[0089] 充气固定的幼崽肺包埋在异丁烯酸甲酯中，将2 μπι厚、甲苯胺蓝染色的左肺切片 用于结构研宄。收集和处理肺图象数据的观察人员对治疗组的组别和肺的暴露状况不知 情。使用系统抽样法（与 Tschanz 和 Burri，Exp. Lung Res. 28:457-471 (2002)中的方法 相似），由不含大气道和血管结构，随机定向的左肺横向切片中取4个0. 60mm2的视野，进 行数字化以测定Lm ;在这些视野中，获取4个0. 15mm2切片以测定％ AVD。使用专门编辑 的 macro 和 ImageJ (Rasband，ImageJ，Bethesda，MD (1997-2004))，用前述方法过滤并分割 图像（Tschanz等人，2002)。为测定Lm，通过对含有间隔90 μπι的水平线的图象进行位元 字串的按位元逻辑与运算（bit-wise logical AND operation)将图像倒排和归并。将得 到的弦排序；排除〈8 μm且>250 μm的弦，从而除去与肺毛细血管和传导气道相关的数据 (Soutiere 等人，Respir. Physiol. Neurobiol 140:283-291(2004))。通过将得到的弦总 和除以截段（intercept)数得到Lm。用标准点计数方法测定远端气腔的％ AVD(Weibel， 1979)。通过计数客观测定次级隔密度。
[0090] 细胞外基质蛋白的肺染色
[0091 ] 用6 μ m厚、石赌包埋的肺切片测定肺弹性蛋白和Jj父原。用0. 5 %尚猛 酸钾和1 %草酸处理后，用弹性蛋白米勒染色进行弹性蛋白染色（Miller，Stain Techno. 28:148-149(1971))。用含0.1 %粘胶纤维红（Sirius red)的饱和苦味酸进行胶原 染色（Walsh等人，Anal. Biochem. 203:187-190 (1992))。用标准方法测定实质中的弹性蛋 白％体积密度（Pierce 等人 Am J Physiol. 272 :L452-60 (1997)) 〇
[0092] 血管发育评估。
[0093] 用凝集素染色鉴定远端气道壁中的肺微脉管系统。已观察到西非单叶 豆（Griffania simplicifolia，Bandeiraea)凝集素与内皮细胞（Mattsson 等人， Pancreatology 2:155-I62 (2〇〇2))中的 a -D-半乳糖昔结合（Hayes 等人，了.13;[01· Chem. 249:1904-1914 (1974))，优选用于鉴定肺微脉管系统（King等人，Microvasc. Res. 67:139-1512004))。石蜡包埋的6 μπι厚的肺切片经封闭，与生物素化的西非单叶豆 凝集素 （Molecular Probes) ΙΒ4同种型孵育过夜。用含0. 1 %吐温20的Tris缓冲盐水 (TBST)洗涤过后，用抗生物素蛋白-生物素复合的碱性磷酸酶和Vector Red底物（Vector Laboratories)检测结合的凝集素，切片用甲苯胺蓝复染。根据前述方法使用6μπι厚的石 蜡包埋的肺切片，用鼠单克隆抗a SM抗体（1Α4 ;Sigma)对平滑肌细胞进行免疫组织化学 鉴定（Roberts 等人，Circ. Res. 87:140-145 (2000))。
[0094] 用Weibel (1979)所述的方法分析小鼠幼崽肺中的肺微血管细胞的面密度（areal density)。如前所述与生物素化的凝集素 、a SM抗体和Vector Red底物反应的肺切片分 别用于获取微脉管系统内皮和SMC区室的详细信息。使用上文详述的系统抽样法获取除去 胸膜、大气道和血管结构的周边肺的落射萦光图像。经过过滤和分割操作后，通过用萦光像 素对应的像素数目除以图像中的像素总数确定％萦光体积密度（％FVD)。取每张幼崽肺切 片的三幅图像的％ FVD中值用于分析。
