专利名称：胶原产生促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶原产生促进剂，涉及刺激在皮肤的真皮层上存在的成纤维细胞的胶原产生促进剂。
背景技术：
目前已知，胶原在全身的所有脏器中存在，特别是在皮肤中，真皮干燥重量的约 70%为胶原，还已知，不仅具有保持皮肤的收缩性、柔软性、保湿性等功能，而且正常地维持各种细胞的形态，对于代谢以及粘附等也产生影响。另外，皮肤通常暴露于外界，随着年龄增加而丧失弹力和张力，出现皱纹、下垂等老化现象。这些现象可以认为是由于在皮肤中存在的胶原的量随着老化减少而产生。大量报道了为了消除这样的皱纹和下垂，而使用了具有胶原产生促进作用的物质的胶原产生促进剂(专利文献1)。以往已知在真皮中存在的成纤维细胞产生胶原，该促进剂对于成纤维细胞以促进胶原产生的方式发挥作用。专利文献1 日本特开2008-260747号公报
发明内容
本发明的目的在于，提供使皮肤组织中含有的胶原量增加的新型胶原产生促进剂。本发明(1)为一种胶原产生促进剂，其特征在于，以磷酸钙微粒作为有效成分。本发明( 为上述发明(1)所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒为羟基磷灰石微粒。本发明C3)为上述发明(1)或( 所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒的平均粒径为10 lOOOnm。本发明(4)为上述发明(1) (3)中任一项所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒为烧结体。本发明(5)为上述发明(4)所述的胶原产生促进剂，其中，所述烧结体通过包括如下工序的方法而制得混合工序，将含有磷酸钙的一次粒子与抗熔接剂混合；和烧结工序，将通过所述混合工序得到的混合粒子暴露于烧结温度下。本发明(6)为上述发明(1) (5)中任一项所述的胶原产生促进剂，其含有选自醇类、糖类、蛋白质类、氨基酸类、水溶性维生素类、脂溶性维生素类、脂质、粘多糖类、表面活性剂中的至少一种物质。本发明(1)作用于成纤维细胞，发挥促进胶原产生的效果。另外，实现改善皱纹和下垂等老化现象，和在组织中将进一步损坏的胶原纤维再构使其改善成正常的组织的效^ ο根据本发明O)，作用于成纤维细胞，实现促进胶原产生的效果。
根据本发明(3)，磷酸钙微粒的平均粒径非常小，因此，通过在皮肤的表面涂布，实现使肌理的状态变好的效果。根据本发明G)，通过形成烧结体，实现观察到显著的胶原产生量的增加作用的效果。
根据本发明(5)，磷酸钙微粒即使通过烧结，粒子之间也难以熔接，而保持一次粒子的状态，因此，能够在粒径小的状态下得到烧结体，因而，实现能够发挥更高的胶原产生促进作用的效果。根据本发明(6)，通过含有这些物质，实现向真皮迅速的渗透的促进、收敛、保湿、 抗炎症等效果。
图1是表示被试者1的皮肤的表面的状态的图。图2是表示被试者2的皮肤的表面的状态的图。
具体实施例方式本最佳方式的胶原产生促进剂包含磷酸钙微粒。此外，作为任意的构成要素， 优选包含醇类、糖类、蛋白质类、氨基酸类、水溶性维生素类、脂溶性维生素类、脂质、粘多糖类、表面活性剂。作为本最佳方式的磷酸钙微粒，例如可以列举出羟基磷灰石 (Ca10 (PO4)6(OH)2)、氟磷灰石(Caltl(PO4)6F2) Xa10(PO4)6C12等。另外，该磷酸钙中可以含有钙离子和/或氢氧根离子和/或磷酸根离子的一部分用锶离子、钡离子、钠离子、碳酸氢根离子、碳酸根离子、氟化物离子、氯化物离子等取代后的化合物或磷酸三钙(Cii3(PO4)2)、偏磷酸钙(Ca(PO3)2)、磷酸八钙(OCP)。上述例示中，优选为羟基磷灰石。另外，在本最佳方式中的磷酸钙粒子(磷酸钙的粒子)的表面上优选存在Caltl (PO4)6(OH)215只要该Qiltl (PO4)6 (OH)2 在磷酸钙的表面上存在，则优选，只要相对于磷酸钙总量含有约0. 1重量％即可，更优选含有50重量％以上。另外，在上述磷酸钙微粒中可以含有对非晶质的羟基磷灰石如后所述进行烧结时产生的磷酸三钙等。本实施方式的磷酸钙的与生物体组织的亲和性以及在生物体环境中的稳定性优良。本最佳方式的磷酸钙微粒的平均粒径优选为10 lOOOnm，更优选为20 300nm， 进一步优选为20 250nm。通过设定为这样的粒径的范围，微粒从皮肤的表面向真皮层渗透，因此，即使为皮肤化妆品等外用剂，该磷酸钙微粒也作用于真皮相中含有的成纤维细胞，从而能够发挥胶原促进作用。通过形成20 250nm，表皮细胞的间隙为约250nm，因此， 发挥特别是变得容易从皮肤的表面向真皮层渗透的效果。变动系数优选为20%以下，更优选为18%以下，进一步优选为15%以下。需要说明的是，平均粒径以及变动系数使用电子显微镜，对于至少100个以上的一次粒子测定粒径进行计算即可。