊断RSV感染的方法可能提供不正确的结果。举例来说，检 测针对RSV的抗体的免疫测定或病毒斑测定可能未必准确识别处于复发性感染风险中的 个体。的确，本发明人观测到尽管取自个体的样品可在病毒斑测定中反馈阴性结果[参见 例如W.Olszewska等，2004]，此类结果有时可能是假阴性，因为更灵敏的方法有时证实感 染性RSV粒子仍存在。事实上，需要诸如定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR)的方法来证 实受试者是否可能实际上感染了RSV、是否处于复发性感染的风险中，或已接种的受试者是 否的确具有针对RSV的后天无菌免疫。此测定可能是关键的，因为接种之后的再感染有时 引起增强性疾病，偶而引起死亡。
[0107] 因此，在某些实施方案中，本文提供确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险 中的方法，其包括定量地确定获自受试者的样品是否含有RSV基因组，其中RSV基因组的存 在指示复发性感染RSV的可能性。在某些实施方案中，定量确定获自受试者的样品是否含 有RSV基因组是通过qRT-PCR来进行的。
[0108] 如本文所用，术语"样品"是指含有多核苷酸和多肽或其部分的获自个体、细胞系、 组织培养物或其它来源的任何生物样品。生物样品包括体液（诸如，例如，血液、血清、血 浆、尿、滑液、脊髓液、支气管肺泡灌洗液（BAL))和发现和/或怀疑含有RSV的身体组织，包 括例如获自参与临床试验或其它实验性研宄的受试者的临床样品。用于从哺乳动物获得组 织活检和体液的方法是本领域中熟知的。在某些实施方案中，生物样品包括RSV核酸。
[0109] 如在本文中可互换使用，术语"RT-qPCR"、"qRT-PCR"是指一种称为"定量实时聚 合酶链式反应"的方法。在一些情况下，此方法也可以称为动态聚合酶链式反应（KPCR)。
[0110] 在某些实施方案中，本文提供确定受试者是否具有针对RSV的后天无菌免疫的方 法，其包括定量地确定获自受试者的样品是否含有RSV基因组，其中RSV基因组的存在指示 受试者不具有针对RSV的后天无菌免疫。本文还提供对不具有针对RSV的后天无菌免疫的 受试者进行免疫的方法，其包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA中的任一者。另 外地或可选地，提供了本文所描述的重组MVA中的任一者以用于对不具有针对RSV的后天 无菌免疫的受试者进行免疫的方法中，所述方法包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组 MVA的任一者。本文还提供了本文所描述的重组MVA中的任一者在制备用于对不具有针对 RSV的后天无菌免疫的受试者进行免疫的药剂和/或疫苗的制备中的用途，其中药剂或疫 苗是鼻内施用的。
[0111] 在某些实施方案中，本文提供在不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导 针对RSV的无菌免疫的方法，其包括向受试者鼻内施用本文所描述的重组MVA的任一者。本 文还提供本文所描述的重组MVA的任一者以用于在不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试 者中诱导针对RSV的无菌免疫的方法中，所述方法包括向受试者鼻内施用本文所描述的重 组MVA的任一者。另外地或可选地，本文提供本文所描述的重组MVA的任一者在用于在不 具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中诱导针对RSV的无菌免疫的药剂和/或疫苗的制 备中的用途，其中所述药剂或疫苗是鼻内施用的。
[0112] 本发明的某些实施方案还包括以下各项：
[0113] 1.包含编码至少一种呼吸道合胞病毒（RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列 的一种重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，用于通过鼻内施用来治疗或预防RSV感染，其中 排除肌内施用。
[0114] 2.包含编码至少一种呼吸道合胞病毒（RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列 的重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)在制备药物组合物和/或疫苗中的用途，其中鼻内施 用药物组合物和/或疫苗并且其中排除肌内施用。
[0115] 3. -种针对RSV感染对包括人类的受试者进行免疫的方法，其包括向包括人类的 受试者鼻内施用包含编码呼吸道合胞病毒（RSV)膜糖蛋白的至少一种抗原决定簇的核苷 酸序列的重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，其中排除肌内施用。
[0116] 4.如第1项所述的重组MVA、如第2项所述的用途和/或如第3项所述的方法，其 仅仅包括鼻内施用。
[0117] 5.如第1项所述的重组MVA、如第2项所述的用途和/或如第3项所述的方法，其 包括皮下施用。
[0118] 6.如第1项或第4至5项中任一项所述的重组MVA、如第2项、第4项或第5项中 任一项所述的用途和/或如第3至5项中任一项所述的方法，其中所述重组MVA进一步包 含编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。
[0119] 7. -种重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，其包含至少一条编码呼吸道合胞病毒 (RSV)膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳抗原决定簇的核苷酸 序列。
[0120] 8.如第1至7项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜 糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码RSVF抗原决定簇。
[0121] 9.如第1至8项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其进一步包含至少一 条编码RSVF膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
[0122] 10.如第1至9项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV 膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码全长RSVF膜糖蛋白。
[0123] 11.如第8至10项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选来源于A2和/或A&。
[0124] 12.如第8至11项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包含编码氨基酸序列SEQIDN0:4的核苷酸序列。
[0125] 13.如第8至12项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSVF膜 糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包含核苷酸序列SEQIDNO:3。
[0126] 14.如第1至13项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV 膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码截短的RSVF膜糖蛋白。
[0127] 15.如第14项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述截短的RSVF膜糖 蛋白的核苷酸序列来源于RSV株A，优选地来源于A&。
