鼠胰岛中的ROS水平以及代表性的图像(N=来自4只小鼠/组的10-15个胰岛/小鼠)。D)抗氧化基因Cat和(e) Ucp2的表达(每组η = 4)。F)在接受500 μ M的NAC处理的被处理24小时的胰岛中的ROS积聚(η =来自4只小鼠/组的10个胰岛/小鼠)。接受500 μΜ的NAC共同处理的被处理24小时的胰岛的G)GSIS和(h)总胰岛素含量(每组η = 4)。示出了(i)GSK3|3的Ser9磷酸化、(j)AKT的Ser473磷酸化的蛋白质印迹(每组η = 3)。K)示出了在使用CMPF和NAC处理的情况下F0X01和(I)TOXl的核易位的免疫荧光染色(η = 3-6)。在使用CMPF和NAC处理的情况下基于免疫荧光染色(m) F0X01和(η)PDXl的核百分比的定量。O)示出了 I3DXl和F0X01的蛋白质丰度的蛋白质印迹。值是平均值 +/-SEM0 学生 t 检验(Student，s t-test) (a、c_j、m_o)、单因素 ANOVA(b)。*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，_Ρ〈0.0Olo
[0043]图18示出了 CMPF引起胰岛素生物合成基因的表达减少并且改变代谢基因的表达。A)在被24小时处理的胰岛中胰岛素、胰岛素加工酶、胰岛素转录因子以及葡萄糖感应基因的表达(每组N = 5-6)。B)在与对照或200 μ M的CMPF —起孵育24小时之后的MMP以及荧光的变化(每组N = 4)。C)在被处理24小时的小鼠胰岛中通过微阵列基于生物功能对显著变化的基因进行的分类(N = 3，Ρ〈0.05)。值是平均值+/-SEM。学生t检验(a、c)、单因素 ANOVA (b)。*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.0I。
[0044]图19示出了 CMPF经由有机阴离子转运蛋白3进入β -细胞。Α)对显示OAT转运蛋白和细胞基因表达的人胰岛的微阵列分析(η = 3)。通过(b)RT-PCR、(c)蛋白质印迹、以及(d)使用胰岛素进行的免疫荧光染色对人胰岛中的OAT表达的验证(η = 3-5)。人肾脏样品来自于ΗΚ2人近端小管细胞系。接受OAT抑制剂(e)丙磺舒、(f)苄青霉素(PCG)以及(g)对氨基马尿酸盐(PAH)共同处理的鼠胰岛的GSIS(每组η = 4)。h)接受CMPF和PCG共同处理的鼠胰岛的总胰岛素含量(η = 4)。值是平均值+/-SEM。学生t检验(a、e-h)ο *Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001。
[0045]图20示出了使CMPF与无脂肪酸的BSA缀合对受CMPF损伤的葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有影响。使CMPF与无脂肪酸的BSA缀合6小时，之后添加胰岛(绿色条柱和蓝色条柱)。使用用于缀合油酸酯的相同的方案。黑色条柱和白色条柱表示在未进行预先缀合的情况下在培养基中添加CMPF连同0.1%的BSA。N = 3。*P〈0.05。
【具体实施方式】
[0046]在本发明说明内容的一个方面，3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)已被证实是一种可用于鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的生物标志物。如在实施例1中所阐述，发现与具有正常的葡萄糖耐量的受试者相比，呋喃脂肪酸CMPF的水平在患有妊娠期糖尿病(GDM)的受试者中升高。还发现在GDM后在产后I年内患葡萄糖耐量受损的女性与在同一时间段内维持正常的葡萄糖耐量的女性相比具有显著升高的CMPF水平。在本公开的另一个方面，高的生理学上相关水平的CMPF已经被证实在体外会损伤胰岛素分泌。此外，注射CMPF已经被证实在体内会损伤细胞功能并且阻止葡萄糖刺激的胰岛素分泌。CMPF因此损伤了葡萄糖利用，如通过葡萄糖耐量测试所测量，并且与葡萄糖稳态受损和特征在于β -细胞功能障碍的病况的发病有关，所述病况如GDM、胰岛素分泌受损、葡萄糖不耐症以及II型糖尿病。诸如丙磺舒之类的CMPF抑制剂的使用已经被证实会消除CMPF对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。值得注意的是，丙磺舒的施用还已经被证实会升高体内的循环CMPF水平而不改变葡萄糖耐量。降低血液和/或胰岛细胞中CMPF的生理水平的CMPF抑制剂因此预期可用于治疗如患有葡萄糖稳态受损的受试者的细胞功能障碍。
[0047]本发明的说明内容因此提供了用于鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法以及用于监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法。任选地，患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者患有β-细胞功能障碍或特征在于细胞功能障碍的病况。任选地，本文所述的方法可用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损而未患细胞功能障碍的受试者。
[0048]还提供了用于通过使一个或多个细胞与CMPF接触来引起β -细胞功能障碍的方法。用于引起细胞功能障碍的方法可用于产生葡萄糖稳态受损和特征在于细胞功能障碍的病况的体外模型或体内模型。本公开还提供了对影响细胞活性的化合物进行筛选的方法。还提供了用于治疗细胞功能障碍或特征在于细胞功能障碍的病况的方法，所述方法包括向受试者施用CMPF抑制剂；或CMPF抑制剂用于治疗β -细胞功能障碍或特征在于β -细胞功能障碍的病况的用途。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂并且使用所述OAT激活剂进行治疗有助于降低血液中CMPF的水平。任选地，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂，如丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)或苄青霉素(PCG)、或其组合。在一个实施方案中，使用OAT抑制剂进行治疗有助于降低胰岛细胞中CMPF的水平。