需要说明的是，“变动系数”是表示能够通过标准偏差+平均粒径X 100(% )计算的粒子间的粒径的偏差的值。作为磷酸钙微粒的形状，没有特别的限定，例如可以为粒子状，也可以为棒状。需要说明的是， 在为棒状的情况下，所述平均粒径为通过该粒子的长径测定的粒径。本最佳方式的磷酸钙微粒优选为对磷酸钙进行烧结(煅烧)而成的磷酸钙烧结体 (也称为磷酸钙陶瓷)。特别优选通过后述的分散煅烧法进行烧结。通过使用磷酸钙微粒烧结体，与未烧结体比较，实现胶原产生促进作用显著提高的效果。另外，磷酸钙微粒烧结体与非晶质的磷酸钙比较，结晶性高，在生物体中溶解性低。因此，能够在生物体内长期维持生物体活性，因此，容易长期发挥胶原产生促进效果。磷酸钙微粒烧结体通过使非晶质的磷酸钙烧结而得到。具体而言，例如通过后述的方法进行烧结，能够得到磷酸钙微粒烧结体。 另外，优选使用磷酸钙微粒的结晶性高的高结晶性磷酸钙。该磷酸钙的结晶性的程度可以通过X射线衍射法(XRD)进行测定。具体而言，表示各结晶面的峰的半峰宽越窄则结晶性越高。在此，本发明的高结晶性磷酸钙的“高结晶性”是指在d = 2. 814处的半峰宽为0.8 以下(优选为0.5以下)。优选本最佳方式的胶原产生促进剂中含有醇类、糖类、蛋白质类、氨基酸类、水溶性维生素类、脂溶性维生素类、脂质、粘多糖类、表面活性剂。作为醇类，例如可以列举出乙醇、甘油等。通过含有醇类，提高磷酸钙微粒的分散稳定性，促进向真皮层中的迅速渗透。另外，也发挥皮肤的清洗、收敛、保湿效果。作为糖类， 例如可以列举出水解氢化淀粉等。通过含有糖类，提高保湿效果、抗炎症效果。作为蛋白质类，例如可以列举出胶原。通过含有蛋白质类，能够形成磷酸钙的载体，促进向真皮层中转运。作为氨基酸类，例如可以列举出谷氨酸、精氨酸、或者它们的钠盐等。通过含有氨基酸类，可以促进胶原产生。作为水溶性维生素类，例如可以列举出磷酸抗坏血酸镁等。通过含有水溶性维生素类，促进胶原产生，能够期待与磷酸钙的协同效果。作为脂溶性维生素类， 例如可以列举出维生素A。通过含有脂溶性维生素类，能够促进粘多糖类的产生，润滑皮肤。 作为脂质，例如可以列举出神经酰胺或磷脂质类。通过含有脂质，发挥保湿效果。作为粘多糖类，例如可以列举出透明质酸等。通过含有粘多糖类，发挥保湿效果。作为表面活性剂， 例如可以列举出聚乙二醇、硬脂酸衍生物。通过含有表面活性剂，微粒或维生素A等脂溶性成分的分散性提高。本最佳方式的磷酸钙微粒，没有特别的限定，适宜在化妆品、整形外科用制剂、齿科用制剂中配合。化妆品的种类没有特别的限定，作为其具体例，可以列举出洗面奶、化妆水、美容液、软膏、雪花膏、乳液、润肤霜、面膜、口红、入浴剂等。本最佳方式的化妆品中的磷酸钙微粒的配合量可以根据化妆品的种类或提取物的生理活性等适当调节，优选为 0.01 30质量％，更优选为0. 1 15质量％，进一步优选为0. 1 10质量％。醇类的配合料，没有特别的限定，优选为0. 01 70质量％，更优选为0. 01 50质量％，进一步优选为0. 01 30质量％。糖类的配合料，没有特别的限定，优选为0. 01 70质量％，更优选为 0.01 50质量％，进一步优选为0.01 30质量％。蛋白质类的配合料，没有特别的限定， 优选为0.01 30质量％，更优选为0.01 20质量％，进一步优选为0.01 10质量％。 氨基酸类的配合料，没有特别的限定，优选为0. 01 30质量％，更优选为0. 01 20质量％，进一步优选为0. 01 10质量％。水溶性维生素类的配合料，没有特别的限定，优选为 0.001 30质量％，更优选为0.001 20质量％，进一步优选为0.001 10质量％。脂溶性维生素类的配合料，没有特别的限定，优选为0. 001 30质量％，更优选为0. 001 20质量％，进一步优选为0. 001 10质量％。脂质的配合料，没有特别的限定，优选为0. 001 30质量％，更优选为0. 001 20质量％，进一步优选为0. 001 10质量％。粘多糖类的配合料，没有特别的限定，优选为0. 01 70质量％，更优选为0. 01 50质量％，进一步优选为0. 01 30质量％。表面活性剂的配合料，没有特别的限定，优选为0. 001 30质量％，更优选为0. 001 20质量％，进一步优选为0.001 10质量％。本最佳方式的化妆品中，只要没有妨碍磷酸钙微粒的胶原产生促进作用，则可以使用化妆品的制造中通常使用的各种主剂以及助剂、其他任意的助剂。本最佳方式的化妆品中，能够与磷酸钙微粒一起作为化妆品构成成分利用的添加剂，可以使用化妆品中使用的公知的添加剂，例如可以列举出收敛剂、杀菌/抗菌剂、美白剂、紫外线吸收剂、保湿剂、 细胞赋活剂、消炎/抗过敏剂、抗氧化/活性氧消去剂等。需要说明的是，在制造化妆品的情况下，对于其他制造原料的选择几乎没有限制，油脂类、蜡类、烃类、脂肪酸类、醇类、酯类、 表面活性剂、香料等通常的基材或助剂均可以使用。