免疫原性组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含艰难梭状芽抱杆菌（CYiosirii/itt? C i/i/fici/e)多 肽和不含铝的佐剂的免疫原性组合物。本发明还涉及疫苗组合物，以及本发明的疫苗和免 疫原性组合物在预防或治疗或制备药物中的用途。
[0002] 背景 艰难梭状芽孢杆菌是医院肠道感染的最重要原因并且是人中假膜性结肠炎的主要原 因（Bartlett等人Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl: 2521-6 (1980))。感染艰难梭状芽抱杆 菌的个体的总体相关死亡率在诊断的3个月内计算为5. 99%，并且更高的死亡率与高龄相 关，在超过80岁的患者中为13. 5% (Karas等人/otfraa/ o/561:1-9 (2010))。 目前对艰难梭状芽孢杆菌感染的治疗是施用抗生素（甲硝唑和万古霉素），然而，已经存 在对这些抗生素具有抗性的菌株的证据（Shah等人.，Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5)，555 - 564 (2010))。因此，存在对能够诱发针对艰难梭状芽孢杆菌的抗体和/或保 护性免疫应答的免疫原性组合物的需求。
[0003] 艰难梭状芽孢杆菌的肠毒性主要由于毒素 A( "ToxA"）和毒素 B( "ToxB"）两种 毒素的作用。毒素 A和毒素 B的C端结构域包含重复单位，例如毒素 A的C端结构域由连 续的重复单位构成（Dove等人Infect. Immun. 58:480-499 (1990))。由于这一原因，C端 结构域也可以称为"重复结构域"。如Ho等人（PNAS 102:18373-18378 (2005))中描述， 这些重复部分可以进一步分为短重复（SRs)和长重复（LRs)。
[0004] 已经描述了包含来自艰难梭状芽孢杆菌的抗原的免疫原性组合物。W096/12802和 W000/61762 和 Lyerly 等人（Current Microbiology 21:29-32 (1990))涉及毒素 A 的片 段，特别是C端结构域的片段，其用于诱导仓鼠中的保护性免疫应答。W09920304涉及通过 在甲醛中孵育灭活的共同纯化的毒素 A和毒素 B的混合物。W000/61762涉及包含艰难梭状 芽孢杆菌的毒素 A和毒素 B的全长C端结构域或C端结构域的片段的免疫原性组合物。类 似地，W02012/163817、W02012/163811和W02012/163810提供毒素 A和毒素 B的可能的片 段以及其融合蛋白的公开内容。
[0005] 需要具有改进的免疫原性的新组合物或疫苗。作为一种策略，已经用佐剂尝试和 改进针对任何给定抗原产生的免疫应答。例如，W02009035707描述了包含艰难梭状芽孢杆 菌毒素 A和B的类毒素以及佐剂诸如氢氧化铝化合物的组合物。
[0006] 以前已经公开了含有脂多糖和皂树（Quillaja)皂苷的组合的佐剂，例如，在 EP0671948中。水包油乳剂自身在本领域众所周知，已表明可用作佐剂组合物（EP 399843; WO 95/17210)〇
[0007] 仍然需要提供针对艰难梭状芽孢杆菌的合适的免疫应答的疫苗和免疫原性组合 物。
[0008] 概述 在一个方面，本发明涉及包含多肽和佐剂的免疫原性组合物，所述多肽包含艰难梭状 芽孢杆菌（C 毒素 A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素 B片段，且所述佐剂包 含以脂质体的形式呈现的免疫活性皂苷级分。免疫学活性皂苷级分可以是QS21，且脂多糖 可以是3D-MPL。合适地，免疫原性组合物可以包含约50 Pg 3D-MPL和约50 Pg QS21。 [0009] 在一个方面，本发明涉及包含多肽和佐剂的免疫原性组合物，所述多肽包含艰难 梭状芽孢杆菌毒素 A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素 B片段，且所述佐剂包含水包油乳 剂，其中所述水包油乳剂包含可代谢油、母育酚和乳化剂。可代谢油可以以约5. 35 mg的量 存在。母育酚可以以约5. 94 mg的量存在。合适地，乳化剂可以以约2. 425 mg的量存在。 合适地，可代谢油是角鲨烯，母育酚是α -生育酚，且乳化剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油 酸酯。
[0010] 合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含艰难梭状芽孢杆菌毒素 A 重复结构域片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素 B重复结构域片段，且引发中和毒素 A和毒素 B 的抗体。在本发明的进一步实施方案中，免疫原性组合物包含艰难梭状芽孢杆菌毒素 A片 段和艰难梭状芽孢杆菌毒素 B片段，其中所述片段中的一种是N端片段，而另一种是重复结 构域片段。
[0011] 合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:23、SEQ ID Ν0:25 或SEQ ID NO:27的多肽变体。
[0012] 合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含含有SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID N0:31、SEQIDN0:32、SEQIDN0:33、SEQIDN0:34或SEQIDN0:35的多肽或任何这些序 列的变体或片段。
