果并 分析免疫球蛋白纯度应大于95% ; (6) 浓度测定及调节：取少量免疫球蛋白溶液，稀释10倍后，分别测定A26jP A28tl，采用 经验公式：蛋白浓度（mg/ml) =1. 45A28(l-0. 74A26(I,计算蛋白浓度,用生理盐水调整蛋白浓度 至 8mg/mL〇
[0013] 2、转移因子的制备： (1) 猪脾脏处理：取健康成年的、外观红润、有光泽的新鲜猪脾脏，把脾脏表面的脂肪以 及筋膜都剔除干净，并用冰冷的生理盐水清洗干净； (2) 组织匀浆：将脾脏剪碎，加入适量生理盐水，用高速组织捣碎机捣碎（12000 r/min， 3次，I min/次)，形成匀楽液； (3) 冻融：将匀浆液置于500毫升血清瓶中，于-20°C冷冻，冻透后，在常温下解冻，如此 反复冻融6次以上，最后1次解融的匀浆液经4000 r/min离心30min后收集上清液； (4) 超滤纯化：将上清液用截留分子量为10 ku的超滤机进行超滤，收集滤出液，即得 转移因子溶液； (5) 质量控制：取少量转移因子溶液，稀释2倍后，以生理盐水为参比，检测转移因子溶 液于260 nm和280 nm处的吸光度，并计算46(|/48。比值，若A26tl /A28c^ 1.9为合格； (5)浓度测定：采用folin酚法测定转移因子溶液中多肽含量，用生理盐水调节多肽浓 度至 4mg/mL。
[0014] 3、黄芪多糖的配制：称量黄芪多糖10g，溶解于1000 mL的生理盐水中，溶解后即得 10mg/mL的黄芪多糖溶液。
[0015] 4、配制三联免疫增强剂 (1)三种溶液的配比：按一定比例将上述3种溶液混合，其中，免疫球蛋白溶液2份，转 移因子溶液1份，黄芪多糖溶液1份，混匀。
[0016] (2)辅料的添加：向上述混合液中加入5~8%丙三醇，优选6% ;0. 1~1%吐温80， 优选 〇· 5% ; 1-lOmmol/L EDTA，优选 5mmol/L ;0· 2% 苯甲酸和 3% 丙二醇，混匀； (3)过滤除菌：在无菌状态下将配制好的三联免疫增强剂用0. 45um的滤膜过滤除菌， 并分装入IOmL西林瓶。
[0017] 实验测试： 本实验用剂是按实施例1方法制备的兽用三联免疫增强剂。
[0018] 试验时间及地点：2014年05月10日至06月23日在登封市某种猪繁殖基地进 行。
[0019] 试验动物及管理：选择胎次相同、体况相似的健康母猪所产日龄相同、体重相近的 新生仔猪12窝。所有仔猪均在一个产房内饲养，日常管理相同，环境条件一致，自由吮吸母 乳。
[0020] 1)试验设计 仔猪出生后6h，分别灌服兽用三联免疫增强剂，以窝为重复单位，每3窝组成1组，随机 分为4组，其中分为对照1个组和试验3个组。各试验组灌服剂量见表1。
[0021] 表1试验组别与兽用三联免疫增强剂的灌服剂量
【主权项】
1. 一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 制备免疫球蛋白： 取抗凝血1L，3000 r/min转速离心20min，获得的上清液和沉淀分别为血浆和血细胞， 向血浆中加入生理盐水补足1L，混匀后加入固体硫酸铵饱和度达到20%，室温沉淀2h ;在 4?条件下，5 000 r/min转速离心10 min,收集上清液；向上清液中再加入固体硫酸铵使 饱和度达到35%，在4°C条件下，沉淀过夜；4°C 5 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀即为 免疫球蛋白，用IL生理盐水溶解，将溶液装入透析袋，在4°C条件下，透析除去硫酸铵饱，用 生理盐水调整蛋白浓度至8mg/mL ; (2) 制备转移因子： 取新鲜的猪脾脏，经去脂和去筋膜等杂质后，绞碎加入适量生理盐水，用高速组织捣碎 机捣碎，将匀浆液置于500毫升血清瓶中，于-20°C条件下冷冻，冻透后，在常温下解冻，如 此反复冻融6次以上，最后1次解融的匀浆液经4000 r/min离心30min后收集上清液，将 上清液用截留分子量为10 kd的超滤机进行超滤，收集滤出液，即得转移因子溶液，用生理 盐水调节多肽浓度至4mg/mL ; (3) 配制黄芪多糖：称量黄芪多糖10g，溶解于IOOmL的生理盐水中，溶解后即得IOmg/ mL的黄芪多糖溶液； (4) 配制三联免疫增强剂：按一定体积比例将上述3种溶液混合，加入适当辅料以起到 的蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂等，彻底混匀后过滤除菌并分装入IOmL西林瓶。
2. 根据权利要求1所述的一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述步 骤（4)中免疫球蛋白、转移因子和黄芪多糖3种溶液体积比2:1:1。
3. 根据权利要求1所述的一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述步 骤（4)中所用的辅料为占三种混合物体积百分比5-8%的丙三醇、占三种混合物体积百分比 5-8%的0. 1-1%吐温80、EDTA l-10mmol/L，占三种混合物体积百分比0. 2%的苯甲酸和占三 种混合物体积百分比3%的丙二醇。
4. 根据权利要求1所述的一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述的 高速组织捣碎机的转速为12000 r/min，捣碎次数3次，捣碎频率I min/次。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，该三联免疫增强剂具有增强仔猪的机体免疫力、抗菌、杀菌等功效，先制备免疫球蛋白、转移因子和黄芪多糖，然后按照一定比例混合，混匀后，过滤除菌即可，提供了一种兽用三联免疫增强剂及其制备方法，以指导兽医临床科学、合理地使用兽药，促进畜牧业的健康发展。
【IPC分类】A61K31-715, A61P31-04, A61K38-00, A61K35-26, A61K39-395, A61P37-04
【公开号】CN104667276
【申请号】CN201510070847
【发明人】王永芬, 郑鸣, 郭宏伟, 乔宏兴
【申请人】郑州牧业工程高等专科学校
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月11日