水蛭的全唾液提取物的制作方法
【专利说明】水蛭的全唾液提取物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月21日提交的美国申请No. 13/624,847的优先权，该申请 要求2012年9月17日提交的美国临时申请No. 61/701，735的权益，每份申请的全部内容 均以引用方式并入本文。 【背景技术】 技术领域
[0003]
[0004] 本文提供的教导总体涉及分离以及使用水蛭的全唾液提取物来治疗受试对象的 方法。
[0005] 相关领域的描沐
[0006] 人类使用水蛭的历史可以追溯至几千年前，并且实际上所有的人类文化都描述了 水蛭治疗多种疾病的用途。不幸的是，至少由于缺乏对与此用途相关的化学和机制的了解， 目前最先进的技术仍不能成功地商业化水蛭唾液提取物在治疗疾病中的用途。
[0007] 曾经尝试杀死水蛭以便由水蛭的全身、由水蛭的头或由它们的唾液腺提取活性化 合物。很多研宄已经定向于识别水蛭唾液提取物中的蛋白质。但是，可能除了分离和使用 水蛭素作为抗凝剂，这些努力都不能再现使用完整活水蛭的作用。
[0008] 已经尝试不杀死水蛭，而是由活水蛭提取很多的稀释的唾液溶液。不幸的是，这 些努力面临2个主要的问题：（i)唾液移出需要手工挤压水蛭，这样是不容易升级的；以及 (ii)唾液保持稀释的，其仅可以新鲜使用，并且任何冻干法的尝试都将降低或完全消除水 蛭唾液提取物的治疗活性。这样，剂量依赖的治疗或者高浓度下的适量不可用于测试。
[0009] 任一技术人员都将欣赏（i)分离活性的精制的水蛭唾液提取物（LSE)的方法，所 述的水蛭唾液提取物可以成功地储存数月或者甚至几年；（ii)再利用水蛭以生产LSE的 方法；（iii)使水蛭的分离和再利用商业化达到可升级的量（其实际用于商业化）的方法， (iv)使用LSE质粒实体肿瘤的方法；（V)使用LSE治疗液体肿瘤的方法；(vi)使用LSE质 粒糖尿病的方法；(vii)使用LSE治疗病毒的方法；(viii)使用LSE治疗寄生虫疾病的方 法；（ix)使用LSE作为抗氧化剂的方法；以及（X)使用LSE作为抗细菌剂的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 本文提供的教导总体涉及分离和使用水蛭全唾液提取物治疗受试对象的方法。提 供包含水蛭提取物和药物可接受的载体的药物配制物。
[0012] 所述的教导包含由水蛭移出全唾液的方法。在这些实施方案中，所述的方法可以 包含向水蛭提供取食刺激（取食刺激）剂；诱导水蛭反刍，所述的诱导包含将水蛭置于温度 低于大约o°c的环境下；以及在冷却水蛭的反刍中收集未精制的全唾液。
[0013] 所述的教导包含建立水蛭的冻干的全唾液提取物（具有改善的稳定性）的方法。 在这些实施方案中，所述的方法包含向水蛭提供取食刺激剂；诱导水蛭反刍，所述的诱导包 含将水蛭置于温度为大约-5°C至大约15°C的环境下；在冷却水蛭的反刍中收集未精制的 全唾液；由未精制的全唾液移出固体成分以建立精制的全唾液；以及冻干分离体积的精制 的全唾液提取物，所述的体积均不超过大约2ml。
[0014] 在一些实施方案中，所述的收集包含挤压水蛭以增加所收集的未精制的全唾液的 量。在一些实施方案中，所述的方法进一步包含通过将水蛭在温度为大约5°C至大约40°C 的水浴中温暖来复苏水蛭。在一些实施方案中所述的方法进一步包含建立精制的全唾液提 取物；所述的建立包含由未精制的全唾液移出固体成分。在一些实施方案中，所述的方法进 一步包含冻干分离体积的精制的全唾液提取物，所述的体积均不超过大约2ml。并且在一些 实施方案中所述的水輕为菲牛輕（irudinaria manillensis)。
[0015] 所述的教导包含水蛭的稳定的冻干的全唾液提取物。在这些实施方案中，所述的 提取物包含体积均不超过大约2ml的水蛭的、精制的冻干全唾液提取物，所述的提取物是 通过由未精制的全唾液移出固体成分而精制的，从而建立精制的全唾液；其中当将所述的 提取物在温度低于大约_20°C下储存以用于使用时，其具有稳定的活性，所述的提取物保持 至少70%的活性达至少6个月。并且所述的水蛭可以为菲水蛭。
[0016] 提供给药有效量的水蛭提取物来治疗受试对象的方法。在一些实施方案中，所述 的方法包含治疗实体肿瘤、治疗液体肿瘤、治疗糖尿病、治疗病毒疾病、治疗寄生虫疾病、治 疗细菌疾病或者给药抗氧化剂治疗。应该理解的是各治疗还涉及受试对象中可以理想地治 疗的其他状况。
[0017] 附图简述
[0018] 图1示出了根据一些实施方案使，用膜向水蛭提供取食刺激剂的方法。
[0019] 图2A-2C示出了根据一些实施方案，未精制的全唾液提取物的收集。
[0020] 图3示出了根据一些实施方案，精制的水蛭唾液提取物的UV光谱。
[0021] 图4示出了根据一些实施方案，Bradford蛋白比色检验的标准曲线。
[0022] 图5示出了根据一些实施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝胶电泳得到的马来 西亚水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白质分子量分布结果。
[0023] 图6示出了根据一些实施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝胶电泳得到的马来 西亚水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白质分子量分布结果，其中所述的LSE是使用丙酮沉淀而浓 缩的。
