作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法
【专利说明】作为糖尿病的生物标志物的CMPF和相关方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2012年9月21日提交的美国临时专利申请号61/703，867和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/787，718的优先权，这两件美国临时专利申请的内容在此以引用的方式整体并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及糖尿病的领域，并且更确切地说，涉及作为患有葡萄糖稳态受损和/或糖尿病或有患葡萄糖稳态受损和/或糖尿病风险的受试者的生物标志物的3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)。
【背景技术】
[0004]日益上升的肥胖率、愈加久坐的生活方式以及人口老龄化持续驱使2型糖尿病(T2D)患病率的显著增加。在世界范围内估计有26000万人患T2D，数百万人患有糖尿病前期，所述糖尿病前期是一种使个体有更高的患T2D风险的葡萄糖耐量受损(IGT)的病况，并且每年有另外700万人被新诊断出。虽然肥胖和胰岛素抵抗促成T2D的发生，但是导致疾病发生的最终是β细胞不能响应于变化的代谢需求。
[0005]重要的是，另一种形式的糖尿病，即妊娠期糖尿病(GDM)的出现也日益增多。目前3%-14%的孕妇患有GDM并且GDM是没有先前糖尿病病史的女性在妊娠晚期期间在存在严重的胰岛素抵抗时表现出IGT的一种病况。这种严重的获得性胰岛素抵抗对β细胞代偿能力施加了显著的生理应激，与在T2D中所观测到的相似，其中适当的适应会产生正常的葡萄糖耐量(NGT)，这表示未来T2D的风险低，而不足的β细胞代偿作用导致GDM，这表明非常高的未来患T2D的风险(在5年内约20% -50% )。
[0006]当前对T2D的诊断测试依靠对血糖水平的直接测量和间接测量。对糖化血红蛋白(HbAlc)的测量间接地指示了在先前2-3个月内平均的血糖水平，其中>6.5%的糖化血红蛋白则表示平均血糖高并且因此表示T2D。更直接的方法包括随机或空腹血糖测试、或口服葡萄糖耐量测试(OGTT)，如在GDM诊断中所使用，其直接测量在摄入后的设定的一段时间内从血液中清除葡萄糖的能力。
[0007]仍需要用于鉴定和/或监测患有葡萄糖稳态受损和/或糖尿病的受试者的新的并且改进的方法。
【发明内容】
[0008]在本公开的一个方面，CMPF已经被鉴定为葡萄糖稳态受损和/或糖尿病的生物标志物。在一个实施方案中，CMPF是II型糖尿病的生物标志物。CMPF还已经被鉴定为特征在于葡萄糖稳态受损的病况的生物标志物，所述病况诸如但不限于妊娠期糖尿病和葡萄糖耐量受损。CMPF还已被证实在患有II型糖尿病的受试者体内相对于正常对照增加。高水平的CMPF还已被证实在体外和体内会损伤β -细胞功能并且阻止葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
[0009]在一个实施方案中，提供了一种鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法，所述方法包括:
[0010](a)测定来自受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基_2_呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
[0011 ] (b)将CMPF的测试水平与对照水平比较，其中CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
[0012]在一个实施方案中，所述对照水平代表没有葡萄糖稳态受损的受试者的CMPF水平并且相对于对照增加的CMPF的测试水平则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。在一个实施方案中，所述对照水平代表患有葡萄糖稳态受损的受试者的CMPF水平并且相对于对照相似或更大的CMPF的测试水平则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。任选地，所述方法进一步包括对被鉴定为患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者进行治疗。举例来说，在一个实施方案中，用CMPF抑制剂对被鉴定为患有葡萄糖稳态受损的受试者进行治疗。在一个实施方案中，用胰岛素对所述受试者进行治疗。在一个实施方案中，用二甲双胍(metformin)、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、磺酰脲(sulfonylurea)或胰岛素增敏剂对所述受试者进行治疗。在一些实施方案中，对受试者进行治疗包括向所述受试者施用适用于治疗葡萄糖稳态受损的药剂，如CMPF抑制剂、胰岛素、二甲双胍、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、磺酰脲或胰岛素增敏剂等。