[0049]定义
[0050]如本文所用的“葡萄糖稳态受损”指的是其中受试者不能维持血液中正常的葡萄糖水平的一种短暂的或持续的病况。葡萄糖稳态受损的实例包括但不限于胰岛素分泌受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。任选地，患有葡萄糖稳态受损的受试者还患有β-细胞功能障碍。
[0051]如本文所用的术语“ β -细胞功能障碍”指的是其中β -细胞的活力或生理活性受损的一种病况。在一个实施方案中，细胞功能障碍指的是β细胞不能分泌足够的生物活性胰岛素以维持血液和组织中葡萄糖、脂肪酸以及其它营养物质的正常水平。在一个实施方案中，细胞功能障碍指的是细胞的胰岛素分泌被不适当地增大，其促使胰岛素抵抗的发生。细胞功能障碍任选地是体外、离体或体内一个或多个细胞的病况。细胞功能障碍的实例包括但不限于胰岛素分泌受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。
[0052]如本文所用的术语“受试者”指的是动物界中具有细胞的任何成员，所述细胞储存并且释放胰岛素以控制血液中葡萄糖的水平。在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述受试者患有或疑似患有特征在于细胞功能障碍的病况。在一个实施方案中，所述受试者是动物，如大鼠或小鼠。
[0053]术语“样品”指的是来自受试者的可以测定CMPF的任何流体或其它样品。举例来说，在一个实施方案中，所述样品是血液或血液衍生物，如血清或血浆。任选地，所述样品是呈EDTA(钠盐、Κ2盐或Κ3盐)或肝素形式的血浆。在一个实施方案中，所述样品是尿或汗液。在一个实施方案中，测定来自受试者的测试样品中CMPF的水平。任选地，所述测试样品可以是冷冻的样品或存档的样品。
[0054]如本文所用的术语“对照水平”指的是来自已知患有特定的病况或未患特定的病况的受试者或一组受试者的样品中CMPF的水平。所述对照可以变化，这取决于正被监测、评估或鉴定的物质。举例来说，在一个实施方案中，CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。在一个实施方案中，CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有特征在于细胞功能障碍的病况或有患特征在于细胞功能障碍的病况的风险。所述对照还可以是值的预定的标准、平均或参考范围。任选地，术语“对照水平”包括在更早的时间点测定的来自受试者的测试样品中CMPF的水平。在一个实施方案中，对照是年龄或性别匹配的对照。在一些实施方案中，对照水平表示受试者未患葡萄糖稳态受损，任选地约20 μ Mo在一些实施方案中，对照水平表示受试者患有葡萄糖稳态受损，任选地约50μΜ、100μΜ、150 μ M或200 μ Mo在一些实施方案中，大于对照水平的CMPF水平表示受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
[0055]如本文所用的“药剂”指的是具有确定的或未确定的组成的分子、化合物或物质，包括但不限于有机或无机分子、多肽、抗体、多糖或其它生物分子或者由诸如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织之类的生物材料制成的提取物。任选地，所述药剂是处在诸如组合的小分子阵列或展示文库之类的阵列中的分子、化合物或物质。在一个实施方案中，所述药剂是有机化合物，如丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)或苄青霉素(PCG)。
[0056]如本文所用的“ β -细胞的活性”指的是β -细胞影响对营养物质的感应或胰岛素的合成、储存或释放的尺寸、活力或生理活性方面的任何变化。β -细胞的活性的实例包括但不限于葡萄糖刺激的胰岛素分泌、胰岛素基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译、β -细胞数目的变化或细胞群的扩增、损耗或扩增失败。任选地，本文所述的方法包括确定测试药剂对一个或多个β-细胞的单一活性或两种或更多种活性的作用。
[0057]如本文所用的术语“葡萄糖耐量受损”指的是特点在于与胰岛素抵抗有关的高血糖症的糖尿病前期状态的一种病况。术语“胰岛素抵抗”指的是其中胰岛素在降低血糖水平方面变得不太有效的一种生理病况。术语“妊娠期糖尿病”指的是其中先前未被诊断出2型糖尿病的女性在妊娠期期间表现出高的血糖水平的一种病况。如本文所用的术语“糖尿病前期”指的是其中受试者表现出空腹血糖受损和/或葡萄糖耐量受损而尚未发展成糖尿病或2型糖尿病的一种病况。如本文所用的术语“2型糖尿病”也被称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，是特征在于在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏的背景下出现高血糖的一种代谢病症。任选地，2型糖尿病指的是受试者的空腹血浆葡萄糖彡7.0mmol/1 (126mg/dl)。用于鉴定患有葡萄糖稳态受损、糖尿病、β -细胞功能障碍和/或相关病况的受试者的合适标准参见于 Standards of Medical Care in Diabetes-2012Diabetes Care (糖尿病的医疗护理标准-2012年糖尿病护理)，第35卷，增刊1，2012年I月中，该文献在此以引用的方式并入本文。