此外，作为整形外科用制剂，可以列举出通过注入到由于受伤等在皮肤上能出现凹陷的部分中，使自身组织的缺损部位再生的软组织充填剂等。作为齿科用制剂，可以列举出在进行植入治疗等后适用于出现间隙的部位、容易固定基材和牙齿等的齿肉固定剂等。《制造方法》下面，对于本最佳方式的磷酸钙微粒的制造方法进行说明。磷酸钙微粒可以通过湿式法、干式法、水解法、水热法等公知的制造方法人工地制造，另外，也可以是由骨、齿等得到的来自天然的磷酸钙微粒。另外，也可以是制造粒径大的磷酸钙粒子、通过众所周知的方法进行粉碎而成的磷酸钙微粒。磷酸钙微粒优选通过使无定形的磷酸钙烧结而得到。另外，作为烧结温度的下限值，更优选为500°C以上。烧结温度低于500°C时，有时烧结不充分。另一方面，作为烧结温度的上限值，更优选为1800°C以下，进一步优选为1250°C以下，特别优选为1200°C以下。烧结温度高于1800°C时，有时磷酸钙发生分解。因此，通过使烧结温度为上述范围内，能够制造在生物体内难以溶解的(结晶性高)磷酸钙。另外，作为烧结时间，没有特别的限定，可以适当设定。需要说明的是，通过烧结也有时粒子之间发生熔接，但在这样的情况下，可以将烧结后的粒子粉碎后使用。本最佳方式的磷酸钙微粒，特别优选通过后述的方法来制造。即，本最佳方式的磷酸钙微粒的制造方法，优选包括至少由混合工序和烧结工序构成的分散煅烧(烧结)法的方法。通过该分散煅烧法得到的微粒由于直接反映一次粒子的粒径，因此，容易调节至上述范围的平均粒径。另外，本最佳方式的制造方法可以包括一次粒子生成工序、除去工序。 这些工序例如以一次粒子生成工序、混合工序、烧结工序、除去工序的顺序来进行。(一次粒子生成工序)该一次粒子生成工序只要是能够生成磷酸钙微粒的工序，则没有特别的限定，根据制造的高结晶性磷酸钙微粒的原料适当选择并采用即可。例如如果在常温下在氢氧化钙浆料中滴加磷酸，则磷酸钙(CaP)的粒子沉淀。关于生成如本最佳方式的磷酸钙微粒这样微细(纳米尺寸)并且粒径均勻的(粒度分布窄的)一次粒子群的方法，没有特别的限定，例如可以利用日本特开2002-137910号公报记载的方法。即，在表面活性剂/水/油系乳相中使钙溶液以及磷酸溶液可溶并混合， 在表面活性剂的浊点以上使其反应，由此，可以合成磷酸钙(羟基磷灰石)微粒(一次粒子)。另外，此时，通过改变上述表面活性剂的官能团以及亲水性/疏水性比的比例，能够控制磷酸钙微粒的大小。如果简便地说明制造上述磷酸钙微粒的原理，如下。在表面活性剂/水/油系乳相中使钙溶液以及磷酸溶液可溶并混合、使其反应来合成磷酸钙微粒的方法中，在表面活性剂的胶束中磷酸钙的核生长，粒子生长。此时，通过使反应温度变化(所述表面活性剂为非离子型的表面活性剂的情况下，设定为表面活性剂的浊点以上)，能够控制胶束的热力学稳定性。即，提高反应温度成为降低形成表面活性剂的胶束的力。可以认为，如果这样，则在胶束这样的框中受到限制的磷酸钙的粒子生长的驱动力比维持胶束的框的驱动力大。由此，可以利用该机制来控制粒子的形状。在制作表面活性剂的胶束的情况下，表面活性剂的官能团(亲水性部位)以及分子内的亲水性/疏水性比很重要，通过该差异，胶束的稳定性、浊点也不同。另外，表面活性剂的浊点根据种类而不同。因此，通过适当变更表面活性剂的种类，能够改变上述表面活性剂的官能团以及亲水性/疏水性比的比例，从而可以控制磷酸钙微粒的大小。需要说明的是，上述方法中使用的表面活性剂的种类，没有特别的限定，可以从上述日本特开平5-17111号公报中公开的其他种类的公知的阴离子、阳离子、两性离子、非离子性表面活性剂中适当选择来使用。这些表面活性剂中，为非离子型的表面活性剂的情况下，由于具有表面活性剂的浊点，利用上述机制的结晶的形状控制变容易。更具体而言，作为非离子性表面活性剂，可以利用聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯丙基醚、聚氧乙烯烷基烯丙基醚、聚氧乙烯衍生物、氧乙烯-氧丙烯嵌段共聚物、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺等。另外，作为阳离子表面活性剂，可以利用十八酰胺盐酸盐、十二烷基三甲基氯化铵、烷基苯二甲基氯化铵等季铵盐等，作为阴离子表面活性剂，可以利用十二烷基醇硫酸酯钠、油醇硫酸酯钠等高级醇硫酸酯盐类，十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵等烷基硫酸盐类，十二烷基苯磺酸钠、十二烧基萘磺酸钠等烷基芳基磺酸盐类等，作为两性表面活性齐 ，可以利用烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、氧化胺型等。上述表面活性剂使用1种或组合使用2种以上。其中，从浊点、溶解性的观点出发，特别优选使用五乙二醇十二烷基醚。