苗或试剂盒。在一个实施方案中，提供用于治疗或预防 艰难梭状芽孢杆菌疾病的原发性和/或复发事件的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试 剂盒。
[0146] 本发明的进一步的方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制造用于 治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供用于制造用 于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的原发性和/或复发事件的药物的本发明的免疫原 性组合物或疫苗或试剂盒。
[0147] "艰难梭状芽孢杆菌疾病"是指由艰难梭状芽孢杆菌释放的毒素引起的任何感染 或疾病。艰难梭状芽孢杆菌疾病的实例是抗生素相关的腹泻（AAD)、伪膜性结肠炎和中毒性 巨结肠症，其可以是威胁生命的。
[0148] 将"左右"或"大约"定义为关于本发明的目的的给定数值的10%或多或少之内。
[0149] 在每一种情况下，本发明人意在本文的术语"包含（comprising) "、"包含 (comprise) "和"包含（comprises) "可以任选地分别被术语"由......组成（consisting of)"、"由……组成（consist of)"和"由……组成（consists of)"所替换。术语"包含 (comprises)"表示"包括（includes)"。因此，除非上下文另外需要，将理解词语"包含 (comprises) "及变式诸如"包含（comprise) "和"包含（comprising) "意指包括陈述的化合 物或组合物（例如核酸、多肽、抗原）或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其他的化 合物、组合物、步骤、或其组。缩写"例如（e. g )"来源于拉丁文例如（exempli gratia)，并 用于本文以表示非限定性实例。因此，缩写"例如（e.g.) "与术语"例如（for example)" 同义。
[0150] 本文中涉及本发明的"疫苗"的实施方案也适用于涉及本发明的"免疫原性组合 物"的实施方案，并且反之亦然。
[0151] 除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学中普通术语的定义可以见于Benjamin Lewin，K Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等人· (eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (ed·)， Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0152] 除非上下文明确另有说明，单数术语"一个（a) "、"一个（an) "和"该（the) "包括 复数指示物。类似地，除非上下文明确另有说明，词语"或"旨在包括"和"。术语"复数"是 指两个或更多。还应理解对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量 (molecular weight)或分子量（molecular mass)值均是估算值，并且提供用于说明。此 外，关于物质（诸如多肽抗原）的浓度或水平给出的数值界限可以是近似的。
[0153] 本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请以其整体通过引用并入本文。
[0154] 下文记载的这些实施例仅用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本 发明的范围。
[0155] 将理解的是，本文描述的特定方面和实施方案通过说明的方式而不是作为本发明 的限制来显示。本发明的主要特征可以在各种实施方案中采用，而不脱离本发明的范围。本 领域技术人员将认识到或者能够使用常规研宄确定本文所述的特定方法的许多等同方案。 此类等同方案被视为在本发明的范围内，并且被权利要求所覆盖。
[0156] 本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明本发明涉及的本领域技术人员的 技能的水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物或专 利申请被具体且单独地指明通过引用并入。本文中提到的所有文件都在可允许的最大程度 上通过引用并入。
[0157] 当与权利要求和/或说明书中的术语"包含"结合使用时使用词语"一个/种（a) " 或"一个/种（an)"意指" 一个/种（one) "，但它也与" 一个/种或多个/种（one or more) "、 "至少一个 / 种（at least one) " 和"一个 / 种或多于一个 / 种（one or more than one) " 的含义一致。
[0158] 本发明将参考以的非限制性图表和实施例进一步描述。 实施例