[0058]如本文所用的术语“抗体”意图包括单克隆抗体、多克隆抗体以及嵌合抗体。所述抗体可以来自于重组来源和/或在转基因动物中产生。如本文所用的术语“抗体片段”意图包括而不限于Fab、Fab’、F (ab') 2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚体、微型抗体、双特异抗体、以及其多聚体、多特异性抗体片段和结构域抗体。可以使用常规技术使抗体片段化。举例来说，F (ab’)2片段可以通过使用胃蛋白酶对抗体进行处理而产生。可以对所得的F (ab’) 2片段进行处理以还原二硫桥键而产生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可以引起Fab片段形成。Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚体、微型抗体、双特异抗体、双特异性抗体片段以及其它片段还可以通过重组技术来合成。
[0059]CMPF的抗体可商购自生命科学先进技术公司(Life Sciences AdvancedTechnology Inc.)(佛罗里达州的圣彼得堡(St.Petersburg, FL))或诺威特生物科技公司(Noventein B1sciences)(马萨诸塞州的剑桥市(Cambridge, Mass.)) ο然而，本领域技术人员将了解的是，可以产生对CMPF或对与CMPF代谢或降解相关的生物标志物具有特异性的其它抗体。为了产生单克隆抗体，可以从利用目标抗原(例如CMPF)免疫接种的动物收集抗体产生细胞(淋巴细胞)并且通过标准的体细胞融合程序使这些细胞与骨髓瘤细胞融合，从而使得这些细胞永生化并且产生杂交瘤细胞。这些技术(例如最初由Kohler和Milstein (Nature 256:495-497 (1975)研发的杂交瘤技术)以及其它技术是本领域公知的，所述其他技术如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4:72(1983))、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，Methods Enzymol, 121:140-67 (1986))、以及对组合抗体文库进行筛选(Huse等，Science 246:1275 (1989))。可以免疫化学方式针对与目标抗原发生特异性反应的抗体的产生来筛选杂交瘤细胞，并且可以分离单克隆抗体。
[0060]如本文所用的术语“CMPF抑制剂”包括螯合或降低血液或血浆中CMPF的生理浓度和/或降低胰岛细胞中CMPF的生理浓度的任何药剂。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂提高了 CMPF从血浆中的清除率。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂。在一个实施方案中，所述OAT激活剂提高了 CMPF从血浆中的清除率。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂降低胰腺β -细胞中CMPF的生理浓度。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂抑制在胰岛细胞中表达的有机阴离子转运蛋白(OAT)的活性。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂。
[0061]如本文所用的“0ΑΤ抑制剂”指的是抑制有机阴离子转运蛋白(OAT)的表达或活性的任何药剂。在一个实施方案中，OAT抑制剂抑制OATl (也被称为SLC22A6)、0ΑΤ3 (也被称为SLC22A8)和/或0ΑΤ4(也被称为SLC22A11)的表达或活性。OAT抑制剂的实例包括但不限于丙磺舒、苄青霉素(PCG)以及对氨基马尿酸盐(PAH)。
[0062]如本文所用的“0ΑΤ激活剂”指的是提高有机阴离子转运蛋白(OAT)的表达或活性的任何药剂。在一个实施方案中，所述OAT激活剂对0ΑΤ4(也被称为SLC22A11)具有特异性。
[0063]如本文所用的并且如本领域所充分了解的“治疗(treating或treatment) ”意指用于获得有益的或所需的结果的方法，所述结果包括临床结果。有益的或所需的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况；降低疾病的程度；使疾病的状态稳定(即不恶化)(例如维持足够的胰岛素和/或生理学上正常的血糖水平)；预防疾病传播；延迟或减缓疾病进展；改善或缓和疾病状态；减少疾病复发；以及缓解(无论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测出的或是不可检出的。“治疗”还可以意指使存活期与在未接受治疗的情况下预期的存活期相比得到延长。如本文所用的“治疗”还包括预防性治疗。在一个实施方案中，治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的CMPF抑制剂并且任选地由单次施用组成，或可选地包括一系列施用。在一个实施方案中，“治疗”包括改善具有葡萄糖稳态受损的受试者中的细胞功能。
[0064]如本文所用的短语“有效量”或“治疗有效量”意指在为实现所需的结果所必需的剂量和时间段下有效的量。举例来说，在治疗葡萄糖稳态受损的背景下，有效量是与在未施用化合物的情况下所获得的反应相比[有助于改善细胞功能或有助于使胰岛素和/或葡萄糖的水平稳定在生理学上正常的浓度]的量。有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别以及体重之类的因素而变化。将对应于这种量的给定化合物的量将随各种因素而变化，所述因素如给定的药物或化合物、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者或宿主的特征等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。
