智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于外科医疗用材料及其制造方法，具体的说，智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板。
【背景技术】
[0002]据国际内固定研宄协会AO (Arbeit sgem ein schaft fur Osteosynthesesfragen) /ASIF (Associat1n for the Study of Internal Fixat1n)报道，开放性骨折中感染率高达约3?40%，如使用内固定则感染率增加30%以上。每年在美国约200万例院内感染病例中，约50%与内植物有关，不仅消耗高达240亿美元的巨大社会财富，还导致包括细菌耐药、截肢甚至每年10万患者死亡等严重后果。宄其原因，细菌与植入物材料粘附以形成完整的生物膜是“内植物相关感染”的主要病理基础。“内植物相关感染”(Orthopedic Device Related Infect1ns, 0DRI)始终是困扰骨科临床的最常见而严重的并发症之一。针对0DRI，一般传统的治疗方法是:在取出内植物的基础上，彻底清创去除感染坏死骨与软组织及大部分细菌；使用外固定支架临时固定骨折断端；全身或局部应用大剂量抗生素消灭残留细菌；应用皮瓣等技术关闭伤口。确实无感染后再行植骨、骨搬移或延长及膜成骨技术恢复骨结构。
[0003]针对ODRI的传统治疗技术，周期长、花费大，多使用外固定支架固定骨骼，维持其稳定性。而较少使用内固定器械，与在开放性骨折和火器伤中钢板螺丝钉等内植物则被视为禁忌症的原因相同，仅约数量为103CFU/ml的细菌即可与内植物粘附以及并形成完整的生物膜导致ODRI的发生、发展与持续迀延不愈是基础。而没有内植物的情况下，即使开放性骨折局部有106CFU/ml细菌，也未必导致肌体感染。但是外固定具有针道感染率高(5.9%?19% )、在干骺端骨折中不易固定、钢针松动和严重影响患者生活、不便于护理等缺点。而在干骺端骨折中，接骨板是不可替代的固定骨折断端的方式。因此，在ODRI的预防与治疗中，传统抗生素使用方法:全身或局部用药。前者，往往由于局部损伤和血循破坏导致全身血中抗生素难以在损伤局部达到有效抗菌浓度；后者，虽然能够在局部初始产生高浓度的抗生素，但随后快速下降，不能维持有效治疗浓度。因此，均难以对ODRI与创伤性骨髓炎的形成与发展产生有效的抗感染作用。目前针对细菌生物膜，通过抑制其多糖基质合成及促进其分解、干扰密度感应系统、加用单抗和改进植入物的表面理化特性以降低细菌与材料的粘附及抗菌素涂层等方法，证实在一定程度上可以降低ODRI发生率，但均不能彻底地解决生物膜的形成和由此导致的持续感染。为此，寻找新的改变固定物材料表面特性的方法或物质已成为目前临床工作的迫切需要，是国内外微生物、材料、临床医学等多领域研宄焦点之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种强力抗感染和抑制细菌生物膜形成的智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板，该接骨板制备PEG-C0-AA微胶粒为核的智能化电荷梯度径向分布凝胶颗粒、PH敏感型PMMA微凝胶层为控释壳的复合微胶粒。该微胶粒不仅能够充分负载hBD-3等抗菌肽，并且由于微胶粒核内hBD-3等抗菌肽呈现正电荷梯度径向分布，使hBD-3等抗菌肽具有“智能化”由高电势向低电势自动地递补、发挥“接触性杀菌”效应和拓扑抗菌结构的三重“智能化”特征的纳米水凝胶涂层，以克服传统交联方法的困境及涂层易水解、负载抗菌肽量少和半衰期短的缺陷，从而突破hBD-3等抗菌肽在体内防治ODRI的应用“瓶颈”。
[0005]本发明的目的之二在于提供一种智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板的制造方法。
[0006]一种智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板，包括钛金属或钛合金接骨板(I)，其关键在于:所述钛金属或钛合金接骨板拓扑抗菌结构表面复合微胶粒负载β —防御素一I?3、乳铁蛋白1-11、LL-37、富组蛋白类似体(histatin analogue DHVAR-5)、内源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的阳离子抗菌肽单位面积浓度约0.025?lmg/mL。