24] 图16示出了通过空斑测定测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1X108TCID5Q 的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠 用106pfuRSV鼻内或用50ylFI-RSV肌内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfu RSV(A2)激发。4天后将肺分离并且通过空斑测定确定RSV负荷（pfu/肺）。
[0225] 图17示出了通过RT-qPCR测量的肺中的RSV负荷。将小鼠用TBS或1X108TCID5Q 的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B或MVA-mBN294A3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用 106pfuRSV鼻内或用50ylFI-RSV肌内免疫两次。然后，在第49天将小鼠用106pfuRSV A2激发。4天后将肺分离并且通过RT-qPCR测定RSV负荷（基于所观测到的L基因拷贝的 数目来估计）。
[0226] 图18示出了RSV(A2)激发后4天支气管肺泡灌洗（BAL)流体中的嗜酸性粒细 胞和嗜中性粒细胞浸润。将小鼠用TBS或IX108TCID50的MVA-mBN199B、MVA-mBN201B 或MVA-mBN294A3周分开两次进行皮下免疫。将对照小鼠用106pfuRSV鼻内或用50yl FI-RSV肌内免疫两次。然后将小鼠用106pfuRSVA2激发。4天后将肺用lmlPBS洗涤并 且测定BAL流体中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的百分比。
[0227] 序列简述
[0228] SEQIDNO: 1是编码来自人类RSV(hRSV)株A2(GenBank登录号Ml1486)的全长G 蛋白的DNA序列。
[0229] SEQIDNO: 2是来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的全长G蛋白的氨基酸 序列。
[0230] SEQIDNO: 3是编码来自hRSV株A2的全长F蛋白（BN变体）的DNA序列。
[0231] SEQIDNO:4是来自hRSV株A2的全长F蛋白（BN变体）的氨基酸序列。
[0232] SEQIDNO: 5是编码来自hRSV株A长的全长F蛋白（BN变体）的DNA序列。
[0233] SEQIDNO:6是编码来自hRSV株A长的全长F蛋白（BN变体）的氨基酸序列。
[0234] SEQIDNO: 7是编码来自hRSV株B(GenBank登录号P20896)的缺乏跨膜域和胞浆 域的截短G蛋白的DNA序列。
[0235] SEQIDNO: 8是来自hRSV株B(GenBank登录号P20896)的缺乏跨膜域和胞浆域的 截短G蛋白的氨基酸序列。
[0236] SEQIDNO: 9是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏终止密码子 的N蛋白的DNA序列。
[0237] SEQIDNO: 10是来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏终止密码子的N 蛋白的氨基酸序列。
[0238] SEQIDNO: 11是编码缺乏起始与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A的片 段的DNA序列。
[0239] SEQIDNO: 12是缺乏起始与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A的片段的 氨基酸序列。
[0240] SEQIDNO: 13是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏起始密码子 的全长M2蛋白的DNA序列。
[0241] SEQIDNO: 14是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏起始密码子 的全长M2蛋白的氨基酸序列。
[0242] SEQIDNO: 15是编码来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏跨膜域和胞 浆域的截短F蛋白（BN变体）的DNA序列。
[0243] SEQIDNO: 16是来自hRSV株A2(GenBank登录号Ml1486)的缺乏跨膜域和胞浆域 的截短F蛋白（BN变体）的氨基酸序列。
[0244] SEQIDNO: 17是编码来自hRSV株A2 (GenBank登录号Ml1486)的缺乏终止密码子 的N蛋白的DNA序列+编码缺乏起始密码子与终止密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A 片段的DNA序列+编码来自hRSV株A2 (GenBank登录号Ml1486)的缺乏起始密码子的全长 M2蛋白的DNA序列。