[0013] 根据本发明的免疫原性组合物可以包含额外抗原，诸如衍生自细菌的抗原，所 述细菌选自肺炎链球菌?OCOCCwiS /7/751 /7/7、流感嗜血杆菌 {Haemophilus influenzae, H influenzaS).、激猿炎奈录氏儀{Neisseria meningitidis, N. meningi tidis) > M If IMl {Escherichia coli, E. coll) > "itk ^ IMl {Moraxella catarrhal is，M_ cattarhali^)、德光i JA欺歇育袍於售[{Clostridium tetani，C_ tetani)、 白喉棒状杆菌t/ipiAerieriae, C t/ipiAerieriae)、百日咳博代 氏杆菌W1S1Si1S,汉 W1S1Si1S)、表皮葡萄球菌（5?<3/成r/ococciAs epidermidis, 51 、肠球菌和金黄色葡萄球菌aareiAs, S. aureus) 0
[0014] 在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋 形剂的疫苗。
[0015] 在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗在治疗或预防艰难 梭状芽孢杆菌疾病中的用途。
[0016] 在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预 防艰难梭状芽孢杆菌疾病。
[0017] 在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或 预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的药物中的用途。
[0018] 在一个方面，本发明涉及预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌疾病的方法，其包括将根 据本发明的免疫原性组合物或疫苗施用于受试者。
[0019] 附图简述 图1 -显示用佐剂A ;佐剂A无 QS21和佐剂A无 MPL配制的F2免疫的仓鼠的抗ToxA 和抗ToxB ELISA结果的图。
[0020] 图2 -显示用未佐剂化的F2或用佐剂A、佐剂B和明矾配制的F2免疫的仓鼠的 抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0021] 图3 -用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫 的雄性和雌性仓鼠的第1次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0022] 图4 -用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫 的雄性和雌性仓鼠的第II次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0023] 图5 -在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫 的雄性和雌性仓鼠的第III次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0024] 图6 -在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫 的雄性和雌性仓鼠的第III次免疫后第87天血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0025] 图7 -在第1、11和III次免疫后血清上，在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配 制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0026] 图8 -显示用混合物（ToxA+ToxB)或用明矾或佐剂A中配制的F2融合蛋白免疫 的雄性和雌性仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。
[0027] 图9 -显示用佐剂B中配制的毒素 A的C端的片段（aa 2387-2706)、毒素 B的C 端的片段（aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxA免疫原性的图。
[0028] 图10 -显示用佐剂B中配制的毒素 A的C端的片段（aa 2387-2706)、毒素 B的 C端的片段（aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的血细胞凝集抑制的图。
[0029] 图11 -显示用佐剂B中配制的毒素 A的C端的片段（aa 2387-2706)、毒素 B的 C端的片段（aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxB免疫原性的图。
[0030] 图12 -来自用佐剂B中配制的毒素 A的C端片段（aa 2387-2706)、毒素 B的C 端片段（aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠的细胞毒性抑制滴度。
[0031] 图13 -显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、G54New或F5 ToxB融合体免 疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图。
[0032] 图14 -显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免 疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图。
[0033] 图15 -显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免 疫的小鼠的血细胞凝集抑制的图。
[0034] 图16 -显示来自用佐剂B中配制的？2、？52恥￥、？54617、？54他￥或？51'(?8融合 体免疫的小鼠的HT29细胞中的细胞毒性滴度的图。
[0035] 图17 -显示来自用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合 体免疫的小鼠的IMR90细胞中的细胞毒性滴度的图。
