专利名称：p53的表达促进方法和该方法中使用的p53表达促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进细胞中p53表达的方法、该方法中使用的p53表达促进剂及其用 途。
背景技术：
在DNA受到损伤时，细胞会对该损伤进行修复，在不能修复的情况下，细胞发生凋 亡。已知p53是在凋亡过程中具有重要作用的蛋白质。p53是转录因子，是由393个氨基酸 构成的分子量为53， 000Da的核蛋白质。由于p53在正常细胞中被很快分解，所以在细胞内 的蛋白质表达水平低。但是，正常细胞在DNA受到损伤等情况下，通过信号转导，p53被磷 酸化而变得稳定。结果，依靠P53进行转录的各种基因(p21基因、noxa基因、p咖a基因、 Pig3基因等)的转录得到促进，在它们的基因产物的参与下，发生细胞的凋亡。
但是，在肿瘤细胞中，即使发生了如上所述的在正常细胞中可引起凋亡的DNA损 伤，也难以诱导凋亡。已知的原因之一是p53基因的变异。p53基因变异时，所表达的p53 蛋白质丧失了功能，结果阻碍了凋亡的进行。而且，从P53基因的变异与肿瘤的进展高频度 地相关这一事实，可知p53作为肿瘤抑制因子具有重要作用(非专利文献1 3)。但是， p53基因的变异是肿瘤进展过程(恶化)中较晚的阶段中出现的现象，临床诊断出的多数肿 瘤未发生p53基因的变异，并且有报告指出p53表达减少的现象。例如，有报告表明，在乳 腺肿瘤的情况下，约80X没有p53基因的变异，并且，p53的mRNA的表达量比周围正常组织 减少约1/5 1/10(非专利文献1、4、5)。 非专利文献1 :Steele， R. et al. Br. J. Surg. 85， 1460-7 (1998)
非专利文献2 :Levine， A. et al. Cell 88， 323-331 (1997)
非专利文献3 :Vogelstein， B. et al. Nature 408， 307-310 (2000)
非专利文献4 :Pharoah， P. et al. Br. J. Cancer 80， 1968-1973 (1999).
非专利文献5 :Raman， V. et al. Nature 405， 974-978 (2000)
发明内容
因此认为，在肿瘤细胞中，如果抑制p53mRNA的表达量的减少，使p53mRNA的表达 量维持或者增加，则可以例如促进依靠p53转录的各种基因的转录，通过获得的各种基因 产物，使肿瘤细胞发生凋亡。 因此，本发明的目的是提供一种促进p53的mRNA表达的方法以及在该方法中使用 的表达促进剂。 为了实现上述目的，本发明的促进p53表达的方法是一种促进细胞中p53基因表 达的方法，其特征在于，抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA 结合，从而促进P53基因的表达。 本发明的p53表达促进剂是一种在本发明的促进p53表达的方法中使用的p53表 达促进剂，其特征在于，它包含可抑制从vegf-A基因的外显子1转录的RNA与从p53基因
7转录的mRNA结合并且从下述(Al) (A4)中选出的至少一种结合抑制剂 (Al)可分解从vegf-A基因的外显子l转录的RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶
分解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物以及核酶中选出的至少一种结合抑制剂； (A2)可抑制从vegf-A基因的外显子l转录RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶分
解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物、核酶以及DECOY核酸中选出的至少一种结合抑制
剂； (A3)可与从vegf-A基因的外显子l转录的RNA结合、并且包含从p53基因转录的 mRNA之外的其他核酸的结合抑制剂； (A4)含有一种表达载体的结合抑制剂，所述表达载体中插入了从上述(Al) (A3)中选出的至少一种结合抑制剂的编码DNA。 本发明的凋亡促进方法是一种促进细胞凋亡的方法，其特征在于，通过本发明的 促进p53表达的方法来促进细胞内p53的表达。 本发明的凋亡促进剂是一种用于促进细胞凋亡的凋亡促进剂，其特征在于，包含 本发明的p53表达促进剂。 本发明的增强方法是一种增强细胞对抗癌剂的感受性的方法，其特征在于，通过 本发明的促进p53表达的方法来促进所述细胞中p53的表达。 本发明的增强剂是一种用于增强细胞对抗癌剂的感受性的增强剂，其特征在于， 它含有本发明的p53表达促进剂。 本发明的治疗方法包括将本发明的p53表达促进剂给予生物体内的癌细胞。
本发明的抗癌剂的特征在于含有本发明的p53表达促进剂。 本发明的p53mRNA结合剂是一种可与p53mRNA结合的结合剂，其特征在于，所述结 合剂中含有核酸，所述核酸中包含Seq ID No :l所示的vegf-A mRNA中的第694位-第714 位的序列组成的RNA。 本发明的vegf-A mRNA结合剂是一种可与vegf-A mRNA结合的结合剂，其特征在 于，所述结合剂含有核酸，所述核酸中包括Seq ID No :2所示的p53mRNA中的第462位-第 481位的序列组成的RNA。 本发明的筛选方法是一种筛选可促进p53表达的表达促进剂的方法，其特征在 于，包括下述步骤(A) 步骤(C): (A)在候选物质的存在下，使本发明的p53mRNA结合剂与本发明的vegf-A RNA结 合剂接触， (B)检测所述候选物质对所述p53mRNA结合剂与所述vegf-ARNA结合剂相结合的 抑制， (C)将抑制了所述p53mRNA结合剂与所述vegf-A RNA结合剂的结合的候选物质， 选择为p53表达促进剂。 下文中，将从vegf-A基因转录的RNA称为"vegf-A RNA"，上述vegf-A RNA也包括 例如从vegf-A基因转录的mRNA的含义。另外，将从p53基因转录的mRNA称为"p53mRNA"。
为了弄清肿瘤细胞中p53mRNA表达量减少的原因，本发明人进行了努力的研究。 结果发现，血管内皮生长因子A (VEGF-A)的RNA (vegf-A RNA)与p53mRNA的表达有关。并 且进行了进一步的研究，结果发现，在从vegf-A基因转录的RNA中，从外显子1转录的RNA与p53mRNA结合，由此抑制p53mRNA的表达。因此，通过抑制从vegf-A基因外显子1转录 的RNA与p53mRNA结合，来避免p53mRNA表达的减少，促进p53的表达(p53mRNA的转录以 及p53蛋白质的翻译)，由此完成本发明。这样，根据本发明可促进p53的表达，由此可促 进依靠p53进行转录的、参与凋亡的基因的转录。所以，最终可促进目标细胞的凋亡的发 生。特别是在医疗领域中，可利用细胞的凋亡进行肿瘤恶化的预防和癌症的治疗，所以本发 明可以说是治疗癌症等的有用手段。另外，已知在P53表达量下降的肿瘤细胞中，对抗癌剂 的感受性下降，并表现出抗癌剂耐性。但是，根据本发明，可增强细胞对抗癌剂的感受性，从 而使现已公知的抗癌剂高效地发挥作用。如上所述，本发明在癌症治疗等医疗领域中，可以 说是非常优秀的手段。另外，认为p53mRNA的表达量下降是由以下机制导致的。S卩，转录的 p53mRNA与从vegf-A基因外显子1转录的RNA结合，形成异源双链RNA，在翻译过程中，形 成异源双链RNA的p53mRNA被分解。另外，本发明不受这种机制的限制。
另外已知，与作为肿瘤抑制因子的p53蛋白相反，VEGF-A蛋白参与肿瘤血管的生 成，并且还作为肿瘤细胞的生存因子起作用，所以在肿瘤进展中起关键性的作用。因此在以 前，已经开发了通过抑制VEGF-A蛋白的表达来抑制肿瘤恶化的技术。具体地说，有报告指 出，通过以vegfmRNA中蛋白质编码区的外显子2、3、4和5为耙标的siRNA，抑制VEGF-A蛋 白的表达。但是到目前为止，没有任何报告指出在p53mRNA表达量下降中有RNA参与，更进 一步说有来自vegf-A基因外显子1的RNA参与。
图1是本发明实施例Al的结果，(a)是显示各细胞中vegf mRNA表达的照片，(b) 是显示经抗癌剂5-FU处理的各种细胞的凋亡比例(％ )的图，(c)是显示表达vegf siRNA 的细胞中p53mRNA和p53蛋白的表达的照片，(d)是显示表达vegfsiRNA的细胞中p53靶 基因的mRNA表达的照片。 图2是本发明实施例A2的结果，(a)是表示各种质粒构建体的示意图，(b)是显示
各细胞中p53mRNA的表达的照片，(c)是显示各细胞中p53蛋白的结果的照片。 图3是本发明实施例A3的结果，(a)是显示各种质粒构建体的示意图，(b)是显示
各细胞中p53mRNA的结果的照片，(c)是显示各细胞中p53mRNA、p53蛋白和L-VEGF蛋白的
表达的照片。 图4是本发明的上述实施例A3的参考例，是显示H1299细胞中p53mRNA的表达的 照片，在该H1299细胞中，同时导入了表达各种基因中的5'UTR和CAT mRNA的嵌合mRNA的 质粒以及表达p53的质粒。 图5是本发明的实施例A4的结果，(a)是显示各细胞中内源性p53mRNA的表达的 照片，(b)是显示各细胞中内源性p53蛋白的表达的照片，(c)是显示noxa mRNA、bax mRNA 和p21mRNA的表达的照片。 图6是上述实施例A4的结果，(d)是显示5-FU浓度变化时各种细胞的凋亡比例 (% )的图，(e)是显示经5-FU处理的各种细胞的凋亡比例(％ )随时间变化的图。
图7是本发明的实施例A5的结果，(a)是显示各细胞中存在内源性p53mRNA及 其分解物的照片，(b)是显示各细胞中p53mRNA的表达的照片，(c)是显示vegf5'UTR和 p53mRNA在体外会合的照片。
图8是上述实施例A5的结果，(d)是显示在vegf 5' UTR共存下的无细胞蛋白质 合成反应液中存在p53mRNA及其分解物的照片，(e)是显示在vegf5'UTR共存下的无细胞 蛋白质反应液中合成p53蛋白的放射自显影。 图9是显示本发明的实施例A6中各种质粒构建体的示意图。 图10是显示在本发明的实施例A6中，在各种癌细胞中存在vegflres RNA的照片。 图11是上述实施例A6的结果，(a)和(b)是显示各细胞中p53mRNA的表达的照片。 图12是本发明的实施例A7的结果，(a)是移植有表达vegf-A5' UTR的导入细胞 的小鼠的照片，(b)是移植有表达变异型vegf-A 5' UTR的导入细胞的小鼠的照片。
