146;Ambrosini等 (1999)，JNeurosciRes55:569]。假定这些出版物中所报导的结果已使用各种已知MVA 株获得，因为所用病毒的性质、特别是其在各种细胞系中的生长习性基本上不同。出于各种 原因此类残余复制是不需要的，包括与在人类中使用有关的安全性担忧。
[0031]BavarianNordic已开发出对于开发更安全的产物（诸如疫苗或药物）来说具有 增强的安全性特征的MVA株：MVA由BavarianNordic进一步传代并且命名为MVAHMVA 以及MVA-BN与祖先CVA病毒相比缺乏约15% (来自六个区域的31kb)的基因组。所述缺 失影响许多毒性和寄主范围基因以及A型包涵体的基因。对应于第583代的MVA-BN的样 品于2000年8月30日以编号V00083008保藏于欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC)。
[0032]MVA-BN可粘附于并且进入非常有效地表达病毒编码基因的人类细胞。然而，不出 现子代病毒的组装和释放。MVA-BN非常适合于原代鸡胚胎成纤维细胞（CEF)细胞并且在 人类细胞中不复制。在人类细胞中，病毒基因得以表达，并且未产生感染性病毒。MVA-BN 根据美国疾病控制和预防中心被归类为1级生物安全有机体。已将MVA-BN和衍生物的制 剂向许多类型的动物并且向包括免疫缺陷个体的2000个人类受试者施用。所有接种已 证明通常是安全的并且良好耐受。尽管其高度减毒并且毒性降低，但是在临床前研宄中 MVA-BN已显示可引发针对痘苗和针对由克隆至MVA基因组中的基因编码的异源基因产物 的体液与细胞免疫反应[E.Harrer等（2005)，Antivir.Ther. 10 (2) : 285-300 ;A.Cosma等 (2003)，Vaccine22(1): 21-9 ;M.DiNicola等（2003)，Hum.GeneTher. 14 (14): 1347-1360; M.DiNicola等（2004)，Clin.CancerRes. ,10(16): 5381-5390]。
[0033]MVA的"衍生物"或"变体"是指展现与如本文所描述的MVA基本上相同的复制特 征但在它们基因组的一个或多个部分中展现差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或 变体未能在人类和小鼠、甚至在严重免疫抑制小鼠中进行体内繁殖性复制。更具体地说， MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体还优选地具有在鸡胚胎成纤维细胞（CEF)中繁殖性复制 的能力，但在人角化细胞细胞系HaCat[Boukamp等（1988)，JCellBiol106:761-771]、人 骨肉瘤细胞系143B(ECACCNo. 91112502)、人胚肾细胞系293(ECACCNo. 85120602)以及人 宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCCNo.CCL-2)中没有繁殖性复制的能力。另外，MVA-BN的衍生物 或变体在Hela细胞和HaCaT细胞系中具有比MVA-575小至少两倍、更优选地小三倍的病毒 扩增率。对MVA变体的这些性质的测试和分析描述于W0 02/42480(US2003/0206926)和 WO03/048184(US2006/0159699)中，两者以引用的方式并入本文中。
[0034] 病毒的扩增或复制一般以称为"扩增率"的由受感染细胞产生的病毒（输出）与 本来用于感染起初细胞的量（输入）的比率表示。扩增率"1"定义了一种扩增状态，其中 由受感染细胞产生的病毒的量与最初用于感染细胞的量相同，这意味着受感染细胞容许病 毒感染和繁殖。与之相反，扩增率小于1(即输出与输入水平相比有所降低）表明缺乏繁殖 性复制并且因此病毒减毒。
[0035] 基于MVA的疫苗的优势包括其安全性性质以及可用于大规模疫苗生产。临床前测 试已显示MVA-BN与其它MVA株相比展示优越的减毒和功效（W002/42480)。MVA-BN株的另 外的性质是在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导与DNA初免/痘苗病毒加强方案相 比基本上相同水平的免疫性的能力。
[0036] 重组MVA-BN病毒（本文中的最优选实施方案）因其在哺乳动物细胞中的不同复 制缺陷和其已充分确定的无毒性而被认为是安全的。此外，除其功效之外，工业规模制造的 可行性也可以是有益的。另外，基于MVA的疫苗可递送多个异源抗原并且允许同时诱导体 液与细胞免疫。
