组织再生促进剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处 理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分、且用于组织再生促进、细胞分化促进 和/或细胞增殖促进的组合物、包含MMP14抑制物质且用于抑制细胞增殖的组合物、及包含 经MMP14处理的胶原的细胞培养基材等。
【背景技术】
[0002] 生物体的组织如果受到损伤，则会进行再生以修复损伤部分，并恢复其功能。例 如，已知肝脏即使切除一半以上，也会在短时间内再生，恢复大致原本的大小和功能。关于 组织再生的研宄以往重点对肝脏进行，且报告了各种见解，但关于组织再生的详细机制仍 有多个不明之处。认为组织的再生中有多种细胞的复杂参与，但关于这些细胞中的哪一个 承担主要作用，并未得出决定性的见解。
[0003] 通过对利用组织染色或细胞染色等的损伤组织的经时变化、或各种生理活性物 质对组织再生造成的影响等进行解析，组织再生机制逐渐得以阐明。例如，非专利文献 1中示出了如下假说：在小鼠肝部分切除模型中，特定的表型的肝窦内皮细胞提供介由 VEGFR2(血管内皮生长因子-A受体-2)的内皮细胞特异性转录因子Idl的向上调节而引起 肝细胞增殖，接着通过内皮细胞自身增殖，由此进行肝脏的再生。
[0004] 然而，尽管进行了悉心研宄，但组织再生的机制仍仅有极少的部分得以明确，需要 进一步的研宄努力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献 I :Ding et al. ,Nature. 2010Nov 11 ;468 (7321) :310-5
【发明内容】
[0008] 发明要解决的技术问题
[0009] 本发明的目的在于提供一种新型的组织再生促进剂和组织再生促进方法。
[0010] 用于解决技术问题的手段
[0011] 本发明人们为了解决上述课题进行了深入研宄，在此过程中发现活化星状细胞对 于组织的再生发挥了重要的作用、活化星状细胞的分泌物会诱导成为组织再生的核心的干 细胞的增殖和分化、受到活化星状细胞所表达的MMP14的作用的胶原会诱导组织实质细胞 的增殖、以及胶原中存在的RGD序列参与该增殖的诱导，从而完成了本发明。
[0012] SP，本发明涉及以下内容。
[0013] (1) 一种用于促进组织再生的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞 分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。
[0014] (2)根据（1)所述的组合物，其中，组织再生在损害组织或移植组织中发生。
[0015] (3)根据⑵所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起4天以内被投予。
[0016] (4)根据⑵所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起1天以内被投予。
[0017] (5)根据（2)~（4)中任一项所述的组合物，其中，损害选自由组织破坏、炎症、坏 死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭构成的组。
[0018] (6)根据（1)~（5)中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织干细胞的分 化和/或增殖。
[0019] (7)根据（1)~（6)中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织实质细胞的 增殖。
[0020] (8)根据⑴~（7)中任一项所述的组合物，其中，活化星状细胞被实施了使选自 由HGF、EGF、MMP14构成的组中的蛋白质的表达增大的处置。
[0021] (9)根据（1)~（8)中任一项所述的组合物，其是针对具有组织再生受到抑制的状 态的对象来使用。
[0022] (10)根据（9)所述的组合物，其中，组织再生受到抑制的状态是选自由炎症、坏 死、纤维化、器官衰竭、血小板数量减少、基因异常、去甲肾上腺素减少构成的组。
[0023] (11) 一种促进对象的组织再生的方法，其包括将（1)~（10)中任一项所述的组合 物投予至需要其的对象的工序。
[0024] (12) -种用于干细胞分化和/或增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活 化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成 分。
[0025] (13) -种使组织干细胞分化和/或增殖的方法，其包括使选自由活化星状细胞、 活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成 分与干细胞接触的工序。
[0026] (14) 一种用于促进细胞增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细 胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。
[0027] (15) -种使细胞增殖促进的方法，其包括使选自由活化星状细胞、活化星状细胞 分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分与细胞接触 的工序。
[0028] (16) -种用于抑制细胞增殖的组合物，其包含抑制MMP14的物质。
[0029] (17)根据（16)所述的组合物，其中，抑制MMP14的物质所作用的细胞是CAF和/ 或肿瘤细胞。
[0030] (18) -种细胞培养基材，其包含经MMP14处理的胶原。
[0031] (19) 一种细胞培养容器，其由经MMP14处理的胶原被覆。
[0032] 发明的效果
[0033] 根据本发明，不仅能促进生物体内的组织再生，而且还能促进生物体外的组织形 成，因此可期待对生物学、医学作出巨大的贡献。
[0034] 而且，本发明的组织再生的促进在组织再生受到抑制的状况、例如伴有纤维症等 疾病的状况等下尤其有用。
【附图说明】
[0035] 图1是表示对肝部分切除大鼠的处置的流程的图。
[0036] 图2是表示将肝部分切除后第5天和第10天采集的各组的肝脏的外观与肝部分 切除前和刚切除后的肝脏进行比较的图。
[0037] 图3是表示所采集的各组的肝重量的推移的图表。
[0038] 图4是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的荧光显微镜像的图。
