白介素-13抗体组合物的制作方法
【专利说明】白介素-13抗体组合物
[0001] 本申请是申请日为2006年09月29日、申请号为200680044973. 9 (国际申请号为 PCT/GB2006/003650)、发明名称为"白介素-13抗体组合物"的发明申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及一种药物组合物，其包含白介素-13抗体，更具体的说是白介素-13单 克隆抗体，尤其是人白介素-13单克隆抗体。本发明还涉及纯化所述抗体的方法和使用所 述组合物来治疗白介素-13相关病症诸如哮喘的用途。
[0003] 白介素（IL) -13是114个氨基酸的细胞因子，未修饰时的分子量是大 约12kDa。IL-13与IL-4最密切相关，二者在氨基酸水平具有30 %的序列同源 性。人IL-13基因位于染色体5q31，与IL-4基因邻近[McKenzie, A. N. et al.，J Immunol, 1993. 150(12), 5436-5444 ；Minty, A. et al. , Nature, 1993. 362(6417), 248-50]〇
[0004] 尽管最初将IL-13鉴定为Th2⑶4+淋巴细胞衍生细胞因子，Thl⑶4+T细胞、⑶8+T 淋巴细胞、NK细胞、及非T细胞群诸如肥大细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、巨噬细胞、单核细 胞和气道平滑肌细胞也生成IL-13。
[0005] 已经将IL-13与许多疾病联系起来，具体有由炎性应答引起的疾病。例如， 对未曾接受治疗的（na'ive)、未被致敏的（non-sensitised)啮齿类动物的气道施用 重组IL-13显示出引起哮喘表型的许多方面，包括气道炎症、粘液生成和气道高应答 性（六!11〇['^118-1(&叩，]\1.6七31.，5(^611。6，1998.282(5397)，2258-2261 ;61'111^8,6· et al. , Science, 1998. 282 (5397), 2261-2263 ；Venkayya, R. , et al.,Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 26(2), 202-208 ；Morse, B. et al. , Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002. 282(1)，L44-49]。在肺中特异性过表达IL-13的转基因小鼠中观察到类 似的表型。在该模型中，更长时间的暴露于IL-13还导致纤维化[Zhu，Z. et al.，J Clin Invest, 1999. 103(6)，779-788]。
[0006] 已经将IL-13基因的许多遗传多态性与变应性疾病联系起来。具体而言，已经将 IL-13基因第130位精氨酸残基被谷氨酰胺替代的的变体（Q130R)与支气管哮喘、特应性 皮炎（atopic dermatitis)和血清 IgE 水平升高联系起来[Heinzmann，A.et al·，Hum Mol Genet, 2000. 9 (4), 549-559 ；Howard, T. D. et al.,Am J Hum Genet, 2002. 70 (I), 230-236 ； Kauppi, P. et al. , Genomics, 2001. 77 (1-2), 35-42 ；Graves, P. E. et al. , J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3), 506-513]。有些小组还将这种IL-13变体称为Q110R变体（第110 位精氨酸残基用谷氨酰胺替代），因为它们从氨基酸计数中排除了 20个氨基酸的信号序 列。
[0007] 还已经将IL-13生成与变应性哮喘联系起来[van der Pouw Kraan, T. C. et al.，Genes Immun, 1999. I (1)，61-65]，而且在患有特应性鼻炎（atopic rhinitis)(干草热 (hay fever))、变应性皮炎（湿疹）和慢性（鼻）窦炎的人类受试者中测量到升高的IL-13 水平。
[0008] 在哮喘外，已经将IL-13与其它纤维变性疾患联系起来。已经在患有系 统性硬化的患者的血清中和患有其它形式肺纤维化的患者的支气管-肺泡灌洗 (BAL)样品中测量到升高的IL-13水平，达到比IL-4高1000倍[Hasegawa，M. et al. , J Rheumatol, 1997. 24(2), 328-332 ；Hancock, A. et al. , Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 18(1)，60-65]。
[0009] 已经证明了 IL-13在小鼠肺中的过表达引起肺气肿、粘液生成增加和炎症， 这些症状反映了人慢性阻塞性肺病（COPD)的各个方面[Zheng，T. et al.，J Clin Invest, 2000. 106(9)，1081-1093]。
[0010] 有人提出IL-13可能在炎性肠病的发病机理中发挥作用[Heller，F. et al. , Immunity, 2002. 17 (5), 629-38],而且在有些何杰金氏病（Hodgkin' s disease) 患者的血清中检测到与正常对照相比升高的IL-13水平[Fiumara，P. et al.，Blo od, 2001. 98(9), 2877-2878] 〇