另外，作为上述方法中可以利用的油相，例如可以列举出甲苯、二甲苯、己烷、十二烷、环己烷等烃类，氯苯、氯仿等卤化烃类，乙醚等醚类，丁醇等醇类，甲基异丁基酮、环己酮等酮类等，这些溶剂，根据所使用的表面活性剂，水的溶解度小，为了溶解上述表面活性剂的任意一种选择1种或2种。其中，从水的溶解度、表面活性剂的溶解性的观点出发，特别优选使用十二烷。此外，反应温度、反应时间、原料的添加量等可以根据一次粒子的组成来适当地选择最佳的条件来采用。但是，反应温度的上限，由于是水溶液的反应，因此优选溶液不沸腾的温度，更优选为90°C以下。另外，可以包括用水等清洗本工序中生成的一次粒子的工序、通过离心分离、过滤等回收一次粒子的工序。(混合工序)该混合工序为混合一次粒子和抗熔接剂的工序。在通过上述一次粒子生成工序得到的一次粒子群的粒子间预先隔着抗熔接剂，由此，能够防止之后的烧结工序中的一次粒子之间的熔接。需要说明的是，将通过该混合工序得到的一次粒子与抗熔接剂的混合物称为“混合粒子”。在此，作为“抗熔接剂”，只要是能够防止一次粒子间的熔接的物质，则没有特别的限定，优选在之后的烧结工序的烧结温度下为不挥发性。这是由于，在烧结温度条件下为不挥发性，因此，不会在烧结工序中从一次粒子间消失，能够确实地防止一次粒子之间的熔接。但是，无需在烧结温度下具有100%的不挥发性，只要是在烧结工序结束后在一次粒子间残存10%以上的程度的不挥发性即可。另外，抗熔接剂可以是在烧结工序结束后通过热而化学分解的物质。即，如果在烧结工序结束后残存，则不需要在烧结工序的开始前后为相同的物质(化合物)。另外，抗熔接剂优选为在溶剂、特别是水系溶剂中溶解的物质。作为如上所述的抗熔接剂，如果使用溶剂中溶解的抗熔接剂，则仅仅通过将混合有抗熔接剂的磷酸钙微粒在纯水等水系溶剂中混悬，就能够除去抗熔接剂(例如碳酸钙等)。特别如果是水系溶剂中溶解的抗熔接剂，则在除去抗熔接剂时不需要使用有机溶剂，因此，不需要在除去工序中与使用有机溶剂对应的设备、有机溶剂废液处理。因此，可以说能够更简便地从磷酸钙微粒中除去抗熔接剂。作为上述溶剂，没有特别的限定，例如作为水系溶剂，可以列举出水、乙醇、甲醇等，作为有机溶剂，可以列举出丙酮、甲苯等。另外，为了提高抗熔接剂在水中的溶解性，上述水系溶剂可以含有草酸盐、乙二胺、双吡啶、乙二胺四乙酸盐等鳌合物。另外，为了提高抗熔接剂在水中的溶解性，上述水系溶剂也可以含有氯化钠、硝酸铵、碳酸钾等电解质离子。在此，抗熔接剂在溶剂中的溶解度越高，除去效率越高，因此优选。关于优选的溶解度，如果将溶剂IOOg中的溶质的量(g)设定为溶解度，则优选为0. Olg以上，进一步优选为Ig以上，最优选为IOg以上。作为上述抗熔接剂的具体例，可以列举出氯化钙、氧化钙、硫酸钙、硝酸钙、碳酸钙、氢氧化钙、乙酸钙、柠檬酸钙等钙盐(或者络合物)，氯化钾、氧化钾、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、氢氧化钾、磷酸钾等钾盐，氯化钠、氧化钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、磷酸钠等钠盐等。需要说明的是，关于在该混合工序中使一次粒子与抗熔接剂混合的方法，没有特别的限定，可以是在固体的一次粒子中混合固体的抗熔接剂后、使用搅拌机进行混合的方法，也可以是在抗熔接剂的溶液中使一次粒子分散的方法。但是，由于难以均勻地混合固体和固体，因此，为了在一次粒子间均勻并且确实地存在抗熔接剂，可以说后者是优选的方法。在采用后者的方法的情况下，优选使分散有一次粒子的抗熔接剂溶液干燥。这是由于， 能够长期保持均勻地混合有一次粒子和抗熔接剂的状态。在后述的实施例中，在碳酸钙饱和水溶液中分散羟基磷灰石(HAp) —次粒子0. 5g，在80°C下使其干燥，从而获得混合粒子。另外，该混合工序可以为如下工序将包含在侧链上具有羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦酸基、氨基或者这些盐中的任一种的高分子化合物的溶液与上述一次粒子混合，再添加金属盐(碱金属盐和/或碱土金属盐和/或过渡金属盐)。通过采用上述工序，高分子化合物在磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}表面上吸附，由此，能够确实地防止在抗熔接剂混合过程中的磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}之间的接触，然后，通过添加钙盐，能够在磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}表面上确实地使抗熔接剂析出。需要说明的是，在以下的说明中，将在侧链上具有羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦酸基、氨基或者这些盐中的任一种的高分子化合物简单地称为“高分子化合物”。