鱼用亚单位浸泡疫苗的制作方法
【技术领域】 本发明涉及用于保护鱼对抗由传染性病原体引起的疾病的亚单位浸泡疫苗领域。具体 地，本发明属于包含重组抗原以保护鱼对抗由黄杆菌科（Flavobacteriaceae)和/或传染 性胰坏死病毒（IPNV)引起的疾病的浸泡疫苗领域。
【背景技术】 通过水产养殖进行的鱼的产业养殖正急剧扩大。由病原体引起的传染病构成产业水产 机构必须克服的主要问题。为了防止这些传染病的发作，经常采用的策略是应用疫苗。目 前在水产养殖中使用的几乎所有疫苗都对应于与引起疾病的病原生物体相同的病原生物 体的减毒活培养物或灭活培养物。重组疫苗在研宄实验室水平上日益增长，但现场应用仍 然几乎只是通过注射技术。 存在两种可对鱼进行疫苗接种的方式：可通过注射或通过浸泡来施用疫苗。目前，水产 养殖中的最大问题之一是可注射疫苗的施用困难且昂贵，并且由于存在导致腹膜内粘连的 风险以及在收获时产生鱼大小的高度分散而通常不能在体重小于15-20克的幼鱼中使用。 此外，可注射疫苗的使用导致鱼的应激、高劳动力成本以及对使用者的无意注射所引起的 事故的风险。 尽管浸泡疫苗具有潜在的优势，但却一直是可注射疫苗在商业水产养殖中具有更大发 展。鱼的腹膜内注射是目前最常用的施用疫苗的方法，主要是由于其高效性以及保证足够 的血浆水平的精细给药。当前的浸泡疫苗通常的特点是它们穿过鱼皮肤的低效吸收并且可 能经受降低的免疫原性。因此，通常需要高度免疫原性的组合物，例如减毒活病原体或灭活 病原体。 嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum)是引起细菌冷水疾病（CWD)的革兰氏 阴性细菌性鱼病原体，并且因其广泛分布和经济影响而被认为是影响鲑科鱼水产养殖的重 要病原体。在美国，据估计，对于虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss Walbaum)的商业水产养殖 和鲑科鱼物种的保护性水产养殖，仅太平洋西北地区由CWD引起的年损失分别为约960和 400万美元。 柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare)是一种对温水鱼和冷水鱼物种都具有高度 传染性的水生细菌。对于斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus)，它是柱状病的病原体。柱状 黄杆菌是一种革兰氏阴性的杆状病原体，其已从培养该物种的美国东南部地区的斑点叉尾 鮰中分离出来。这种疾病还会影响运动性鱼（即白斑鱼（walleye)和大口鲈鱼）和观赏鱼 类。目前使用含药饲料（抗生素）来尝试控制这种细菌感染。然而，这些治疗在其有效性 上受限，而且大多数生产商已经停止使用含药饲料。在全世界通过接种疫苗预防柱状病是 一个重要的目标，并且是鲶鱼和其他鱼类生产商的最优先选择。每年这些产业的估计节省 额将超过1亿美元。 对于黄杆菌属的治疗选择是有限的，包括降低病原体浓度、消除病原体的扩散以及使 用抗生素。然而，治疗的有效性通常是不一致的，并且存在发展出抗生素抗性菌株的潜在风 险。因此，需要预防感染的疫苗。 传染性胰坏死病毒（IPNV)是虹鳟鱼和溪红点鲑（Brook trout)以及大西洋鲑鱼的具 有高度传染性和破坏性的疾病的病原。IPNV的高毒力株可能在不到四个月大的鱼孵化群体 (hatchery stock)中引起大于90%的死亡率。感染的幸存者可保持为终身无症状的携带 者，并作为感染源，在它们的粪便和生殖产物中排出病毒。因此，IPNV是对水产养殖业具有 主要经济重要性的病原体。 IPNV是双RNA病毒科（Birnaviridae)病毒家族的原型。IPNV含有双区段 (bisegmented)的dsRNA基因组，该基因组被具单壳的二十面体衣壳包围。两个基因组区 段中的较大区段，即区段A(3097个碱基），编码106-kDa前体多蛋白，该前体多蛋白被加 工以产生成熟的病毒结构蛋白VP2和VP3,以及VP4(也称为NS)非结构蛋白（Duncan等 人，1987)。VP2已被确定为IPNV的主要宿主保护性抗原。 IPNV的理想疫苗必须在早期年龄诱导保护，防止成为携带者，并应有效地对抗大量的 IPNV亚型。