[0065]在一个实施方案中，诸如本文所述的CMPF抑制剂之类的化合物被制备或配制用于向有需要的受试者施用，如本领域已知的那样。用于选择和制备合适的制剂的常规程序和成分描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences (《雷明顿药物科学》)(2003 年-第 20 版)和 1999 年出版的 The United States Pharmacopeia:The Nat1nalFormulary (《美国药典:国家处方集》)(USP24NF19)中。
[0066]鉴定或监测β -细胞功能障碍的方法
[0067]在一个实施方案中，提供了一种鉴定患有葡萄糖稳态受损或有产生葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括:
[0068]a)测定来自受试者的样品中3-羧基-4-甲基_5_丙基_2_呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
[0069](b)将CMPF的测试水平与对照水平比较，其中CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
[0070]还提供了一种监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法，所述方法包括:
[0071](a)测定来自所述受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
[0072](b)将CMPF的测试水平与来自所述受试者在更早的时间点的CMPF水平相比较，其中CMPF水平增加则表示所述受试者的葡萄糖稳态受损更严重，并且CMPF水平降低则表示所述受试者的葡萄糖稳态得到改善。
[0073]在一个实施方案中，本文所述的用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法可用于鉴定或监测患有细胞功能障碍或有患细胞功能障碍风险的受试者。任选地，本文所述的方法包括获得或提供来自所述受试者的样品。举例来说，在一个实施方案中，所述样品是血液样品、血浆样品、血清样品或尿样品或者可以用于分析CMPF水平的另一种生物样品。
[0074]在一个实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定或监测其中对血糖水平的调节受损的病况。特征在于葡萄糖稳态受损的病况的实例包括但不限于细胞功能障碍、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病(GDM)、胰岛素抵抗或2型糖尿病。在一个实施方案中，受试者中CMPF水平的量值反映了所述受试者中对血糖水平的调节受损的严重程度。在一个实施方案中，受试者中CMPF水平的量值反映了所述受试者中β -细胞功能障碍的严重程度。
[0075]本领域技术人员将了解的是，在来自受试者的测试样品中所观测到的CMPF的水平与对照水平之间的差异或相似可以被用于鉴定或监测患有或疑似患有葡萄糖稳态受损的受试者。
[0076]举例来说，如果正在对妊娠期糖尿病(GDM)进行鉴定或监测，那么所述对照可以来自于已知未患GDM的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有GDM或患GDM的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有GDM的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有GDM或患GDM的风险增加。
[0077]在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患葡萄糖耐量受损的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患葡萄糖耐量受损的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有葡萄糖耐量受损的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患葡萄糖耐量受损的风险增加。
[0078]在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患糖尿病前期的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有糖尿病前期或患糖尿病前期的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有糖尿病前期的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患糖尿病前期的风险增加。
[0079]在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患胰岛素抵抗的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有胰岛素抵抗或患胰岛素抵抗的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有胰岛素抵抗的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有胰岛素抵抗或患胰岛素抵抗的风险增加。
[0080]在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患2型糖尿病的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有2型糖尿病或患2型糖尿病的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有2型糖尿病的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有2型糖尿病或患2型糖尿病的风险增加。
[0081]在一个实施方案中，所述对照水平代表具有正常的葡萄糖耐量的受试者中的CMPF水平，并且相对于所述对照水平，测试样品中CMPF的水平增加则表示葡萄糖耐量受损。
[0082]未患葡萄糖稳态受损的受试者的血浆中CMPF的水