[0245] SEQIDN0:18是来自hRSV株A2(GenBank登录号M11486)的N蛋白的氨基酸 序列+缺乏起始密码子的来自口蹄疫病毒的蛋白酶2A片段的氨基酸序列+来自hRSV株 A2 (GenBank登录号Ml1486)的缺乏起始密码子的全长M2蛋白的氨基酸序列。
[0246] SEQIDNO: 19是来源于RSVF蛋白的RSV-1肽的氨基酸序列。
[0247] SEQIDN0:20是来源于RSVF蛋白的RSV-2肽的氨基酸序列。
[0248] SEQIDN0:21是来源于RSVF蛋白的RSV-3肽的氨基酸序列。
[0249] SEQIDN0:22是来源于RSVG蛋白的RSV-4肽的氨基酸序列。
[0250] SEQIDNO:23是来源于RSVG蛋白的RSV-5肽的氨基酸序列。
[0251] SEQIDNO:24是来源于RSVG蛋白的RSV-6肽的氨基酸序列。
[0252] SEQIDNO:25是来源于RSVG蛋白的RSV-7肽的氨基酸序列。
[0253] SEQIDNO:26是来源于RSVG蛋白的RSV-8肽的氨基酸序列。
[0254] SEQIDNO:27是来源于RSVM2蛋白的RSV-9肽的氨基酸序列。
[0255] 5￡〇10勵:28是编码来自111?￥株42的全长？蛋白的0嫩序列。
[0256] SEQIDNO: 29是来自hRSV株A2的全长F蛋白的氨基酸序列。
[0257] SEQIDNO: 30是编码来自hRSV株A2的全长G蛋白的DNA序列。
[0258] SEQIDN0:31是来自hRSV株A2的全长G蛋白的氨基酸序列。
[0259] SEQIDNO: 32是编码来自hRSV株A2的全长M2蛋白的DNA序列。
[0260] SEQIDNO: 33是来自hRSV株A2的全长M2蛋白的氨基酸序列。
[0261] SEQIDN0:34是编码来自hRSV株A2的全长N蛋白的DNA序列。
[0262] SEQIDNO: 35是来自hRSV株A2的全长N蛋白的氨基酸序列。
[0263] SEQIDN0:36 是用于RT-qPCR中的引物 1。
[0264] SEQIDNO:37 是用于RT-qPCR中的引物 2。
[0265] SEQIDNO: 38 是用于RT-qPCR中的探针 6。
[0266] SEQIDN0:39是PrS启动子的核苷酸序列。
[0267] SEQIDNO:40是Pr7. 5启动子的核苷酸序列。
[0268] SEQIDN0:41是PrSynllm启动子的核苷酸序列。
[0269] SEQIDN0:42是PrLEl启动子的核苷酸序列。
[0270] SEQIDN0:43是PrH5m启动子的核苷酸序列。 实施例
[0271] 实施例1 :重组MVA的构律。
[0272] 重组MVA的产牛是如下讲行:通过经由在CEF细胞中的使用用于选择重组MVA的 选择标记的同源性重组将RSV编码序列与所指示的启动子（图1) 一起插入MVA基因组。使 用基因间区（IGR)作为插入位点描述于W003/097845中。为缺失选择标记，使用同源性重 组的第二步骤。
[0273] MVA-BN?病毒用作用于产生含有IGR88/89中的RSV-A2-G和RSV-F-A2_BN的基 因的重组MVA-mBN199B的原料。MVA-mBN199的PreMaster材料用作用于产生以下描述的 MVA-mBN201B的原料。
[0274]插入到IGR88/89 中（MVA-mBN199B):
[0275] RSV-A2-G的编码序列是基于RSV-A2株糖蛋白G的天然存在序列。融合蛋白 RSV-F-A2BN的编码序列也是基于RSV-A2株，但由BavarianNordic改良。两种所插入的基 因均是由Geneart使用人适应密码子使用合成并且用于克隆重组质粒。RSV-A2-G的蛋白质 序列显示与GenBank序列P03423. 1的100%同一性。RSV-F-A2BN的蛋白质序列由于在位 置103处的一个单一的氨基酸交换（P换成A)仅显示与GenBank序列P03420. 1的99%同 一性。
[0276]插入至IGR148/149 中（MVA-mBN201B)：
[0277] RSV-N-A2和RSV-M2-A2的编码序列是基于相应RSV-A2株糖蛋白的天然存在 序列。两个基因是通过2A自切割肽序列[M.D.Ryan等（1991)，J.Gen.Virol. 72(Pt 11) : 2727-2732]连接，这允许两种单独的天然蛋白质在单一启动子的控制下表达。 RSV-G(B)和RSV-FA长BN的编码序列被截短以去除跨膜域，使得所表达的蛋白质可得以 分泌。所有插入的基因均是由Geneart使用优化密码子使用合成并且用于克隆重组质粒。 RSV-N-A2和RSV-M2-A2的蛋白质序列分别显示出与GenBank序列P03418. 1和P04545. 1有 100%的同一性。截短的RSV-G(B)的蛋白质序列显示与GenBank序列P20896. 1有100%的 同一性。如R.P.Du等（1994)Biotechnology(NY) 12(8) :813-818 所描述，截短的RSV-FA 长BN的编码序列被设计成含有RSV-F蛋白的起始526个氨基酸。