[0039] 图5是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的荧光显微镜像中的a -SM阳性TUNEL阳性细胞的数量的图。
[0040] 图6是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经Ki67和DAPI共染色后所得的荧 光显微镜像的图。
[0041] 图7是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经Ki67和DAPI共染色后所得的荧 光显微镜像中的Ki67阳性细胞数量的图。
[0042] 图8是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经⑶133和DAPI共染色后所得的 荧光显微镜像的图。
[0043] 图9是表示对例3的各组实施的处置的概要的图。
[0044] 图10是表示将所采集的各组的肝脏的外观与刚进行肝部分切除后（第0天）的 肝脏进行比较的图。
[0045] 图11是表示将所采集的各组的肝脏的重量与刚进行肝部分切除后（第0天）的 肝脏进行比较的图表。
[0046] 图12是表示肝部分切除后的肝组织中的a -SM阳性细胞的经时变化的图。
[0047] 图13是表示肝部分切除后的肝组织中的a -SMA阳性细胞数量的经时变化的图 表。
[0048] 图14是表示静止型肝星状细胞（上图）和活性型肝星状细胞（下图）的显微镜 像的图。
[0049] 图15是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的显微 镜像的图。
[0050] 图16是表示在干细胞与星状细胞的接触共培养中添加了 EGF和HGF时的GFP/白 蛋白两阳性群落的显微镜像的图。
[0051] 图17是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落数量的 图表。
[0052] 图18是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的面积 的图表。
[0053] 图19是表示干细胞与星状细胞的非接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的面 积的图表。
[0054] 图20是以吸光度表示干细胞与星状细胞的非接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性 细胞数量的增殖的图表。
[0055] 图21是表示肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时变化的显微镜像。
[0056] 图22是表示肝部分切除后的肝组织中的BrdU阳性细胞的比例的经时变化的图 表。
[0057] 图23是表示肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时变化的显微镜像。
[0058] 图24是表示肝部分切除后的肝组织中的BrdU阳性细胞的比例的经时变化的图 表。
[0059] 图25是表示共培养肝细胞与星状细胞时的BrdU阳性肝细胞的显微镜像。
[0060] 图26是表示共培养肝细胞与星状细胞时的BrdU阳性肝细胞的比例的图表。
[0061] 图27是表示在实施了各种处理的胶原上培养肝细胞时的BrdU阳性细胞的显微镜 像。
[0062] 图28是表示在实施了各种处理的胶原上培养肝细胞时的BrdU阳性细胞的比例的 图表。
[0063] 图29是表示共培养肝细胞与已敲减MMP14和/或HGF的星状细胞时的BrdU阳性 肝细胞的显微镜像。
[0064] 图30是表示共培养肝细胞与已敲减MMP14和/或HGF的星状细胞时的BrdU阳性 肝细胞的比例的图表。
[0065] 图31是表示在MMP14处理胶原上、在存在R⑶肽的条件下培养肝细胞时的BrdU 阳性细胞的显微镜像。
[0066] 图32是表示在MMP14处理胶原上、在存在R⑶肽的条件下培养肝细胞时的BrdU 阳性细胞的比例的图表。
【具体实施方式】
[0067] 本发明的一个方面涉及一种用于促进组织再生的组合物，其包含选自由活化星状 细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组 中的成分。
[0068] 活化星状细胞可以通过传代培养从生物体分离出的星状细胞而获得。已知星状细 胞存在于肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺等各种组织中（Zhao and Burt, J Mol Histol. 2007Mar; 38(1) :53-64)，可以利用其中的任一种。星状细胞的分离可以使用已知的任意方法来进行。 肝星状细胞的分离方法的具体例例示于后述的例5(1)中。活化星状细胞的特征在于a SM 的表达，可以将其作为标记物进行分选。
[0069] 活化星状细胞可以被实施了使选自由HGF、EGF、MMP14构成的组中的蛋白质的表 达增大的处置。作为这样处置，并无限定，例如可以列举出将编码所述蛋白质的基因导入活 化星状细胞。编码HGF、EGF和MMP14的基因是已知的，而且基因的导入法也是本技术领域 所熟知的。
[0070] 活化星状细胞分解物可通过利用包含物理性和/或化学性方法的各种方法对活 化星状细胞进行分解而获得。关于分解，可以使用将细胞分解的已知的任意的方法，例如 渗透压冲击法、冷冻熔解法、表面活性剂的使用、酶消化法、超声波处理、弗氏细胞压碎器、 利用研钵的粉碎、利用均化器的破碎、利用玻璃珠的破碎等。分解方法优选不会使蛋白质变 性、或变性程度轻的方法。通过使用这样的方法，可获得在细胞膜上表达的MMP14而不会损 及其功能。而且，活化星状细胞分解物优选含有细胞膜成分。
[0071] MMP14(也称为MT1-MMP)是在细胞膜上表达的MMP。MMP14可以作用于胶原I。通 过本发明人可知，MMP14对胶原I的作用与细胞的增殖有很深的关系。
[0072] 本发明的MMP14不仅包括在细胞膜上表达的MMP14,而且还包括已从细胞膜游离 出的MMP14。MMP14可以天然存在，也可以人工制作。因此，MMP14包括重组MMP14。游离型 的 MMP14 是已知的（例如 Jo et al.，Biochem J.2000Feb l;345Pt 3:511-9 等），也已市 售（例如 R&D Systems, Cat No. 918-MP-0KK918-MPN-010 等）。MMP14 的氨基酸和对其进 行编码的碱基序列是已知的（例如人MM