[0011] 还认为IL-13抑制剂在治疗上可用于预防肿瘤复发或转移[Terabe，M. et al.，Nat Immunol, 2000.1 (6)，515-520]。在动物模型中对IL-13的抑制还显示出增强抗病毒疫苗， 而且对于HIV和其它感染性疾病的治疗可能是有益的[Ahlers，J.D.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99 (20) ,13020-13025]。
[0012] 致力于IL-13抑制的抗体法已有记载。例如，WO 2005/007699 (Cambridge Antibody Technology Limited)记载了一系列显示出中和IL-13活性的人抗IL-13抗体分 子，而且宣称它们可在治疗IL-13相关病症方面可能有用。
[0013] 依照本发明的第一个方面，提供了一种药用组合物，其包含IL-13抗体及一种或 多种制药学可接受赋形剂，并用乙酸盐缓冲剂缓冲至pH 4. 5-6. 0。
[0014] 普遍知道抗体纯化规程通常需要多种分离技术，诸如层析分离（例如蛋白A层析、 离子交换层析、诸如此类）。这种分离方式的后果是需要使用多种不同缓冲液。例如，WO 2004/076485中所记载的抗体纯化规程需要50mM甘氨酸/甘氨酸盐pH8. 0用于蛋白A层 析、50mM Tris-HCl ρΗ8·0 和 20mM 磷酸钠 ρΗ6·5 用于 Q-S印harose 层析、及 25mM Tris-HCl ρΗ8· 6 用于 DEAE-sepharose 层析。
[0015] 相反，本发明只需要使用一种以固定浓度和预定pH存在于本发明组合物中的乙 酸盐缓冲剂，其优点在于这种缓冲剂存在于所有IL-13抗体纯化步骤中。如此，这种缓冲剂 不仅用于纯化过程开始时，而且用于整个纯化过程，因此缩短了操作时间、降低了成本并提 高了产量。
[0016] 应当领会，"抗体"的术语包括免疫球蛋白，无论是天然的或者是部分或完全合成 的。该术语还覆盖任何包含抗原结合结构域的多肽或蛋白质。
[0017] 包含抗原结合结构域的抗体片段有诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和双抗体等分子。
[0018] 有可能采用单克隆抗体和其它抗体，并且采用重组DNA技术来生成保留最初抗体 特异性的其它抗体或嵌合分子。这样的技术可涉及将编码免疫球蛋白可变区或互补决定区 (CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见例如EP-A-184187; GB2188638A或EP-A-239400 ;及大量后续文献。
[0019] 或者，可以生成携带⑶R衍生序列的新VH或VL区，即通过一种或多种选 定VH和/或VL基因的随机诱变而在整个可变域中生成突变。Gram et al. ,PNAS USA, 1992. 89, 3576-3580记载了这样一种技术，他们采用错误倾向PCR。可使用的另一种方 法是针对 VH 和 VL 基因 CDR 区的诱变。Barbas et al·，PNAS USA 1994. 91，3809-3813 和 Schier et al.，J. Mol. Biol. 1996. 263, 551-567 披露这样的技术。
[0020] 因为可以以多种方法修饰抗体，术语"抗体"应解释为覆盖任何包含具有所需特异 性的抗原结合结构域的特定结合成员或物质。如此，该术语覆盖抗体片段和衍生物，包括任 何包含免疫球蛋白结合结构域的多肽，无论是天然的或者是完全或部分合成的。因此还包 括包含免疫球蛋白结合结构域或等同物且其与另一多肽相融合的嵌合分子。P-A-0120694 和EP-A-0125023及大量后续文献中披露了嵌合抗体的克隆和表达。
[0021] 抗体工程领域可利用的其它技术使之有可能分离人抗体和人源化抗体。例如，可 以如Kontermann et al. , [2001 ；Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals] 所述来生成人杂交瘤。许多出版物，诸如Kontermann et al.(supra)and W092/01047 中详细记载了为生成特定结合成员而建立的另一种技术，噬菌体展示。小鼠抗体基因 遭到灭活并用人抗体基因功能性替换同时小鼠免疫系统的其它成分保持完整的转基因 小鼠可用于分离针对人抗原的人抗体。核糖体展示，一种将突变导入已知基因序列的 无细胞翻译技术也可用于生成和/或优化特定结合成员[Hanes and PlUckthun PNAS USA, 1994. 94, 4937-4942 ；He and Taussig Nucleic Acids Res. 1997. 25, 5132-5134 ； Schaffitzel et al. , J. Tmmunol. Methods, 1999. 231, 119-135 ；He et al.,J.Tmmunol. Methods, 1999. 231，105-117 ;He et al.，Methods Mol. Biol. 2004. 248, 177-189]。
[0022] 通过合成寡核苷酸并在合适的表达载体中进行装配，再用所得基因进行表达，可 以制备合成的抗体分子，参见例如 Knappik et al.，J. Mol. Biol. 2000. 296, 57-86 ;Krebs et al. , Journal of Immunological Methods 2001. 254, 67-84。
[0023] 已经显示了完整抗体的片段可发挥结合抗原的功能。结合片段的例子 有⑴由VL、VH、CL和CHl结构域组成的Fab片段；（ii)由VH和CHl结构域组 成的Fd片段；（iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；（iv)由VH 或 VL 结构域组成的 dAb 片段[Ward, E. S. et al. , Nature, 1989. 341, 544-546 ; McCafferty et al. , Nature, 1990. 348, 5