[0037] 在另一个方面中，适合用于产生重组病毒的MVA病毒株可以是MVA-572株、 MVA-575株或任何类似减毒MVA株。也适合的可以是突变体MVA，诸如缺失型绒毛膜尿囊安 卡拉痘苗病毒（dCVA)。dCVA包含MVA基因组的delI、delII、delIII、delIV、delV以 及delVI缺失位点。所述位点特别适用于插入多个异源序列。dCVA可在人类细胞系（诸 如人293、143B以及MRC-5细胞系）中繁殖性复制（其中扩增率大于10)，然后其通过用于 基于病毒的接种策略的进一步突变实现优化（参见W0 2011/092029)。
[0038] 定义
[0039] 术语"抗原决定簇"是指刺激宿主的免疫系统产生抗原特异性免疫反应（细胞反 应和/或体液抗体反应）的任何分子。抗原决定簇可包括在宿主中仍引发免疫反应的蛋白 质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位，并且形成抗原、蛋白质的同系物或变体、多肽 以及抗原性蛋白质片段、抗原以及表位的一部分，包括例如糖基化蛋白、多肽、抗原性蛋白 质片段、抗原以及表位，以及编码此类分子的核苷酸序列。因此，蛋白质、多肽、抗原性蛋白 质片段、抗原以及表位不限于特定天然核苷酸或氨基酸序列，但涵盖与天然序列同一的序 列以及对天然序列的修饰，诸如缺失、添加、插入以及取代。
[0040] 优选地，所述同系物或变体与参考蛋白、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位 在核苷酸或氨基酸序列层面具有至少约50%、至少约60 %或65%、至少约70 %或75%、至 少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%;更典型地至少约90%、 91%、92%、93%或94%和甚至更典型地至少约95%、96%、97%、98%或99%;最典型地 至少约99%的同一性。术语同系物或变体还涵盖截短、缺失或另外修饰的核苷酸或蛋白质 序列，诸如，例如（1)编码缺乏信号肽的可溶性形式的相应RSV-F或RSV-G蛋白以及全长 RSV-F或RSV-G蛋白的跨膜域和/或胞浆域的RSV-F或RSV-G核苷酸序列，（2)编码全长 RSV-M2或RSV-N蛋白的缺失、截短或另外的突变形式的RSV-M2或RSV-N核苷酸序列，（3) 缺乏信号肽的可溶性形式的RSV-F或RSV-G蛋白以及全长RSV-F或RSV-G蛋白的跨膜域和 /或胞浆域，或（4)全长RSV-M2或RSV-N蛋白的缺失、截短或另外突变形式。
[0041] 用于测定核酸和氨基酸之间的序列同一性的技术是本领域中已知的。可通过测定 两条或更多条序列的"同一性百分比"来将其进行比较。两条序列（核酸或氨基酸序列）的 同一性百分比是两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度并且乘以100。
[0042] 相对于本文所描述的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原以及表位的"氨基酸 序列同一性百分比（％ )"被定义为在比对序列并且必要时引入空位以实现最大序列同 一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考序 列（即将其衍生出来的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原或表位）中的氨基酸残基 相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以本领域 技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较 的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
[0043] 加以必要的变更，这也适用于"核苷酸序列同一性百分比（％ ) "。
[0044] 举例来说，通过Smith和Waterman, (1981)，AdvancesinAppliedMathematics 2:482-489的局部同源算法提供核酸序列的适当比对。此算法可通过使用由 Dayhoff,AtlasofProteinSequencesandStructure，M.O.Dayhoff编著，5 增刊 3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USA开发并且 通过Gribskov(1986),Nucl.AcidsRes. 14 (6) : 6745-6763标准化的打分矩阵应用于氨基 酸序列。此算法用于测定序列的同一,性百分比的示例性实现方式由GeneticsComputer Group(Madison,Wis.)在"BestFit"功效应用中提供。此方法的缺省参数描述于威斯康辛 州序列分析包程序手册（WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual),第 8版（1995)(可购自GeneticsComputerGroup,Madison,Wis.)