图13是显示在本发明的上述实施例A7中，移植有导入细胞的小鼠的肿瘤体积随 时间变化的图。 图14是显示在本发明的实施例A8中，经各种抗癌剂处理的各种vegf 5'UTR表达 细胞的凋亡比例(％ )的图。 图15是显示在本发明的实施例A9中，经各种抗癌剂处理的各种siRNA表达细胞 的凋亡比例(％)的图。 图16是显示在本发明的实施例A10中，经各种抗癌剂处理的各种siRNA表达细胞 的相对生存率(％ )的图。 图17是本发明的实施例All的结果，(a)是显示各种质粒构建体的示意图，(b)是 显示p53mRNA的表达水平的照片。 图18是显示本发明的实施例Bl的结果的图，(a)是显示导入了各种表达载体的 细胞表达vegf IresRNA的照片，(b)是显示上述导入细胞表达p53mRNA的图，(c)是显示上 述导入细胞表达p53蛋白的照片，(d)是显示经各种抗癌剂处理的上述导入细胞的凋亡比 例(％)的图，(e)是显示上述导入细胞的肿瘤体积随时间变化的图。 图19是显示本发明的实施例Bl的结果的图，(f)是显示上述细胞中的肿瘤的照 片。 图20是显示在本发明的实施例B2中，表达针对vegf mRNA的siRNA的细胞中的 肿瘤体积随时间变化的图。 图21是显示本发明的实施例B3的结果的图，(a)是显示在表达vegf mRNA的 siRNA的细胞中，表达vegf mRNA和vegf IresRNA的图或照片，(b)是显示表达上述siRNA 的细胞中凋亡的比例(％)的图，(c)是显示表达上述siRNA的细胞中表达p53mRNA的图， (d)是显示表达上述siRNA的细胞中表达p53蛋白的照片。 图22是显示本发明的实施例B3的结果的图，(e)是显示表达上述siRNA的细胞 中表达p53耙基因的mRNA的图，(f)是显示在受到各种应激的细胞中各种RNA的表达的照 片。 图23是显示本发明的实施例B4的结果的图，(a)是显示导入了各种表达载体的 细胞中表达p53mRNA和vegf IresRNA的照片，(b)禾P (c)是显示p53mRNA和vegf IresRNA 的相互作用区域的图。 图24是显示本发明的实施例B4的结果的图，(d)是显示vegflresRNA的二级结构 的图，(e)是显示vegf IresRNA中人为缺失的区域的图，(f)是显示在表达部分缺失的vegfIresRNA的细胞中表达RNA的照片，(g)是显示在RNA Pull-Down试验中各种vegf IresRNA 和p53mRNA的结合的照片。 图25是显示本发明的实施例CI的结果的图，(a)是显示在导入了 p53DEC0Y的细 胞中表达p53mRNA的照片，(b)是显示上述细胞的存活率的图。 图26是显示本发明的实施例C2的结果的图，(a)是显示在导入了 vegf IresRNA 的反义物的细胞中表达p53mRNA的照片，(b)是显示上述细胞的存活率的图。
具体实施例方式
本发明中，所谓的"p53的表达"直接地是指p53mRNA的表达(即转录)，但间接地 也包括p53蛋白的表达(即翻译)。本发明中，mRNA可以是mRNA前体( 一次转录mRNA)， 也可以是加工(剪接)后的成熟RNA。另外，RNA既可以是上述mRNA前体的部分序列，也可 以是上述成熟RNA的部分序列。 本发明中，vegf-A是血管内皮生长因子A(vascular endothelialgrowth factor A)。本发明中，Seq ID No :1表示从人vegf-A基因转录的成熟mRNA全序列，即除去内含 子、包括非翻译区域的全长成熟mRNA。 Seq ID No :1中，1-1104位的区域是"外显子1区"、 1-1038位的区域是"5'UTR区"。Seq ID No : 1中第600位-第879位的区域是作为小分 子RNA表达的区域。下文中将由该区域组成的RNA称为vegflresRNA或IresRNA。 5' UTR 和IresRNA是非翻译性RNA。外显子1区域中的非翻译性区域是指在起始密码子(从Seq ID No :1的第1039位起的AUG)的上游的区域。Seq ID No :1中，第1039-1041位的区域是 "起始密码子(aug)"，第1684-1686位的区域是"终止密码子(uga)"。该成熟mRNA序列，例 如它的第8个碱基以后，在NCBI编号NMJ)03376中收录。另外，在Seq ID No:l中，将"u" 用"t"表示的序列即为vegf-A基因的cDNA序列。另夕卜，Seq ID No :45表示人vegf-A基 因的一次转录产物的部分序列，即含有内含子的、mRNA前体的部分序列。Seq IDNo :45中的 第1-1104位的区域与上述Seq ID No :1相同，第1105位以后是"内含子1"的5'侧的部 分序列。另外，Seq ID No :45中将"u"用"t"表示的序列是vegf-A基因的基因组DNA的 部分序歹l」，在例如NCBI编号AL136131. 15中收录。本发明中，vegf-A mRNA序列不限制于 上述的Seq ID No :1序列，还可以是具有SNP等各种多态性的序列。 另外，Seq ID No :2表示从人p53基因转录的成熟mRNA全序列，即除去内含子、含 有非翻译区的全长成熟mRNA。该全序列在例如Ensemble Transcript ID :ENST00000269305 中收录。Seq ID No :2中，第252位-第254位的区域是"起始密码子(aug)"，第1431-1433 位的区域是"终止密码子(uga)"。本发明中，p53mRNA的序列不限制于上述Seq ID No :2 的序列，可以是例如具有SNP等各种多态性的序列。
〈促进p53表达的方法〉 如上所述，本发明的促进p53表达的方法是一种促进细胞中p53基因表达的方法， 其特征在于，抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA结合，从而 促进p53基因的表达。在下文中，该结合抑制步骤也称为(a)步骤。 如上所述，本发明可通过抑制vegf-A RNA与p53mRNA的结合来抑制vegf-A RNA 对p53表达的抑制，所以也可称为"抑制p53的表达抑制的方法"、"p53的表达回复方法"、 "p53的表达维持方法"。另外，本发明中，所说的与p53mRNA的结合被抑制、从vegf-A基因外显子1转录的RNA可以是例如下述RNA中的任意一种从整个外显子1转录的RNA、从含 有所述外显子1的区域转录的RNA、从外显子1的部分区域转录的RNA、从含有外显子1部 分区域的区域转录的RNA。 本发明的上述(a)步骤中，抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因
转录的mRNA的结合的方法可包括例如从下述(al)步骤 (a3)步骤中选出的至少一个步
骤的方法。本发明可以包括任意一个步骤，也可以包括两个以上的步骤。另外，两个以上步
骤可以例如同时进行，也可以单独进行。 (al)分解从vegf-A基因外显子1转录的RNA ; (a2)抑制从vegf-A基因外显子1转录RNA ; (a3)使从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA之外的其他 核酸结合，从而抑制上述RNA与从p53基因转录的mRNA的结合。 首先，对上述(al)步骤进行说明。在上述(al)步骤中，只要例如使转录的RNA减 少即可，对其机制没有特别的限制，例如可以通过分解进行。本发明中的分解也包括例如切 断的含义。通过上述(al)步骤，虽然从vegf-A基因外显子l转录RNA，但是该转录物被分 解(或者切断)，所以可最终抑制所述RNA的表达量(转录量)。因此，可以抑制从vegf-A 基因外显子1转录的RNA与p53mRNA结合，结果可防止p53mRNA的表达抑制，促进p53的表 达。 在上述(al)步骤中，作为分解对象的RNA在下文中称为目标RNA，该区域称为目 标区域。在上述(al)步骤中，对于从vegf-A基因外显子l转录的RNA，可以是例如vegf-A mRNA中的外显子1RNA的整体被分解，也可以是外显子1RNA的部分被分解。也就是说，在上 述(al)步骤中，目标RNA既可以是外显子1RNA整体，也可以是外显子1RNA的一部分。另 外，上述目标RNA可以是由从vegf-A基因转录的RNA中的含有所述外显子1RNA的区域组 成的RNA，也可以是由所述外显子1RNA的部分序列组成的RNA，还可以是由含有所述外显子 1部分序列的区域组成的RNA。 上述目标RNA优选例如至少是由Seq ID No : 1中第600位_第879位的序列的 全部或部分序列组成的RNA。即，上述目标RNA优选是在vegf-A mRNA的外显子1RNA内存 在的、上述IresRNA的全部或者一部分。另外，上述目标RNA可以是在vegf-A mRNA中由含 有所述IresRNA的区域组成的RNA，也可以是由含有所述IresRNA的一部分的区域组成的 RNA。对于上述目标RNA中的所述IresRNA的部分序列，例如，其碱基数可以是100 150 碱基，优选80 100碱基，更优选20 40碱基。另外，优选地，所述IresRNA的部分序列 可以是例如由Seq ID No :1中的第694位-第714位、第693位-第714位、第691位-第 703位或者第711位-第723位的序列组成的RNA，或者是含有所述RNA的序列。另外，本 发明并不限制于此。 上述目标RNA的具体实例如下所示。可以将它们中的任意一种作为目标RNA，也 可以将两种以上作为目标RNA。另外，还可以将含有这些RNA的区域组成的RNA作为目标 RNA。另外，本发明并不限制于此。 (1) Seq ID No :1中第600位_第879位的序列组成的RNA
(2) Seq ID No : 1中第659位-第879位的序列组成的RNA
(3) Seq ID No : 1中第659位-第780位的序列组成的RNA
4) Seq ID No
5) Seq ID No
6) Seq ID No
7) Seq ID No
8) Seq ID No
9) Seq ID No
10) Seq ID No
11) Seq ID No
12) Seq ID No
13) Seq ID No
1中第659位-1中第659位-1中第694位-1中第693位-1中第691位-1中第711位-1中第16位-1中第659位 1中第526位
第752位的序列组成的RNA 第745位的序列组成的RNA 第714位的序列组成的RNA 第714位的序列组成的RNA 第703位的序列组成的RNA 第723位的序列组成的RNA 第780位的序列组成的RNA -第917位的序列组成的RNA -第1104位的序列组成的RNA
:45中第526位-第1216位的序列组成的RNA :14)vegf mRNA中的5' UTR RNA :15)vegf mRNA中的外显子1的RNA :16)vegf mRNA。
上述(1)是IresRNA， (2) (9)是IresRNA的部分序列，(10)和(11)是含有 IresRNA的一部分的序列，(12) (16)是含有IresRNA整体的序列。上述(10)的第16 位-第780位的区域作为功能未知的序列收录于NCBI编号BC019867中，上述(12)的第526 位-第1216位的区域收录于NCBI编号BC011177中。如上所述，上述(14)的5'UTRRNA是 Seq ID No :1中的第1 1038位的区域，上述(15)的外显子1RNA是Seq ID No :1中的第 1位 第1104位的区域。上述(16)的vegf-A mRNA可以是成熟mRNA和mRNA前体中的任 意一种。上述目标RNA之中，特别优选分解IresRNA内的、上述(2) 659位-879位的RNA，上 述(6) 694位-714位、(7) 693位-714位、(8) 691位-703位或者(9) 711位-723位的区域 组成的RNA，或者，vegf-A mRNA中由含有上述RNA的区域组成的RNA。
上述目标RNA还可以是例如下述(17)。 (17)上述(1) (16)的RNA中， 一个或多个碱基被置换、缺失、插入或添加而成 的碱基序列组成的、并且具有抑制p53表达的功能的RNA，或者具有与p53mRNA结合的功能 (或者形成杂合物的功能)的RNA。 在上述(al)步骤中，对上述目标RNA的分解方法没有特别的限制，可采用用于RNA 分解的现已公知的方法。具体实例有，例如，使用siRNA、可用核糖核酸酶切断从而游离出 siRNA的siRNA前体、反义物、核酶等分解用核酸的方法，以及使用表达上述分解用核酸的 表达用载体的方法。通过用这些分解用核酸分解目标RNA，从vegf-A基因外显子1转录的 RNA与p53mRNA的结合被抑制。因此，本发明中，上述分解用核酸以及表达它们的表达用载 体也被称为"结合抑制剂"。另外，如上所述，这些结合抑制剂使目标RNA分解，从vegf-A基 因外显子1转录的RNA与p53mRNA结合被抑制，结果促进了 p53的表达。因此，上述的结合 抑制剂还可称为促进p53表达的p53表达促进剂。作为本发明的p53表达促进剂，在后文 中对它们进行叙述。 对于使用上述结合抑制剂的处理方法没有特别的限制。例如，可将上述结合抑制 剂直接导入目标细胞中。另外，在上述结合抑制剂是表达上述分解用核酸的表达载体的情 况下，可以将上述表达载体导入目标细胞，在所述细胞内由所述表达载体表达上述结合抑 制剂。