[0095] 通过测定富尔顿比（Fulton ratio) (Fulton 等人，Br. Heart J. 14:413-420(1952))评估慢性呼吸85% 02或空气对14只小鼠幼崽右心室肥大的影响。 在含3%低聚甲醛和0. 1%戊二醛的PBS中固定3天后，将心脏在PBS中4°C储存。除去心 房和大血管，将右心室游尚壁与左心室和室间隔分割开。从组织上吸去过量PBS后，将右心 室和左心室（包括室间隔）在带防护的天平上称重。
[0096] 统计方法
[0097] 用Pocock所述的方法测定用于立体学分析的样品大小（Pocock，123-141页， Clinical trials ：A practical approach, New York : John Wiley&Sons (1983)) 〇 每组取 六个肺进行研宄以检测可能的10%的Lm减少，使用同种型对照抗体，α为0.05,效力为 〇. 9。初步研宄显示用IDll处理使得用PBS处理过的呼吸85% O2的小鼠 Lm从68. 0减少 至62. 3 μ m，合计SD为4. 2。由于这些数据显示每组需要11. 4个幼崽肺以显示IDll的有益 效果，α为0. 05,效力为0. 90,于是每个治疗和暴露组取12个幼崽肺进行研宄。成对两窝 中的幼恵重量用随机化完全区组设计进行分析（Snedecor等人，255-273页，Statistical methods，Ames，Iowa:Iowa State University Press(1980))。数据用平均值土SD表不，用 ANOVA因素模型进行对比。之后当检测到显著差异时，使用Sheffe检验。显著性以P〈0. 05 确定。
[0098] 实施例1 :TGF_f3在发育中肺的表达，及用抗TGF-β抗体调节TGF-β信号传导
[0099] 尽管在出生后的大鼠肺中观察到TGF-β 1和TGF-β 2的RNA水平增加（Zhao等人， Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278:L1231-1239(200 O))，TGF-0 同种型在发育中 的肺周边中的表达模式知之甚少。如图1所示，在10日龄小鼠幼崽肺中检测TGF-β 1-3的 免疫反应性。在大传导气道中，以及在末端和呼吸性细支气管中观察到相似的TGF-β同种 型水平。尽管在周边肺中TGF-β 1显示具有最高的免疫反应性，但在该处也检测到TGF-β 2 和TGF-β 3。由于期望确定抑制远端发育中的肺的TGF-β活性是否抑制肺损伤对肺泡发 育的影响，我们首先测试泛特异性TGF-β中和抗体是否识别周边肺中的TGF-β。IDll为 杂交瘤产生的单克隆抗体，该杂交瘤由用天然的牛TGF- β 2免疫的Balb/c小鼠脾细胞产生 (Dasch 等人，J. Immunol. 142:1536-1541 (1989))。在体外用 IDl 1 中和 TGF-β 1-3 (Dasch， 1989 ;Ruzek 等人，Immunopharmacol. Immunotoxicol. 25:235-257(2003))并鉴定人胎盘 和蜕膜组织中的TGF-β (Graham等人，Biol. R印rod 46:561-572(1992))。如图2所示，用 IDll检测10日龄小鼠肺中的TGF-β。特别是在大小气道和血管的壁中观察到TGF-β免 疫反应性。强烈的细胞外TGF-β免疫反应性也与细胞外基质（箭头）相关。