所述钛金属或钛合金接骨板表面覆盖由聚乙二醇-Co-丙稀酸(Poly (ethyleneglycol)-co-acrylic acid, PEG_co_AA)微凝胶核为内核，外层控释壳为pH敏感型聚甲基丙稀酸(poly (methacrylic acid, PMAA)微凝胶层的智能化电荷梯度径向分布复合微胶粒，该复合微胶粒涂层在不锈钢、钛金属或钛合金接骨板形成拓扑抗菌结构表面复合微胶粒负载β 一防御素一 I?3、乳铁蛋白l-ll、LL-37、富组蛋白类似体(histatin analogueDHVAR-5)、内源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的阳离子抗菌肽。所述复合微胶粒直径约100?400 μm、高度范围0.6?8 μπι。PEG-co-AA微凝胶核电势范围约负6?40mv，核内径约I?100nm ;PMAA微凝胶层电势范围约负6?Omv，层数约5?30层。该复合微胶粒具备电荷自高电势向低电势自动转移的特性。所述不锈钢、钛金属或钛合金接骨板拓扑抗菌结构表面复合微胶粒(3)间距范围约0.5?4 μπι。
[0007]一种智能化纳米水凝胶拓扑结构抗菌接骨板的制造方法，其关键在于，按如下步骤进行:
[0008]步骤1，钛金属或钛合金接骨板(I)表面预处理和钛表面带电处理。钛金属或钛合金接骨板(I)依次以蒸馏水、丙酮、75%乙醇、蒸馏水超声清洗、等离子plasma进行亲水处理各10?20分钟，置入0.2mg/mL，平均分子量为30?50k，pH9的多聚L赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)2?3小时，在钛合金基体形成带正电高分子层，进行初始底层沉积，取出后用去离子水洗净，在室温下干燥待用。
[0009]步骤2，制备PEGDA/AA乳液(2)。分别取平均分子量500?600的聚乙二醇丙烯酸醋(Polyethylene Glycol Diacrylate, PEGDA) 200 μ 1，丙稀酸单体(acrylic acid, AA)在50°C蒸馏后留取0?20 μ 1，以及光引发剂(Darocur 1173，Ciba) 10 μ 1，共同溶解在二氯甲烧(dichloromethane，DCM) Iml中形成油相。I?10%聚乙稀醇(PVA) I?3ml作为乳化剂，被溶解在1ml去离子水中形成水相。在高速磁子(100rpm)的搅拌10?20分钟，油相被分散到连续的水相中形成乳液。通过调整PVA的含量，油相/水相的比例，以及磁子搅拌的时间，控制乳液直径大小约1.0?1.5 μπι。
[0010]步骤3，合成PEG-co-AA微凝胶核(2)。制成的乳液被置于10w的紫外灯下20分钟。紫外光激发光引发剂产生自由基，在自由基聚合的原理下，油滴中的PEGDA以及AA的双键被打开，导致链增长和链之间交联反应。因此，油滴中的PEGDA和AA形成了微凝胶核，以70%乙醇悬浮一离心的方法反复三次进行纯化，用去离子水悬浮一离心的方法去除酒精。通过控制PEGDA与AA的比例10:0.1?I，控制微凝胶核的电荷密度，形成电势约范围约负6?40mv。制成的微胶粒核通过16000?50000r/min高速离心收集，用不同孔径的滤膜可以选择性的得到所需的粒径大小I?lOOOnm，最后收集到的微胶粒核被分散在1mlPBS磷酸盐缓冲液中。
[0011 ] 步骤4，PEG-co-AA微凝胶核表面修饰PMAA高电荷密度壳层⑵。纯化后的微凝胶核首先被分散到聚乙稀卩比略烧酮(poly(N-vinylpyrrolidone)，PVP0N)的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分钟后，将微凝胶粒通过过滤，离心的方式洗净。随后，将PVPON处理过的胶粒分散在聚甲基丙烯酸PMAA的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分钟后，用上述方法洗净。重复以上方法5?30次，形成有氢键交联的5?30层PVPON/PMAA凝胶层。
[0012]步骤5，交联稳定PMAA凝胶壳层(2)。微凝胶颗粒被分散在1_乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐5mg/mL和羟基硫代琥珀酰亚胺5mg/mL的0.0lM PBS溶液(PH5)中1.5小时；之后，将胶粒从溶液中分离，并且浸泡到10mg/mL的乙二胺(ethylenediamine,EDA)溶液(ρΗ5.8)中14小时进行PMAA层之间的共价交联；最后，为了去除PVPON和未反应的其他试剂，PEG-co-AA/PMAA复合微凝胶粒被浸泡在ρΗ7.5的0.0lMPBS中2小时，离心一过滤之后复合微凝胶粒被悬浮在PBS中(pH7.4,0.1Μ)。应用动态光散射和Zeta电势测定方法在不同ρΗ4?9及离子强度的情况下复合微凝胶的大