[0278] MVA-mBN210BAM2 的M2 (A2)中的缺失突夺体：
[0279] ]\^4-1^吧1(?八]\12在]\12仏2)基因的第12个密码子中包括缺失突变，从而不允许功 能性M2表达。此缺失引起苏氨酸和丙氨酸两种氨基酸添加至M2(A2)的起始11个氨基酸 中，继之转录停止（UGA终止密码子）。
[0280] 实施例2 :表汰RSVF蛋白、RSVG蛋白、RSVN蛋白以及RSVM2蛋白的重组MVA 痔苗的免痔原件和功效。
[0281] 疫苗候选者MVA-mBN199B编码RSV的糖蛋白（G)和融合（F)蛋白，而 MVA-mBN201BAM2和MVA-mBN201B表达除全长F和G蛋白之外的截短型F和G、核衣壳蛋白 (N)，并且在MVA-mBN201B的情况下还表达RSV的基质蛋白（M2)(参见图1)。这些实验的目 标是分析与MVA-mBN199B相比MVA-mBN201BAM2和MVA-mBN201B在经由皮下（s.c.)或鼻 内（i.n.)施用途径进行两次和三次免疫之后的免疫原性和保护性功效。
[0282] 这些构建体的功效是使用BALB/c小鼠的RSV(A2)激发模型来测试的。用 MVA-mBN199B或MVA-mBN201B进行两次免疫当皮下施加时如根据实时定量聚合酶链式反 应（RT-qPCR)所判断提供部分保护，并且当通过鼻内途径施加时提供几乎完全保护。由 MVA-mBN201B提供的保护比由MVA-mBN199B所提供的更佳。在由两种构建体诱导的体液免 疫反应中不存在差异，不过在T细胞反应中观测到重大差异。MVA-mBN199B诱导良好RSVF 特异性细胞反应，然而与MVA-mBN199B相比用MVA-mBN201B观测到强M2特异性T细胞反应 以及更显著的G特异性反应。因为在皮下和鼻内免疫之后所诱导的IgG和T细胞反应类似， 所以通过鼻内免疫获得的几乎完全无菌免疫可能与在粘膜感染位点处RSV特异性IgA的诱 导和分泌有关。对于MVA-mBN201BAM2,缺乏M2特异性T细胞反应与MVA-mBN201B相比与 减少的保护有关并且产生了与MVA-mBN199B相比类似的保护。
[0283] 研究设计
[0284] 将小鼠用 1X108TCID5(lMVA-mBN199B(组 3、4 以及 5)、1X108TCID5(lMVA-mBN201B(组 6、7以及8)或1父108!'(：105(|]\^六118吧018八]\12(组9)皮下（8.(〇或鼻内（1.11.)处理。根 据表1将小鼠处理两次（组3、4、6、7以及9)或三次（组5和8)。根据表7将两个对照组 用TBS(组1)处理（皮下）或用RSV(组2)鼻内处理两次。在免疫或激发的前一天以及处 死的当天收集血液。通过酶联免疫吸附测定（ELISA)测定RSV特异性IgG滴度。在第48 天，将一半小鼠处死。将它们的脾去除并且准备用于通过酶联免疫斑点检测技术（ELISP0T) 分析RSV特异性T细胞反应。在第49天，将剩余小鼠用106pfuRSVA2激发（鼻内）。 从激发当天开始每天监测外观和体重。激发后四天，通过注射高剂量的氯胺酮-赛拉嗪 (Ketamine-Xylazine)和末端放血将小鼠处死。在肺灌洗之后，将肺去除并且通过空斑测定 和通过RT-qPCR分析RSV负荷。
[0285] 表1 :实验设计
[0286]
【主权项】
1. 一种重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，其包含编码至少一种呼吸道合胞病毒 (RSV)膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，用于通过鼻内施用治疗或预防RSV感染，其中 排除肌内施用。
2. 如权利要求1所述的重组MVA，其仅仅包括鼻内施用。
3. 如权利要求1或2所述的重组MVA，其中所述重组MVA进一步包含编码RSV核衣壳 蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
4. 一种重组改良型安卡拉痘苗病毒（MVA)，其包含至少一条编码呼吸道合胞病毒 (RSV)膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列和至少一条编码RSV核衣壳抗原决定簇的核巧 酸序列。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的重组MVA，其中编码所述RSV膜糖蛋白的抗原决 定簇的所述核巧酸序列编码RSV F和/或RSV G抗原决定簇。
