一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种制备自体外周血内皮祖细胞的方法以及通过所述方法获得的含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品。特别地，本发明涉及采用自体外周血来源的富含血小板血浆和内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到富含血小板血浆中制备成生物美容制剂，富含血小板血浆促使内皮祖细胞分化为内皮细胞形成血管。同时提供了由自体内皮祖细胞和自体血浆制备成医学美容产品，可用于皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的症痕等修复改善。
【背景技术】
[0002]目前，市场上已经出现一些活细胞医学美容产品，但这些活细胞来源多数为同源异体的。尽管皮肤免疫反应低下，但是作为异体的活细胞应用到皮肤上，还是容易发生过敏反应，所以需要在应用前进行皮试，观察两个小时以上，无过敏反应方可应用。
[0003]内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。内皮祖细胞主要来源骨髓，但骨髓采集需要麻醉且较痛苦，存在创伤，不易为人们接受。在人循环血液中已经证明存在内皮祖细胞，可以分化成内皮细胞和/或平滑肌细胞，其主要功能是参与血管新生。表皮和真皮层细胞之所以能使得皮肤保持活力，主要是因为皮肤中毛细血管提供了足够的养分，促使细胞不断增殖、分裂和分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能。
[0004]本发明利用外周血内皮祖细胞及其血管生成的功能，配合富含血小板血浆中大量细胞因子和营养成分，有效令内皮祖细胞分化为内皮细胞和平滑肌细胞，应用到皮肤中形成新生血管，保持皮肤丰富的营养成分，促使细胞不断增殖、分裂和分化。特别是，对于皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等，具有良好修复作用。
【发明内容】
[0005]为了促使皮肤新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能，本发明利用自体外周血来源富含血小板血浆和内皮祖细胞的生物学作用，可以有效地促使内皮祖细胞分化为内皮细胞和平滑肌细胞，形成新生毛细血管，为皮肤供应充足养分。本发明通过采集抗凝外周血获得自体血浆，抗凝外周血来源单核细胞培养获得内皮祖细胞。自体血浆富含血小板和富含各种生长因子，其中成纤维细胞生长因子:激发新活细胞，加速组织修复；表皮生长因子:修复上皮细胞，加速血管生长，加快组织修复；转化生长因子:促进血管上皮细胞修复再生；血小板衍生生长因子:产生胶原蛋白，促进血管生长，激活细胞再生；血管内皮生长因子:强力修复组织，产生胶原蛋白，刺激产生透明质酸。
[0006]本发明中内皮祖细胞存在骨髓和外周血中，加速新生血管的形成，完善组织的血液循环，改善组织的血供，最终达到防止组织缺血坏死。内皮祖细胞可以直接作用于终末血管，增加皮瓣局部毛细血管及小静脉的数量和总面积，以增加皮片及随意皮瓣的成活面积。烧伤、外伤等引起的疤痕，内皮祖细胞可以加速创伤愈合的速度，减少瘢痕增生的发生，促进脂肪细胞增殖和存活。内皮祖细胞通过对血管内皮细胞的作用，促进皮肤组织不断形成新的毛细血管，供应充足营养，使得成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等不断增殖、分裂和分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能。
[0007]本发明提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆和培养获得自体内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂。
[0008]所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物；所述自体内皮祖细胞高表达CD34、⑶133和FLK-1分子；所述自体内皮祖细胞高表达⑶34+彡90 ⑶133+彡90 %和FLK-1+ 彡 80%。
[0009]本发明提供了的富含血小板血浆由抽取人自体抗凝外周血，经两次离心去除红细胞和白细胞后获得的富含血小板血浆，放置4°C冰箱存放备用。
[0010]本发明提供了的自体内皮祖细胞，其特征在于由离心获取自体血浆后的血细胞，经Ficoll密度分离液离心获得单核细胞，用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12yg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )重悬，按5Χ 16细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中5ml，于37°C，5% CO2培养箱中生长48小时。
[0011]48小时后对培养的内皮祖细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入5ml新鲜的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )，重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中继续在37°C，5% CO 2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。
[0012]内皮祖细胞在25cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01 % EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞；用5ml移液管加入1ml新鲜的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )，加入到I瓶用纤连蛋白包被的75cm2培养瓶中继续在370C ,5% 0)2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。如此连续传代1-5 (优选连续传代3代)代培养经胰酶消化离心后，获得4X 17以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4°C存放备用。
[0013]所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物，其表型检测方法为:取苔盼兰染色计数后的2 X 16细胞，分两组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20 μ LPE标记鼠抗人⑶133单抗和20 μ L Percp标记鼠抗人⑶34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓中液洗涤三次，最后用0.5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测，所述自体内皮祖细胞高表达CD34+彡90%、CD133+彡90%和FLK-1+彡80%。
[0014]所述自体内皮祖细胞可用40%内皮祖细胞培养液、10%二甲基亚砜和50%胎牛血清组成的冻存液，储存在_196°C液氮罐中，以备今后复苏后使用。
[0015]本发明还提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品，其中，该产品主要由如下成分组成:
[0016]I) 5ml自体富含血小板血浆；
[0017]2) 5 X 16自体内皮祖细胞；
[0018]装入1ml无菌的密封塑料针管中，共5ml，包装后形成产品，可保存在4°C冰箱条件下，保质期为24小时。
[0019]本发明提供了含有自体血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，
[0020]通过本发明的方法，通过获取的富含血小板血浆和自体内皮祖细胞制备成的医学美容制剂。由本发明提供的方法得到含有自体富含血小板血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，能够对皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等产生良好修复和填充作用，以及具有祛皱、抗氧化、皮肤修复、除斑和抗衰老。
【附图说明】
[0021]图1表示由实施例1所培养的内皮祖细胞图片。
[0022]图2表示由实施例1所培养的内皮祖细胞流式细胞图片。
[0023]图3表示36岁男性经含自体内皮祖细胞的医学美容制剂I个疗程美容前后外伤疤痕改善的图片。
【具体实施方式】
[0024]本发明提供了一种含自体外