[0013]在另一个实施方案中，提供了一种监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法，所述方法包括:
[0014](a)测定来自所述受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
[0015](b)将CMPF的测试水平与来自所述受试者在更早的时间点的CMPF水平相比较，其中CMPF水平增加则表示所述受试者的葡萄糖稳态受损更严重，或CMPF水平降低则表示所述受试者的葡萄糖稳态得到改善。
[0016]在一个实施方案中，本文所述的用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法包括在测定CMPF的测试水平之前获得或提供来自所述受试者的样品。在一个实施方案中，患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者患有特征在于β-细胞功能障碍的病况或有患所述病况的风险。在一个实施方案中，特征在于细胞功能障碍的病况是葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。任选地，测定所述样品中CMPF的测试水平的步骤包括检测所述样品中的CMPF。举例来说，在一个实施方案中，使用质谱法、光谱法或免疫组织化学来检测所述样品中的CMPF。在一个实施方案中，如在酶联免疫吸附测定中，使用对CMPF具有特异性的抗体来检测CMPF。在一个实施方案中，使用气相色谱/质谱法(GC-MS)或液相色谱/质谱法(LC-MS)来检测CMPF。
[0017]在另一个实施方案中，提供了一种在一个或多个细胞中引起细胞功能障碍的方法，所述方法包括使所述一个或多个β -细胞与CMPF接触。任选地，所述β -细胞在体内、体外或离体。在一个实施方案中，使细胞与CMPF接触引起了胰岛素分泌受损。在一个实施方案中，所述方法包括使所述细胞与大于20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ,200 μ Μ、300 μ M或500 μ M的浓度的CMPF接触。任选地，所述β -细胞在受试者体内并且所述方法包括向所述受试者施用CMPF。在一个实施方案中，所述受试者是动物，如小鼠或大鼠。任选地，本文所述的引起细胞功能障碍的方法可用于产生细胞功能障碍的体外或体内模型。在一些实施方案中，这些模型可用于筛选测试药剂以鉴定可用于治疗与葡萄糖稳态受损或细胞功能障碍相关的病况的候选者。
[0018]在一个实施方案中，提供了一种对影响细胞活性的药剂进行筛选的方法，所述方法包括:
[0019](a)提供一个或多个β -细胞，其中所述β -细胞的活性已通过使所述β -细胞与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)接触而降低；
[0020](b)使所述β -细胞与测试药剂接触；以及
[0021](c)确定所述测试药剂对所述细胞活性的作用。
[0022]在一个实施方案中，所述方法进一步包括如果所述测试药剂对所述β -细胞活性的作用高于阈值水平，那么将所述测试药剂鉴定为有效的。在一个实施方案中，所述活性是胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是胰岛素胞吐。在一个实施方案中，所述活性是葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。在一个实施方案中，所述活性是脂肪酸或氨基酸刺激的胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是如由肠促胰岛素激素所调节的胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是控制胰岛素生物合成和/或分泌(胞吐)的基因、胰岛素调节基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译。