[0036] 图 18 -用艰难梭状芽孢杆菌 ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白（未佐剂化的）免疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图。
[0037] 图 19 -用艰难梭状芽孢杆菌 ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白（未佐剂化的）免疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图。
[0038] 图20 -用佐剂B中配制的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、 ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白免疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图：第II次免 疫后、第III次免疫后、加强前、第IV免疫后血清。
[0039] 图21 -用佐剂B中配制的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、 ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白免疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图：第II次免 疫后、第III次免疫后、加强前、第IV免疫后血清。
[0040] 图22 -描述使用圆二色性测量的融合体2、3、4和5的远UV谱的图。融合体2的 谱用具有表示为小矩形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为小菱形的点的线表示， 融合体4用具有表示为圆形的点的线表示，并且融合体5用具有表示为十字形的点的线表 不O
[0041] 图23 -描述使用圆二色性测量的融合体2、3、4和5的近UV谱的图。融合体2的 谱用具有表示为十字形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为圆形的点的线表示，融 合体4的谱用具有表示为三角形的点的线表示，并且融合体5的谱用具有表示为小菱形的 点的线表示。
[0042] 图24 -描述使用圆二色性测量的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的远 UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三 角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示，并且F5ToxB用具有表示为十 字形的点的线表示。
[0043] 图25 -描述使用圆二色性测量的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的近 UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三 角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示，并且F5ToxB用具有表示为十 字形的点的线表示。
[0044] 详述 本发明人已经显示，包含含有用不含铝的佐剂、特别是佐剂诸如本文所述的佐剂A和 佐剂B配制的艰难梭状芽孢杆菌毒素 A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素 B片段的多肽的 免疫原性组合物提供与含有未佐剂化的艰难梭状芽孢杆菌多肽的组合物相比改善的免疫 应答。根据本发明的免疫原性组合物还可以提供与用明矾配制的艰难梭状芽孢杆菌多肽相 比改善的针对艰难梭状芽孢杆菌的免疫应答。
[0045] 多肽 包含艰难梭状芽孢杆菌毒素 A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素 B片段的多肽可以包 含已经合适地通过在甲醛中孵育灭活的纯化的毒素 A或毒素 B，诸如W09920304中描述的那 止匕 -、〇
[0046] 所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌毒素 A N端片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素 B 重复结构域片段。所述多肽可以含有艰难梭状芽孢杆菌毒素 A重复结构域片段和艰难梭状 芽孢杆菌毒素 B N端片段。所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌毒素 A重复结构域片段和 艰难梭状芽孢杆菌毒素 B重复结构域片段。
[0047] 所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌的毒素 A和毒素 B的全长N端和/或C端结 构域或其片段。
[0048] 在一个实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物中的多肽不含有艰难梭状芽孢 杆菌的毒素 A和/或毒素 B的全长N端结构域。在一个实施方案中，根据本发明的免疫原 性组合物中的多肽不含有艰难梭状芽孢杆菌的毒素 A和/或毒素 B的N端结构域片段。
[0049] 所述多肽可以是融合蛋白。例如，所述融合蛋白可以包含融合序列，诸如Seq ID N0:36和37或W02012/028741中描述的其它序列。
[0050] 所述多肽可以包含第一片段和第二片段，其中 (i) 所述第一片段是毒素 A重复结构域片段； (ii) 所述第二片段是毒素 B重复结构域片段； (iii) 所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端； (iv) 所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且 其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二 重复部分具有结构相似性。