[0100] 尽管出生前暴露于TGF-β中和抗体可以抑制具有细胞外基质异常的小鼠中的 TGF-β信号传导（N印tune等人，2003)，但此方法能否调节受损的发育中的肺中TGF-β信 号传导的预期增加仍不知晓。由于增加的TGF-β信号传导与Smad2或3的磷酸化和细胞 核定位增加相关（Nakao等人，Embo J. 16:5353-62(1997))，使用免疫组织化学测试在小鼠 幼崽肺中高氧肺损伤是否与磷酸化的Smad2(p-Smad2)的细胞核区室化增加相关。用此方 法进行额外研宄以确定TGF-β信号传导的增加是否可以通过用抗TGF-β抗体进行处理而 改变。如图3所示，与用PBS处理过、暴露于空气的幼崽肺相比，用PBS处理过、慢性暴露于 85% O2的幼崽肺中细胞核p-Smad2的水平增加。重要的是，IDll处理与暴露于高水平氧的 幼崽肺中P_Smad2细胞核定位的减少相关。这些观察结果表明高氧肺损伤增加 TGF-β信 号传导，且过度的TGF-β活性可以用TGF-β中和抗体减弱。而且有趣的是，注意到PBS处 理的暴露于空气的肺中的一些肺细胞具有细胞核P_Smad2。这说明TGF-β在出生后的肺中 有一些基础活性，并在正常末端肺发育的调控中起作用。
[0101] 实施例2 :抗TGF-β抗体处理改善受损新生肺中的肺泡产生
[0102] 新生啮齿动物慢性吸入高水平氧导致肺损伤，抑制末端肺发育，其方式与在患有 BF1D 的婴儿中所观察到的相似（Bonikos 等人，Lab Invest. 32:619-635(1975) ;Frank 等 人，J. Appl. Physiol. 45:699-704 (1978) ;Pappas 等人，Lab Invest. 48:735-748 (1983); Bonikos，Am. J. Pathol. 85:623-650 (1976) ;Warner 等人，Am. J. Physiol. 275 :L110-117(1998))。因此，使用高氧小鼠幼崽的肺损伤模型检测用TGF-β中和抗体处理是 否改善肺泡的发育。将新生小鼠幼崽连续暴露于85% O2IO天，这是因为在初步研宄中观察 到这样的暴露水平导致肺泡产生减少，同时存活率>80%。如图4所示，慢性暴露于85% O2 与末端肺发育减退相关。与呼吸空气的对照幼崽肺相比，受损的幼崽肺的远端气道显示复 杂程度较低的间质结构，和较少的次级隔和肺泡（箭头）。此末梢气腔面积的增加可能由间 质组织的减少所引起，因为暴露于85% O2的肺的总体积与暴露于空气的肺没有不同（肺体 积，μ Ι/g 体重：PBS 和 85% 026 2 ±8,相对于 PBS 和空气：60±5, P>0. 05)。
[0103] 重要的是，暴露于抗TGF-β抗体改善受损新生肺的末端肺发育，因为其致使周边 肺的分隔水平和气腔面积接近PBS处理的呼吸空气的对照肺中的水平。此外，暴露于IDll 未显示与肺毒性相关。在IDll处理、暴露于空气的肺中，远端气道中没有高水平的炎症细 胞浸润。这些观察结果表明减弱异常的TGF-β信号传导改善受损的新生小鼠肺中的末梢 肺发育。
[0104] 在暴露于85% O2的幼崽肺中对IDll对于Lm和％ AVD的影响进行了检测，以确 定用抗TGF-β抗体进行处理是否改善受损的新生肺中的肺泡产生。受损新生肺中肺泡 产生的减少与肺内表面积减少和肺泡的气腔面积增加相关，这可以用立体学方法进行量化 (Weibel，1979 ;Bolender 等人，Am. J. Physiol. 265:L521-548(1993))。例如，Lm 与肺内表面 积成反比，％ AVD与肺泡气腔面积逆相关。其他学者报道了高氧肺损伤令发育中的小鼠和 大鼠肺中的！^和％ AVD 增加 （Shaffer 等人，Pediatr. Res. 21:14-20(1987) ;Boros 等人， Am. J. Physiol. 272: L433-441 (1997) ;Warner 等人，Am. J. Physiol. 275: LI 10-117 (1998)) ·
[0105] 如图5A-5C所示，与暴露于空气相比，慢性呼吸85 % 02与Lm增加30 % (PBS-空气 50. 7 ± 3. 4 μ m，相对于 PBS-026 7 . 3 ± 3. 7 μ m)、％ AVD 增加~20 % (PBS-空气 55. 6 ± 3. 7 %， 相对于PBS-0267 . 8 ±4.0% )和次级隔密度降低相关。重要的是，和这种与暴露于PBS和 〇2相关的变化相比，用