已发现灭活的IPNV疫苗通过腹膜内接种IPNV是有效的（在US2003072772和 US8168201中描述，这些文献通过引用而并入）；然而，它们并非是有效的，并且导致通过注 射的额外给药。US8168201描述了包含特定抗原作为亚单位疫苗的抗原性组合物，其中该疫 苗可进一步包含另外的混杂T细胞表位。 海洋粘着杆菌（Tenacibaculum maritimum)(先前称为海洋纤维菌（Cytophaga marina)、海岸屈烧杆菌（Flexibacter marinus)和海洋黄杆菌（F. maritimus))是 海洋鱼类的屈烧杆菌病（flexibacteriosis)的病原体，并属于细菌的黄杆菌科家族 (Wakabayashi 等人，1986 ;Bernardet 和 Grimont, 1989 ;Sukui 等人，2001)。海洋屈烧杆 菌病（Marine flexibacteriosis)广泛分布于欧洲、日本、北美和澳大利亚的养殖和野生 的鱼中（McVicar和White, 1979, 1982)。在养殖鱼中，该疾病已被报道见于大菱鲆、鳎目鱼 (sole)、金头海鯛、石斑鱼、红鯛、黑鯛（黑鳍棘鯛（Acanthopagrus schlegeli))、比目鱼和 鞋科鱼中。 尽管成年鱼和幼鱼均可受海洋屈挠杆菌病的影响，但较年轻的鱼罹患该疾病的较严重 形式。已报道，该疾病的流行性和严重性在较高温度下增加。除水温外，该疾病还受多种环 境因素（应激）和与宿主相关的因素（皮肤表面状况）影响。通常，受影响的鱼具有受侵 蚀且出血的口、溃疡性皮肤损伤、磨损的鳍和烂尾。也可以形成累及不同内脏器官的全身性 疾病。鱼上皮表面的缺损（这种疾病的典型特征）也是其他细菌或寄生病原体的侵入口。 为了在商业上有用，当鱼用疫苗通过实用方法例如将鱼浸泡于含有疫苗的水中而施用 时，该疫苗必须能够赋予对抗病原体的保护性免疫。需要对鱼进行个别处理的疫苗接种方 案（如通过注射）对许多商业水产养殖操作来说并不实用。 Cain等人的美国专利公开号2008/0317781声称，"已经尝试使用嗜冷黄杆菌以杀死的 细菌进行免疫，并且采用杀死的细菌通过浸泡或通过注射而获得的保护是微乎其微的"。因 此，Cain等人设计了嗜冷黄杆菌的新的减活过程，该过程据称通过浸泡技术产生了有效的 免疫。 然而，迄今为止，并不存在基于亚单位抗原，特别是含有重组抗原的有效的商业浸泡疫 苗。鉴于Cain等人提出的关于难以生产含有杀死的细菌的免疫原性浸泡疫苗的考虑，亚单 位浸泡疫苗很可能会面临更大的挑战。在此背景下，申请人开始了开发亚单位浸泡疫苗的 艰巨任务。
【发明内容】
令人惊讶地，申请人已发现：亚单位抗原事实上可用于浸泡疫苗中以保护鱼对抗细菌 和病毒感染。因此，本发明的一个实施方案提供了鱼用浸泡疫苗，其包含至少一种分离的抗 原。更具体地，该抗原是重组抗原。 在另一个实施方案中，所述抗原来自细菌。更具体地，该抗原来自黄杆菌科。又更具体 地，该黄杆菌科选自柱状黄杆菌（F. columnare)、嗜冷黄杆菌（F. psychrophilum)和海洋粘 着杆菌（T. maritimum)。在另一个实施方案中，该黄杆菌科是嗜冷黄杆菌。在另一个实施方 案中，该疫苗对柱状黄杆菌和/或海洋粘着杆菌中的至少一种提供交叉保护。 在另一个实施方案中，分离的抗原是组蛋白样蛋白质。在另一个实施方案中，该抗原与 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6 或 SEQ ID N0:7 的氨基酸序列具有至少 70%的同 一性。在另一个实施方案中，该抗原包含具有SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或 SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列或与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列具有 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 5%同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽，或其片段。在另一个实施方案中，该抗原与T 细胞表位融合。