B和RB)和末端气道中（图IC和图1D)检测到不同的TGF-β免疫反应性（暗斑）。此外， 在末端气道壁中，相对于TGF-β 2和TGF-β 3, TGF-β 1显示有更高的免疫反应性。所有的 图均用苏木精复染。实心比例尺：50 ym ;空心比例尺：100 ym ;交叉阴影线比例尺：30 μπι。
[0069] 图2A-2F为显微照片，显示TGF- β中和抗体在10日龄小鼠幼崽肺中检测到 TGF-β表达。图2A-2C中，用泛特异性单克隆抗TGF-β抗体IDll在10日龄的小鼠幼崽 的肺中检测到TGF-β免疫反应性（暗斑）。图2D-2F中，用非免疫血清代替IDll与肺共 同孵育。如图2Α所示，在大气道（*)和血管（**)的壁中及细胞外基质（箭头）中的细胞 鉴定出了 TGF-β免疫反应性。并且在幼崽肺远端气道中鉴定出了 TGF-β免疫反应性（图 2Β和2C)。所有的图均用苏木精复染。实心比例尺：20μπι;空心比例尺 ：50μπι。
[0070] 图3A-3D为显微照片，显示用抗TGF-β抗体的治疗降低受损的新生肺中的TGF-β 信号传导。用免疫组织化学检测经过以下处理的10日龄幼崽肺中的P_Smad2(暗斑）：PBS 和空气（图3八）、？85和85%02(图38)、1011和空气（图3〇以及1011和85%02(图30)。 与暴露于空气的肺相比，用PBS处理并暴露于85% O2IO天的肺在远端气道的细胞核中检测 到更丰富的p_Smad2(箭头指示代表性的细胞核p-Smad2免疫反应性）。相反，用IDll处 理、暴露于O 2的肺中，具有P_Smad2反应性的细胞核比用PBS处理并暴露于O2的肺中具有 p-Smad2反应性的细胞核的少。用IDll处理、暴露于02的肺中的p-Smad2染色的细胞核还 与用PBS和IDll处理并暴露于空气的肺中的p-Smad2染色的细胞核数量相似。所有的图 均用苏木精复染。比例尺：50 μ m。
[0071] 图4A-4D为显微照片，显示暴露于抗TGF- β抗体与受损的新生肺中远端气道发育 的改善相关。用甲苯胺蓝染色经过以下处理的10日龄幼崽肺切片：PBS和空气（图4A)、PBS 和85% O2 (图4B)，IDll和空气（图4C)以及IDll和85% O2 (图4D)。与暴露于空气的幼 崽肺相比，用PBS处理并暴露于85%02与远端气腔面积增加和次级隔数量减少（箭头）相 关。用IDll处理改善了暴露于O 2的幼崽肺的远端气道发育；在这些肺中显示有更多的肺 泡形成。比例尺：200 μπι。
[0072] 图5A-5C为实验图示，显示在受损的肺中，用抗TGF-β抗体进行处理改善肺泡发 育的客观量化指征。在PBS处理的小鼠肺中，在周边肺中慢性暴露于85%的氧与平均弦长 (Lm)和气腔体积密度AVD)(图5Β)的增加相关（图5Α)，而这些与周边肺发育和气道表 面积成反比，慢性暴露于85%的氧还与发育中的肺中的次级隔密度降低相关（图5C)。在 慢性暴露于高水平O 2的肺中，用IDll处理抑制Lm和％ AVD的异常增加，并提高次级隔的 密度。每组 N = 12 ;*Ρ〈(λ 05。
[0073] 图6A-6C为显微照片，显示在用抗TGF- β抗体处理的受损新生肺中，弹性蛋白的 表达提高。显示了经下列处理的10日龄小鼠幼崽周边肺的弹性蛋白米勒染色（黑）：PBS 和空气（图6A)、PBS和85% O2 (图6B)以及IDll和85% O2 (图6C)。弹性蛋白在对照的 幼崽周边肺中表达，在次级隔（箭头）顶部观察到高水平表达。慢性暴露于高水平O2与定 位于隔片（spetae)中的弹性蛋白减少和其与球囊壁关联的增加相关（箭头头部；图6B)。 用抗TGF-β抗体处理与弹性蛋白在肺泡隔顶部的沉积增加相关。实心比例尺：100μπι ;空 心比例尺：20 μπι。
[0074] 图7Α为显微照片，图7Β为实验图示，显示用抗TGF-β抗体处理受损的发育中的 肺提高周边肺实质中的弹性蛋白体积密度％ EVD)，其为细胞外基质发育的客观量化指 征。在PBS处理的小鼠肺中，慢性暴露于85%氧与弹性蛋白的异常沉积相关，该异常沉积 由％ EVD的增加反映。用IDll处理通过改善弹性蛋白在周边肺的分布来抑制％ EVD的异 常增加。每组N = 4 ;*Ρ〈0· 05。