接下来对上述(a2)步骤进行说明。在上述(a2)步骤中，只要能够抑制从vegf基 因外显子1转录RNA就可以，其机制没有特别的限制。若采用上述(a2)步骤，则从vegf-A 基因外显子1向RNA的转录本身被抑制，因此可抑制上述RNA与p53mRNA的结合。可以理 解，结果是可防止p53mRNA的表达抑制，促进p53的表达。在上述(a2)步骤中，"抑制RNA 的转录"不仅包括例如转录完全停止的情况，也包括转录量减少的情况。另外，"抑制RNA的 转录"还包括例如以下情况在vegf-A基因中，由于一个或多个碱基被置换、缺失、插入或 添加，而转录失去抑制p53表达的功能的RNA，或者转录失去与p53mRNA形成杂合物的功能 的RNA，或者转录这些功能减弱的RNA。 在上述(a2)步骤中，转录抑制的对象在下文中被称为目标RNA，该区域被称为目 标区域。上述(a2)步骤中的目标RNA与上述(al)步骤中的目标RNA相同。具体地说，在 上述(a2)步骤中，对于从vegf-A基因外显子1转录RNA，可以抑制例如外显子1RNA的整体 转录，也可以抑制外显子1RNA的部分转录。S卩，在上述(a2)步骤中，目标RNA既可以是外 显子1RNA整体，也可以是外显子1RNA的一部分。另外，上述目标RNA可以是vegf-A mRNA 中由含有上述外显子1RNA的区域组成的RNA，也可以是由含有上述外显子1RNA的一部分的 区域组成的RNA。 上述目标RNA优选至少是由Seq ID No :1中的第600位-第879位的序列的全 部或部分序列组成的RNA。即，上述目标RNA优选是在vegf-A mRNA的外显子1RNA内存在 的、上述IresRNA的全部或者一部分。另外，上述目标RNA可以是在从vegf-A基因转录的 RNA中由含有上述IresRNA的区域组成的RNA，也可以是由含有上述IresRNA的一部分的区 域组成的RNA。上述部分序列的碱基数或者序列的具体实例例如如上所述。另外，目标RNA 的具体实例与上述(al)步骤一样，例如可例举出(1) (17)。另外，并不限制于此。
在上述(a2)步骤中，对上述目标RNA的转录抑制方法没有特别的限制，可采用用 于RNA转录抑制的现已公知的方法。具体实例有例如，使用siRNA、可用核糖核酸酶切断而 游离出siRNA的siRNA前体、反义物、核酶、DEC0Y核酸等转录抑制用核酸的方法，以及使用 表达上述转录抑制用核酸的表达用载体的方法。具体地说，例如，使用以vegf-A基因启动 子区序列为靶标的siRNA、反义物或核酶、含vegf-A基因启动子区序列的DECOY核酸等，通 过抑制启动子活性，可抑制从vegf-A基因转录目标RNA。由于用这些转录抑制用核酸抑制 了目标RNA的转录，所以从vegf-A基因外显子1转录的RNA与p53mRNA的结合被抑制。因 此，本发明中，与上述(al)步骤一样，上述转录抑制用核酸以及表达它们的表达用载体也 被称为"结合抑制剂"。如上所述，这些结合抑制剂抑制目标RNA的转录，来自vegf-A基因 外显子1的RNA与p53mRNA的结合被抑制，结果促进了 p53的表达。因此，与上述(al)步 骤一样，上述结合抑制剂也可被称为促进P53表达的p53表达促进剂。作为本发明的p53 表达促进剂，对此将在下文中叙述。对使用上述结合抑制剂的处理方法没有特别的限制，例 如，可与上述(al)步骤一样。 接下来，对(a3)步骤进行说明。在上述(a3)步骤中，例如，只要使细胞内从vegf-A 基因外显子1转录的RNA与上述细胞内转录的p53mRNA之外的其他核酸结合即可。与 p53mRNA结合的上述其他核酸在下文中称为DECOY核酸。这样，DECOY核酸与从vegf-A基 因外显子1转录的RNA结合，上述RNA中的与p53RNA的结合部位被掩盖，从而可抑制上述 RNA与p53mRNA的结合。由此可以防止vegf-A RNA抑制p53mRNA的表达，促进p53的表达。另外，也可以使用表达上述DECOY核酸的表达载体，使细胞中从上述表达载体表达的DECOY 核酸与从vegf-A基因外显子1转录的RNA结合。这样，上述DECOY核酸以及表达它们的载 体可促进p53的表达，所以也可称为p53表达促进剂。作为本发明的p53表达促进剂，对此 将在后文中叙述。 对于使用上述DECOY核酸的处理方法没有特别的限制，例如可以在目标细胞中直 接导入DECOY核酸。另外，在使用表达上述DECOY核酸的表达载体的情况下，可以将上述表 达载体导入目标细胞，在上述细胞内由上述表达载体表达上述核酸DECOY。
根据本发明，如上所述，通过p53表达的促进(回复)，可促进依靠p53进行转录的 各种基因的转录，从而进行细胞的凋亡。因此，可适用本发明的细胞没有特别的限制，优选 是希望进行凋亡的细胞。具体地说，是例如p53mRNA的表达量下降的细胞，特别希望适用于 肿瘤细胞。细胞的具体实例有，例如肝癌细胞、大肠癌细胞(结肠癌细胞)、肺癌细胞、乳腺 癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞等。对细胞的来源没 有特别的限制，可来自例如人、除人外的哺乳类等动物。 上述细胞可以是例如从生物体取出的细胞，也可以是生物体内的细胞。因此，本发 明的促进p53表达的方法可以例如在体外(in vitro)适用于目标细胞或目标组织，也可以 在体内(in vivo)适用于生物体内的目标细胞或目标组织。另外，还可以离体(ex vivo) 适用于目标细胞或目标组织。
〈p53表达促进剂〉 如前所述，本发明的p53表达促进剂的特征在于，例如，包括可抑制从vegf-A基因 的外显子l转录的RNA与从p53基因转录的mRNA结合、并且从下述(Al) (A4)中选出的 至少一种结合抑制剂。本发明的p53表达促进剂也可称为"p53表达回复剂"或者"p53表 达维持剂"。 (Al)可分解从vegf-A基因的外显子l转录的RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶 分解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物以及核酶中选出的至少一种结合抑制剂；
(A2)可抑制从vegf-A基因的外显子l转录RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶分 解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物、核酶以及DECOY核酸中选出的至少一种结合抑制 剂； (A3)可与从vegf-A基因的外显子l转录的RNA结合、并且包含从p53基因转录的 mRNA之外的其他核酸的结合抑制剂； (A4)含有一种表达载体的结合抑制剂，所述表达载体中插入了从上述(Al) (A3)中选出的至少一种结合抑制剂的编码DNA。 本发明的p53表达促进剂可以包括例如(Al) (A4)的结合抑制剂中的任意一 种，也可以包括两种以上。 siRNA、反义物、核酶以及DECOY核酸技术作为例如分解从基因转录的RNA的手段， 或者抑制从基因转录RNA的手段已经被确立。因此，在实施本发明时，为了分解目标RNA或 者抑制目标RNA的转录，siRNA、反义物、核酶以及DECOY核酸等的设计可由本领域技术人员 根据技术常识进行。此外，对siRNA、反义物、核酶以及DECOY核酸等的构成材料没有特别的 限制，例如可以是天然来源的核酸，也可以是PNA等人工核酸等，没有什么限制(下同)。
首先，对上述(Al)的结合抑制剂进行说明。该结合抑制剂对应于例如本发明的p53表达促进方法中的上述(al)步骤中所述的结合抑制剂。该结合抑制剂分解的目标RNA 与上述本发明的p53表达促进方法的(al)步骤中的目标RNA相同。 (Al)可分解从vegf-A基因的外显子l转录的RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶 分解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物以及核酶中选出的至少一种结合抑制剂。
本发明的p53表达促进剂，作为上述(Al)的结合抑制剂，可包括siRNA、可由核糖 核酸酶切断而游离出siRNA的siRNA前体、反义物以及核酶中的任何一种。此外，上述结合 抑制剂可以是任意一种，也可以两种以上同时使用。 上述结合抑制剂优选为例如siRNA。上述siRNA通常是由与mRNA等RNA互补的 反义链以及与之互补的正义链组成的双链RNA。 siRNA的各链的长度没有特别的限制，但通 常为19 25碱基的寡核苷酸，优选为19碱基。上述siRNA例如可以在各链的3'末端具 有悬突(overhang)，在这种情况下，各自的3'末端形成突出的形状。悬突的长度没有特别 的限制，但通常为2碱基。悬突的序列没有特别的限制，例如，在反义链中，可以是与结合的 RNA互补的序列，在正义链中，可以是与反义链互补的序列，即与反义链所结合的RNA相同 的序列。另外也可以是其他序列，例如皿、au、ag、gc、cc等序列。与反义链对应的正义链 可以是例如内部序列比反义链短2碱基左右的序列。 反义链的序列可以例如不与结合的RNA序列完全互补，但与上述mRNA的相同性例 如在70%以上，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上，最优选100% (完全 地匹配)。另外，反义链中，除悬突外的上述寡核苷酸序列可以例如不与结合的mRNA序列完 全互补，但与上述mRNA的相同性例如在70 %以上，优选80 %以上，更优选90 %以上，特别优 选95%以上，最优选100% (完全一致)。 另外，对于vegf-A RNA，上述siRNA的结合区域并不限制于上述目标RNA区域。通 常，由siRNA切断mRNA首先在siRNA结合区域内发生，但已知也可首先在其他区域发生切 断，最终目标区域被完全切断。因此，siRNA可被设计成例如与vegf-A RNA的目标区域结 合，也可被设计成与上述目标区域以外的区域结合。在后一种情况下，siRNA结合区域内的 切断首先发生，结果目标区域(目标RNA)也被分解。因此，即使从vegf-A基因外显子l转 录RNA，结果也是上述RNA被分解，所以上述RNA与p53mRNA的结合被抑制，失去了抑制p53 表达的功能。 如上所述，siRNA在vegf-A mRNA上的结合区域没有特别的限制，但是优选例如 在上述目标RNA区域的内部，例如在IresRNA内部、5' UTR内部、外显子1RNA内部、外显子 1RNA与内含子1RNA的交界附近等。具体实例有，例如上述(1) (9)的目标RNA的内部 (IresRNA内部)、上述(10) (16)的目标RNA的内部。另外，本发明并不限制于此。
下面给出上述siRNA的反义链的具体实例。此外，在下述反义链#1 #10中的悬 突用下划线表示。下述#1 #17中，n是任意的核酸，例如可以是a、u、g、c或t。另外，在 siRNA中，悬突是任选的，例如没有也可以(下同)。另外，本发明中，siRNA的反义链并不 限制于此。 #15， -agcaaggcaaggcuccaaugcni1-3， (Seq ID No :4)