在另一个实施方案中，该抗原由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列或与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 同一性的核苷酸序 列编码。 在另一个实施方案中，所述抗原来自病毒。更具体地，该抗原来自传染性胰坏死病毒 (IPNV)。更具体地，该IPNV抗原是VP2蛋白质。在一些实施方案中，该VP2蛋白质是分离 的重组抗原，其可以是全长VP2蛋白质的片段。在一些实施方案中，该重组VP2抗原与SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有至少70%的同一性。在另一个实施方案中，该抗原包含具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或与SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有50%、60%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽，或 其片段。 在另一个实施方案中，所述组合物包含至少两种不同的分离的抗原。更具体地，至少两 种分离的抗原是IPNV抗原和嗜冷黄杆菌抗原。在一个实施方案中，该组合物包含如SEQ ID N0:9或与SEQ ID N0:9同源的氨基酸序列中的融合蛋白中的两种分离的抗原。 在另一个实施方案中，所述疫苗基本上由重组抗原组成。在另一个实施方案中，该疫苗 不包含减毒活病原体或灭活病原体。 本发明的另一个实施方案提供了至少一种另外的物剂（agent)。更具体地，所述至少 一种另外的物剂是菌苗，或者减毒活病毒或灭活病毒。在另一个实施方案中，至少一种另 外的物剂是佐剂。在另一个实施方案中，所述另外的物剂选自嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)、杀鞋气单胞菌（Aeromonas salmonicida)、焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescen)、暢弧菌（Vibrio anguillarum)、杀鞋弧菌（Vibrio salmonicida)、鞋鱼肾杆 菌（Renibacterium salmoninarum)、传染性造血组织坏死病毒（IHNV)、传染性鞋鱼贫血病 毒（ISAV)、特别是胰腺疾病病毒（PDV)、鲑鱼甲病毒（SAV)、鲑鱼痘病毒和病毒性出血性败 血症病毒（VHSV)。 本发明的另一个实施方案提供了针对病原体对鱼进行免疫的方法，该方法包括将鱼浸 泡在如本文所述的疫苗中。更具体地，该疫苗包含重组嗜冷黄杆菌抗原和重组IPNV抗原。 另一个实施方案提供了包含浸泡疫苗的药物的制备，该药物用于治疗或预防来自鱼病 原体的感染。 通过下文阐述的【具体实施方式】以及所附的权利要求，本发明的这些以及其他实施方 案、特征和优势将会变得明显。应当理解，前述和以下实施方案中的各个方案可合并成一个 实施方案。 序列表的简要说明 SEQ ID NO: 1是编码来自海洋粘着杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP)的核苷酸序列。 SEQ ID N0:2是在SEQ ID N0:1中编码的、来自海洋粘着杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP) 的氨基酸序列。该氨基酸序列可与T细胞表位融合，以增强免疫原性。 SEQ ID N0:3是编码来自柱状黄杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP)的核苷酸序列。 SEQ ID N0:4是在SEQ ID N0:3中编码的、来自柱状黄杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP)的 氨基酸序列。该氨基酸序列可与T细胞表位融合，以增强免疫原性。 SEQ ID N0:5是编码来自嗜冷黄杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP)的核苷酸序列。 SEQ ID N0:6是在SEQ ID N0:5中编码的、来自嗜冷黄杆菌的组蛋白样蛋白质（HLP)的 氨基酸序列。该氨基酸序列可与T细胞表位融合，以增强免疫原性