[0159] 实骀中伸用的佐剂： 佐齐1| A 具有50 Pg以脂质体的形式呈现的QS21、50 Pg 3D-MPL、0.25 mg胆固醇和LO mg D0PC/0. 5ml剂量的佐剂。适合于免疫仓鼠的50μ1的剂量含有5yg QS21、5yg 3D-MPL、 0· 025mg 胆固醇和 0· Img D0PC。
[0160] 佐剂 B 由具有0.125 mL SB62乳剂（总体积）、5. 35 mg角鲨烯、5. 94 mg DL-α-生育酚和 2. 425 mg聚山梨醇酯80/0. 5ml剂量的水包油乳剂组成的佐剂。50 μ 1剂量含有0. 0125ml SB62乳剂（总体积）、0.535mg角鲨烯、0.594mg DL-α生育酚和0.2425 mg聚山梨醇酯80。
[0161] 佐剂 C 具有25 Pg以脂质体的形式呈现的QS21、25 Pg 3D-MPL、0.25 mg胆固醇和LO mg DOPC 的佐剂。50 μ 1 剂量含有 2. 5 μ g QSl'、2· 5 μ g 3D-MPL、0. 025mg 胆固醇和(λ Img D0PC。
[0162] GSK佐剂 AS04D 具有50 u g MPL和0. 5mg (总共Al3i) /0. 5ml剂量的佐剂。50 u 1的剂量含有5 u g MPL 矛口 50 μ g (总共 AL3i)。
[0163] 日月矾 具有500 Ug氢氣化铝/0.5ml剂量的佐剂。话合于仓鼠免痔的50 Ul的剂量含有 50 μ g/50 μ
[0164] 方案 抗ToxA和抗ToxB ELISA应答：实施例2至4、7和8的方案 将磷酸盐缓冲盐水（PBS)中2 Pg/ml (对于ToxA)或I Pg/ml (对于ToxB)的ToxA 或ToxB片段（对于实施例2和4 - ToxA (2121-2686)和ToxB (1968-2366)，对于实施 例 3、5、6、7 和 8 - ToxA (2387-2706)和 ToxB (1750-2360))在 4°C在高结合微量滴定板 (Nunc MAXIS0RP?)上包被过夜。将板在室温在摇动的情况下用PBS+1%牛血清白蛋白（BSA) 封闭30分钟。将仓鼠或小鼠血清在PBS-BSAO. 2%-TWEEN? 0. 05%中1/100 (对于剂量I 后或剂量II后样品）或1/500 (对于剂量III后样品）预稀释，然后，在微孔板中进行2 次进一步两倍稀释，且在室温（RT)孵育30分钟。洗涤后，结合的仓鼠或小鼠抗体使用在 PBS-BSA0. 2%-tween 0· 05% ("检测抗体"）中 1:5000 稀释的 Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的抗小鼠（ref: 110-035-003)或抗仓鼠（ref: 107-035-142)检测。 检测抗体在20°C在摇动的情况下孵育30分钟。使用4 mg邻苯二胺（OPD) + 5 μL H2O2ZlO ml pH 4.5 0.1 M柠檬酸缓冲液在黑暗中在室温显色15分钟。用50 μL HCl停止反应，且读 取在490 nm相对于620 nm的光学密度（OD) 〇
[0165] 每个个别血清中存在的抗ToxA或抗ToxB抗体的水平通过与添加至各板的参考血 清（针对Jackson Global IgG校准）的比较来确定，并且以Pg/ml表示。对于仓鼠或小鼠 免疫的各处理组中的样品，使用Excel软件计算几何平均滴度GMT。
[0166] 实施例1 五种艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合蛋白的设计 设计包含ToxA和ToxB的C端重复结构域的片段的融合蛋白（也称为"融合体")。这 些融合蛋白包含ToxA的C端重复结构域的片段和ToxB的C端重复结构域的片段，和ToxA 片段的C端与ToxB片段的N端之间的连接。设计两种策略，在第一种策略中；设计融合体 从而在两条片段之间的连接处保持长螺线管结构。在第二种策略中，融合体的两条片段由 接头分隔开，以允许它们独立的正确折叠。
[0167] ToxA和ToxB的C端部分由重复序列构成：短重复（SR)和长重复（LR) (PNAS 2005 vol 102 : 18373-18378)。
[0168] 已描述了 ToxA的C端结构域的部分已知的3D结构（PNAS 2005 Greco等人.， vol 102 : 18373-18378 ; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5): 460-461 ; PDB codes : 2F6E, 2G7C and 2QJ6)〇
[0169] 本发明人预测在ToxA和ToxB的C端部分的残基之间存在两种重要的相互作用。 第一种相互作用发生包含在LR及其在前的SR中的残基之间，并且对于维持螺线管类结构 是重要的。第二类相互作用发生包含在LR和随后的SR中的残基之间，并且该相互作用介 导毒素的碳水化合物结合功能。
[0170] 定义新的"结构-功能"重复SR-LR-SR。该重复的结构在设计的融合体中保持完 整。
[0171] ToxA和ToxB重复的短重复（SR)和长重复（LR)的位置显示于表1中。
[0172] ToxA和ToxB的C端结构域中包含的"SR-LR-SR"盒的列表显示于下表2中。
[0173] 最后，两个LRs之间的SRs数目维持在设计的融合体中，以保持长螺线管类结构。