[0075] 图8A-8C为显微照片，显示在用抗TGF-β抗体处理的受损肺中，肺微血管内皮细 胞形态（pattern)发生显著改善。显示了经下列处理的10日龄小鼠幼崽周边肺中，内皮细 胞a -D-半乳糖苷的西非单叶豆（Griffonia simplicifolia)凝集素染色：PBS和空气（图 8A)、PBS和85 % O2 (图8B)以及IDll和85 % O2 (图8C)。暴露于85 % 02的幼崽肺隔壁增 厚，且内皮细胞染色呈错综复杂的形态。相反，用IDll和高水平氧处理的肺则具有更有条 理的内皮细胞形态。所有的图均用苏木精复染。实心比例尺：1〇〇μπι;空心比例尺 ：20μπι。
[0076] 图9Α-9Β为实验图示，显示用抗TGF-β抗体处理的受损肺中的肺微血管发育具有 改善的客观量化指征。用分别与凝集素和a SM抗体反应的幼崽肺检测周边肺中内皮细胞 的％萦光体积密度FVD)(图9A)和SMC (图9B)。发育中肺的损伤与凝集素增加和a SM 的％ FVD减少相关。相反，暴露于TGF-β中和抗体则提高这些肺微血管细胞标记物的体积 密度。每组 N = 7 ;*，Ρ〈(λ 05。
[0077] 图10A-10C显示用抗TGF-β抗体处理的受损的新生肺中，肺微血管肌成纤维细胞 的标准化。显示经下列处理的10日龄小鼠幼崽周边肺细胞中的a SMA免疫反应性（暗斑）： PBS和空气（图10Α)、PBS和85 % O2 (图10Β)以及IDll和85 % O2 (图10C)。与呼吸空气 的小鼠幼崽的肺相比，暴露于高水平〇2的肺在肺周边的a SM免疫反应性较低。用IDll和 高水平氧处理的幼崽肺显示在远端气道壁具有更多的a SMA免疫反应性。所有的图均用甲 苯胺蓝复染。实心比例尺：IOOym ;空心比例尺：20 μ m。
【具体实施方式】
[0078] 实施例
[0079] 实验设计
[0080] 在胚胎第17和19天，对标注时间（time-dated)的C57BL/6怀孕小鼠 （Charles River)腹腔注射含有或不含10mg/kg泛特异性抗TGF-β IDll (Genzyme)的0· 5ml PBS pH 7. 4,或是没有已知抗原的同种型配对骨髓瘤蛋白（M0PC21;Sigma-Aldrich)。出 生12小时以内，经相似处理的成对母鼠的幼崽混合，随机分为两窝，随后与其母鼠一起接 受连续的空气或85%氧处理10天。每24小时，将成对两窝中的授乳母鼠根据不同的O 2 暴露水平进行交换，以减少呼吸高水平O2造成的影响。医用级别的氧和氮气（Airgas) 用分别调控和校准的流量表进行混合。将气体混合物引入680L丙稀酸接触室（acrylic exposure chamber)。阻隔室（airlock)使得可以交换母鼠及更新食物、水和寝具而不改 变幼崽的氧暴露水平。接触室中新鲜气流的流速超过计算得出的其内小鼠的氧消耗的 10 倍以上（Bartlett 等人，Respir. Physiol. 29:193-200 (1997))。氧水平用顺磁反应法 (paramagnetic method)测定（Servomex model 572)。此暴露方法产生具有稳定氧水平的 气体氛围，且接触室中的相对湿度和温度分别为不超过60%和70°C。所有方案均经过麻 省综合医院动物研宄小组委员会（Subcommittee for Research Animal Studies of the Massachusetts General Hospital)批准。
[0081] 组织制备