上述高分子化合物只要是在侧链上具有羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦酸基、氨基或者这些盐中的任一种的化合物，则没有特别的限定。例如作为在侧链上具有羧基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠、羧甲基纤维素、苯乙烯-马来酸酐共聚物等，作为在侧链上具有硫酸基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酸烷基硫酸酯、聚甲基丙烯酸烷基硫酸酯、聚苯乙烯硫酸等，作为在侧链上具有磺酸基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酸烷基磺酸酯、聚甲基丙烯酸烷基磺酸酯、聚苯乙烯磺酸等，作为在侧链上具有磷酸基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酸烷基磷酸酯、聚甲基丙烯酸烷基磷酸酯、聚苯乙烯磷酸、聚丙烯酰氨基甲基膦酸等，作为在侧链上具有膦酸基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酸烷基膦酸酯、聚甲基丙烯酸烷基膦酸酯、聚苯乙烯膦酸、聚丙烯酰氨基甲基膦酸、聚乙烯基烷基膦酸等，作为在侧链上具有氨基的高分子化合物，可以列举出聚丙烯酰胺、聚乙烯基胺、聚甲基丙烯酸氨基烷基酯、聚氨基苯乙烯、多肽、 蛋白质等。需要说明的是，在该混合工序中，可以使用上述高分子化合物中的任一种，也可以混合使用多种高分子化合物。需要说明的是，上述高分子化合物的分子量没有特别的限定，优选为IOOg/摩尔以上且IOOOOOOg/摩尔以下，进一步优选为500g/摩尔以上且500000g/摩尔以下，最优选为IOOOg/摩尔以上且300000g/摩尔以下。如果低于上述优选的范围，则进入一次粒子间的比例减少，阻止一次粒子之间的接触的比例降低。另外，如果超过上述优选的范围，则高分子化合物的溶解度降低、含有该高分子化合物的溶液的粘度增高等操作性变差，因此不优选。需要说明的是，含有高分子化合物的溶液优选为水溶液。这是由于，磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}烧结体粒子在强酸性条件下溶解。需要说明的是，如果是含有高分子化合物的水溶液的PH为5以上且14以下、HAp粒子不溶的条件，则没有特别的限定。含有该高分子化合物的水溶液，只要将高分子化合物在蒸馏水、离子交换水等中溶解，用氨水溶液、氢氧化钠、氢氧化钾等水溶液调节PH即可。另外，上述水溶液中含有的高分子化合物的浓度，优选为0. 001 % w/v以上且50% w/v以下，进一步优选为0. 005% w/v以上且30% w/v以下，最优选为0.01% w/v以上且 10% w/v以下。如果低于上述优选的范围，则进入一次粒子间的量少，阻止一次粒子之间的接触的比例降低。另外，如果超过上述优选的范围，则高分子化合物的溶解变困难、含有该高分子化合物的溶液的粘度增高等操作性变差，因此不优选。本发明中的混合工序中，将含有上述高分子化合物的溶液、和一次粒子混合。该混合例如可以在该溶液中投入一次粒子，通过搅拌操作等，使该一次粒子分散即可。通过该操作，在上述本发明的磷酸钙的制造方法中，在一次粒子的表面上吸附上述高分子化合物，从而可以在该一次粒子的表面上附加羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦酸基、氨基或者这些盐中的任一种。此时，该羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦酸基或者氨基在溶液中以离子的状态存在。接着，如果在混合有含有高分子化合物的溶液和一次粒子的溶液中进一步添加金属盐(碱金属盐和/或碱土金属盐和/或过渡金属盐)，则在上述一次粒子的表面上存在的羧酸根离子、硫酸根离子、磺酸根离子、磷酸根离子、膦酸根离子、氨基离子、与金属离子 (碱金属离子和/或碱土金属离子和/或过渡金属离子)结合，在一次粒子的表面上生成羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐。该金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐作为上述抗熔接剂发挥作用。因此，在其表面上生成金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐的一次粒子为所谓的“混合粒子”。需要说明的是，由于该金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐沉淀，因此，在回收该沉淀物后，使其干燥，用于后述的烧结工序即可。