[0174] 在设计用于融合体的连接之前，定义两种工作假设：第一种假设，融合体越短，融 合体在表达过程中稳定的可能性越大；第二种假设，根据"SR-LR-SR"盒的概念，必须选择 起始位置以确保该之前定义的SR-LR-SR盒的第一个SR的正确折叠。因此，融合体在位于 SR-LR-SR盒之前的SR的起始处起始。使用这两种假设，分析了三个起始位置：ToxA的残基 2370、2234 和 2121。
[0175] 排除了起始位置2370。由于涉及对于蛋白结构稳定性重要的相互作用的残基之一 不是保守的，所以还排除了起始位置2234。因此，决定所有设计的融合体将在ToxA的残基 2121处起始。
[0176] 所有融合体将在ToxB的最后一个残基处结束。
[0177] 设计四个融合体（F1-4)以维持在两个融合片段之间的长螺线管类结构中的完整 融合。
[0178] 使用相同的假设设计融合体I(Fl)和2 (F2)。已经使用多重比对软件比较了 ToxA 和 ToxB 的所有 SR 蛋白序列（ClustalW - Thompson JD 等人· （1994) Tfes.，22，4673-4680)。更相似的序列为ToxA的第三个SR VIII和ToxB的第三个SR II 和ToxB的第三个SR III。为了在ToxB的这两个SR之间做出选择，使用部分的ToxA C端 结构域的已知3D结构（PDB代号：2QJ6)在ToxB的C端部分上进行结构同源性建模（使用 SwissModel 界面-Arnold K等人.（2006) 22，195-201)。使用 ToxA 的 第三个SR VIII，用ToxB的第三个SR II获得了最佳局部结构叠加（使用SwissPDBViewer 进行-Guex N 等人.（1997)，18，2714-2723)。因此，设计了两个连 接：第一个在ToxA的第三个SR VIII和ToxB的第四个SR II之间（Fl)，并且第二个在ToxA 的第二个SR VIII和ToxB的第三个SR II之间（F2)。
[0179] 为了设计融合体3 (F3)，在ToxA的部分C端结构域的已知结构和ToxB的C端结 构域的预测结构之间进行整体结构叠加（使用SwissModel和SwissPDBViewer软件）。在 ToxA的LR VII和ToxB的LR II之间发现最佳叠加。因此，决定在该类似的LR中产生连 接。首先在其中ToxA和ToxB之间的序列是保守的区域中进行连接，随后为了保持融合体 的ToxA部分，残基与在前的SR相互作用，并且最后，为了保持ToxB部分，残基与随后的SR 相互作用。
[0180] 对于融合体4 (F4)的设计，将ToxB的C端结构域分为4个片段并且在它们上进行 更精确的同源性建模（SwissModel)。实现该分裂（split)以保持"SR-LR-SR"盒完整（每 一结构域在跟随LR的SR的末端处结束）。进行这些片段的预测结构和ToxA的已知3D结 构之间的结构叠加，并且对于ToxB的第三个SR (SR I)和ToxA的最后一个SR (第三个SR VIII)获得了最佳结构叠加。因此，在ToxA的第二个SR VIII和ToxB的第三个SRI之间完 成了连接。
[0181] 设计最后一个融合体（F5)以允许融合体的两个片段的独立的正确折叠。在ToxA 蛋白序列的最后一个残基和ToxB的第四个SR II的起始之间添加接头（始终考虑完整的 "SR-LR-SR"盒的重要性）。添加仅一个外源残基（甘氨酸）作为接头并且位于两个现存的 甘氨酸之间。因此，还可以将接头描述为由已知的（对于ToxA)和预测的（对于ToxB) β 链环绕的3个甘氨酸构成。
[0182] 实施例2 用F2融合蛋白免痔仓鼠：佐剂Α、无 QS21的佐剂A或无 MPL的佐剂Α，和与佐剂Β、明 矾或未佐剂化制剂的比较。
[0183] 16只仓鼠（雄性和雌性的混合）的组在第0、14和28天用50 μ 1佐剂Α、无 MPL 的佐剂Α、无 QS21的佐剂Α、佐剂Β、明矾佐剂化或未佐剂化的1 μ g F2融合蛋白IM免疫。
[0184] 在第41/42天（第III次免疫后）收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA 滴度。结果描述于表3和4和图1和2。
[0185] 表3: ELISA抗ToxA:个体第42天血清h的浓度&g/ml)
CI=置信区间 St Dev=标准偏差。
[0186] 表4: ELISA抗ToxB:个体第42天血清h的浓度&g/ml)
[0187] 图 1 和2 图1的结果： F2用全佐剂A、无 QS21的类似制剂或无 MPL的类似制剂注射。
[0188] 对于抗ToxA响应，MPL和QS21两者均具有附加价值，即使QS21似乎是最有效的。
[0189] 对于抗ToxB响应，MPL的作用不太明显的，而QS21去除对IgG滴度具有激烈作用。
[0190] 图2的结果： 关于佐剂比较，与明矾、佐剂B或未佐剂化的制剂相比，佐剂A诱导显著更高的抗ToxA 和抗ToxB抗体。与未佐剂化的制剂相比，佐剂B诱导更高的抗ToxA和抗ToxB抗体。
[0191] 实施例3 Pims 20110544 -用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范闱 免痔雄件仓鼠 10只雄性仓鼠的组在第0、14和28天用50 μ 1剂量的佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C 佐剂化的0. 3 Pg、1 μ g或3 Pg的F2融合蛋白頂免疫。
