发明提供的白细胞提取的制备方法通过将血液中分离到 的白细胞进行扩增培养，获得了大量的白细胞和提取液，从而提取得到了大量的核巧酸和 生长因子。与现有技术相比，同等体积的血液采用本发明提供的方法可获得85倍~100倍 量的核巧酸，且可提取到大量的细胞因子。减少了传统方法中对血液的需求量。
【附图说明】
[0化5] 图1示皿1表皮细胞培养24小时后形态；其中，图1-a为放大40倍，图1-b为放 大100倍；
[0056] 图2示皿3表皮细胞培养24小时后形态；其中，图2-a为放大40倍，图2-b为放 大100倍；
[0057] 图3示皿5表皮细胞培养24小时后形态；其中，图3-a为放大40倍，图3-b为放 大100倍。
【具体实施方式】
[005引本发明提供了一种白细胞提取物及其制备方法与应用，本领域技术人员可W借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过 较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
的范围内对本文的方法和应 用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0059] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0060] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0061] 实施例1白细胞的扩增培养
[0062] 取人体外周血80ml与40ml生理盐水混合后，缓慢加入到60ml淋己细胞分离液 中；700g离屯、分离，取白细胞（中间白膜层细胞），接种于培养基中，37°C，5%的C〇2培养， 每3~4天补充培养基，培养14天；培养基为RPMI1640培养基，其中包括质量分数为5% FBS和200U的白细胞介素2。补充培养基至培养基中的成分及各成分的含量与培养初期一 致。实验设两个平行，定期观察细胞量，其结果如表1所示：
[0063] 表1细胞培养过程中细胞量的变化
[0064] 第1天第4天第7天第10天第14天 组 1 2.1*1〇7 2.2*10' 1.13*l〇s 6.47*l〇s 1.87*1〇9 组 2 2.1*1〇7 2.35*1〇7 1.77*1〇8 8.52*1〇8 2.口*1〇9
[00化]结果显示，通过14天的培养，获得300ml~350ml培养物，细胞数量扩大了 85倍~ 100 倍。
[0066] 实施例2经培养白细胞中核巧酸的提取
[0067] 取实施例1中组1和组2培养后的培养物，经离屯、获得经培养的白细胞，用于核巧 酸的提取。另取两份80ml的人体外周血作为对照，分离白细胞后用于核巧酸的提取。
[0068] 加入1/5体积的质量分数为40%的肥1〇4,揽拌均匀，经1500~2000转/min的离 屯、，取上清液，加入K0H中和，揽拌均匀，经1500~2000转/分离屯、取上清液；每100毫升 上清液中加入2-3克活性炭，经揽拌均匀后，抽滤取活性炭；加入中性双蒸水揽拌、洗漆，抽 滤得活性炭；加入碱性溶液，抑值为11~13,揽拌、洗脱活性炭，抽滤得滤液，用HC1中和， 调整抑到中性，调整等渗度为1. 0。
[0069] 经检测，分离得到的核巧酸总量如表2所示：
[0070] 表2提取得到的核巧酸量
[0071] 80 mL人体 80 mL人体 实施例1中组1 实施例1中组2 提取材料 __外周血 外周血 培养物__培养物 分离细胞量（个） 2.1*1〇7 2.1*10^__2.1*10^__2.1*1〇7 裂解细胞量（个） 2.1*1〇7 2.1*10^__1.87*1〇9__2.12*1〇9 分离核普酸总量 0.206mg 0.212mg 18.23mg__20.78mg 单位扬每酸量 ,, 9.8峭 ！0.1 峭 9.75峭 9.8峭 (母百万细胞） 产物中掠.菩酸浓度 100|ag/ml 100|.ig/ml 100鸭/ml 100 峭/ml 产物体和、 2.06ml 2.12ml 182.3ml 207.8ml
[0072] 从数据结果可知；采用本发明提供的方法对白细胞经培养和提取核巧酸，总量可 提高85倍~100倍。
[0073] 实施例3培养液中生长因子的提取
[0074] 取实施例1中组1和组2培养后的培养物，分离白细胞后，得到培养液进行生长因 子的提取。
[0075] 培养液经0. 45 y m孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；
[0076] 再经0. 22 y m孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；
[0077] 得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤化去除小分子物质，得 到生长因子。
[007引经检测，提取得到的生长因子浓度为Img/血和2mg/mL。提取物的主要成分为白介 素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死因子。其中，白介素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死 因子的质量比为；8-10:1-3:2-5:0. 5-1。
[0079] 实施例4白细胞提取物的功效验证