中。在本发明上下文中 确定同一,性百分比的优选方法是使用由爱丁堡大学（UniversityofEdinburgh)拥有版 权、由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发并且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,Calif)分销的MPSRCH程序包。由此套程序包，可使用Smith-Waterman算法，其中在 打分表中使用缺省参数（例如空位开口罚分是12、空位延伸罚分是一，并且空位是六）。从 产生的数据来看，"匹配"值反映了"序列同一性"。其它适合用于计算序列之间的同一性 百分比或相似性的程序通常是本领域中已知的，例如另一种比对程序是以缺省参数使用的 BLAST。举例来说，可使用以下缺省参数来使用BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准；过滤 器=无；链=两条；截止值=60 ;预期值=10 ;矩阵=BL0SUM62 ;描述=50条序列；排序 依据=高得分；数据库=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankQ)S翻译+瑞士蛋白 质（Swissprotein)+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于以下网址：http://http://blast,ncbi.nlm.nih.gov/〇
[0045] 如本文所用，"异源"基因、核酸、抗原或蛋白质被认为是不存在于野生型痘病毒 基因组（例如MVA)中的核酸或氨基酸序列。熟练人员了解"异源基因"当存在于诸如MVA 的痘病毒中时是要以如下方式并入痘病毒基因组中，使得在向宿主细胞施用重组痘病毒之 后，所述异源基因表达为相应异源基因产物，即"异源抗原"和/或"异源蛋白质"。表达一 般是通过将异源基因可操作地连接至允许在痘病毒感染的细胞中表达的调控元件来实现。 优选地，调控元件包括天然或合成痘病毒启动子。
[0046] 如本文所用的"无菌免疫"意指在应用诸如RT-qPCR的灵敏检测方法时在不存在 可检测的RSV基因组的情况下的保护性免疫。
[0047] 必须指出的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式"一个/ 一 种（a/an)"和"该/所述"包括复数参考物。因此，举例来说，提到"一种表位"包括一个或 多个表位，并且提到"该/所述方法"包括提到本领域普通技术人员已知可改进或替换本文 所描述的方法的等效步骤和方法。
[0048] 除非另外指出，否则位于一系列元素前面的术语"至少"应被理解为是指所述系列 中的每一个元素。本领域的熟练技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验确定本文所描 述的本发明特定实施方案的许多等效物。此类等效物意在由本发明涵盖。
[0049] 在本说明书和随附权利要求书通篇中，除非上下文另外要求，否则词语"包含/包 括（comprise)"和诸如"包含/包括（comprises,comprising)"的变型应被理解为暗示包 括所陈述的整体或者步骤或者整体或步骤的群组，但不排除任何其它整体或者步骤或者整 体或步骤的群组。当在本文中使用时，术语"包含/包括（comprising)"可用术语"含有" 或"包括（including)"或有时当在本文中使用时用术语"具有"取代。以上所提到的术语 (包含、含有、包括、具有）中的任一者尽管较不优选，但无论何时在本文中用于本发明的一 个方面或实施方案的情况下均可用术语"由...组成"取代。
[0050] 当在本文中使用时，"由...组成"排除权利要求组成部分中未规定的任何元素、步 骤或成分。当在本文中使用时，"基本上由...组成"不排除不实质上影响权利要求的基本 和新颖特征的材料或步骤。
[0051] 如本文所用，多个所引用元素之间的连接术语"和/或"被理解为涵盖个别与组合 选择两者。举例来说，在两个元素通过"和/或"连接的情况下，第一选择指第一元素在不存 在第二元素情况下的适用性。第二选择指第二元素在不存在第一元素情况下的适用性。第 三选择指第一和第二元素一起的适用性。这些选择中的任一种均被认为落入所述含义内， 并且因此满足如本文所用的术语"和/或"的要求。所述选择中超过一种的共存适用性也 被认为落入所述含义内，并且因此满足术语"和/或"的要求。
[0052] RSV核苷酸序列和蛋白质
[0053] 尽管在病毒株或分离株之间基因的确切序列和/或基因组位置可不同，如本文所 提到的RSV基因是指编码任何RSV株或分离株中的相应蛋白质的基因；或所述基因的同系 物或变体。
[0054] 同样地，本文所提到的RSV蛋白是指由如上文所定义的相应蛋白质基因编码和表 达的蛋白质或所述蛋白质的同系物或变体。
