周血内皮祖细胞的医学美容产品的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆，然后培养获得自体内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂。
[0025]所述自体血浆通过两步离心分离法得到，由抽取人50-200ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血楽，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4°C冰箱存放备用。
[0026]优选地，自体抗凝外周血使用肝素和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)作为抗凝剂。
[0027]本发明所述的自体内皮祖细胞，其特征在于由离心获取自体血浆后的血细胞，经Ficoll密度分离液离心获得单核细胞，用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2%胎牛血清、1U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子_1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)重悬，按5Χ 16细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中5ml，于37°C，5% CO 2培养箱中生长48小时。
[0028]48小时后对培养的内皮祖细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入5ml新鲜的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )，重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中继续在37°C，5% CO 2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。
[0029]内皮祖细胞在25cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01 % EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞；用5ml移液管加入1ml新鲜的EGM_2(含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子_1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )，加入到I瓶用纤连蛋白包被的75cm2培养瓶中继续在37°C，5% CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。如此连续传代1-5代(优选连续传代3代)培养经胰酶消化离心后，获得4X 17以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4°C存放备用。
[0030]所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物，其表型检测方法为:取苔盼兰染色计数后的2 X 16细胞，分两组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20 μ L PE标记鼠抗人⑶133单抗和20 μ L Percp标记鼠抗人⑶34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl、20 μ L PE标记鼠IgGl和20 μ L PerCP标记鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测，即 CD34+ 彡 90%、CD133+ 彡 90%和 FLK-1+ 彡 80%。
[0031]作为本发明制造方法中使用的重组人纤连蛋白包被的培养瓶，在超净台中包被前用PBS预先湿润培养瓶，吸弃PBS，加入FN(25-200 μ g/ml, lml)，室温包被30_60min ;吸弃包被液，在超净台中开风机吹干，使用的培养瓶可例举为25cm2细胞培养瓶、75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、细胞培养皿和细胞培养板等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养瓶。
[0032]本发明的制造方法中对内皮祖细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50%小牛血清、40%细胞培养液和10%二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为内皮祖细胞培养液。复苏后培养的内皮祖细胞仍高表达⑶34、⑶133和FLK-1。
[0033]本发明还提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品，其中，该产品主要由如下成分组成:
[0034]I) 5ml自体富含血小板血浆；
[0035]2) 5 X 16自体内皮祖细胞；
[0036]装入1ml无菌的密封塑料针管中，共5ml，包装后形成产品，可保存在4°C冰箱条件下，保质期为24小时。
[0037]在医学美容产品中用密封塑料针管包装，使用含肝素的动脉血气针或不含肝素的有密封盖的塑料针管，优选地，使用含肝素的动脉血气针，可以保持内皮祖细胞不凝聚在一起。
[0038]本发明提供了含有自体血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，能够对皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等产生良好修复和填充作用，还能够对皮肤具有祛皱、抗氧化、皮肤修复、除斑和抗衰老。本发明还提供了该美容制剂使用方法，即美容针局部注射，选择人暗斑、粉刺瘢痕、疤痕以及皱纹等部位皮肤真皮层注射，为皮肤产生修复、填充、祛皱、抗氧化和除斑等功效。具体方法如下:美容者使用洁面乳清洗面部皮肤，晾干后脸部涂上皮肤外用麻醉剂，根据麻醉剂使用要求，一般约15分钟麻醉剂起效。将装有本发明生物美容制剂的塑料注射器安装上20G有侧开口的美容针，取暗斑、瘢痕和疤痕等部位进行真皮层注射500ul，缓慢撤出美容针后用无菌棉棒轻轻压住2-5分钟，对于面积较大的暗斑、瘢痕和疤痕等可以多点注射，注射完毕后冰覆20-40分钟，也可以用于皱纹的除皱美容。
[0039]美容者本发明生物美容制剂处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，一般需间隔I个月连续使用4次，可达到更佳的医学美容效果，对皮肤可以去除暗斑、粉刺瘢痕减少、疤痕填充和修复以及抗氧化的作用。
[0040]以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
[0041]制备例I富含血小板血浆的制备
[0042]用两支50ml注射器分别抽取1000U/ml肝素2ml (河北常山生化药业股份有限公司)，采集人10ml抗凝经脉血后摇匀，将采集的肝素抗凝血加入到两支50ml无菌离心管中，经1000转每分钟速度离心10分钟，用5ml移液管吸取离心后上层血浆置新的50ml离心管中，获得40ml左右自体血浆。自体血浆再次3000转每分钟离心10分钟，获得40ml左右富含血小板血浆，分装至15ml无菌离心管中，置4°C冰箱存放备用。
[0043]制备例2自体内皮祖细胞制备
[0044]取制备例I中离心获取自体血浆后的60ml血细胞，用60mlI XPBS (pH值为7.4)稀释，加入到Ficoll密度分离液中经1800rpm密度梯度离心30min，获得单核细胞，苔盘兰染色后倒置显微镜下计数。计数后单核细胞用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )重悬，按5Χ 16细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中5ml，于37°C，5% CO2培养箱中生长48小时。
[0045]48小时后对培养的内皮祖细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入5ml新鲜的EGM-2 (含2%胎牛血清、10U/ml肝素、12 μ g/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、I μ g/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β )，重组人纤连蛋白包被的25cm2培养瓶中继续在37°C，5% CO 2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。
[0046]内皮祖细胞在25cm2培养瓶中生长融合达到80%以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25% (质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01 % EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内