伴侣素CCTγ在制备肿瘤诊断试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，伴侣素 CCTY在制备肿瘤诊断试剂中的应用，具体的 本发明涉及伴侣素 CCTY在制备骨肉瘤诊断试剂中的新用途。
【背景技术】
[0002] 伴侣素（chaperonins)是由约60kDa亚单位组成的环状低聚物复合体，在细胞中 广泛存在、大量表达且序列相关，以一种ATP依赖反应介导多肤链的折叠，将单体和低聚体 亚单位转变为功能完全的天然蛋白。真核伴侣素有TCP-Iring complex (TRiC)，cytosolic chaperonin (c_cpn)或 cpn-containing TCP-1 (CCT)等几种叫法。伴侣素 CCT 是一个大的 圆筒状多亚基复合体，具有用于结合非折叠和变性多肽的中央空腔结构，CCT的每个环都 是由分子量在52-65kDa之间的八个不同但同源的亚基组成。哺乳动物的CCT亚基被命名 为 CCT a (CCTl)、CCT β (CCT2)、CCT γ (CCT3)、CCT δ (CCT4)、CCT ε (CCT5)、CCT ζ (CCT6)、 CCTn (CCT7)和CCT θ (CCT8)。根据现有的研宄来看，不同伴侣分子之间的协作是蛋白折叠 过程的中心原则。然而，协作对于每一个新合成肽链或许不是必需的。有结果显示，一旦 多肽链出现，许多伴侣分子就被招募至蛋白合成机器，他们被这些伴侣分子包括CCT所保 护。已经证实在原核和真核生物中，伴侣分子能够结合核糖体结合的多肽链。细胞蛋白似 乎是按照伴侣分子依赖和非依赖通路来实现其生物学功能性三维结构。在伴侣分子非依赖 性通路上的蛋白可能是小蛋白，并且他们能够不需要任何伴侣分子而折叠。伴侣分子依赖 性折叠过程依照蛋白本质的不同来遵循三种不同的策略：首先，新合成蛋白将会与Hsp70， Hsp90或其它小伴侣分子短暂的在非天然蛋白表面暴露的疏水区结合，保护蛋白免于聚集 并将折叠；其次，某些蛋白被Hsp70和Hsp90依次结合，并进行折叠进程；第三，一小部分新 合成多肤链依次结合Hsp70, Hsp90和prefoldin/phosducin样蛋白，再传递至CCT以完成 最终折叠。数量巨大的分子伴侣的集中和协作导致了三维结构和生物学功能性蛋白分子的 产生。该过程的失败会导致许多必须蛋白的聚集和错误折叠，并可能对细胞的整体功能产 生严重影响。目前已经很好的认识到蛋白的聚集和错误折叠是许多称为"蛋白错误折叠"或 "蛋白构象"病的根本原因。I型和II型伴侣素均被发现参与了错误折叠病的调节。
[0003] 骨肉瘤（Oseteosarcoma)是除浆细胞瘤外最常见的恶性骨原发性肿瘤，其组织学 特点是在多数情况下肿瘤细胞产生骨样或不成熟骨。骨肉瘤易于侵及生长迅速的干髓端， 其典型的位置是在长管状骨，股骨远端及胫骨、胧骨的近端是最常见的发病部位，全部病人 的50% -70%病变发生在膝关节周围。骨肉瘤起病时无明显的临床症状，极易与外伤混淆， 且恶性程度高早期即可能发生肺转移，故其危害性大死亡率很高。临床骨科工作者一直致 力于对其防治的研宄，希望寻找到骨肉瘤精确有效治疗的靶点。
[0004] 发明人对5例骨肉瘤病例样本及3例正常对照进行高通量测序，结合生物信息学 方法进行基因筛选，挑选出候选基因 CCTy。现有的研宄表明，CCTy与其β-tubulin之间 存在相互作用；(ΧΤγ与D型逆转录病毒Mason-Pfizer猴病毒的Gag多蛋白相互作用，参 与了 Gag的折叠和/或衣壳组装。但是并没有研宄表明（ΧΤγ与骨肉瘤之间的关系，进一 步，本发明进行了分子细胞生物学方法证实了 CCT γ与骨肉瘤的关系：CCT γ与骨肉瘤具有 很好的相关性，骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗 制剂，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供(ΧΤγ基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应 用。
[0006] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 CCTy，今儿通过分子细胞生物学方法验证了 CCTy与骨肉瘤的关系：CCTy与骨肉瘤具 有很好的相关性，CCTy在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤 辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
[0007] 进一步，所述抗骨肉瘤制剂是指可以抑制骨肉瘤细胞中CCTy基因的表达的制 剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激 活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目 的基因表达、激活促进目的基因 mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的 分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活CCTy基因的抑制基因、激 活抑制CCTy基因表达的蛋白、导入抑制CCTy基因表达的siRNA、激活促进CCTymRNA降 解的microRNA、导入促进(ΧΤγ蛋白降解的分子、抑制促进(ΧΤγ基因表达的因子及蛋白的 表达。
[0008] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的SiRNA可以通过磷酸 妈共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0009] 进一步，所述抑制CCT γ基因表达的SiRNA序列选自下列序列中的一种和/或几 种：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6。 优选 siRNA 序列为 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
[0010] 本发明的目的在于提供一种抗骨肉瘤制剂，所述抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞中 CCTy基因的表达。进一步，所述的抗骨肉瘤制剂中含有抑制CCTy基因表达的siRNA。
[0011] 本发明的目的在于提供CCTy基因在制备骨肉瘤诊疗制剂中的应用。
[0012] 进一步，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测 骨肉瘤组织中CCTy基因的表达。
[0013] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0014] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
[0015] 所述的用于荧光定量PCR方法检测骨肉瘤中CCTy基因的产品含有一对特异性扩 增(ΧΤγ基因的引物；所述的基因芯片包括与(ΧΤγ基因的核酸序列杂交的探针。
[0016] 进一步，所述的骨肉瘤的诊疗制剂包括用免疫方法检测肺腺癌中(ΧΤγ蛋白的表 达。优选所述免疫检测方法检测骨肉瘤中CCTy蛋白表达的为western blot和/或ELISA 和/胶体金检测方法。
[0017] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0018] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方 便。
[0019] 进一步，所述检测CCT γ蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒 中的抗体可采用市售的CCTy单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被CCTy单克隆 抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终 止液等。
[0020] 进一步，所述检测CCTγ蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的CCTy单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区