[0055] 举例来说，如在本文中可互换使用，术语"F蛋白基因"、"F糖蛋白基因"、"RSVF蛋 白基因"、"RSVF糖蛋白基因"或"F基因"是指编码任何RSV株或分离株中的跨膜融合糖 蛋白的基因，尽管病毒株或分离株之间的确切序列和/或基因组位置可不同；或所述基因 的同系物或变体。举例来说，在RSV的A2株中，F(A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号 M11486中所编号的第5601-7499位（包括端点）核苷酸。F(A2)蛋白基因进一步包含跨越 如在GenBank登录号M11486中所编号的第5614-7338位（包括端点）核苷酸的编码蛋白 质的开放阅读框（ORF)。来自RSVA2的F蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQIDNO:28中。
[0056] 在本文中也可互换使用的是术语"F蛋白"、"F糖蛋白"、"RSVF蛋白"、"RSVF糖蛋 白"或"F"，所述术语是指由如上文所定义的RSVF蛋白基因编码和表达的高度糖基化跨膜 融合糖蛋白或所述蛋白质的同系物或变体。来自RSVA2的F蛋白的氨基酸序列显示于SEQ IDNO: 29中。RSV(A2)F蛋白包含信号肽、胞外域、跨膜域以及胞浆域（参见例如UniProtKB/ Swiss-Prot登录号P03420)。RSVA2F蛋白的信号肽由SEQIDN0:29的第1-21位氨基酸 组成；RSVA2F蛋白的胞外域由SEQIDN0:29的第1-529位氨基酸或SEQIDN0:29的第 22-529位氨基酸组成；RSVA2F蛋白的跨膜域由SEQIDNO:29的第530-550位氨基酸组 成；并且RSVA2F蛋白的胞浆域由SEQIDNO: 29的第551-574位氨基酸组成。
[0057] 同样地，术语"G蛋白基因"、"G糖蛋白基因"、"RSVG蛋白基因"、"RSVG糖蛋白基 因"或"G基因"在本文中也可互换使用。举例来说，在RSV的A2株中，G(A2)蛋白基因包 含如在GenBank登录号Ml1486中所编号的第4626-5543位（包括端点）核苷酸。G(A2)蛋 白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中所编号的第4641-5537位（包括端 点）核苷酸的编码蛋白质的开放阅读框（0RF)。来自RSVA2的G蛋白基因的核苷酸序列显 示于SEQIDNO:30 中。
[0058] 术语"G蛋白"、"G糖蛋白"、"RSVG蛋白"、"RSVG糖蛋白"或"G"是指高度糖基化 跨膜粘附糖蛋白或所述蛋白质的同系物或变体。来自RSVA2的G蛋白的氨基酸序列显示 于SEQIDNO:31中。RSVA2G蛋白包含胞外域、跨膜域以及胞浆域（参见例如UniProtKB/ Swiss-Prot登录号P03423)。RSVA2G蛋白的胞外域由SEQIDNO:31的第67-298位氨基 酸组成；RSVA2G蛋白的跨膜域由SEQIDNO:31的第38-66位氨基酸组成；并且RSVA2G 蛋白的胞浆域由SEQIDNO:31的第1-37位氨基酸组成。
[0059] 在本文中也可互换地使用的是术语"M2蛋白基因"、"M2核衣壳蛋白基因"、"RSVM2 蛋白基因"、"RSVM2基质蛋白基因"、"RSVM2核衣壳蛋白基因"或"M2基因"。举例来说，在 RSV的A2株中，M2 (A2)蛋白基因包含如在GenBank登录号Ml1486中所编号的第7550-8506 位（包括端点）核苷酸。M2 (A2)蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号M11486中 所编号的第7559-8143位（包括端点）核苷酸的蛋白质编码的开放阅读框（0RF)。来自RSV A2的M2蛋白基因的核苷酸序列显示于SEQIDNO:32中。
[0060] 在本文中可互换使用的是术语"M2蛋白"、"M2核衣壳蛋白"、"RSVM2蛋白"、"RSV M2核衣壳蛋白"、"RSVM2基质蛋白"或"M2"。来自RSVA2的M2蛋白的氨基酸序列显示于 SEQIDN0:33 中（参见例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P04545)。
[0061] 另外，术语"N蛋白基因"、"N核衣壳蛋白基因"、"RSVN蛋白基因"、"RSVN核衣壳 蛋白基因"或"N基因"在本文中可互换使用。举例来说，在RSV的A2株中，N(A2)蛋白基因 包含如在GenBank登录号M11486中所编号的第1081-2277位（包括端点）核苷酸。N(A2) 蛋白基因进一步包含跨越如在GenBank登录号Ml1486中所编号的第1096-2271位（包括 端点）核苷酸的编码开放阅读框（ORF)的蛋白质。来自RSVA2的N蛋白基因的核苷酸序 列显示于SEQIDNO: