专利名称：：IgA产生促进剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及IgA的产生促进剂'本发明特别涉及在肠内发挥作用的IgA产生促进剂(IgAproductionpromoter).
背景技术：
：已知IgA是存在于唾液、肠、气管等的分泌液中、在阻断从口腔内和小肠等的粘膜入侵的微生物和过敏原等粘膜屏障(barrier)功能的增强中具有重要作用的分子，另外，广为人知的是，为了防御免疫功能未成熟的新生儿的机体，来源于母乳的IgA作为被动免疫而被用于新生儿的免疫功能补偿。另一方面，近年来对于乳酸菌的免疫调谐功能有多种报道，有关其作用机制、以及菌种或菌林造成的差异的信息也逐渐明确(广田哲二NewFoodIndustry,Vol.32，No.10，p9(1990)),但是，在这些报道中，并未涵盖全部的免疫调谐功能，而且也没有研究到所有的乳酸菌种。因此，目前仅仅获得了尚未把握整体情况的非常不完整的信息。对于促进IgA分泌的乳酸菌也进行了一部分研究，特别是双岐杆菌属(Bifidobacterium)细菌，在新生儿粪^(更中的存在比例高，因此可以i/v为其对于新生儿具有某种作用。有研究者正在进行尝试，将双岐杆菌属细菌和淋巴集结(Peyer'spatch)细胞共同培养，选择IgA诱导活性高的细菌.具体来说，报道了长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)和短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)中存在IgA的分泌促进作用强的菌林(曰本特开平02-280059).然而，双岐杆菌属细菌原本在成人的小肠中几乎不存在，因此，预计其几乎不会和淋巴集结接触，实际上，每一个选择出来的这样的菌种、菌林是否能在体内、特别是人的肠内充分发挥作用尚未确认。纵观全部乳酸菌，并没有显示乳酸杆菌(lactobacillus)属细菌和IgA产生的关联性的报道，特别是并没有相关报道进行后迷尝试，即对于大量存在于小肠(该小肠中具有在肠道免疫中有重要作用的淋巴集结)中的、定位性(localization)好的乳杆菌属菌种或菌林，比较该菌种或菌抹之间的IgA产生促机功能，以寻找活性高的菌种或菌林。另外，关于乳酸杆菌的人肠内的局部存在性(局在性)，有报道称食淀粉乳杆菌(lactobacillusamylovorus，L.amylovorus)，与类干酪孝L杆菌(Lactobacillusparacasei)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)均为人菌群中占有优势的乳杆菌属乳酸菌(BioscienceMicroflora，22(3),75-83，2003)。
发明内容本发明提供能够提高淋巴集结等的功能而促进IgA的产生、且在人肠道上具有定位性的乳杆菌属细菌，以及以前述乳杆菌属细菌的菌体(菌体)为有效成分的IgA产生促进剂.本发明人等使用人的肠道中存在的、或不存在(来源于人粪便的和其他来源的)的乳杆菌属的多种菌林，测定了它们对淋巴集结细胞的IgA产生促进活性，明确了乳杆菌属菌种间对淋巴集结细胞的IgA产生促进活性存在差异.特别是，在人肠道定位性的乳杆菌属菌种中，发现食淀粉乳杆菌的IgA产生诱导活性高.因此，本发明为以食淀粉乳杆菌的菌体为有效成分的IgA产生促进剂。特别是以食淀粉乳杆菌CP1750株(FERMBP-10532)为有效成分的IgA产生促进剂.通过本发明，能提供可以增强免疫屏障的IgA产生促进剂.因此，根据本发明可以提供以增强免疫屏障为目的的免疫调节剂、食品或飼料(含饮料)、特别是发酵乳、营养食品、功能性食品、特定保健用食品、健康饮料、药片(tablet)等。根据本发明的IgA产生促进剂，可以提高机体的粘膜屏障功能，以防止花粉、螨、室尘等环境过敏原、以及食物过敏原、病原性微生物的入侵。[图1多种乳杆菌属细菌的IgA产生促进活性的比较。Control为仅仅添加了不含菌体的PBS的对照。棒(bar)表示标准误差.具体实施例方式本发明为以后迷乳杆菌属细菌菌体为有效成分的IgA产生促进剂，4所述乳杆菌属细菌菌体的IgA诱导能力(具有抑制舍过敏原的抗原物质与粘膜接触的作用)以往并不为人所知.在本说明书中，"IgA产生促进剂"是指具有促进IgA产生的活性的组合物。另外，本发明的"IgA产生促进剂"并不只是以IgA产生促进为目的而限定其用途，例如，可以用作药品、或用于向食品(含饮料)中添加。特别是，本发明的IgA产生促进剂含有食淀粉乳杆菌的菌体作为有效成分，所述食淀粉乳杆菌是在认为与肠道的免疫活性组织接触机会高的、肠道定位性良好的乳杆菌属中，确认IgA产生诱导能力高的乳杆菌.本发明中可以使用的食淀粉乳杆菌的菌林中包含食淀粉乳杆菌CP1750林。食淀粉乳杆菌CP1750林于2005年3月8日保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心)(日本茨城县筑波(0〈《)市东l丁目l番地l中央第6，邮政编码305-8566)，被授予保藏号(AccessionNo.)FERMBP-10532,IgA—般由含有淋巴集结的粘膜组织大量产生，是气管、小肠的分泌液、唾液、初乳中常见的抗体。淋巴集结是存在于包括人类在内的哺乳动物的小肠粘膜上、含有大量IgA产生细胞的组织。本发明人等在人肠内菌群中发现的多种乳杆菌属细菌、以及人肠内菌群中几乎或完全不存在的多种乳杆菌属细菌的菌体存在下培养淋巴集结，考察淋巴集结细胞的IgA产生，结果发现，如前所迷，乳杆菌属菌种之间存在着淋巴集结细胞的IgA产生促进活性的差异，在人肠内菌群中占优势的乳酸杆菌种中，食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)具有特别高的IgA产生促进活性。在多种食淀粉乳杆菌菌林的菌体存在下对淋巴集结细胞进行共培养，通过测定共培养下淋巴集结细胞产生的IgA量，可以确认这些食淀粉乳杆菌林可用于本发明。对淋巴集结细胞的IgA产生促进活性可以如下测定.将细菌，例如乳杆菌属细菌用常规的培养基和条件、例如用MRS培养基(Difco)在约37'C~45。。下培养12~18小时，通过离心回收菌体，将所得的菌体用灭菌水或PBS等合适的緩冲液洗净后，冷冻干燥。将冷冻干燥的菌体在PBS等合适的緩冲液中混悬，在100。C加热(例如，约10分钟)进行杀菌处理，可以为了之后的测定而先行保存.另一方面，淋巴集结细胞可以从小鼠的小肠配制。可以将小鼠的小肠放置在含有胶原酶(约lmg/ml)、对淋巴集结而言合适的培养基、例如RPMI培养基中，在例如约37。C下搅拌约1小时，直至细胞分散。使获得的细胞悬浊液通过筛网，除去不需要的残渣，将所得的细胞用合适的培养基、例如RMPI洗净，从而获得淋巴集结细胞配制物。在放入了恰当的培养基(例如含有5%FCS的RPMI培养基)的96孔板中以约5xl05细胞/孔接种获得的淋巴集结细胞，在各个孔中添加前述的细菌菌体至约10ng/ml，在5。/。C02气体环境下于37'C培养约7天，获得培养上清液。获得的培养上清液中的IgA的量可以依照常规方法，例如用ELISA法测定。例如，将恰当稀释过的抗-小鼠IgA抗体作为初级抗体在ELISA板中添加50fil左右，在4。C放置一夜进行包覆(coating),将孔用PBS-Tween溶液洗净之后，在各个孔中添加lOOjil的1%BSA/PBS-Tween溶液，在室温下静置2小时进行封闭(blocking),将孔洗净后，在孔中添加IgA标准品或恰当稀释过的样品50jd,在室温下静置2小时，将孔洗净后，在孔中添加50fU的用1%BSA/PBS-Tween溶液稀释过的二级抗体，例如生物素化抗-小鼠IgA，在室温下静置2小时。用PBS-Tween将孔洗净后，在孔中加入50jU的用1%BSA/PBS-Tween溶液恰当稀释过的碱性磷酸酶溶液，在室温下静置l小时，用PBS-Tween将孔洗净后，将4-硝基苯基磷酸二钠以lmg/ml溶于二乙醇胺-盐酸緩冲液(pH8.9)中，在各孔中添加所得溶液50pl使显色，测定405nin的吸光度，从而可以测定各孔中产生的IgA量'用这样的方法发现的、对淋巴集结的IgA产生促进活性优异的食淀粉乳杆菌的一个菌抹即CP1750抹(FERMBP-10532)，由于其对人肠道亲和性特别高，可以期待其在人、特别是人肠内显示出非常高的IgA产生促进活性，特别优选作为本发明的IgA产生促进剂的有效成分。虽然没有被任何理论束溥的意图，本发明人等认为，具有1gA产生诱导能力的人肠道定位性的乳酸菌，特别是包括食淀粉乳杆菌在内的乳杆菌属菌种、菌株，通过促进淋巴集结中的抗体产生细胞产生IgA,进而非特异性地激活IgA产生细胞，提高IgA的产生，从而是包括可以更有效地处理抗原的佐剂活性在内的总活性优秀的菌种。确认具有促进淋巴集结的IgA产生活性的食淀粉乳杆菌林，例如CP1750林(FERMBP-10532),无论是包含活菌体、死菌体、菌体破碎物、菌体溶解物、菌体粉末的何种形态，只要未失去IgA产生促进活性，都可以作为本发明的IgA产生促进剂的有效成分使用。因此，只要没有特别明示，"食淀粉乳杆菌的菌体"也包括活菌体、死菌体、菌体破碎物、菌体溶解物和菌体粉末及其他的任何形态，特別是，培养的活菌体和冷冻干燥的食淀粉乳杆菌菌体在其简便性方面利用价值应该较高。必要时，任何形态下都可以用上述方法确认它们对淋巴集结具有IgA产生促进活性.在将本发明的IgA产生促进剂作为药品使用时，除了食淀粉乳杆菌菌体，还可以含有其他药品以及制药业能允许的常规的赋形剂和添加剂。作为剂型，例如可以是片剂、散剂、丸剂、颗粒剂、胶嚢剂、糖衣剂以及糖浆剂，这些可以依照常规方法制造。另外，本发明的IgA产生促进剂也可以添加到多种食品(包括饮料)或饲料、特别是发酵乳、营养食品、功能性食品、特定保健用食品、健康饮料、药片中。无论是何种形态，本发明的IgA促进剂的标准摄取量是，作为菌体质量(干燥质量)，优选每天20mg(干燥质量)(作为菌体数量为约IO"个；菌体数可以用库尔特计数器等计测)以上。另外，作为发酵乳、发酵汁，优选每天摄取100g左右。由于本发明的有效成分即食淀粉乳杆菌是人的小肠内存在的乳酸菌，因而认为本发明的IgA产生促进剂即使大量摄取也没有副作用.因此，本发明的IgA产生促进剂适合作为人的食品用，即，本发明的IgA产生促进剂适用于直接作为食品、或添加到食品中使用。虽然本发明中使用的食淀粉乳杆菌可以使用本领域技术人员熟知的培养基并依照本领域技术人员熟知的培养条件培养，在以制作人用的药品、食品和饮料之类的给人摄取的配制物为目的时，优选使用人摄取后无害的培养基，例如，仅用食品规格成分制作的培养基。例如，使用仅用食品规格的成分配制的半合成培养基(无论种类)，将食淀粉乳杆菌在3745。C的范围培养1218小时，进行离心分离，回收菌体，之后将回收的菌体用灭菌水离心洗净(必要时重复洗净)，从而可以获得作为本发明的IgA产生促进剂的有效成分使用的食淀粉乳杆菌菌体。将获得的菌体直接冷冻、或例如在适宜地加入了糊精等赋形剂的状态下冷冻，进行冷冻干燥，从而可以获得含有活菌体的食品原料。另一方面，在对灭菌水洗净的菌体进行加热杀菌的前提下，将之直接冷冻、或在适宜地加入了糊精等赋形剂的状态下冷冻，进行冷冻干燥或者进7行喷雾干燥，从而可以获得死菌的食品原料.在使用这样的菌体自身或将菌体添加到食品中的形态的情况下，优选制作成各种食品或药品，使得可以每天摄取20mg以上(换算为干燥质量)的菌体。另一方面，可以将以引子(starter)用培养基培养的食淀粉乳杆菌培养物以数％、例如3~6%的比例添加到蔬菜汁、果汁、麦芽汁、米汤、乳汁以及这些的混合汁中，在37'C45'C下使之发酵，进行冷却以使最终酸度为0.85以上，从而获得发酵乳、发酵汁或混合发酵汁。还可以在获得的产物中加入适当的甜味剂和/或香料，调整其感官特性，直接制成冷藏制品食品，进而也可以进行杀菌制成保质期延长的产品，对于这样的发酵产物，作为发酵产物，优选以100g左右/天的量口服摄取。优选的是在这样的发酵产物100g中含有约101()个食淀粉乳杆菌菌体。将淋巴集结细胞和本发明的IgA产生促进剂一起培养，其培养液中产生的IgA量显著增加(参照实施例).由于IgA的产生一般在粘膜组织细胞中常见，故认为本发明的1gA产生促进剂不仅对淋巴集结细胞，对其他的粘膜组织中的IgA产生也有促进作用。因此，通过口服摄取本发明的IgA产生促进剂，不仅可以促进肠道粘膜，还可以促进全身的粘膜系统中的IgA产生，可以增强全身的粘膜系统的感染防御功能，阻断过敏原从粘膜入侵，抑制包括食物过敏在内的一般的过敏发病.例如，本发明的IgA产生促进剂通过促进口腔内的IgA产生，可以用于抑制牙周病菌，预防、改善牙周病。本发明的1gA产生促进剂几乎或完全没有副作用，非常安全。不仅如此，特别是以CP1750株的菌体为有效成分的IgA产生促进剂，由于对人肠道的亲和性特别高，故认为其IgA产生促进活性特别高。实施例实施例1l)乳酸菌菌体的配制使用的菌种和菌林如下所示。L.rhamnosusA(鼠李糖乳杆菌A林)L.reuteriA(路氏乳杆菌A林)L.plantarumA(植物乳杆菌A林)L,paracaseiA(类干酪乳杆菌A林)L.paracaseiB(类干酪乳杆菌B株)L.johnsoniiA(约氏乳杆菌A林)L,johnsoniiB(约氏乳杆菌B林)L.galinammA(鸡乳杆菌A抹)L.gasseriA(加氏乳杆菌A抹)L.gasseriB(加氏乳杆菌B林)L.fermentumA(发酵乳杆菌A抹)L.crispatusA(巻曲乳杆菌A抹)L.buchneriA(布氏乳杆菌A株)L.amylovorusCP1705(食淀粉乳杆菌CP1705林)L,acidophilusA(嗜酸乳杆菌A林)食淀粉乳杆菌CP1705是从申请人等的标准食淀粉乳杆菌保存菌抹中任意选择的菌林，将这些乳杆菌属菌种、菌林分别在MRS培养基(DifcoLaboratories)100ml中于37'C下培养18小时后，洗净菌体，冷冻千燥。冷冻干燥后，各个菌林都获得约IOH个(约lOOmg)的干燥菌体，将冷冻干燥的菌体的一部分混悬于PBS，在IOO'C下加热10分钟进行杀菌处理，用于以后的实验。2)在乳杆菌属细菌的菌体存在下的淋巴集结细胞的培养从BALB/c小鼠(购自日本CLEA)取出小肠，从其上切取、淋巴集结。将胶原酶(Sigma)溶解于5%FCS-RPMI,浓度为lmg/ml，将切取的淋巴集结置于其中，在37'C下搅拌1小时'当细胞分散时，使细胞混悬液通过篩网，除去杂质，用RPMI洗净细胞，获得淋巴集结细胞。将淋巴集结细胞以5xl()S细胞/孔接种在装有5%FCS-RPMI的96孔板中。向其中加入在l)中配制的菌体混悬液，使浓度为10吗/ml(菌体干燥质量)，在5%FCS-RPMI中在5%C02气体环境下于37。C培养，培养7天后回收培养上清液。3)来自淋巴集结细胞的IgA产生量的测定用ELISA法测定在2)中获得的培养上清液中的IgA量，将初级抗体(山羊抗-小鼠IgA，ZymedLaboratories)用0.1MNa2HP04溶液稀释1000倍，将所得稀释物S0nl添加至ELISA板中，在4'C静置一夜进行包覆。将孔用PBS-Tween溶液洗净之后，在各个孔中添加lOOjil的1%BSA/PBS-Tween溶液，在室温下静置2小时进行封闭，将孔洗净后，9在孔中添加IgA标准品(IgA;纯化小鼠骨髄瘤IgA(PurifiedMouseMyelomaIgA)，ZymedLaboratories)或恰当稀释过的样品50jd，在室温下静置2小时，将孔洗净后，在孔中添加50jil的用1%BSA/PBS-Tween溶液稀释过的二级抗体(IgA;生物素抗-小鼠IgA,克隆；ClO-l，BDPharmingen)，在室温下静置2小时。用PBS-Tween将孔洗净后，在孔中加入50^1的用1%BSA/PBS-Tween溶液稀释IOOO倍的碱性确酸酶溶液(Zymed)，在室温下静置1小时，用PBS-Tween将孔洗净后，将4-硝基苯基磷酸二钠(东京化成工业)溶于二乙醇胺-盐酸緩沖液(pH8,9)中使浓度为lmg/ml,将所得溶液50nl添加至孔中使显色，测定405nm的吸光度，以IgA标准品的数据为基准对产生的IgA量进行作图(图1),已知IgA产生促进活性比较高的菌林、路氏乳杆菌A、布氏乳杆菌A、食淀粉乳杆菌CP1750、嗜酸乳杆菌A(参照图l)中，路氏乳杆菌A、布氏乳杆A和嗜酸乳杆菌A是通常在人的小肠中见不到的菌种和菌林，与之相对，包括CP1750林在内的食淀粉乳杆菌是定位于人小肠的乳酸菌，在人肠内菌群中占优势。4)食淀粉乳杆菌CP1750的细菌学性质使用市售的细菌鉴定试剂盒(API50CH:Biomerieux公司制造，货号50307)考察食淀粉乳杆菌CP1750的糖同化性(carbohydrateassimilation)。结果如以下的表1所示。表l_糖同化性*甘油—赤藓糖醇一D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖一核糖—D-木糖—L-木糖-核糖醇—卩基-D-木糖苷-糖+糖+乳萄糖露半葡果甘表l续2-稱基-葡糖酸(2-keto-gluconate)5-酮基-葡糖酸|一|||||一+|1||+++|+|一|++||十|一||||||一苷應^胺醇醇醇t1st'J*糖糖糖糖糖伯伯—DD葡苦皮糖糖扭苏蓋莱莱iLlsl糖糖银醇醇4l酰仁苷树苷二糖糖糖糖糖醇双附来拔rl-^22酸梨李乳醇露梨甲甲乙杏果栗杨维芽糖二糖藻糖三子粉原糖胆-TJr"--糖山鼠半肌甘山ii!^苦熊马水纤麦乳蜜蔗海菊松棉淀糖木龙DDDDLDL葡11*+表示有同化性，-表示无同化性。另外，食淀粉乳杆菌CP1750在45'C下也能良好地发育。参考文献1.日本特开平2-280059号公报2.NewFoodIndustry,Vol.32,No.10，p9(1990)3.BioscienceMicroflora,Vol.22，No.3，p75-83(2003)权利要求1.IgA产生促进剂，其以食淀粉乳杆菌的菌体为有效成分。2.权利要求1所述的IgA产生促进剂，其以用保藏号FERMBP-10532特定的食淀粉乳杆菌CP1750林的菌体为有效成分。3.权利要求1或2所述的IgA产生促进剂，其用于添加到食品中。4.食淀粉乳杆菌CP1750林，其由保藏号FERMBP-10532特定。全文摘要本发明提供提高淋巴集结的功能、促进IgA的产生、且在人肠道具有定位性的乳杆菌属细菌和以前述乳杆菌属细菌菌体为有效成分的IgA产生促进剂。本发明为以食淀粉乳杆菌的菌体为有效成分的IgA产生促进剂，特别是以食淀粉乳杆菌CP1750株(FERMBP-10532)作为有效成分的IgA产生促进剂。文档编号A61K35/74GK101668534SQ200780051609公开日2010年3月10日申请日期2007年12月18日优先权日2006年12月21日发明者八村敏志,勘里裕树,藤原茂申请人:卡尔皮斯株式会社