[0082] 为得到分析用的肺和心脏，幼崽经称重，通过腹腔注射200mg/kg戊巴比妥钠 处死。施行胸廓切开术令肺萎陷，通过颈中的横切口鉴定气管，将0.61mm外径的聚乙 稀管（PE10 ;Harvard Apparatus)固定在气管中。用含3%低聚甲醛和0.1%戊二醛 (gluteraldehyde)的PBS以22cm的H 2O压力令肺膨胀30分钟，而后当肺扩张时结扎气 道。幼崽躯体于4°C浸于固定剂中3天。从躯体中解剖心和肺，4°C储存于PBS中留待进一 步分析。为获得用于冷冻切片的肺组织，进行气管插管，用组织冷冻培养基（TFMJriangle Biochemical Sciences)和含20%鹿糖的PBS(按1:1体积比稀释）轻柔地令肺膨胀并取 出。随后，用TFM将肺覆盖，在异戊烷中冷冻（保存在干冰上），储存在-80 °C待用。
[0083] 检测组织TGF-β。
[0084] 用免疫组织化学检测幼崽肺中的TGF-β同种型免疫反应性。经过柠檬酸抗原 修复之后，封闭肺切片，暴露于兔抗TGF-01(Santa Cruz，sc-146)、TGF-02(sc-9O)和 TGF- β 3 (sc-82)抗体及预先免疫的兔血清（对照）。经充分洗涤，切片暴露于生物素化的 抗兔抗体、抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物（Vector Labs)和二氨基联苯胺（DAB ; Vector labs)，再用苏木精复染。肺TGF-β也用泛特异性抗TGF-β抗体和间接免疫组织 化学（Graham等人，Biol. R印rod. 46:561-572 (1992))以及对于使用小鼠组织中的鼠类抗 体最优化的市售试剂盒（M.O.M.免疫检测试剂盒；Vector Labs)进行检测。将石蜡包埋的 6 μπι厚的肺切片用二甲苯、醇梯度溶液处理，在PBST(含有0. 1 %吐温20的PBS)中水合。 在封闭试剂中孵育后，组织在4°C下暴露于IDll (在封闭溶液中稀释）过夜。组织用PBST 洗涤过后，用生物素化的抗小鼠抗体孵育，用PBST洗涤，暴露于抗生物素蛋白-生物素过氧 化物酶复合物（Vector Labs)和二氨基联苯胺（DAB ;Vector labs)，再用苏木精复染。
[0085] 分析TGF-β信号传导
[0086] 用间接免疫组织化学检测肺中的细胞核磷酸SMAD 2 (p-Smad2)。将6 μ m厚的冷冻 肺切片置于Superfrost Plus?载玻片（Fisher Scientific)上，用含4%低聚甲醛的PBS 固定2分钟，用100 %甲醇透化处理10分钟。用含5 %山羊血清的PBST封闭1小时，将切 片在4°C下暴露于用封闭液稀释的兔抗pSmad2(Cell Signaling)中过夜。切片用PBST洗 涤后，与生物素化的抗兔抗体孵育，用PBST洗涤，暴露于抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶 复合物和DAB，再用苏木精复染。
[0087] 肺结构的立体学分析
[0088] 肺的病理生理学由确定肺体积，Lm(平均截线长度（mean linear intercept)或弦 长）和％ AVD (%气腔体积密度）表征。在肺充气固定之后，用阿基米德原理测定肺体积。受 损的发育中的肺的肺泡形成中断，停留在类似囊状期的发育阶段，远端气道直径增大。通过 用立体学方法，以及测定 Lm(Massaro 等人，Am. J. Physiol. 250:R51_55 (1986) ;Tomkeieff， Naturel55:24(1945))、 % AVD (ffeibel, Stereological Methods. London ：Academic Press (1979))和次级隔密度（Pierce 等人 Am J Physiol. 272 :L452-60 (1997))量化这些 变化。Lm 与肺的内表面积成反比（Thurlbeck，Am. Rev. Respir.Dis. 95:752-764(1967); Thurlbeck，Am. Rev. Respir. Dis. 95:765-773(1967))。次级隔密度与肺泡的发育直接相关。