一种兽用三联免疫增强剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种兽用三联免疫增强剂的制备方法，该三 联免疫增强剂具有增强仔猪的机体免疫力、抗菌、杀菌等功效。 技术背景
[0002] 我国是第一养殖业大国，第一动物保健品消费国，但与发达国家相比，兽用免疫增 强剂产业落后，稳定高效、无残留、无污染的新型免疫增强剂的研制及产业化符合绿色食 品、绿色生产的发展趋势，对健康养猪、绿色养猪具有重要意义。
[0003] 针对目前我国兽用免疫增强剂的现状，项目组从猪血分离纯化免疫球蛋白，从猪 脾脏、淋巴结等内脏中分离提取转移因子，再引入天然中药类免疫增强剂黄芪多糖，利用现 代动物生物集成技术，在整体水平、细胞水平及分子水平上，根据不同免疫增强剂作用机制 的差异，研究它们之间的协同效应，优化免疫增强剂配方，开发黄芪多糖-免疫球蛋白-转 移因子三联免疫增强剂，发挥三者的协同效应，从直接补充特异性抗体、促进免疫器官发 育、激活免疫细胞增强细胞免疫和体液免疫、诱导产生各种细胞因子等多个方面全方位增 强仔猪的机体免疫力，为仔猪安全度过断奶时期提供技术保障。
[0004] 产品中的原材料免疫球蛋白和转移因子分别来自于屠宰场排放的大量废弃猪血 液和猪内脏，将猪的废弃物转变为价值较高的生物制品，降低了生产成本，解决了屠宰场对 环境的污染问题；同时，项目产品三联免疫增强剂除具有增强免疫功能外，还具有高效的抗 菌、杀菌功能且不产生耐药性，可作为抗生素等药物理想替代品，为解决细菌耐药性和畜禽 药物残留等问题提供了新的思路。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足而提供一种兽用三联免疫增强剂的制 备方法，本发明针对新生仔猪免疫力低下，易感染病原微生物而引起仔猪腹泻，影响仔猪的 生产性能，提供了一种兽用三联免疫增强剂及其制备方法，以指导兽医临床科学、合理地使 用兽药，促进畜牧业的健康发展。
[0006] -种兽用三联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 制备免疫球蛋白： 取抗凝血1L，3000 r/min转速离心20min，获得的上清液和沉淀分别为血浆和血细胞， 向血浆中加入生理盐水补足1L，混匀后加入固体硫酸铵饱和度达到20%，室温沉淀2h ;在 4?条件下，5 000 r/min转速离心10 min,收集上清液；向上清液中再加入固体硫酸铵使 饱和度达到35%，在4°C条件下，沉淀过夜；4°C 5 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀即为 免疫球蛋白，用IL生理盐水溶解，将溶液装入透析袋，在4°C条件下，透析除去硫酸铵饱，用 生理盐水调整蛋白浓度至8mg/mL ; (2) 制备转移因子： 取新鲜的猪脾脏，经去脂和去筋膜等杂质后，绞碎加入适量生理盐水，用高速组织捣碎 机捣碎，将匀浆液置于500毫升血清瓶中，于-20°C条件下冷冻，冻透后，在常温下解冻，如 此反复冻融6次以上，最后1次解融的匀浆液经4000 r/min离心30min后收集上清液，将 上清液用截留分子量为10 kd的超滤机进行超滤，收集滤出液，即得转移因子溶液，用生理 盐水调节多肽浓度至4mg/mL ; (3) 配制黄芪多糖：称量黄芪多糖10g，溶解于IOOmL的生理盐水中，溶解后即得IOmg/ mL的黄芪多糖溶液； (4) 配制三联免疫增强剂：按一定体积比例将上述3种溶液混合，加入适当辅料以起到 的蛋白保护剂、稳定剂和防腐剂等，彻底混匀后过滤除菌并分装入IOmL西林瓶。
[0007] 基于以上所述，所述步骤（4)中免疫球蛋白、转移因子和黄芪多糖3种溶液体积比 2:1:1。
[0008] 基于以上所述，所述步骤（4)中所用的辅料为占三种混合物体积百分比5-8%的丙 三醇、占三种混合物体积百分比5-8%的0. 1-1%吐温80、EDTA l-10mmol/L，占三种混合物 体积百分比〇. 2%的苯甲酸和占三种混合物体积百分比3%的丙二醇。
[0009] 基于以上所述，所述的高速组织捣碎机的转速为12000 r/min，捣碎次数3次，捣 碎频率I min/次。
[0010] 免疫球蛋白含有大量特异性抗体，可与相应的抗原结合，凝集与沉淀抗原物质，防 止病原微生物对机体细胞的侵袭，免疫球蛋白还可与抗原结合后能激活补体，进而产生一 系列免疫调节作用，发挥具有免疫效应的细胞对病原微生物的吞噬、溶解和杀灭作用，显著 增强机体抗病能力；转移因子具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能增强机 体特异性和非特异性细胞免疫功能等作用，能够特异地将供体某一细胞免疫的功能转移给 受体；而黄芪多糖对免疫器官生长发育的促进及对免疫细胞增殖的促进作用，它既可提高 动物机体胸腺、脾脏、法氏囊及肠系膜淋巴结等主要免疫器官重量，还可提高病理状态下机 体外周血T、B淋巴细胞的增殖。正是基于这种增强免疫机理的差异以及仔猪的生理特点， 将免疫球蛋白、转移因子和黄芪多糖进行合理搭配，开发出具有稳定、高效、无毒和无残留 的兽用三联免疫增强剂，充分发挥三者的协同效应。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。
[0012] 具体制备工艺如下： 1、免疫球蛋白的制备： (1) 血楽和血细胞分离：取抗凝血1L，3000 r/min转速离心机离心20min，获得的上清 液和沉淀分别为血浆和血细； (2) 除杂蛋白：向血浆中加入生理盐水补足1L，混匀后加入固体硫酸铵饱和度达到 20%，室温沉淀2h，此时沉淀为纤维蛋白原；在4°C条件下，5 000 r/min转速离心机离心10 min,弃沉淀收集上清液； (3) 沉淀免疫球蛋白：向（2)步中获得的上清液中再加入固体硫酸铵使饱和度达到 35%，4°C沉淀过夜，4°C 5 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀即为免疫球蛋白； (4) 除残留硫酸铵：用IL生理盐水溶解，将溶液装入透析袋，于4°C透析，并用2%BaCl2 溶液检测溶液中残留的硫酸根离子，直到完全除去硫酸铵； (5) 纯度测定：取少量免疫球蛋白溶液进行SDS-PAGE检测，Bandscan软件扫描结