在一个实施方案中，所述活性是一种或多种直接地或间接地影响胰岛素转录、胰岛素翻译、胰岛素生物合成和/或分泌(胞吐)的基因、胰岛素调节基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译。在一个实施方案中，所述一种或多种基因选自 SLC2Al、SLC2A2、GCK、Kir6.2、ABCC8、CACNA1D、CACNA1A、CACNA1H、KCNB1、SNAP25、STX1A、VAMP2、SYN1A、PDXU MAFA, NKX6.1、INS(小鼠中为 INSl 或 INS2)、PCSKl、PCSK2 以及 CPE。在一个实施方案中，所述活性是细胞群扩增或细胞损失。任选地，将影响细胞活性的测试药剂鉴定为可用于治疗特征在于β-细胞功能障碍的病况的候选者。
[0023]在另一个实施方案中，提供了一种治疗有需要的受试者的细胞功能障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂。在一个实施方案中，还提供了 CMPF抑制剂用于治疗有需要的受试者的β-细胞功能障碍的用途。在一个实施方案中，还提供了一种CMPF抑制剂，用于治疗有需要的受试者的β-细胞功能障碍。还提供了 CMPF抑制剂在制备用于治疗β-细胞功能障碍的药物的用途。任选地，所述受试者患有或疑似患有葡萄糖稳态受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂。
[0024]在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使血液中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使胰岛细胞中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使诸如β -细胞的胰岛素产生型细胞中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT调节剂。在一个实施方案中，所述OAT调节剂是0ΑΤ1、0ΑΤ3和/或0ΑΤ4的抑制剂。OAT特异性抑制剂的实例包括但不限于丙磺舒(probenecid)、对氨基马尿酸盐(PAH)、普伐他汀(pravastatin)、新生霉素(novob1cin)、磺卩比酮(sulfinpyrazone)、以及节青霉素(benzylpenicillin) / 青霉素 G(Penicillin G，PCG)、西司他丁(cilastatin)以及KW-3902。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂是非特异性OAT抑制剂，如丙磺舒。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂对OATl具有特异性，如PAH。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂对0AT3具有特异性，如PCG或普伐他汀。
[0025]根据以下详细说明，本发明的其它特征和优势将变得显而易见。然而，应当了解的是，虽然详细说明和具体实施例表明了本发明的优选的实施方案，但是所述详细说明和所述具体实施例仅是以说明的方式给出的，这是因为根据这一详细说明，落入本发明的精神和范围内的各种变化方案和改动方案对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
【附图说明】
[0026]图1:A)示出了基于代谢组谱分析相比于NGT患者血浆在GDM患者血浆中显著变化的生物分子的变化倍数的直方图。相比于NGT，在GDM中CMPF是最高程度上调的，增加到5.69倍。B)对独特的群组进行两次独立的代谢组学筛选的结果，所述结果显示与NGT患者相比，在GDM患者中CMPF的增加倍数相似。第一轮以黑色示出，第二轮以白色示出，两轮的平均值以灰色示出。与对应的NGT群体相比，GDM值均显著升高，*P〈0.01。
