一种白细胞提取物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及活性物质提取技术领域，尤其设及一种白细胞提取物及其制备方法与 应用。
【背景技术】
[000引 白细胞（white blood cell, WBC)俗称白血球，是血液中非常重要的一类细胞，具 有吞瞻异物并产生抗体、机体损伤治愈、抗御病原体入侵等方面的能力。
[0003] 现有技术中对W白细胞为原料进行提取的方法主要包括；首先，从血液中分离白 细胞，然后通过裂解并去除杂质后获得白细胞提取物。该种方法得到的产物中的主要成分 为核巧酸并含有极其微量的细胞因子或小分子多肤，其用途主要有增强免疫力、抗炎、抗菌 或抗肺纤维化。现有技术中尚未有关于白细胞提取物用于美容护肤产品的报道。
[0004] 分析原因，虽然白细胞提取物能够具有很好的增强免疫力的作用，但并不能很好 的起到促进皮肤细胞增殖和新陈代谢的作用。也就是说，将W核巧酸为主要成分的白细胞 提取物直接用于美容护肤产品，其效果并不理想。生长因子是具有刺激细胞生长的活性因 子，是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长和其他细胞功能的多效 应的多肤类物质。现有技术表明，在化妆品中添加生长因子能够增强新陈代谢能力。血液 中含有少量的生长因子，经传统的提取方法对白细胞进行提取后，提取物中存在的生长因 子微乎其微。
[0005] 当白细胞在体外扩增培养时，会产生大量的生长因子，因此，将白细胞扩增培养 后，分别提取白细胞和培养液，即可富集得到大量的核巧酸和生长因子。其中富含核巧酸的 提取物能够起到很好的提高免疫力的作用，而富含生长因子的提取物能够起到很好的促进 皮肤坏死细胞和毒素的清理的作用。但现有技术并无法获知将该些核巧酸和生长因子混合 是否能够起到更好的美容护肤效果。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种白细胞提取物及其制备方法与 应用。
[0007] 本发明提供的白细胞提取物，包括2. 5 y g/mL~7 y g/mL的核巧酸和0. 3mg/mL~ 1. 5mg/mL的蛋白质。
[000引在一些实施例中，本发明提供的白细胞提取物包括4 y g/mL~5 y g/mL的核巧酸 和0. 5mg/mL~Img/mL的蛋白质。
[0009] 本发明经试验证实，当白细胞中提取的核巧酸和培养液中提取的蛋白W 2 ;1~ 1:2的体积比混合时，能够促进小鼠表皮细胞的融合和增殖。表明该混合物能够起到良好的 促进皮肤新陈代谢、并提高免疫力的作用。
[0010] 作为优选，本发明提供的白细胞提取物中蛋白质的分子量不小于3kDa。
[0011] 蛋白质分子量通常不小于3kDa，例如，表皮生长因子EGF的分子量为6kDa左右； 白细胞介素2的分子量为15kDa，白细胞介素4的分子量为18~19kDa ; 丫干扰素的分子 量为14~16kDa ;肿瘤坏死因子分为TNF-a和TNF-0，其中，TNF-a的分子量为17kDa， TNF-0的分子量为25kDa。
[0012] 在本发明的实施例中，蛋白质包括白介素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死因子。
[0013] 在本发明的实施例中，白介素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死因子的质量比为： 8 ~10:1 ~3:2 ~5:0. 5 ~1。
[0014] 浓缩培养液，提取因子加到产品中是本专利的一个发明点，具体设及的因子种类 主要包括；白介素2、白介素4、丫干扰素、肿瘤坏死因子。
[00巧]白介素2 ;是所有T细胞亚群的生长因子，并可促进活化B细胞增殖，故为调控免 疫应答的重要因子，也参与抗体反应，造血和肿瘤监视，是免疫系统发挥免疫功能的一种重 要因子。
[0016] 白介素4;白细胞介素4是趋化因子家族中的一种细胞因子。白细胞介素4的生 物作用包括刺激活化B细胞和T细胞增殖，它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作 用。
[0017] 丫干扰素；巨瞻细胞活化因子，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。干扰素可W 用来治疗传染病，但也能促成自身免疫。
[001引肿瘤坏死因子（TNF);分TNF- a、TNF- 0，在生活学活性上都起杀伤或抑制肿瘤细 胞的作用，并具有抗感染、提高中性粒细胞的吞瞻能力、刺激机体局部炎症反应等功能。
[0019] 美容功效的好坏取决于美容产品能否促进皮肤细胞的增殖和新陈代谢，本发明通 过实验表明，本发明提供的白细胞提取物能够促进小鼠表皮细胞的融合和增殖，因此，本发 明提供的白细胞提取物能够应用于美容护肤产品中。
[0020] 本发明提供的白细胞提取物在制备美容护肤产品中的应用。
[0021] 一种美容护肤产品，其中包括本发明提供的白细胞提取物。
[0022] 本发明所述的美容护肤产品为；面膜、眼霜、面霜、精华素、洁面乳、爽肤水、乳液、 隔离霜和防晒霜。
[0023] 本发明提供的白细胞提取物的制备方法为：
[0024] 步骤1 ;扩增培养白细胞，获得培养液和经扩增的白细胞；