[0051] 术语多肽是指氨基酸的连续序列。
[0052] 术语"毒素 A重复结构域"是指包含重复序列的来自艰难梭状芽孢杆菌的毒素 A蛋 白的C端结构域。例如，毒素 A蛋白的C端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255) 的毒素 A的氨基酸1832-2710和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 A的氨基酸1832-2710对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸1832-2710。
[0053] 术语"毒素 B重复结构域"是指来自艰难梭状芽孢杆菌的毒素 B蛋白的C端结构 域。例如，毒素 B蛋白的C端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 B的氨 基酸1834-2366和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的 毒素 B的氨基酸1834-2366对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸1834-2366。
[0054] 毒素 A的全长N端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 A的氨 基酸1-542和/或它们在不同菌株中的等价物。因此，术语"艰难梭状芽孢杆菌毒素 A N端 片段"或"毒素 A的N端结构域片段"是指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 A的氨 基酸1-542的片段和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255) 的毒素 A的氨基酸1-542对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸1-542。
[0055] 毒素 B的全长N端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 B的氨 基酸1-543和/或它们在不同菌株中的等价物。因此，术语"艰难梭状芽孢杆菌毒素 B N端 片段"或"毒素 B的N端结构域片段"是指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素 B的氨 基酸1-543的片段和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255) 的毒素 B的氨基酸1-543对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸1-543。
[0056] 艰难梭状芽孢杆菌毒素 A和B是保守蛋白。然而，该序列在菌株间有少量差别。此 外，不同菌株中的毒素 A和B的氨基酸序列可能在氨基酸的数量上有所不同。
[0057] 在一个实施方案中，毒素 A重复结构域和/或毒素 B重复结构域可以是这样的序 列，其是与SEQ ID N0:1的氨基酸1832-2710具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一 性的变体或与SEQ ID N0:2的氨基酸1834-2366具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列 同一性的变体。
[0058] 在一个实施方案中，毒素 A N端结构域可以是作为与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-542 具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体的序列。在一个实施方案中，毒素 B N端结构域可以是作为与SEQ ID N0:2的氨基酸1-543具有至少90%、95%、98%、99%或100% 序列同一性的变体的序列。
[0059] "变体"是通过保守性氨基酸取代（由此，残基由具有相同物理化学性质的另一个 残基所取代）而与参照多肽有所不同的多肽。通常这样的取代在Ala、Val、Leu和Ile之 间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间，并在碱性残基Lys 和Arg之间；或在芳香族残基Phe和Tyr之间。
[0060] 此外，在来自一种菌株的毒素 A (或毒素 B)与来自另一种菌株的毒素 A (或毒素 B)的C端结构域或N端结构域之间，氨基酸编号可以有所不同。由于这一原因，术语"不 同菌株中的等效物"是指，对应于参考菌株（例如艰难梭状芽孢杆菌VPI10463)的那些，但 发现于来自不同菌株的毒素中并且可能因此而编号不同的氨基酸。可以通过比对来自不 同菌株的毒素的序列来确定"等效物"氨基酸的区域。全文中提供的氨基酸编号是指菌株 VPI10463的编号。
[0061] 术语多肽或蛋白的"片段"是指来自该多肽或蛋白的连续部分，诸如至少100、150、 180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580 或 600 个氨基酸。
[0062] 艰难梭状芽孢杆菌的"毒素 A的N端结构域片段"是指来自毒素 A的全长N端结 构域的连续部分，诸如至少 100、150、180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500 或 530个氨基酸。艰难梭状芽孢杆菌的"毒素 B的N端结构域片段"是指来自毒素 B的全长 N 端结构域的连续部分，诸如至少 100、150、180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、 500或530个氨基酸。
[0063] 毒素 A重复结构域片段可以是来自毒素 A重复结构域的至少100、200、230、250、 300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