所述干燥例如可以列举出在减压条件下(优选为IXlO5Pa以上且IXlO-5Pa以下，进一步优选为1 X IO3Pa以上且1 X KT3Pa以下，最优选为1 X IO2Pa以上且1 X KT2Pa以下)进行加热 (优选为0°C以上且200°C以下，进一步优选为20°C以上且150°C以下，最优选为40°C以上且120°C以下)的方法。需要说明的是，上述干燥中，从能够降低干燥温度的方面出发，优选在减压条件下，也可以在大气压条件下进行。作为上述碱金属盐，没有特别的限定，例如可以利用氯化钠、次氯酸钠、亚氯酸钠、 溴化钠、碘化钠、碘酸钠、氧化钠、过氧化钠、硫酸钠、硫代硫酸钠、硒酸钠、亚硝酸钠、硝酸钠、磷化钠、碳酸钠、氢氧化钠、氯化钾、次氯酸钾、亚氯酸钾、溴化钾、碘化钾、碘酸钾、氧化钾、过氧化钾、硫酸钾、硫代硫酸钾、硒酸钾、亚硝酸钾、硝酸钾、磷化钾、碳酸钾、氢氧化钾寸。另外，作为上述碱土金属盐，例如可以利用氯化镁、次氯酸镁、亚氯酸镁、溴化镁、 碘化镁、碘酸镁、氧化镁、过氧化镁、硫酸镁、硫代硫酸镁、硒酸镁、亚硝酸镁、硝酸镁、磷化镁、碳酸镁、氢氧化镁、氯化钙、次氯酸钙、亚氯酸钙、溴化钙、碘化钙、碘酸钙、氧化钙、过氧化钙、硫酸钙、硫代硫酸钙、硒酸钙、亚硝酸钙、硝酸钙、磷化钙、碳酸钙、氢氧化钙等。另外，作为上述过渡金属盐，例如可以利用氯化锌、次氯酸锌、亚氯酸锌、溴化锌、 碘化锌、碘酸锌、氧化锌、过氧化锌、硫酸锌、硫代硫酸锌、硒酸锌、亚硝酸锌、硝酸锌、磷化锌、碳酸锌、氢氧化锌、氯化铁、次氯酸铁、亚氯酸铁、溴化铁、碘化铁、碘酸铁、氧化铁、过氧化铁、硫酸铁、硫代硫酸铁、硒酸铁、亚硝酸铁、硝酸铁、磷化铁、碳酸铁、氢氧化铁等。另外， 也可以为镍化合物。需要说明的是，在混合有含有高分子化合物的溶液和一次粒子的溶液中添加的金属盐(碱金属盐、碱土金属盐、过渡金属盐)可以为1种，也可以为2种以上的混合物。另夕卜，金属盐(碱金属盐、碱土金属盐、过渡金属)可以为固体的状态，从能够均勻地添加、以及能够控制所添加的浓度等理由出发，优选以水溶液的形式添加。另外，所添加的金属盐 (碱金属盐和/或碱土金属盐和/或过渡金属盐)的量(浓度)，只要是与在一次粒子表面上存在的羧酸根离子、硫酸根离子、磺酸根离子、磷酸根离子、膦酸根离子、氨基离子结合而产生金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐的条件，则没有特别的限定，进行适当研究后来确定即可。需要说明的是，通过上述工序在一次粒子的表面上生成的金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、膦酸盐、氨基酸盐，在后述的烧结工序中产生热分解，形成金属(碱金属和/或碱土金属和/或过渡金属)的氧化物。例如在一次粒子的表面上生成聚丙烯酸钙的情况下，通过烧结工序得到氧化钙。需要说明的是，由于该金属氧化物(碱金属氧化物和/或碱土金属氧化物(例如氧化钙)和/或过渡金属氧化物)为水溶性，因此，能够通过后述的除去工序简单地除去。需要说明的是，由于聚丙烯酸钠在水中可溶，因此，在本混合工序中可以作为抗熔接剂直接利用，由于聚丙烯酸钙在水中不溶，因此，优选暂时仅仅将聚丙烯酸吸附到一次粒子表面上后，添加钙盐等，由此，使聚丙烯酸钙在一次粒子表面上析出。另外，在高温(约 3000C以上)下对一次粒子进行预烧时，高分子化合物发生分解，因此，为了在预烧后也作为抗熔接剂发挥作用，可以说优选使高分子化合物的金属盐在一次粒子的表面上析出。但是，在高分子化合物不分解的(不软化的)温度下对一次粒子进行预烧(热处理)的情况下，特别不需要使高分子化合物的金属盐在一次粒子的表面上析出。(烧结工序)该烧结工序是将通过上述混合工序得到的混合粒子暴露于烧结温度下、使该混合粒子中含有的一次粒子形成为高结晶性磷酸钙微粒(烧结体粒子)的工序。由于在一次粒子的粒子间存在抗熔接剂，因此，即使暴露于烧结工序中的高温条件下时，也能够防止一次粒子之间的熔接。该烧结工序中的烧结温度，只要以高结晶性磷酸钙微粒的硬度达到所期望的硬度的方式适当设定即可，例如，更优选为100°c 1800°C的范围内，进一步优选为150°C 1500°C，最优选为200°C 1200°C。需要说明的是，对于烧结时间，只要以所期望的高结晶性磷酸钙微粒的硬度等为基准适当设定即可。在后述的实施例中，在800°C下进行1小时烧结。需要说明的是，在该烧结工序中使用的装置等，没有特别的限定，根据制造规模、 制造条件等，适当选择市售的煅烧炉来采用即可。(除去工序)该除去工序是除去在通过烧结工序得到的高结晶性磷酸钙微粒的粒子间混合存在的抗熔接剂的工序。关于除去的手段以及方法，只要根据上述混合工序中采用的抗熔接剂而适当采用即可。例如在使用具有溶剂溶解性的抗熔接剂的情况下，通过使用不溶解磷酸钙微粒的溶剂(非溶解性)并且溶解抗熔接剂的(溶解性)溶剂，能够仅将抗熔接剂溶解而除去。