[0027]图2示出了 ELISA结果，所述ELISA结果显示相比于NGT患者，在妊娠期间获得的GDM患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高；相比于NGT患者，在产后获得的IGT患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高；以及相比于NGT对照，在混合性别的群体中T2D患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高。GDM-妊娠患者(N = 24)的CMPF血浆浓度是NGT-妊娠对照(N = 24)的约10倍，p〈0.001。在产后一年时取自相同孕妇的血浆样品显示患有GDM并且在产后进而产生IGT的女性(N = 5)的血浆CMPF与在妊娠期间和产后均维持NGT的女性(N = 5)相比增加到13倍。来自T2D的混合性别群体(N = 6)的血浆样品显示与NGT对照群体(N = 6)相比，血浆CMPF增加到约10倍。在所有情况下，P〈0.05，并且样品在年龄、种族、性别以及妊娠前BMI的方面是匹配的。对于妊娠期样品和产后样品来说，患者在糖尿病家族史方面也是匹配的。
[0028]图3示出了 CMPF显著损伤MIN6细胞和完整的原代人和鼠胰岛中的GSIS。A)使用媒介物(0CMPF，黑色)或200 μ M的CMPF (白色)对ΜΙΝ6细胞进行处理，证实了 CMPF处理在4小时的预孵育之后显著地损伤GSIS和KCl刺激的胰岛素分泌(η = 4)。使用媒介物(0CMPF，黑色)、20μΜ的CMPF(灰色)、或200 μΜ的CMPF(白色)对原代人⑶胰岛和原代鼠(C)胰岛进行处理证实了与媒介物对照和20 μM CMPF对照相比，200 μΜ的CMPF在24小时预孵育之后损伤人胰岛和鼠胰岛这两者中的GSIS(对于人胰岛，η = 5，并且对于鼠胰岛，η = 4)。LG = 2.8mM 的葡萄糖，HG = 16.7mM 的葡萄糖，KCl = 16.7mM 的葡萄糖 +30mM的 KC1。*ρ〈0.05。
[0029]图4示出了 CMPF处理虽然抑制GSIS但是不诱导体外处理的细胞发生细胞凋亡或坏死。Α)使用O μ M (EtOH媒介物对照)、20 μ M或200 μ M的CMPF将ΜΙΝ6细胞处理4小时，之后加入膜联蛋白V和碘化丙锭荧光染料，并且使用赫斯特染料(Hoechst dye)进行复染色。仅在阳性对照，即接受5mM H2O2处理3小时的MIN6中观测到膜联蛋白V和碘化丙锭染色。B)将原代⑶I胰岛分散并且用媒介物对照(0CMPF，黑色)、20 μΜ的CMPF(灰色)或200 μΜ的CMPF(白色)处理48小时，然后使用膜联蛋白V、碘化丙锭以及赫斯特染料染色。通过Arrayscan VTI HCS读数器对双重阳性染色的定量进行评估。
[0030]图5示出了 CMPF处理降低了总胰岛素含量和与胰岛素生物合成和葡萄糖感应相关的基因的表达。使用媒介物对照(OCMPF)、20 yM(20CMPF)、或200 μ M (200CMPF) CMPF将鼠胰岛处理24小时，并且对总胰岛素含量和mRNA表达进行评估。与媒介物对照相比，200 μ M的CMPF显著地降低了总胰岛素含量⑷和胰岛素mRNA⑶。胰岛素mRNA的表达减少可能是因为包括Pdx-1、MafA以及HNF4a在内的胰岛素转录因子的表达减少(C)。胰岛素加工酶PCSK1、PCSK2以及CpE的表达减少(D)表示CMPF还可以损伤翻译后的胰岛素加工。最终，CMPF引起β细胞葡萄糖转运蛋白GLUT2和对于葡萄糖代谢来说关键的限速酶GCK的表达减少(E)，这或许损伤了葡萄糖感应和代谢。在所有情况下，η = 4，*Ρ〈0.05。
[0031]图6示出了腹膜内注射CMPF使得血浆水平升高并且在腹膜内注射3天后进行的OGTT显示在接受CMPF处理的小鼠中胰岛素分泌受损以及葡萄糖耐量受损。对CDl小鼠腹膜内注射媒介物对照(黑色)或CMPF(白色)。Α)在腹膜内注射后的10分钟、30分钟、60分钟、120分钟以及360分钟时获得血浆样品，并且对CMPF进行测定。接受CMPF注射的小鼠的血浆CMPF的水平显著地升高(ρ〈0.05)持续最多2小时，但在注射后的6小时之时不显著升高(每组η = 4)。在腹膜内注射的3天过程期间，监测小鼠的体重(B)、随机进食血糖(C)以及血浆胰岛素(C)。这些参数中的任一个均不存在差异。在连续3天的CMPF注射之后，使小鼠禁食14小时，并且进行0GTT。接受CMPF处理的小鼠与接受媒介物注射的对照相比具有显著受损的胰岛素分泌(D)和受损的葡萄糖耐量(C)(每组η = 10，ρ〈0.05)。
[0032]图7示出了取自接受CMPF腹膜内注射3天的小鼠的胰岛显示GSIS受损，总胰岛素含量减少以及胰岛素mRNA减少。A)在接受CMPF注射的小鼠(处理，白色)与媒介物对照(对照，黑色)之间在胰岛尺寸方面不存在显著性差异。这些胰岛确实表现出GSIS受损(B)、总胰岛素含量减少(C)以及胰岛素mRNA减少(D)，与对分离的原代胰岛进行体外处理相一致。N = 5，*Ρ〈0.05。