与Seq ID No :1中的碱基编号1062-1082互补 #25， _agagcagcaaggcaaggcuccnil_3， (Seq ID No :6)
与Seq ID No :1中的碱基编号1067-1087互补
#35， -cacgaccgcuimcc皿ggcau胆-3， (Seq ID No :8) 与Seq ID No :45中的碱基编号1097-1117互补 #45， -imgcac皿cucgcggcuccgc胆-3， (Seq ID No :10) 与Seq ID No :1中的碱基编号728-748互补 #55， -cgagcimgcac皿cucgcggc胆-3， (Seq ID No :12) 与Seq ID No :1中的碱基编号733-753互补 #65， -uggacgaaaag皿ucagugcgacgc皿-3， (Seq ID No :14) 与Seq ID No :1中的碱基编号644-668互补 #75， -3g朋g皿gg3cg朋33gu皿c3gug皿-3， (Seq ID No :16) 与Seq ID No :1中的碱基编号650-674互补 #85， -gaag皿ggacgaaaag皿ucagugc皿-3， (Seq ID No :18) 与Seq ID No :1中的碱基编号649-673互补 #95， -ggacgaaaag皿ucagugcgacgcc皿-3， (Seq ID No :20) 与Seq ID No :1中的碱基编号643-667互补 #105，-皿ggacgaaaag皿ucagugcgacg皿-3， (Seq ID No :22) 与Seq ID No :1中的碱基编号645-669互补 #115， -3g朋g皿gg3cg朋33gu皿c3gug皿-3， (Seq ID No :61) 与Seq ID No :1中的碱基编号650-674互补 #125， -ag皿ucagugcgacgccgcgagccc皿-3， (Seq ID No :63) 与Seq ID No :1中的碱基编号635-659互补 #135， -gaagcgagaacagcccagaag皿gg迎-3， (Seq ID No :65) 与Seq ID No :1中的碱基编号666-690互补 #145， -agcaaggcaaggcuccaaugcaccc迎-3， (Seq ID No :67) 与Seq ID No :1中的碱基编号1058-1082互补 #155， -agagcagcaaggcaaggcuccaaug迎-3， (Seq ID No :69) 与Seq ID No :1中的碱基编号1063-1087互补 #165' -cgagcimgcac皿cucgcggcuccg迎-3' (Seq ID No :71) 与Seq ID No :1中的碱基编号729-753互补 #175' -cgcggaccacggcuccuccgaagcg迎-3' (Seq ID No :73) 与Seq ID No :1中的碱基编号685-709互补 由上述反义链和正义链构成的siRNA的具体实例如下所示。在下述实例中，下划 线部分"皿"是悬突，在正义链的皿的上方、反义链的皿的下方分别一并给出悬突序列的 一个实例。另外，对于siRNA#l #17，例如，反义链和正义链各自的悬突是任选的，没有也 可以。另外，本发明中的siRNA不限制于此。 siRNA#l gu或ca 正义链5， -gcauugga c皿gcc皿gcu皿-3， (Seq ID No :3) 反义链3， -nncgimaccucggaacggaacga_5， (Seq ID No :4) ac或gu:0157] siR應2
:0158] gu或ca
:0159] 正义链5， -ggagccuug uugcugcucu皿-3， (Seq ID No :5)
■0160] 反义链3，-皿ccucggaacggaacgacgaga-5， (Seq ID No :6)
:0161] ac或gu
:0162] siR應3
:0163] gu或ca
■0164] 正义链5， -augccaag aagcggucgug皿-3， (Seq ID No :7)
:0165] 反义链3，-皿uacgguuccauucgccagcac-5， (Seq ID No :8)
:0166] ac或gu
:0167] siR應4
:0168] gu或ca
■0169] 正义链5， -gcggagccg agaagugcimnn-3， (Seq ID No :9)
:0170] 反义链3'-皿cgccucggcgcucuucacgau-5' (Seq ID No :10)
:0171] ac或gu
:0172] siR應5
:0173] gu或ca
■0174] 正义链5， -gccgcgag gugcuagcucg皿-3， (Seq ID No :11)
■0175] 反义链3，-皿cggcgcucuucacgaucgagc-5， (Seq ID No :12)
:0176] ac或gu
:0177] siR應6
:0178] ag
:0179] 正义链5， _gcgucgcacugaaacuuuucguccanE_3， (Seq ID No :13)
■0180] 反义链3，-皿cgcagcgugacuuugaaaagcaggu-5， (Seq ID No :14)
:0181] ua
:0182] siR應7
:0183] ag
:0184] 正义链5， _cacugaaacuuuucguccaacuucunn_3， (Seq ID No :15)
■0185] 反义链3，-皿gugacuuugaaaagcagguugaaga-5， (Seq ID No :16) :0186] ua
:0187] siR應8
:0188] ag
:0189] 正义链5， _gcacugaaacuuuucguccaacuucnn_3， (Seq ID No :17)
:0190] 反义链3，-皿cgugacuuugaaaagcagguugaag-5， (Seq ID No :18)
:0191] ua
:0192] siR應9
:0193] ag
:0194] 正义链5， _ggcgucgcacugaaacuuuucguccnn_3， (Seq ID No :19)
■0195] 反义链3，-皿ccgcagcgugacuuugaaaagcagg-5， (Seq ID No :20)
siR應10正义链5'一CgUCgC3CUg朋3C皿皿CgUCC33胆--3，(SeqIDNo:21)反义链3'一皿gC3gCgUg3CU皿g朋33gC3gg皿--5，(SeqIDNo:22)siR應ll正义链5'一C3CUg朋3C皿皿CgUCC33C皿CU皿--3，(SeqIDNo :60)反义链3'一皿gUg3CU皿g朋33gC3gg皿g朋g3--5，(SeqIDNo:61)siR應12正义链5'一gggCUCgCggCgUCgC3CUg朋3CU胆--3，(SeqIDNo:62)反义链3'一皿CCCg3gCgCCgC3gCgUg3CU皿g3--5，(SeqIDNo:63)siR應13正义链5'一cc朋c皿cugggcug皿cucgc皿c胆--3，(SeqIDNo:64)反义链3'一皿gg皿g朋g3CCCg3C33g3gCg朋g--5，(SeqIDNo:65)siR應14正义链5'一gggUgC3皿gg3gCC皿gCC皿gCU胆--3，(SeqIDNo:66)反义链3'一皿ccc3cgim3ccucgg朋cgg朋cg3--5，(SeqIDNo:67)siR應15正义链5'一c3皿gg3gcc皿gcc皿gcugcucuniT-3，(SeqIDNo:68)反义链3'一皿gim3ccucgg朋cgg朋cg3cg3g3--5，(SeqIDNo:69)siR應16正义链5'一cggagccgcgagaagugcimgcucgniT-3，(SeqIDNo:70)反义链3'一皿gCCUCggCgCUC皿C3Cg3UCg3gC--5，(SeqIDNo:71)siR應17正义链5'一cgc皿cggaggagccgugguccgcgniT-3，(SeqIDNo:72)反义链3'-nngcgaagccuccucggcaccaggcgc--3，(SeqIDNo:73)这些siRNA可以例如以上述序列的双链siRNA的形式导入至细胞内，也可以如后述(A4)的结合抑制剂所示，例如以表达上述序列的siRNA表达载体的形式导入至细胞内。
如上所述，上述(Al)的结合抑制剂也可以是可由核糖核酸酶分解而游离出siRNA 的siRNA前体。上述siRNA前体的实例有，例如双链RNA和单链RNA。前一种情况下，例如， 在导入细胞中时，上述双链RNA被核糖核酸酶切断，生成上述的siRNA。后一种的单链RNA 的实例有例如，通过自身退火而形成多个发夹结构相连的折叠式RNA前体。例如，将其导入 细胞时，首先被Drosha切断，形成发夹型的miRNA样RNA前体，然后被Dicer切断，生成上 述的双链siRNA。后一种的单链RNA也可以是例如发夹型的miRNA样RNA前体。例如，将其 导入细胞时，被Drosha和Dicer切断而生成上述的siRNA。另外，后一种的单链RNA也可 以是发夹型siRNA前体。另外，在后一种的情况下，导入细胞的siRNA前体可以例如预先形 成发夹，也可以在细胞内形成发夹。上述siRNA前体的序列没有特别的限制，可以根据例如 siRNA的序列、siRNA反义链的结合区域的序列、目标RNA的序列来适当地设计。上述核糖核酸酶的实例有例如Dicer、 Drosha等(下同)。 如上所述，上述(Al)的结合抑制剂也可以是反义物。反义物的实例有例如由与上 述目标RNA互补的序列组成的反义物。反义物即可以是例如DNA也可以是RNA。反义物抑 制表达的机制可以是例如通过形成三链来抑制转录起始、通过RNA聚合酶与形成局部开放 环结构的部位形成杂合物从而抑制转录、与合成进行中的RNA形成杂合物来抑制转录等等 (平岛和井上；新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编、东京化 学同人)pp.319-347、1993)。反义物的长度没有特别的限制，例如，通常其下限在15碱基 以上，优选100碱基以上，更优选500碱基以上，其上限例如在5000碱基(5kb)以下，优选 2500碱基(2. 5kb)以下。 如上所述，上述(Al)的结合抑制剂也可以是核酶。核酶是指有酶活性的RNA分子， 在本发明中可例举出可位点特异性地切断RNA的核酶。本发明中的核酶具有例如可使如上 所述的目标RNA特异性断裂的核酶活性。核酶的序列没有特别的限制，例如可设计成具有 与切断目标序列互补的序列。核酶的种类没有特别的限制，可例举出例如锤头型核酶、发夹 型核酶等。 下面对上述(A2)的结合抑制剂进行说明。该结合抑制剂对应于例如本发明的p53
表达促进方法中的上述(a2)步骤中所述的各种结合抑制剂。该结合抑制剂所分解的目标
RNA与上述本发明的p53表达促进方法的(a2)步骤中的目标RNA相同。 (A2)可抑制从vegf-A基因的外显子1转录RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶分
解而游离出siRNA的siRNA前体、反义物、核酶以及DECOY核酸中选出的至少一种结合抑制剂。 作为上述(A2)的结合抑制剂，本发明的p53表达促进剂可以包括siRNA、可由核 糖核酸酶切断而游离出siRNA的siRNA前体、核酶RNA、 DECOY核酸中的任何一种。siRNA、 siRNA前体、核酶以及DECOY核酸没有特别的限制，例如可与上述(Al)的结合抑制剂同样地 设计。 上述结合抑制剂优选设计为例如抑制vegf-A基因的启动子活性。由此可抑制从 vegf-A基因外显子l的转录。上述结合抑制剂可例举出例如与vegf-A基因的启动子区互 补的、可与上述区域结合的反义物。若使用这样的反义物，便可使vegf-A基因的启动子与 上述反义物结合，从而抑制启动子活性，结果可以抑制从vegf-A基因外显子1的转录。
下面对上述(A3)的结合抑制剂进行说明。该结合抑制剂对应于例如本发明的p53 表达促进方法中的上述(a3)步骤中所述的、由DECOY核酸组成的结合抑制剂。
(A3)可与从vegf-A基因的外显子1转录的RNA结合、并且由从p53基因转录的 mRNA之外的其他核酸(DECOY核酸)组成的结合抑制剂 上述DECOY核酸的种类没有特别的限制，例如可以是DNA，也可以是RNA。上述 DECOY核酸的序列没有特别的限制，可例举出可与从vegf-A基因外显子1转录的RNA中 的、与p53mRNA的结合区域结合的序列。具体地说，可例举出例如，与vegf-A RNA中的 p53mRNA结合区域互补的序列或者与含有上述结合区域的区域互补的序列，p53mRNA中的 与从vegf-A基因外显子1转录的RNA结合的区域组成的序列或者由含有上述结合区域的 区域组成的序列。上述DEC0Y核酸的碱基数没有特别的限制，例如可以是25 50碱基，优 选25 30碱基。
上述DECOY核酸的具体实例如下所示。上述结合抑制剂例如可以是任意一种，也 可以包括两种以上。另外，本发明并不限制于此。 (Dl)Seq ID No :2中的第462位_第481位的序列组成的RNA，或者，在所述序列 中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D2) Seq ID No :2中的第462位_第482位的序列组成的RNA，或者，在所述序列 中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D3) Seq ID No :2中的第462位_第491位的序列组成的RNA，或者，在所述序列 中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D4) Seq ID No :2中的第462位_第505位的序列组成的RNA，或者，在所述序列 中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D5)Seq ID No :2中的第252位_第551位的序列组成的RNA，或者，在所述序列 中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D6) Seq ID No :1中的第694位_第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者， 在所述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA (D7)Seq ID No :1中的第693位_第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者， 在所述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA
5， _ccccgcgcggaccacggctcct_3， (Seq ID No :74) (D8)从上述(Dl) (D7)中选出的至少一种核酸中， 一个或多个碱基被置换、缺 失、插入或添加而成的碱基序列组成的、并且可与从vegf-A基因的外显子1转录的RNA结 合的核酸 上述(Dl) (D5)的RNA和DNA由与p53基因(RNA或DNA)的部分序列相同的序 列组成。上述(D6)和(D7)是与vegf-A基因(RNA或DNA)外显子1中的部分序列互补的 序列组成的反义物。 下面，对上述(A4)的结合抑制剂进行说明。 (A4)含有一种表达载体的结合抑制剂，所述表达载体中插入了从上述(Al) (A3)中选出的至少一种结合抑制剂的编码DNA 上述(A4)的结合抑制剂只要是例如表达前述(Al) (A3)中的至少任意一种的 表达载体即可。使用上述表达载体时，例如，将上述表达载体导入细胞中，从而在上述细胞 内表达(例如RNA的转录、DNA的复制)上述结合抑制剂。上述表达载体的导入以及在上 述表达载体中插入的编码序列的表达系统没有限制，可采用现已公知的技术。例如，通过表 达载体在细胞内生成siRNA的情况下，可使用siRNA表达系统、miRNA表达系统等市售的试 剂盒。 对于上述表达载体，例如，在载体中插入了上述各种结合抑制剂的编码DNA。对 上述载体没有特别的限制，可根据例如导入上述表达载体的细胞的种类、导入方法等适当 地确定，可例举例如病毒类载体、非病毒类载体。上述非病毒载体的实例有例如，可在目标 细胞内或生物体内表达上述RNA的载体。具体实例有例如pcDNA3. 1 (Invitrogen公司)、 pZeoSV (Invitrogen公司)、pBK-CMV (Stratagene公司)、pCAGGS (Genel08， 193-200 (1991)) 等表达载体。通常，只要在这些载体的启动子的下游，以可表达的方式插入上述DNA即可。 另外，病毒载体的实例有例如反转录病毒载体、免疫缺陷病毒(HIV)等慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV载体；adeno associated virus)、抱疫病毒、牛痕病毒、痕病毒、多瘤 病毒、Sindbis病毒、仙台(Sendai)病毒、SV40等DNA病毒和RNA病毒。可以在以上的载体 中基于现已公知的方法插入上述DNA，从而制备表达载体。 上述表达载体中还可包含调节上述DNA表达的调节序列。上述调节序列的实例有 例如巨细胞病毒(CMV)来源的启动子、鲁斯肉瘤病毒(RSV)、猿猴空泡病毒-40(SV-40)、肌 肉P肌动蛋白启动子、单纯疱疹病毒(HSV)等的组成型启动子、胸苷激酶启动子等组织特 异型启动子、生长激素调节性启动子、lac操纵子序列调控下的启动子、锌诱导性的金属硫 蛋白启动子等诱导性启动子或调节性启动子。可基于现已公知的方法，将这些调节序列配 置于或者结合于可功能性调节上述基因的表达的位点。其他还可包括例如增强子序列、多 腺苷酸化信号、复制起点序列(ori)等。 另外，上述表达载体中还可以含有例如抗药性标记、荧光蛋白标记、酶标记、细胞 表面受体标记等选择性标记的编码序列。 本发明中，在细胞内生成siRNA的情况下，例如可以导入表达上述siRNA的表达 载体，也可以导入表达可由核糖核酸酶切断从而游离出siRNA的上述siRNA前体的表达载 体。在前一种情况下，例如，在细胞内生成siRNA，在后一种情况下，例如，在细胞内生成的 siRNA前体在分子内与互补链结合形成茎环，再如上所述，通过Drosha和Dicer等核糖核酸 酶切断，生成上述siRNA。关于表达反义RNA的表达载体以及表达核糖核苷酸的表达载体， 情况是一样的。 将本发明的p53表达促进剂导入细胞的方法没有特别的限制，可采用现已公知的 方法。在皿将这些p53表达促进剂导入细胞时，可采用例如磷酸钙法、聚乙二醇法、脂转 染法、电穿孔法、超声核酸导入法、基因枪导入法、0￡八￡-葡聚糖法、使用微细玻璃管等直接 注入法等。另外，还有使用上述的病毒载体的感染导入法等。在皿将本发明的p53表达 促进剂导入细胞或组织中时，其导入方法可根据例如目标细胞或组织的种类，适当地采用 现已公知的方法。具体地说，可采用例如肌内、腹腔内等的注射、经口给药、皮下组织给药、 基因枪给药、液浸、流体动力学法、阳离子脂质体法、使用端肽胶原(atelocollagen)的方 法等。在皿情况下，例如，可以从被检体取出目标细胞或组织，在取出的细胞等中通过上 述的方法将本发明的p53表达促进剂导入，使导入后的细胞等返回被检体体内。
本发明的p53表达促进剂中还可包含帮助将上述结合抑制剂或上述表达载体导 入细胞的佐剂等各种添加物。上述佐剂的实例有例如Lipofectamine、阳离子脂质体等脂质 体、端肽胶原等。〈凋亡促进方法和凋亡促进剂> 本发明的凋亡促进方法是一种促进细胞凋亡的方法，其特征在于，通过本发明的 促进p53表达的方法，来促进细胞内p53的表达。 本发明中优选还包括使用抗癌剂处理上述细胞的步骤。具体地说，除了上述(a) 步骤、即抑制细胞中从vegf-A基因外显子1转录的RNA与p53mRNA结合的步骤之外，优选还 包括(b)步骤，即使用抗癌剂处理上述细胞的步骤。上述(a)步骤和(b)步骤的顺序没有 特别的限制，例如优选对细胞实施上述(a)步骤的抑制上述结合的处理，之后对处理过的 细胞进行抗癌剂处理。抑制上述结合的处理没有特别的限制，但优选包括上述(al) (a3) 步骤中的至少任意一个步骤。
22
上述抗癌剂的种类没有特别的限制，具体实例有例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺钼、
阿霉素、依托泊苷、亚叶酸、丝裂霉素C、紫杉醇、长春新碱、喜树碱等(下同)。 如上所述，本发明的凋亡促进剂的特征在于含有本发明的p53表达促进剂。本发
明的凋亡促进剂只要含有上述p53表达促进剂即可，对其他组成等没有任何限制。另外，本
发明的凋亡促进剂可在本发明的凋亡促进方法中使用，具体的使用方法等与前述的本发明
的p53表达促进剂是一样的。另外，本发明的凋亡促进剂优选还包括抗癌剂。〈抗癌剂感受性增强方法和增强剂> 本发明的抗癌剂感受性的增强方法是一种增强细胞对抗癌剂的感受性的方法，其 特征在于，通过本发明的促进p53表达的方法，来促进所述细胞中p53的表达。在本发明的 增强方法中，例如，只要在抗癌剂处理之前，对目标细胞施加本发明的p53表达促进方法即 可，对其他步骤没有任何限制。通过进行此种处理，可增强细胞对抗癌剂的感受性。
如上所述，本发明的增强剂是一种用于增强细胞对抗癌剂的感受性的增强剂，其 特征在于，它含有本发明的p53表达促进剂。本发明的增强剂只要含有上述p53表达促进 剂即可，对其他组成等没有任何限制。本发明的增强剂可在本发明的抗癌剂感受性的增强 方法中使用，具体的使用方法等与前述本发明的p53表达促进剂是一样的。
〈癌症的治疗方法和抗癌剂> 本发明的癌症的治疗方法包括将本发明的p53表达促进剂给予生物体内的癌细 胞的步骤。上述p53表达促进剂的给药对象没有特别的限制，可以是例如人、除人以外的哺 乳类等动物。 如上所述，本发明的抗癌剂的特征在于含有本发明的p53表达促进剂。本发明的 抗癌剂只要含有上述p53表达促进剂即可，对其他组成等没有任何限制。本发明的抗癌剂 中还可以包括例如其他抗癌剂、药学上可接受的成分。本发明的抗癌剂在本发明的癌症治 疗方法中使用，具体的使用方法与前述的本发明的p53表达促进剂是一样的。
〈p53mRNA结合剂> 本发明的p53mRNA结合剂是一种可与p53mRNA结合的结合剂，其特征在于，所述结 合剂中含有核酸，所述核酸中包含Seq ID No :l所示的vegf-A mRNA中的第694位-第714 位的序列组成的RNA。 上述核酸中所含的RNA，例如可以是由上述第694位_第714位的序列组成的RNA， 也可以是由含有vegf-A mRNA中的第694位-第714位的区域的序列组成的RNA。上述RNA 的实例有例如下述(1) (17)的RNA。上述核酸中所含的RNA可以是任意一种，也可以是