6. 如权利要求3至5中任一项所述的重组MVA，其中编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定 簇的所述核巧酸序列编码所述RSV N核衣壳和/或所述RSVM2基质蛋白的抗原决定簇。
7. 如前述权利要求中任一项所述的重组MVA，其包含一条编码RSV膜糖蛋白、优选所述 RSV F或所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及一条编码RSV核衣壳蛋白、 优选所述RSV N或所述RSV M2蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
8. 如权利要求1至6中任一项所述的重组MVA，其包含两条编码RSV膜糖蛋白、优选所 述RSV F和/或所述RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及一条编码RSV核衣 壳蛋白、优选所述RSV N核衣壳或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
9. 如权利要求1至6中任一项所述的重组MVA，其包含两条编码RSV膜糖蛋白、优选 RSV F和/或RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及两条编码RSV核衣壳蛋白、 优选RSV N和/或所述RSV M2蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
10. 如权利要求1至6中任一项所述的重组MVA，其包含=条编码RSV膜糖蛋白、优选 两种RSV F膜糖蛋白和/或一种RSV G膜糖蛋白或者两种RSV G膜糖蛋白和/或一种RSV F膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及两条编码RSV核衣壳蛋白、优选所述RSV N核 衣壳和/或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
11. 如权利要求1至6中任一项所述的重组MVA，其包含四条编码RSV膜糖蛋白、优选 地两种RSV F膜糖蛋白和/或两种RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及一条 编码RSV核衣壳蛋白、优选所述RSV N核衣壳或所述RSV M2基质蛋白的抗原决定簇的核巧 酸序列。
12. 如权利要求1至6中任一项所述的重组MVA，其包含四条编码RSV膜糖蛋白、优选 两种RSV F膜糖蛋白和/或两种RSV G膜糖蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列，W及两条编 码RSV核衣壳蛋白、优选所述RSV N和/或所述RSV M2蛋白的抗原决定簇的核巧酸序列。
13. -种用于确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的方法，其包括借助于 RT-qPCR确定在获自所述受试者的样品中是否存在RSV，借此RSV的存在指示复发性RSV感 染的存在。
14. 一种用于确定受试者是否具有针对RSV的后天无菌免疫的方法，其包括借助于 RT-qPCR确定在获自所述受试者的样品中是否存在RSV，借此RSV的存在指示所述受试者不 具有针对RSV的后天无菌免疫。
15.如权利要求1至12中任一项所述的重组MVA，其用于在通过如权利要求14所述的 方法诊断不具有针对RSV的后天无菌免疫的受试者中进行免疫和/或诱导无菌免疫的方法 中，所述方法包括向所述受试者鼻内施用所述重组MVA。
【专利摘要】本文提供作为针对呼吸道合胞病毒(RSV病毒)感染的改进的疫苗的重组改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)株，以及相关产物、方法及用途。具体地说，本文提供基因工程化的重组MVA载体，其包含至少一条编码RSV膜糖蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列和至少一条编码RSV核衣壳蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列。本文还提供其例如适合于影响受试者的免疫反应或适合于诊断RSV感染以及确定受试者是否处于复发性RSV感染的风险中的产物、方法以及用途。
【IPC分类】C12Q1-68, A61K39-155
【公开号】CN104540520
【申请号】CN201380040909
【发明人】塞德里克·舍米内, 罗宾·施泰格瓦尔德, 保罗·查普林
【申请人】巴法里安诺迪克有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年3月15日
【公告号】CA2879915A1, EP2879702A1, US20150209421, WO2014019718A1