[0128] 16.如第14或15项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的RSVF膜 糖蛋白缺乏跨13旲域。
[0129] 17.如第14至16项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的 RSVF膜糖蛋白缺乏胞浆域。
[0130] 18.如第8至17项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQIDNO:6的核苷酸序列。
[0131] 19.如第8至18项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV F膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQIDNO:5。
[0132] 20.如前述项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV膜糖 蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSVG膜糖蛋白的抗原决定簇。
[0133] 21.如第1至20项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其进一步包含至少 一条编码RSVG膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
[0134] 22.如第1至21项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV 膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码全长RSVG膜糖蛋白。
[0135] 23.如第20至22项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选来源于株A2和/或B。
[0136] 24.如第20至23项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQIDNO:2的核苷酸序列。
[0137] 25.如第20至24项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQIDNO: 1。
[0138] 26.如第1至25项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV 膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码截短的RSVG膜糖蛋白。
[0139] 27.如第26项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码截短的RSVG膜糖蛋白 的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株B。
[0140] 28.如第26或27项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短RSVG膜糖 蛋白缺乏跨13旲域。
[0141] 29.如第26至28项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述截短的 RSVG膜糖蛋白缺乏胞浆域。
[0142] 30.如第20至29项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括编码氨基酸序列SEQIDN0:8的核苷酸序列。
[0143] 31.如第20至30项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV G膜糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQIDN0:7。
[0144] 32.如第6至31项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣 壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码RSVN核衣壳蛋白的抗原决定簇。
[0145] 33.如第6至32项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣 壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSVM2基质蛋白的抗原决定簇。
[0146] 34.如第6至33项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核衣 壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列编码全长蛋白。
[0147] 35.如第32至34项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码所述RSV N核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列来源于RSV株A，优选株A2。
[0148] 36.如第32至35项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中编码RSV核 衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列编码RSVN核衣壳与RSVM2基质蛋白的抗原决定簇。
[0149] 37.如第36项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述RSVN核衣壳和所述 RSVM2基质蛋白的抗原决定簇由单一开放阅读框编码。
[0150] 38.如第36或37项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述RSVN核衣壳和 所述RSVM2基质蛋白的抗原决定簇是由自切割蛋白酶结构域隔开。
[0151] 39.如第38项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结构域序 列来源于口蹄疫病毒。
[0152] 40.如第38或39项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割蛋白酶结 构域序列是蛋白酶2A片段序列。
[0153] 41.如第38至40项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割 蛋白酶结构域序列包括编码氨基酸序列SEQIDNO: 12的核苷酸序列。
[0154] 42.如第38至41项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述自切割 蛋白酶结构域包括核苷酸序列SEQIDNO: 11。
[0155] 43.如第37至42项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述单一开 放阅读框包括编码氨基酸序列SEQIDNO: 18的核苷酸序列。
[0156] 44.如第37至43项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其中所述单一开 放阅读框包括核苷酸序列SEQIDNO: 17。
[0157] 45.如前述项中任一项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包括一条编码RSV膜 糖蛋白抗原决定簇的核苷酸序列和一条编码RSV核衣壳蛋白抗原决定簇的核苷酸序列。
[0158] 46.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSVF膜糖蛋白和所 述RSVN核衣壳蛋白的抗原决定簇。
[0159] 47.如第45项所述的重组MVA、用途和/或方法，其包含所述RSVF膜糖蛋白和所 述RSVM2基质蛋白的抗原决定簇。
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