[0025] 步骤2 ;提取经扩增的白细胞中的核巧酸；提取培养液中的蛋白质；
[0026] 步骤3 ;混合核巧酸和蛋白质，得到白细胞提取物。
[0027] 常规白细胞提取物是直接裂解血液中分离得到的白细胞，获取白细胞内部的核巧 酸部分，同等体积的血液标本得到的白细胞提取物量少，效果不好；而且忽略了白细胞分泌 的重要成分御胞因子。本发明将分离得到白细胞经培养得到上百倍的原白细胞数量，从而 提取得到了更多的核巧酸。并且，本发明充分利用白细胞培养液，对其进行超滤浓缩，获得 白细胞分泌的细胞因子。实验结果表明，采用本发明提供的方法对白细胞培养并提取核巧 酸，其提取总量较现有技术提高85倍~100倍。
[002引在一些实施例中，核巧酸与蛋白质混合的体积比为2:1~1:2 ;优选为1:1。
[0029] 当白细胞中提取的核巧酸和培养液中提取的蛋白质W 2:1~1:2的体积比混合 时，制得的白细胞提取物中包括2. 5 y g/mL~7 y g/mL的核巧酸和0. 3mg/mL~1. 5mg/mL 的蛋白质。本发明通过试验证实，该白细胞提取物能够促进小鼠表皮细胞的融合和增殖。
[0030] 作为优选，扩增培养白细胞的方法为；分离血液中的白细胞，接种于培养基，5%的 C〇2培养，每3~4天补充培养基，培养14天；
[0031] 所述培养基为RPMI1640培养基，其中包括质量分数为5% FBS和200U的白细胞介 素2。
[0032] 具体的，扩增培养白细胞的方法包括；
[003引步骤1 ;血液与生理盐水W体积比为2:1混合后，缓慢加入到1/2体积的淋己细胞 分离液中；
[0034] 步骤2;将步骤1中所得产物700g离屯、分离，取白细胞（中间白膜层细胞），接种于 培养基中，37°C，5 %的C〇2培养，每3~4天补充培养基，培养14天；所述培养基为RPMI1640 培养基，其中包括质量分数为5% FBS和200U的白细胞介素2。
[0035] 该方法可用于提取的血液来自动物或人体。采用该方法培养白细胞14天后，细胞 总量扩大85倍~100倍。
[0036] 作为优选，核巧酸的提取方法包括：
[0037] 步骤1 ;将经扩增的白细胞W肥1〇4溶液裂解、离屯、，取第一上清液；
[003引步骤2 ;第一上清液W KOH中和、离屯、，取第二上清液；
[0039] 步骤3 ;将第二上清液与活性炭混合后，W中性双蒸水洗漆，W碱性溶液洗脱，调 节抑值为中性，获得核巧酸。
[0040] 优选的，肥1〇4溶液中，肥10 4的质量分数为40%。
[0041] 优选的，肥1〇4溶液与经扩增的白细胞的体积比为1: 5。
[00创优选的，步骤1中离屯、的转速为1500转/min~2000转/min。
[004引优选的，步骤2中离屯、的转速为1500转/min~2000转/min。
[0044] 优选的，每100ml第二上清液与2g~3g活性炭混合。
[0045] 优选的，碱性溶液的抑值为11~13。
[0046] 优选的，步骤3具体为：将第二上清液与活性炭混合后，抽滤弃除滤液，加入中性 双蒸水，洗漆后抽滤弃除滤液，加入碱性溶液抽滤取滤液，调节抑值为中性。
[0047] 优选的，在步骤3后，还包括调整等渗度至1. 0的步骤。
[0048] 采用本发明提供的方法提取核巧酸，所得产品中核巧酸的浓度为8 yg/mL~ 10 U 咨/mL。
[0049] 作为优选，蛋白质的提取方法为：培养液经0. 45 ym滤膜、0. 22 ym滤膜过滤后，去 除滤液中3kDa W下的分子，得到蛋白质。
[0化日]优选的，去除滤液中3kDa W下的分子采用Slice200切向流器，循环过滤的时间为 3h〇
[0化1] 具体的，蛋白质的提取方法为：培养液经0. 45 ym孔径的滤膜初滤，除去大体积杂 质；再经0. 22 ym孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；得到的滤液接通Slice200切向 流器，经3kDa滤膜循环过滤化去除小分子物质，得到成品。
[0052] 采用该方法提取得到的蛋白质的浓度为Img/血~2mg/mU其中主要成分为白介 素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死因子。其中，白介素2、白介素4、丫干扰素和肿瘤坏死 因子的质量比为；8~10:1~3:2~5:0. 5~1。
[0化3] 血液中存在极少量的细胞因子，血液中分离的白细胞未经培养前，直接提取获得 的细胞因子量很低。本发明对经过长时间培养白细胞所获得的培养液进行提取，获得了大 量细胞因子，且该些因子在免疫排毒方面有重要作用，从而在美容方面可W促进皮肤层坏 死细胞和毒素的清理，起到美容功效。
[0054] 本发明提供了一种白细胞提取物及其制备方法与应用，本发明提供的白细胞提取 物中，包括2. 5 y g/mL~7 y g/mL的核巧酸和0. 3mg/mL~1. 5mg/mL的蛋白质。现有技术 表明，W核巧酸为主要成分的白细胞提取物能够起到很好的提高免疫力的作用，而生长因 子能够起到促进细胞新陈代谢的作用。然而，尚无任何证据表明核巧酸与生长因子混合使 用能够对表皮细胞有益。本发明通过实验证明，本发明提供的白细胞提取物能够起到促进 表皮细胞融合和增殖的作用，因此将本发明提供的白细胞提取物应用于美容护肤产品中可 起到美白、去皱、抗衰老的作用。本