作为所使用的溶剂，只要是满足上述要素的溶剂，则没有特别的限定，可以为水系溶剂，也可以为有机溶剂。例如作为水系溶剂，可以列举出水、乙醇、甲醇等，作为有机溶剂，可以列举出丙酮、甲苯等。另外，上述水系溶剂为了提高抗熔接剂在水中的溶解性，可以包含草酸盐、乙二胺、双吡啶、乙二胺四乙酸盐等鳌合物。另外，上述水系溶剂为了提高抗熔接剂在水中的溶解性，可以含有氯化钠、硝酸铵、碳酸钾等电解质离子。但是，由于在该除去工序中不需要与使用有机溶剂对应的设备、不需要有机溶剂废液处理、制造作业的安全性高、对于环境的风险低等理由，因此优选所使用的溶剂为水系溶剂。需要说明的是，在高结晶性磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}烧结体粒子的情况下，由于在PH4.0以下的条件下溶解高结晶性磷酸钙{羟基磷灰石(HAp)}烧结体粒子，因此，优选在pH4. 0 pH12. 0下进行除去工序。但是，可以在使用溶剂除去抗熔接剂的情况下，使通过烧结工序得到的含有抗熔接剂的磷酸钙在溶剂中混悬，然后，通过过滤或者离心分离，仅回收磷酸钙粒子。在最佳方式的磷酸钙的制造方法中，上述操作并不限于1次，也可以进行2次以上。通过进行上述操作多次，可以说磷酸钙的抗熔接剂的除去率进一步提高。但是，由于制造工序变复杂、制造
11成本增高、磷酸钙的回收率降低等理由，不优选进行必要以上的上述操作。由此，上述操作的次数以作为目标的抗熔接剂的除去率为基准适当确定即可。需要说明的是，本工序中可以进一步包括为了使粒径均勻而进行分级的工序。除了使用上述溶剂除去抗熔接剂的方法之外，通过在抗熔接剂中使用磁性体，可以使用磁铁来除去抗熔接剂。更具体而言，在使通过烧结工序得到的含有抗熔接剂的磷酸钙粒子(粗磷酸钙粒子)群在适当的溶剂(水等)中混悬而分散后，对该混悬液施加磁力， 仅使抗熔接剂吸附到磁铁上，从而仅回收没有吸附的磷酸钙粒子。另外，特别是可以如下方法在溶剂中没有混悬，将粗磷酸钙粒子进行粉碎而形成粉体后，通过磁铁使抗熔接剂分离。但是，形成混悬液的方法，可以说磷酸钙粒子与抗熔接剂容易剥离，抗熔接剂的除去率高。需要说明的是，能够采用该方法的磷酸钙粒子，优选为非磁性体或者弱磁性体。《性质》通过上述本最佳方式的磷酸钙粒子的制造方法制造的磷酸钙粒子，根据抗熔接剂的作用，防止一次粒子之间的熔接，因此，其过半数保持一次粒子的状态。由此，使该高结晶性磷酸钙粒子在溶剂中混悬时，高结晶性磷酸钙粒子的过半数可以在由单晶构成的一次粒子或者由所述单晶构成的一次粒子通过离子的相互作用集合而成的粒子块(单晶一次粒子)中分散。本最佳方式的磷酸钙粒子的过半数为由单晶构成的一次粒子、或由所述单晶构成的一次粒子通过离子的相互作用集合而成的粒子块(单晶一次粒子)，在溶剂中分散性良好，由于没有形成二次粒子，因此，其表面积也高。在此，作为对磷酸钙微粒是否以一次粒子存在进行评价的方法，例如将利用电子显微镜观察测定粒径的结果、与利用动态光散射法以在溶剂中混悬的状态测定粒径的情况下的结果进行对比，由此，如果两者的结果几乎一致，则可以判断本最佳方式的磷酸钙粒子的大部分为一次粒子的状态，另外，如果与利用电子显微镜观察的粒径的测定结果相比，利用动态光散射法的粒径测定的结果更大，则判断引起一次粒子之间的熔接，形成二次粒子。需要说明的是，作为使本最佳方式的磷酸钙粒子分散的溶剂，只要是不溶解磷酸钙粒子的溶剂，则没有特别的限定。例如可以列举出水、甲醇、乙醇等醇类，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、环己酮等酮类，N, N-二甲基甲酰胺等酰胺类，二甲基亚砜等亚砜类，甲苯、二甲苯、己烷、十二烷、环己烷等烃类，氯苯、氯仿等卤化烃类，乙醚、二噁烷等醚类等，这些溶剂可以根据使用目的选择1种或2种来使用。 基于由动态光散射法求得的粒径分布图，通过求出与由电子显微镜求得的一次粒子的粒径几乎一致的粒径的粒子的比例，能够计算出由单晶构成的一次粒子、或由所述单晶构成的一次粒子通过离子的相互作用集合而成的粒子块(单晶一次粒子)的比例。需要说明的是，有时根据磷酸钙原料、抗熔接剂的种类、烧结的条件等而不同，根据上述本最佳方式的高结晶性磷酸钙粒子的制造方法，至少50%以上以单晶一次粒子存在，在更优选的情况下60%以上能够以单晶一次粒子存在，在最优选的条件下70%以上能够以单晶一次粒子存在。(用法用量)本最佳方式的胶原产生促进剂向应用部位上的送达方法，例如可以列举出在适当部位上的直接涂布、经皮吸收、皮下注射、外科的方法。