两种以上(l)SeqIDNo1中第600位-第879位的序列组成的RNA(2)SeqIDNo1中第659位-第879位的序列组成的RNA(3) SeqIDNo1中第659位-第780位的序列组成的RNA(4)SeqIDNo1中第659位-第752位的序列组成的RNA(5) SeqIDNo1中第659位-第745位的序列组成的RNA(6)SeqIDNo1中第694位-第714位的序列组成的RNA(7)SeqIDNo1中第693位-第714位的序列组成的RNA(8)SeqIDNo1中第691位-第703位的序列组成的RNA
(9) Seq ID No :1中第711位-第723位的序列组成的RNA
(10) Seq ID No :1中第16位-第780位的序列组成的RNA
(11) Seq ID No :1中第659位_第917位的序列组成的RNA
(12) Seq ID No :1中第526位_第1104位的序列组成的RNA
(13) Seq ID No :45中第526位_第1216位的序列组成的RNA
(14)vegf mRNA中的5' UTR RNA
(15)vegf mRNA中的外显子1的RNA
(16)vegf mRNA (17)上述(1) (16)的RNA中， 一个或多个碱基被置换、缺失、插入或添加而成 的碱基序列组成的、并且具有抑制p53表达的功能的RNA，或者具有与p53mRNA结合的功能 (或者形成杂合物的功能)的RNA
〈vegf-A mRNA结合剂> 本发明的vegf-A mRNA结合剂是一种可与vegf-A mRNA结合的结合剂，其特征在 于，所述结合剂含有核酸，所述核酸中包括Seq ID No :2所示的p53mRNA中的第462位-第 481位的序列组成的RNA。 上述核酸中所含的RNA例如可以是上述第462位-第481位的序列组成的RNA，也 可以是含有p53mRNA中的第462位-第481位的区域的序列组成的RNA。上述RNA的实例 有例如下述(I) (VI)的RNA。上述核酸中所含的RNA可以是任意一种，也可以是两种以 上。 (I) Seq ID No :2中第462位_第481位的序列组成的RNA
(II) Seq ID No :2中第462位_第482位的序列组成的RNA
(III) Seq ID No :2中第462位_第491位的序列组成的RNA
(IV) Seq ID No :2中第462位_第505位的序列组成的RNA
(V) Seq ID No :2中第252位-第551位的序列组成的RNA (VI)上述(I) (V)中选出的至少一种RNA中，一个或多个碱基被置换、缺失、插 入或添加而成的碱基序列组成的、并且具有与从vegf-A外显子1转录的RNA结合的功能的 RNA〈筛选方法> 本发明的筛选方法是一种筛选可促进p53表达的表达促进剂的方法，其特征在 于，包括下述步骤(A) 步骤(C): (A)在候选物质的存在下，使本发明的p53mRNA结合剂与本发明的vegf-A RNA结 合剂接触， (B)检测所述候选物质对所述p53mRNA结合剂与所述vegf-ARNA结合剂相结合的 抑制， (C)将抑制了所述p53mRNA结合剂与所述vegf-A RNA结合剂的结合的候选物质， 选择为p53表达促进剂。 由该方法可筛选出抑制p53mRNA与vegf-A RNA的结合的物质。若上述结合被抑 制，结果可抑制p53mRNA的分解，避免p53mRNA的表达抑制，促进(回复)p53的表达。因此， 通过本发明筛选出来的物质可作为p53表达促进剂使用。另外，上述(C)步骤中的抑制检
24测方法没有特别的限制，可采用确认是否有异源双链形成的现已公知的方法。
实施例 下面对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不受下述实施例的限制。若无特 别说明，市售的药剂基于其使用规程使用。下面将vegf-A基因称为vegf基因，将vegf-A mRNA称为vegfmRNA，将vegf-A RNA称为vegfRNA，将VEGF-A蛋白质称为VEGF蛋白质。 [O302](细胞培养) 使用人大肠癌HCT116细胞(亲本细胞、野生型p53)、人大肠癌p53缺陷型HCT116 细胞(p53-K0 HCT116) 、 HT-29细胞以及SW480细胞；人肝癌H印G2细胞、H印3B细胞以及 HLE细胞；人胃癌AGS细胞；以及人正常皮肤成纤维细胞。对这些细胞使用含有10%胎牛血 清和/或抗生素的、McCoy' s 5A培养基或者Dulbecco' s改良的Eagle' s (DMEM)培养基。
(转染) 各种载体向细胞的转染使用JetPEI转染试剂(商品名、Polyplus-transfection 公司制造)，根据使用说明书进行。
(vegfsiRNA) 为了在目标细胞中表达对于vegfmRNA的下述#1 #5的siRNA，制备了各种表达 载体。下面，这些siRNA也称为vegf siRNA，表达这些siRNA的载体也称为vegf siRNA载 体。使用市售的siRNA表达系统(Invitrogen公司制造)来表达siRNA。
首先制备含有vegf siRNA的编码序列的双链寡核苷酸(寡核苷酸#1 #5)。这 些寡核苷酸的正义链序列在下面给出。各寡核苷酸序列中，下划线部分是与vegf基因外显 子1区域内部互补的反义序列，或者是与包括外显子1和内含子1的区域内部互补的反义 序列，编码最终作为siRNA#l #5发挥作用的序列。另外，下述序列中，小写字母序列对应 于与siRNA的反义链杂交的vegfmRNA区域内部缺失2碱基而形成的RNA序列所对应的DNA。 在各寡核苷酸序列的下面，给出了所表达的siRNA的正义链和反义链，以及与siRNA的反义 链杂交的vegf mRNA区域(目标RNA)的序列。 表1 : 寡核苷酸ftl(Seq ID No :23) 5' -TGCTGAGCAAGGCAAGGCTCCAATGCGTTTTGGCCACTGACTGACgcattggacttgccttgct-3， siRNA#l 正义链5' -gca皿gga c皿gcc皿gcuca-3' (Seq ID No :3)
反义链3' -guCGUAACCUCGGAACGGAACGA-5， (Seq ID No :4) 目标RNA5， -gca皿ggagcc皿gcc皿gcu-3， (Seq ID No :24) 寡核苷酸ft2(Seq ID No :25) 5， -TGCTGAGAGCAGCAAGGCAAGGCTCCGTTTTGGCCACTGACTGACggagccttgttgctgctct-3， siRNA#2 正义链5' -ggagccuug 皿gcugcucuca-3' (Seq ID No :5)
反义链3' -guCCUCGGAACGGAACGACGAGA-5， (Seq ID No :6) 目标RNA 5， -ggagcc皿gcc皿gcugcucu-3， (Seq ID No :26) 寡核苷酸ft3(Seq ID No :27) 5' -TGCTGCACGACCGCTTACCTTGGCATGTTTTGGCCACTGACTGACatgccaagaagcggtcgtg-3， siRNA#3 正义链5' -augccaag aagcggucgugca-3' (Seq ID No :7)
反义链3' -guUACGGUUCCAUUCGCCAGCAC-5， (Seq ID No :8) 目标RNA5， _augccaaggimagcggucgug_3， (Seq ID No :28) 寡核苷酸ft4(Seq ID No :29) 5， -TGCTGTAGCACTTCTCGCGGCTCCGCGTTTTGGCCACTGACTGACgcggagccgagaagtgcta-3， siRNA#4 正义链5， -gcggagccg agaagugcuaca-3， (Seq ID No :9)
反义链3' -guCGCCUCGGCGCUCUUCACGAU-5 ， (Seq ID No :10) 目标RNA5， _gcggagccgcgagaagugcim_3， (Seq ID No :30) 寡核苷酸ft5(Seq ID No :31) 5， -TGCTGCGAGCTAGCACTTCTCGCGGCGTTTTGGCCACTGACTGACgccgcgaggtgctagctcg-3， siRNA#5 正义链5， -gccgcgag gugcuagcucgca-3， (Seq ID No :11) 反义链3' -guCGGCGCUCUUCACGAUCGAGC-3， (Seq ID No :12) 目标RNA5， _gccgcgagaagugcimgcucg_3， (Seq ID No :32) 将上述双链寡核苷酸根据操作规程分别克隆至siRNA表达用质粒载体中。作为
上述载体，使用在前体miRNA表达盒内含有GFP编码区的pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR载体 (Invitrogen公司)。将得到的重组载体分别称为vegf siRNA#l载体 vegf siRNA#5载 体。各重组载体中的上述插入序列通过DNA测序确认。另外，作为siRNA的对照载体，将 与脊椎动物的已知基因没有相同性的序列(Seq ID No :46 :5'-gaaatgtactgcgcgtggagacgt tttggccactgactgacgtctccacgcagtacattt-3，)的双链寡核苷酸克隆至上述pcD廳.2-GW/ EmGFP-miR载体。得到的重组载体称为对照siRNA载体。在用各种重组载体导入细胞的结 果中，基于产生GFP蛋白绿荧光的细胞的比例(％ )，转染效率约为70%。
将上述vegf siRNA#l载体 vegf siRNA#5载体导入细胞后，从EmGFP编码序列 和上述寡核苷酸(#1 #5)的嵌合DNA表达嵌合mRNA。此时，与上述寡核苷酸对应的RNA 在EmGFP mRNA的3'侧作为3' UTR表达。该3' UTR部分与分子内的互补链相结合，所形成 的碱基对被Drosha切断，然后被Dicer切断。因此在导入的细胞内形成双链siRNA(#1 #5)，通过其反义链切断目标RNA。另外，在得到的双链siRNA中，在两条链的3'末端都有两 碱基的悬突。 作为对照siRNA，购买了 Silencer (注册商标)阴性对照#1 (Ambion公司制造) 或者无siRISC的对照siRNA(Dharmacon)。这些siRNA与人基因产物不显示相同性。另 夕卜，以下所示的siRNA从Ambion公司购入。将这些siRNA使用Lipofectamine RNAiMax 试剂(Invitrogen公司制造)、根据使用说明书导入细胞。根据BLOCK-iT Alexa Fluor RedFluorescent Oligo (Invitrogen公司制造)测定的siRNA的导入效率为约60-70%。 [O338](凋亡评价1) 用各种抗癌剂处理目标细胞后，与胰蛋白酶/EDTA —起温育，制备细胞悬液。将 该细胞悬液离心分离，除去上清后，使用含有3. 7%甲醛、0. 5% Nonidet P40和10 y g/mL Hoechst33258 (Invitrogen公司)的PBS溶液固定并染色。用荧光显微镜观察染色后的核，对开裂的核计数并评分。在一次测定中，对至少300个细胞进行计数。 [O340](凋亡评价2) 对作为评价对象的细胞，使用原位细胞死亡检测试剂盒(in situ CellDeath Detection kit, Roche Diagnostics公司制造)、以TUNEL染色法进行评价。对TUNEL阳性 细胞使用显微镜观察，算出凋亡阳性细胞的比例(％)。在一次测定中，对至少300个细胞 进行计数。(蛋白质免疫印迹) 蛋白质免疫印迹根据Huez， I. et al. Mol. Endocrinol. 15 2197-2210 (2001)或 者Masuda， K. ， et al. PLoS Med. 5， e94(2008)进行。 一次抗体使用抗p53抗体(D0-1或 FL-393, Santa Cruz Biotechnology公司制造)、抗P-肌动蛋白(cloneAC-15， Sigma公司 制造)、抗HA (Y-ll， Santa Cruz Biotechnology公司制造)、上述Huez等(2001)中记载的 抗L-VEGF (多克隆抗L-VEGF抗体)。