[0033]图8示出了 CMPF可以引起胰岛素抵抗并且在腹膜内注射7天后进行的OGTT显示在接受CMPF处理的小鼠中胰岛素分泌受损以及葡萄糖耐量受损。对CDl小鼠腹膜内注射媒介物对照(黑色)或CMPF(白色)。在腹膜内注射的7天过程期间，监测小鼠的体重(A)以及随机进食血糖(B)和血浆胰岛素(C)。体重或血糖不存在差异，然而，接受CMPF处理的小鼠在注射的第4-7天具有显著升高的血浆胰岛素水平，这表示CMPF促使胰岛素抵抗。在第8天，在14小时禁食之后，在即将进行OGTT之前出现较低体重。在连续7天的CMPF注射之后，使小鼠禁食14小时，并且进行0GTT。接受CMPF处理的小鼠与对照相比具有显著受损的葡萄糖耐量(D)，这对应于显著受损的胰岛素分泌(E)。在OGTT后立即从小鼠分离的胰岛显示相对于对照，在接受CMPF注射的小鼠中，在低葡萄糖下胰岛素的分泌显著增加以及在高葡萄糖下胰岛素的分泌显著减少(F)。(每组η = 8，ρ〈0.05)。
[0034]图9示出了 3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的结构和分子式。CMPF在健康的个体体内以20 μ M的浓度内源性地存在，而在尿毒症个体体内以超过200 μ M的浓度内源性地存在。
[0035]图10示出了在24小时处理之后，CMPF损伤β细胞的功能。接受200 μ M的CMPF处理24小时的CDl小鼠胰岛与接受媒介物处理的对照相比具有显著受损的葡萄糖刺激的胰岛素分泌和KCl刺激的胰岛素分泌。
[0036]图11示出了 OATl和0ΑΤ3在CMPF转运入肾脏中起作用，而0ΑΤ4负责向肾管腔内的分泌。OATl和0AT3充当交换因子，将CMPF从血浆吸收到肾脏的近端小管细胞中并且将二羧酸释放到血液中。协同转运蛋白NaDC3通过将二羧酸和钠离子这两者转运到细胞中来补充细胞中的二羧酸。一旦CMPF处在小管细胞中，它就由0AT4排泄到肾管腔中与氯离子进行交换。
[0037]图12示出了丙磺舒在体内阻断OAT转运蛋白的功能。图(A)改写自Costigan等，1996并且示出了在单独施用5mg/kg时，CMPF从血浆中被清除(淡灰色)。在将CMPF与150mg/kg丙磺舒共同施用时，它的清除率随时间推移显著降低。图⑶示出了对小鼠每天两次注射150mg/kg的丙磺舒抑制了 OAT转运蛋白的功能，如通过显著降低的血楽尿酸浓度所证实。
[0038]图13示出了 OAT转运蛋白和协同转运蛋白在胰岛细胞中表达。在图(A)中，0AT1、0AT3以及NaDC3在小鼠胰岛中以与其它胰岛基因相当的水平表达。图⑶示出了 OAT3和NaDC3主要在胰岛素产生型细胞中表达，而OATl和0AT4主要在非胰岛素产生型人胰岛细胞中表达。C)0AT1、0AT3以及NaDC3在人胰岛中的表达由蛋白质印迹法(Western blotting)确认。使用人近端小管细胞系HK-2作为阳性对照。
[0039]图14示出了抑制OAT转运蛋白阻断了 CMPF对β细胞功能的抑制作用。图(A)示出了在分离的小鼠胰岛中使用ImM丙磺舒对胰岛进行预处理，之后使用200 μΜ的CMPF处理24小时保持了胰岛素的分泌。图(B)示出了在分离的小鼠胰岛中使用300 μΜ的0ΑΤ3特异性阻断剂PCG对胰岛进行预处理，之后使用200 μ M的CMPF处理24小时保持了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
[0040]图15示出了丙磺舒在体内对葡萄糖耐量没有影响。接受3天的150mg/kg丙磺舒每天两次注射的小鼠在(A)体重或(B)血糖方面没有差异。图(C)示出了在第4天进行OGTT并且在媒介物对照与接受丙磺舒注射的小鼠之间葡萄糖耐量未显示出差异。
[0041]图16示出了在注射CMPF 7天之后，基于高胰岛素-正常血糖钳夹，小鼠具有降低的葡萄糖利用。A)图示了注射和手术的时间线的示意图。与媒介物对照相比，接受7天的CMPF注射的小鼠的B)葡萄糖输注率、(C)葡萄糖出现率和(D)葡萄糖消失率以及(E)糖酵解率(每组N = 4)。后期/基础的糖酵解率无差异，表明CMPF没有诱发胰岛素抵抗，而是降低了葡萄糖出现率和葡萄糖消失率。#P〈0.01，*#P〈0.001。值是平均值土SEM。
[0042]图17示出了 CMPF由β -细胞代谢以增加ROS并且改变胰岛素的生物合成。Α)被处理24小时的胰岛基质中的胰岛素原(每组η = 4)。B)在急速添加媒介物对照或200 μ M的CMPF之后的线粒体膜电位(MMP)(每组N = 3)。C)在被处理4小时和被处理24小时的小