[0192] 从第13天（第1次免疫后）、第27天（第II次免疫后）、第42天（第III次免 疫后14天）和第84天（第III次免疫后56天）收集的个别血清测量抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。
[0193] Pims 20110545 -用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量 范闱免痔雌件仓鼠 10只雌性仓鼠的组在第0、14和28天用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C佐剂化的0. 3 PgUyg或3 Pg的F2融合蛋白頂免疫。
[0194] 从第13天（第1次免疫后）、第27天（第II次免疫后）、第42天（第III次免 疫后14天）和第84天（第III次免疫后56天）收集的个别血清测量抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。
[0195] 图 3 至7 Pims 20110544和 20110545 表5 :第1次免疫后抗ToxA ELISA滴度（几何平均滴度或GMT)
[0196] 表6 :第1次免疫后抗ToxB ELISA滴度（GMT)
[0197] 表7 :第II次免疫后抗ToxA ELISA滴度（GMT)
[0198] 表8 :第II次免疫后抗ToxB ELISA滴度（GMT)
[0199] 表9 :第III次免疫后第42天抗ToxA ELISA滴度（GMT)
[0200] 表10 :第III次免疫后第42天抗ToxB ELISA滴度（GMT)
[0201] 表11 :第III次免疫后第84天抗ToxA ELISA滴度（GMT)
[0202] 表12 :第III次免疫后第84天抗ToxB ELISA滴度（GMT)
[0203] 实施例4 Pims 20120011和20120008 -用明帆、佐剂A中配制的或未佐剂化的F2融合蛋白或 毒素 A和毒素 B片段的混合物免痔仓鼠。
[0204] 8只雌性和8只雄性仓鼠的组在第0、14和28天用明矾、佐剂A中配制的或未佐 剂化的I Kg F2融合蛋白、具有多His标签的F2融合体（F2-His标记的）或C-terToxA (2387_27〇6) (0· 6Pg)+C-terToxB (I75O-236O) (0.4Pg)的混合物 IM 免疫。
[0205] 在第13天、第27天和第42天（第III次免疫后）收集的个别血清中测定抗ToxA 和抗ToxB ELISA滴度。图8 表13
[0206]表 14
几何平均值=几何平均滴度。
[0207] 结果: 在用F2融合蛋白和还有用ToxA和ToxB的混合物免疫后诱导了抗ToxA和抗ToxB抗 体。与其他制剂相比，佐剂A诱导显著更高的ELISA滴度。
[0208] 实施例5 用Tox A或Tox B片段和ToxA-ToxB融合体免痔小鼠 图9至12 Balb/C小鼠用实施例1中描述的构建体免疫。
[0209] 15只雌性Balb/c小鼠的组在第0、14和28天用佐剂B佐剂化的3 μ g或10 Pg ToxA和ToxB (ToxA C-term (2387-2706) (0.6Pg)+C-terToxB (1750-2360)的分别片段以 及ToxA-ToxB融合蛋白頂免疫。10只小鼠的对照组用单独的佐剂B接种。
[0210] 在第42天（第III次免疫后）收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA 滴度。
[0211] 在混合的第III次免疫后血清中测定血细胞凝集抑制滴度。
[0212] 抗ToxA和抗ToxB ELISA应答：方案 将磷酸盐缓冲盐水（PBS)中I Pg/ml (对于ToxB片段）或2 Pg/ml (对于ToxA 片段）的ToxA或ToxB片段的样品在4 °C在高结合微量滴定板（Nunc MAXIS0RP?)上 包被过夜。将板在室温在摇动的情况下用PBS-BSA 1%封闭30分钟。将小鼠抗血清在 PBS-BSAO. 2%-TWEEN? 0. 05%中1/1000预稀释，然后，在微孔板中进行进一步两倍稀释，且 在室温在摇动的情况下孵育30分钟。洗涤后，结合的鼠抗体使用在PBS-BSAO. 2%-tween 0· 05% 中 1:5000 稀释的 Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的 affiniPure山羊抗小鼠 IgG (H+L) (ref: 115-035-003)检测。检测抗体在20°C在摇动的 情况下孵育30分钟。使用4 mg邻苯二胺（OPD) + 5 μL H2O2ZlO ml pH 4.5 0.1 M柠檬酸 缓冲液在黑暗中在室温显色15分钟。用50 μL HCl停止反应，且读取在490 nm相对于620 nm的光学密度（OD)。
[0213] 血清中存在的抗ToxA或抗ToxB抗体的水平通过与参考血清的比较来以中点滴度 表示。对于各处理组中的15个样品（对于对照组为10个样品），计算GMT。
[0214] 血细