本最佳方式的胶原产生促进剂，一日2次，一次150mg (其中含有磷酸钙1. 5mg)，通过以化妆品的形式使用来发挥功效。实施例制造例1 (磷酸钙微粒的制造)(一次粒子生成工序)作为连续油相，使用十二烷[CH3 (CH2) 10CH3]，作为非离子性表面活性剂，使用浊点 31°C的五乙二醇十二烷基醚[CH3 (CH2)ltlCH2O (CH2CH2O)4CH2CH2OH]。在室温下，制备含有上述非离子性表面活性剂0. 5g的连续油相40ml。接着，在上述制备的连续油相中添加2. 5mol/ 1氢氧化钙[Ca(OH)2]分散水溶液10ml，制备油包水型溶液(W/0溶液)。在搅拌上述W/0 溶液的同时，向其中添加1. 5mol/l磷酸二氢钾[(KH2PO4)]溶液10ml。另外，在室温下搅拌 24小时的同时使其反应。接着，通过离心分离将所得到的反应物进行分离清洗，由此，获得羟基磷灰石(HAp) —次粒子群。(混合工序)在含有1. Og聚丙烯酸钠(ALDRICH公司制、重均分子量15000g/摩尔)的pH12. 0 的水溶液IOOml中分散1. Og的羟基磷灰石(HAp) —次粒子群，由此，在相同粒子表面上吸附聚丙烯酸钠。该水溶液的PH使用株式会社堀场制作所制造的pH计D-MSE进行测定。接着，通过在上述制备的分散液中添加0. 12mol/l的硝酸钙[Ca(NO3)2]水溶液 100ml，在相同一次粒子表面上使聚丙烯酸钙析出。该聚丙烯酸钙为抗熔接剂。作为其结果， 回收所产生的沉淀物，在减压下(约0. IPa)、80°C下使其干燥，由此，获得混合粒子。(烧结工序)将上述混合粒子装入坩埚中，在烧结温度800°C下进行1小时烧结。此时，聚丙烯酸钙发生热分解，得到氧化钙[CaO]。烧结工序结束后的氧化钙[CaO]的残存率为25%以上。(除去工序)为了提高抗熔接剂在水中的溶解性，制备50mmol/l硝酸铵[NH4NO3]水溶液。接着， 在上述制备的水溶液500ml中使由上述工序得到的烧结体混悬，通过离心分离进行分离清洗，再在蒸馏水中混悬，同样地通过离心分离进行分离清洗，由此，除去抗熔接剂以及硝酸铵，回收高结晶性羟基磷灰石(HAp)微粒。关于通过这些工序得到的羟基磷灰石微粒的详细的信息，以下进行总结。XRD 的半峰宽0. 2(d = 2. 814)形状球状平均粒径(通过电子显微镜)J8nm变动系数14%制造例2 (未煅烧)除了将一次粒子生成工序中的反应温度设定为30°C以外，在与制造例1相同的条件下仅仅进行一次粒子生成工序，而不进行之后的混合工序和烧结工序等之后的工序，由此，得到制造例2的未煅烧的羟基磷灰石微粒。以下，对于该羟基磷灰石微粒的详细的信息进行记载。XRD 的半峰宽0. 8(d = 2. 814)
形状粒子形状平均粒径(通过电子显微镜)42nm变动系数17%<成纤维细胞的I型胶原产生促进作用试验>将正常人成纤维细胞在含有试样0. 5%的FBS-DMEM培养基中培养M小时后，用 ELISA定量培养基中的胶原量。该实验在各自的条件下反复进行6次(η = 6)。在阳性对照(P. C.)中使用抗坏血酸磷酸镁(VCPMg)。需要说明的是，所使用的试样为在制造例1中制造的煅烧的羟基磷灰石、和在制造例2中使用的未煅烧的羟基磷灰石。将结果示于表1。 在此，表1中的“mean”表示在测定中得到的胶原量的实测值(平均值)，“SD”表示标准偏差，“p (t-test) ”表示通过“t-test”得到的ρ值{通常如果为0. 05 (严格意义上为0. 01) 以下，则表示是具有差异的值，相反，在为大于0. 05的值的情况下，表示几乎没有差异}。
权利要求
1.一种胶原产生促进剂，其特征在于，以磷酸钙微粒作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒为羟基磷灰石微粒。
3.根据权利要求1或2所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒的平均粒径为 10 lOOOnm。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的胶原产生促进剂，其中，所述磷酸钙微粒为烧结体。
5.根据权利要求4所述的胶原产生促进剂，其中，所述烧结体通过包括如下工序的方法而制得混合工序，将含有磷酸钙的一次粒子与抗熔接剂混合；和烧结工序，将通过所述混合工序得到的混合粒子暴露于烧结温度下。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的胶原产生促进剂，其含有选自醇类、糖类、蛋白质类、氨基酸类、水溶性维生素类、脂溶性维生素类、脂质、粘多糖类、表面活性剂中的至少一种物质。
全文摘要
本发明提供使皮肤组织中包含的胶原量增加的新型胶原产生促进剂。一种胶原产生促进剂，其特征在于，以磷酸钙微粒作为有效成分。
文档编号A61K47/36GK102458423SQ200980160540
公开日2012年5月16日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者小粥康充, 河边卡尔和重 申请人:株式会社索夫塞拉