(RNA印迹) 总RNA根据硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate)法制备。将以下所示的各种 cDNA作为模板，使用下述的反义引物、Klenow片断(NewEngland BioLabs公司制造)以及 [a -32P] dCTP，制造标记的cDNA。将得到的标记的cDNA作为RNA印迹用探针。
vegf mRNA用探针1
模板人vegf外显子1-外显子5的cDNA 反义引物
5' _gtcttgctctatctttctttggtctgc_3， (Seq ID No :47) 5， _catctctcctatgtg-3， (Seq ID No :48) 5' _tccaggccctcgtca_3， (Seq ID No :49) vegf mRNA用探针2 (实施例B用) 模板人vegf外显子2-5的cDNA 反义引物
5， _ttgtcttgctctatctttctttg-3， (Seq ID No :75) vegfIresRNA用探针
模板人vegf IresRNA(Seq ID No :1的600-879)的cDNA 反义引物
5' _gcgcacaccgccgcctcacccgtccatgagcccgg_3， (Seq ID No :76) p53mRNA和分解p53mRNA用探针1 模板人p53全长cDNA 反义引物 5，
tcagtctgagtc--3，(SeqIDNo50)
gcccacggatct--3，(SeqIDNo51)
tgatggtgagga--3，(SeqIDNo52)
CCtC3C33CCtC--3，(SeqIDNo53)
33g3tg3C3ggg--3，(SeqIDNo54)
p53mRNA用探针2 (实施例B用)
模板人p53全长cDNA 反义引物 5， _ttaaaagctttcagtctgagtcaggc_3， (Seq ID No :77) vegf-YFP mRNA和YFP mRNA用探针 模板YFP cDNA(Clontech公司制造) 反义引物 5， _ttgatcctagcagaagcaca_3， (Seq ID No :55) 对于下述反义探针，使用末端脱氧核苷酰酶酸转移酶
(terminalDeoxynucleotidyl Transferase, New England BioLabs公司制造)禾口 [ a _32P]
dCTP，对其3'末端进行标记。 noxa mRNA用反义探针(Seq ID No :56) 5， _gctctgctggagcccgcgcggggctcggttgagcgttcttgcgcg_3， puma mRNA用反义探针(Seq ID No :57) 5， _ccctctacgggctccggggagctgccctcctggcgtgcgcggg_3， bax mRNA用反义探针(Seq ID No :58) 5， _ggtggacgcatcctgaggcaccgggtccagggccagctcgggtg_3， p21mRNA用反义探针(Seq ID No :59) 5' -ggcaggccttgctgccgcatgggttctgacggacatccccagccggttctgacat-3' (定量RT-PCR) 从lii g总RNA，使用SuperScriptII RNaseH(-)反转录酶(Invitrogen公司制造) 合成cDNA，以上述cDNA为模板，使用扩增目标核酸序列相对应的引物进行PCR。扩增以及 PCR产物的定量使用Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems公司制造)、以制造 商推荐的方法进行。 vegf mRNA用正向引物(Seq ID No :78) 5， _gagccttgccttgctgctctac_3， vegf mRNA用反向引物(Seq ID No :79) 5， _caccagggtctcgattggatg_3 p53mRNA用正向引物l(Seq ID No :80) 5， _ctttccacgacggtgaca_3， p53mRNA用反向引物l(Seq ID No :81) 5， _tcctccatggcagtgacc_3 bax mRNA用正向引物(Seq ID No :82) 5， _atgttttctgacggcaacttc_3， bax mRNA用反向引物(Seq ID No :83) 5， _atcagttccggcaccttg_3， noxa mRNA用正向引物(Seq ID No :84) 5， _gagatgcctgggaagaagg_3， noxa mRNA用反向引物(Seq ID No :85) 5， _ttgagtagcacactcgacttcc_3，
(RNA Pull-Down试验) 在p53缺陷型HCT116细胞中，共同导入以pcDNA3. 1为基础的且具有来源于上述 载体序列的T7序列的各种表达载体，以及以pCMV-neo-Bam为基础的且没有来源于上述载 体序列的T7序列的p53表达载体。共同导入12小时后，用PBS将细胞洗涤2次，用缓冲 液A使细胞溶解。上述缓冲液A的组成为10mmol/L HEPES (pH7. 4) 、60mmol/L KCl、3mmo1/ L MgCl2、0. 1 % NP-40、lmmol/L DTT、 10mmol/L氧钒核糖核苷复合物(ribo皿cleoside vanadyl complex)。将得到的细胞提取液与带有生物素标记的抗T7探针一起温育。将 与上述抗T7探针相结合形成的复合物，使用由链霉亲和素包被的磁性珠Dynabeads M-270str印tavidin(Invitrogen公司制造)进行沉淀。从上述沉淀物中回收全RNA， 经DNaseI(商品名TurboDNaseI， Ambion公司制造)处理后，使用随机六聚体(random hexamer)和ThermoscriptRT-PCR系统(Invitrogen公司制造)，根据操作规程进行反转录 反应和PCR。在PCR之后，通过电泳验证是否有PCR产物的扩增。 使用的抗T7探针、vegf IresRNA的PCR引物组以及p53mRNA的PCR引物组如下
面所示。另外，在下述抗T7探针中，用大写字母表示的碱基是与T7对应的序列，用小写字
母表示的碱基是附加序列。 抗T7探针(Seq ID No :86) 5' -CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTaaaa-生物素_3，
vegf IresRNA用正向引物(Seq ID No :87)
5' -GAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGG-3'
vegf IresRNA用反向引物(Seq ID No :88)
5' -GCGCACACCGCCGCCTCACCCGTCCATGAGCCCGG-3'
p53mRNA用正向引物2(Seq ID No :89)
5' -AATATCTAGAATGGAGGAGCCGCA-3'
p53mRNA用反向引物2(Seq ID No :90)
5' -TTAAAAGCTTTCAGTCTGAGTCAGGC-3'
实施例Al 具有VEGF信号途径的人肝癌H印G2细胞对抗癌剂显示耐性。因此，验证通过RNA 干涉使vegfmRNA减少对H印G2细胞的抗癌剂耐性的影响。
(l)vegf mRNA的减少 在H印G2细胞(野生型p53)中分别导入前述的vegf siRNA#l载体、vegf siRNA#2 载体以及对照siRNA载体。将这些细胞培养18小时，通过RNA印迹分析vegf mRNA的表 达水平。在未导入上述载体的H印G2细胞中也进行同样的分析。在分析时，作为内参照 (loadingcontrol)监控各细胞中的gapdh mRNA(下同)。使用含有10 %胎牛血清以及 lOOii g/ml(100units/ml)链霉素的DMEM培养基，在温度37°C、5% C02的条件下进行培养 (下同)。 结果示于图1 (a)。图1 (a)是显示各细胞中vegf mRNA的表达的RNA印迹结果。 在该图中，泳道1 "-"表示未导入载体的细胞的结果，泳道2 "对照siRNA"表示对照siRNA 表达细胞的结果，泳道3 "vegfsiRNAftl"表示vegf siRNA#l表达细胞的结果，泳道4 "vegf siRNA#2"表示vegfsiRNA#2表达细胞的结果(下同)。
如图1(a)所示，与未导入载体的细胞(泳道l)以及对照siRNA表达细胞(泳道2)
相比，vegf siRNAftl表达细胞(泳道3)或者vegfsiRNA#2表达细胞(泳道4)的vegfmRNA
表达量显著减少。 (2)凋亡的增加 与上述(1) 一样，将各种重组载体导入H印G2细胞中18小时。将导入细胞用预定 浓度(0、10、30 ii mol/L)的抗癌剂5-FU处理60小时，对处理后的细胞基于上述凋亡评价1 确定凋亡(％)。结果示于图l(b)。图l(b)是显示用预定浓度的5-FU处理的各种细胞的 凋亡(％)的图(平均值士SD，n二3)。 如图1 (b)所示，将对照siRNA表达细胞使用有遗传毒性的抗癌剂5_FU处理，结 果导致凋亡比例有些增加。与此相反，在vegfsiRNA#l或vegf siRNA#2的表达细胞中，由 siRNA导致的vegf mRNA沉默对本底凋亡(0 y mol/L)没有影响，但经5-FU处理时，凋亡比 例就受5-FU浓度依赖性地影响而显著提高。另外，在人大肠癌HCT116(亲本细胞、野生型 p53)中也确认了与上述(1)和(2)中的H印G2细胞的同样的结果。
(3)p53的表达 已知在H印G2细胞和HCT116细胞中，由5_FU诱导的凋亡要依靠p53进行(Bunz， F.et al. J. Clin. Invest. 104,263-269(1999))。因此，为了验证上述(1)中vegf mRNA减 少是否对细胞内的p53途径有影响，测定了 p53mRNA和p53蛋白的表达水平。
与上述(1)相同，将各种载体导入H印G2细胞中18小时后，将所述细胞在存在 30 ii mol/L的5-FU的条件下(+)或者不存在5_FU的条件下(-)进行处理。对于处理8小 时的细胞，通过RNA印迹分析p53 mRNA的表达水平，对于处理12小时的细胞，通过蛋白质免疫印迹分析p53蛋白的 表达水平。蛋白质分析同时也针对作为内源性对照的P-肌动蛋白进行(下同)。结果示 于图l(c)。该图显示在表达vegf siRNA的细胞中p53mRNA和p53蛋白的表达结果。在该 图中，从上端数的第1行表示p53mRNA的表达，第2行表示gapdh mRNA的表达，第3行表示 p53蛋白的表达，第4行表示P-肌动蛋白的表达。另外，在该图中，"-"表示不存在5-FU 的条件，"+ "表示存在5-FU的条件。 另夕卜，同样地，将导入上述各种载体的H印G2细胞，在存在30 ii mol/L的5-FU的条 件下(+)或者不存在5-FU的条件下(_)处理16小时。对于处理后的细胞，通过RNA印迹 分别分析在p53通路中受到诱导的noxa mRNA、puma mRNA和p21mRNA的表达。该结果示于 图1 (d)。该图是显示在表达vegfsiRNA的细胞中p53mRNA的表达的RNA印迹结果。在该 图中，从上端数第1行表示noxa mRNA的表达，第2行表示puma mRNA的表达，第3行表示 p21mRNA的表达，第4行表示gapdh mRNA的表达。各泳道与图1 (c)相同。