[0080] 取实施例2制得的核巧酸和实施例3制得的蛋白质，W小鼠表皮细胞为实验对象， 检测其功效。实验方法为：
[0081] 取生长状态良好的小鼠表皮细胞1皿（15cm皿），消化后等量传代6皿（10cm皿）， 每皿接种1*1〇5个细胞，按W下方式补液培养，当细胞生长至80%融合时，扩增传代继续培 养，至第=天终止培养并计数，中途每化观察细胞生长状态。
[0082] 皿1 ;基本培养液
[0083] 皿2 ;基本培养液+制剂a (每10ml培养液添加1ml制剂a)
[0084] 皿3 ;基本培养液+制剂b (每10ml培养液添加1ml制剂b)
[0085] 皿4 ;基本培养液+制剂a+制剂b (制剂a和制剂b W 2:1混合得混合液1，每10ml 培养液添加1ml混合液1)
[0086] 皿5 ;基本培养液+制剂a+制剂b (制剂a和制剂b W 1:1混合得混合液2,每10ml 培养液添加1ml混合液2)
[0087] 皿6 ;基本培养液+制剂a+制剂b (制剂a和制剂b W 1:2混合得混合液3,每10ml 培养液添加1ml混合液3)
[008引培养结果如表3和图1~3所示。
[0089] 表3细胞培养结果
[0090] 组男4 皿1 皿2 皿3 皿4 皿5 皿6 细胞80% 44 h 32h 30h 24 h 22h 26h 融合时间 第3天 2*106 l.osno7 1.24*107 1.78*107 2.12*107 1.68*107 细胞总量（个）I I ____
[0091] 从数据分析结果可知：本发明提供的白细胞提取物具有促进表皮细胞增殖功能， 其中组别5中，制剂a和制剂b按1:1比例添加，在促进细胞融合速度上最快，获得的细胞 量也最高，说明本专利得到的制剂a和制剂b在1 ;1混匀后，可W达到最佳美容功效。
[0092] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，该些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种白细胞提取物，其特征在于，包括2. 5 μ g/mL~7 μ g/mL的核苷酸和0. 3mg/ mL~I. 5mg/mL的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的白细胞提取物，其特征在于，所述蛋白质包括白介素2、白介 素4、γ干扰素和肿瘤坏死因子。
3. 根据权利要求2所述的白细胞提取物，其特征在于，所述白介素2、白介素4、γ干扰 素和肿瘤坏死因子的质量比为：8~10:1~3:2~5:0. 5~1。
4. 如权利要求1~3任一项所述的白细胞提取物在制备美容护肤产品中的应用。
5. -种美容护肤产品，其特征在于，包括如权利要求1~3任一项所述的白细胞提取 物。
6. 如权利要求1~3任一项所述的白细胞提取物的制备方法为： 步骤1 :扩增培养白细胞，获得培养液和经扩增的白细胞； 步骤2 :提取所述经扩增的白细胞中的核苷酸；提取所述培养液中的蛋白质； 步骤3 :混合所述核苷酸和所述蛋白质，得到白细胞提取物。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸与所述蛋白混合的体积 比为2:1~1:2 ;优选为1:1。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述扩增培养白细胞的方法为：分离 血液中的白细胞，接种于培养基，5%的CO 2培养，每3~4天补充培养基，培养14天； 所述培养基为RPMI1640培养基，其中包括质量分数为5% FBS和200U的白细胞介素 2〇
9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸的提取方法包括： 步骤1 :将所述经扩增的白细胞以HClO4裂解，离心，取第一上清液； 步骤2 :所述第一上清液以KOH中和，离心，取第二上清液； 步骤3 :将所述第二上清液与活性炭混合后，以中性双蒸水洗涤，以碱性溶液洗脱，调 节pH值为中性，获得核苷酸。
10. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质的提取方法为：所述培 养液经0. 45 μ m滤膜、0. 22 μ m滤膜过滤后，去除滤液中3kDa以下的分子，得到蛋白质。
【专利摘要】本发明涉及活性物质提取技术领域，尤其涉及一种白细胞提取物及其制备方法与应用。本发明提供的白细胞提取物中，包括2.5μg/mL～7μg/mL的核苷酸和0.3mg/mL～1.5mg/mL的蛋白质。该白细胞提取物能够起到促进表皮细胞融合和增殖的作用，因此将本发明提供的白细胞提取物应用于美容护肤产品中可起到美白、去皱、抗衰老的作用。本发明提供的白细胞提取的制备方法通过将血液中分离到的白细胞进行扩增培养，与现有技术相比，同等体积的血液采用本发明提供的方法可获得85倍～100倍量的核苷酸，且可提取到大量的细胞因子，减少了传统方法中对血液的需求量。
【IPC分类】A61Q19-00, A61K8-64, A61K8-98, A61Q19-02, A61Q19-08
【公开号】CN104622777
【申请号】CN201510085332
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 应杰, 罗二梅
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月15日