[0024] 图7示出了根据一些实施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝胶电泳得到的马来 西亚水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白质分子量分布结果，其中所述的LSE是使用三氯乙酸（TCA) 沉淀由溶液沉淀得到的。
[0025] 图8示出了根据一些实施方案，使用Non-Urea SDS-PAGE凝胶电泳得到的马来西 亚水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白质分子量分布结果。
[0026] 图9示出了根据一些实施方案，使用麦黄酮SDS-PAGE凝胶电泳得到的马来西亚水 蛭（菲水蛭）的LSE蛋白质分子量分布结果。
[0027] 图IOA和IOB示出了根据一些实施方案，在LSE分析中RP-HPLC的结果。
[0028] 图11示出了根据一些实施方案，使用RP-HPLC的LSE蛋白质的分离。
[0029] 图12示出了根据一些实施方案，使用麦黄酮SDS-PAGE凝胶电泳的2种分离蛋白 质的分子量。
[0030] 图13示出了根据一些实施方案，LSE相对于抗凝血酶活性的IC50。
[0031] 图14示出了根据一些实施方案，凝血酶时间与LSE蛋白质浓度之间的关系。
[0032] 图15示出了根据一些实施方案，冻干条件和储存条件对LSE的活性和稳定性的影 响。
[0033] 图16示出了根据一些实施方案，冻干时间对LSE抗凝血酶活性的影响。
[0034] 图17示出了根据一些实施方案，光照和容器对在室温下储存至多7天的LSE样品 (冻干的和非冻干的）的影响。
[0035] 图18示出了根据一些实施方案，储存温度、光照和容器对在4°C下至多180天的 LSE样品（冻干的和非冻干的）的抗凝血酶活性的影响。
[0036] 图19示出了根据一些实施方案，容器和冻干对在_20°C下至多180天的LSE样品 的抗凝血酶活性的影响。
[0037] 图20示出了根据一些实施方案，LSE显示对人类小细胞肺癌（SW1271细胞系）具 有明显的抗增殖活性。
[0038] 图21和22示出了根据一些实施方案，LSE与依立替康或卡波铂的混合物的细胞 毒作用。
[0039] 图23和24示出了根据一些实施方案，在正常和糖尿病大鼠中，在不同的时间间隔 下不同剂量的LSE和胰岛素对禁食血糖（mmol/L)的影响。
[0040] 图25示出了根据一些实施方案，LSE对糖尿病的发作具有预防作用。
[0041] 图26和27根据一些实施方案，比较了 LSE与L-抗坏血酸（维生素 C)的自由基 清除活性。
[0042] 发明详述
[0043] 本文提供的教导总体涉及分离和使用水蛭全唾液提取物治疗受试对象的方法。提 供了包含水蛭提取物和药物可接受的载体的药物配制物。
[0044] 应该理解的是术语"提取物"可以用于指粉末形式的所关注的化合物、液体形式的 所关注的化合物或者粉末或液体形式的所关注的化合物的任意一种或任意组合。任一技 术人员将理解的是术语"提取物"可以用于指在由水蛭移出之前、移出过程中或移出之后所 关注的化合物。在一些实施方案中，所关注的化合物可以使用任一技术人员已知的标准方 法来化学合成，使得它们可以由那些技术人员在不使用本文所教导的提取方法的情况下单 独或者以任意的组合来合成并使用。本文提供的组合物可以指提取物、组合物、化合物、试 剂、活性剂、生物活性剂、补充剂、药品等。在一些实施方案中，术语"LSE"、"提取物"、"LSE 组合物"、"组合物"、"化合物、"试剂"、"活性"、"活性剂"、"生物活性剂"、"补充剂"和"药品" 可以交换使用，并且应该理解的是"配制物"可以包含这些物质的任意一种或任意的组合。 类似地，在一些实施方案中，所述的组合物还可以为液体或干燥形式，其中在一些实施方案 中，干燥形式可以为粉末形式，液体形式可以包含水性或非水性成分。此外，术语"活性"或 "生物活性"可以指化合物在体外（例如在检验中）或者在体内（在给药受试对象时）的功 能。
[0045] 应该理解的是水蛭提取物可以是分离的或纯化的。在一些实施方案中，术语"分离 的"和"纯化的"可以交换使用。在一些实施方案中，术语"分离的"可以用于指提取物由水 蛭的天然化学环境中移出，使得该提取物并非为其天然存在的形式。应该理解的是术语"纯 化的"在一些实施方案中可以用于指由菲牛蛭水蛭得到的提取物，使得所关注的化合物以 可以给药受试对象的形式（例如可溶形式）或者可以进入到水性溶液中的形式与水蛭的其 余部分分离。这样，任一技术人员将理解的是所关注的化合物有时可以伴有其他成分（其 与提取物一起携带）。例如此类其他的成分可以包含在水蛭中发现具有活性的任意一种蛋 白质或者此类蛋白质的任意组合。在一些实施方案中，术语"纯化的"可以用于指这样的提 取物，其由或者基本上由所关注的任意一种化合物或该化合物的任意组合组成。在一些实 施方案中，所述的提取物包含取食刺激溶液或由取食刺激溶液得到的成分。在一些实施方 案中，提取物"基本上由以下组成":所关注的任意一种化合物或该化合物的组合，其中由水 蛭或提取过程得到的任意其他的成分的存在都对所关注的化合物的活性具有微不足道的 影响。术语"微不足道的影响"可以用于指当分别与所关注的任意一种化合物（不具有其 他成分）或该化合物的任意组合（不具有其他成分）相比时，活性未升高或降低超过大约 10%。在一些实施方案中，术语"微不足道的影响