如图1 (c)所示，在不存在5-FU的条件下(_) ， vegf siRNA#l的表达细胞(泳道3) 和vegf siRNA#2的表达细胞(泳道5)与对照细胞(泳道1)相比，显示出由vegf沉默导 致的p53mRNA和p53蛋白的表达增加。再者，如图1 (c)的泳道4和6所示，在存在5-FU的 条件下(+)，在vegf siRNA#l的表达细胞(泳道4)和vegf siRNA#2的表达细胞(泳道6) 中，vegf沉默导致由5-FU诱导的p53的表达增强，p53mRNA和p53蛋白的表达显著增加。 而且，与此同时，如图1(d)所示，在vegfsiRNA#l的表达细胞(泳道4)禾P vegfsiRNA#2的 表达细胞(泳道6)中，noxa mRNA、 puma mRNA、 p21mRNA的表达诱导也显著增强。与此相
30反，在对照细胞(泳道2)中，如图1 (d)所示，受5-FU作用，p21mRNA的表达只是略微受到 诱导。 由以上结果可知，由vegfmRNA的敲除导致的p53mRNA表达水平的增加可提高细胞 对抗癌剂的感受性，对于在最适量以下的5-FU的给药量也可实现应答。这说明p53的表达 可被细胞内的vegfmRNA抑制。
实施例A2 确认VEGF蛋白或vegfmRNA是否直接参与p53表达的抑制。
(1)质粒构建体 人VEGF服的编码基因(vegf基因)、与其5' UTR和3' UTR对应的序列等，根据 文献(J.Abraham et al. J. Biol. Chem. 266， 18， 11947-11954 (1991))制备。由下述方法制 备的质粒构建体的概况在图2(a)中显示。在该图中显示的质粒构建体A(pl65mSPHA3')、 B(pl65mSPHA) 、C(pl65-3')和D(pVC)分别参照文献(Bornes，S. et al. J. Biol. Chem. 279， 18717-18726(2004) 、Huez， Let al. Mol. Endocrinol. 152197-2210(2001))的方法构建。
构建体A(Dl65mSPHA3' ) (vegf某因的全长cDNA) 参照文献Bornes， S. et al. J. Biol. Chem. 279， 18717-18726 (2004)的方法制备构
建体A(pl65mSPHA3')。构建体A是在pSCT质粒载体中插入下述DNA片段制成的，所述DNA
片段具有vegf基因的cDNA即5' UTR对应的DNA序列、VEGF服蛋白的编码序列和3' UTR对
应的DNA序列，并且，在上述蛋白质编码序列3'末端和上述3'UTR DNA序列的5'末端之间
添加有HA标记的编码序列。 构建体B (pl65mSPHA) (3' UTR缺失) 参照文献Bornes， S. et al. J. Biol. Chem. 279， 18717-18726 (2004)的方法制备构 建体B (pl65mSPHA)。构建体B是在pSCT质粒载体中插入下述DNA片段制成的，所述DNA片 段具有与vegf基因5'UTR对应的DNA序列以及VEGF165蛋白的编码序列，并且，在上述蛋白 质编码序列的3'末端添加有HA标记的编码序列。
构建体C(pl65-3' ) (5' UTR缺失) 在pSCT质粒载体中插入下述DNA片段，制备构建体C(pl65-3')。上述DNA片段 具有VEGF165蛋白的编码序列以及与vegf基因3'UTR对应的DNA序列，并且，在上述蛋白质 编码序列的3'末端和上述3' UTRDNA序列的5'末端之间添加有HA标记的编码序列。具 体地说，使用限制酶Xbal和NgoM IV处理上述构建体A(pl65mSPHA3')，除去5' UTR部分。 之后，经Klenow片段处理使DNA末端变得平滑，使用连接酶将平滑末端之间连接，从而得到 构建体C。 构建体D(pVC)(只有5' UTR) 参照文献Huez， Let al. Mol. Endocrinol. 152197-2210 (2001)的方法，制备构建 体D(pVC)。构建体D是将Seq ID No :1的第1位 第1205位的区域对应的DNA序列与 CAT编码序列的嵌合DNA插入pSCT质粒载体中而形成的。上述Seq ID No:l的第l位 第 1205位的区域中，含有vegfmRNA的5' UTR以及从起始密码子atg至第167碱基的序列。
构建体mock 将没有插入vegf基因的DNA片段的空载体(pSCT质粒载体)称为构建体mock。
(2) p53mRNA和p53蛋白的表达
31
在人肺癌H1299细胞(无p53)中，共同导入表达p53的质粒载体以及作为效应物 的上述各种质粒构建体。上述表达p53的质粒载体在下面被称为"p53表达载体"。该p53 表达载体是在pcDNA3. 1载体(Invitrogen公司)的BamHI-EcoRI位点中，插入人p53的蛋 白质编码序列(Seq ID No :2的第252位-第1433位)制备而成的(pcDNA3. I_p53)。以 下与此相同。将共同导入的各细胞培养18小时，通过RNA印迹分析外源性p53mRNA的表达 水平。另外，将共同导入的各细胞培养24小时，并利用使用抗p53抗体和抗HA标记抗体的 蛋白质免疫印迹分别分析外源性p53蛋白和外源性VEGF蛋白的表达水平。培养是使用含 有10%胎牛血清和100ii g/ml(100units/ml)链霉素的DMEM培养基，在温度37°C、5% C02 的条件下进行的(下同)。 这些结果示于图2 (b)和(c)。图2 (b)是显示各细胞中p53mRNA的表达的RNA印 迹结果，上段显示p53mRNA的表达，下段显示gapdhmRNA的表达。图2 (c)是显示各细胞中 p53蛋白的表达的蛋白质免疫印迹结果，上段显示p53蛋白的表达，下段显示13 -肌动蛋 白的表达。这两个图中，泳道l "NT"表示未导入载体的细胞，泳道2 "A"表示导入构建体 A(pl65mSPHA3')的细胞，泳道3 "B"表示导入构建体B(pl65mSPHA)的细胞，泳道4 "C"表 示导入构建体C(pl65-3')的细胞，泳道5 "mock"表示导入空载体的细胞，泳道6 "D"表示 导入构建体D(pVC)的细胞。"p53+"是指导入p53表达载体。 如图2 (b)和(c)所示，表达vegf基因全长成熟mRNA的构建体A的导入细胞(泳 道2)中明显抑制了外源性p53mRNA的表达。由该结果可知，VEGF蛋白或vegf mRNA参与了 p53的表达抑制。因此，为了确认vegf mRNA的UTR序列是否参与p53的表达抑制，使用缺 失3' UTR的构建体B和缺失5' UTR的构建体C来验证p53的表达。结果，缺失3' UTR的构 建体B的导入细胞(泳道3)与包括vegf基因全长cDNA的构建体A的导入细胞(泳道2) 一样，明显抑制外源性p53的表达。与此相反，在缺失5'UTR的构建体C的导入细胞(泳道 4)中，p53表达不受影响。该结果表明，p53mRNA的抑制不是通过VEGF蛋白实现的，而是通 过vegf mRNA、特别是通过vegf mRNA的5' UTR序列实现的。为了进一步确认5' UTR的参 与，对于在CAT编码基因中融合5' UTR的DNA序列、表达CAT mRNA和5' UTR的嵌合mRNA 的构建体D，同样确认了 p53的表达。另外，在构建体D的导入细胞中，因为只有vegf基因 的5'UTR，所以没有产生VEGF蛋白。结果在构建体D的导入细胞(泳道6)中，虽然没有产 生VEGF蛋白，但仍然确认了 p53mRNA和p53蛋白的表达抑制。从该结果可确认，不是VEGF 蛋白，而是vegfmRNA，其中特别是mRNA的5' UTR参与了 p53的表达抑制。因此，对于vegf 基因，通过抑制5'UTR的表达或者切断所表达的5'UTR，可解除vegf mRNA对p53的下调作 用。另外，使用P53缺失的HCT116细胞时也获得了同样的结果。
实施例A3 制备表达部分缺失的5'UTR或者变异的5'UTR的构建体，确定vegf5'UTR中参与 p53下调的关键序列。 [O452] (1)质粒构建体 与人vegf基因外显子1对应的DNA片段以及下述各种质粒构建体，与上述实施例 A2—样，基于前述的各文献制备。由下述方法制备的质粒构建体如图3(a)所示。
构建体A(pVC) (vegf 1-1203) 参照文献Huez， I. et al. Mol. Endocrinol. 152197-2210 (2001)的方法制备构建
32体A(pVC)。构建体A是将由vegf基因中的外显子1、外显子2以及外显子3的一部分组成 的DNA序列与CAT编码序列的嵌合DNA插入pSCT质粒载体而成。上述DNA序列是对应于 vegfmRNA的外显子l(Seq ID No :1的第1_1104位)、外显子2 (Seq ID No :1的第1105-1154 位)以及外显子3的部分序列(Seq ID No :1的第1155-1203位)的序列。另外，该构建体 A与实施例A2中的构建体D相同。
构建体B( A 555-1012) 制备外显子1部分缺失的构建体B。构建体B是将由缺失Seq IDNo:l的第
555-1012位的区域的外显子1部分序列、外显子2 (Seq ID No :1的第1105-1154位)以及
外显子3部分序列(Seq ID No :1的第1155-1203位)组成的DNA序列与CAT编码序列的
嵌合DNA插入pSCT质粒载体而成。具体地说，用Ng0MIV处理上述构建体A (pVC)，再次连
接，即得构建体B。 构建体C(A 1-744) 制备外显子1部分缺失的构建体C。构建体C是将由缺失Seq IDNo :1的第1_744 位的区域的外显子l部分序列、外显子2(Seq ID No :1的第1105-1154位)以及外显子3 部分序列(Seq ID No :1的第1155-1203位)组成的DNA序列与CAT编码序列的嵌合DNA 插入pSCT质粒载体而成。具体地说，用Xbal和NheI处理上述构建体A (pVC)，再次连接，即 得构建体C。 构建体D( A 1-658) 制备外显子1部分缺失的构建体D。构建体D是将由缺失Seq IDNo :1的第1_658 位的区域的外显子l部分序列、外显子2(Seq ID No :1的第1105-1154位)以及外显子3 部分序列(Seq ID No :1的第1155-1203位)组成的DNA序列与CAT编码序列的嵌合DNA 插入pSCT质粒载体而成。具体地说，用Xbal和Xmnl处理上述构建体A (pVC)，经连接酶处 理使末端平滑后，再次连接，即得构建体D。
构建体E(Al-475、 A 918-1175) 制备外显子1部分缺失的构建体E。构建体E是将由缺失Seq IDNo :1的第1_475 位的区域和第918-1175位的区域的外显子1部分序列、以及5'区域缺失的外显子3部分 序列(Seq ID No :1的第1176-1203位)组成的DNA序列与CAT编码序列的嵌合DNA插入 pSCT质粒载体而成。具体地说，首先，用BamHI处理上述构建体A (pVC)，除去BamHI片段后， 再次连接(pVC-A 1-474)。然后，除去该pVC-A 1-474的Smal-BsaBI片段，再次连接即得。
构建体F(Al-475、 A 746-1012) 制备外显子l部分缺失的构建体F。构建体F是将由缺失Seq IDNo : 1的第1_475位 的区域和746-1012位的区域的外显子l部分序列、外显子2 (Seq ID No :1的第1105-1154 位)以及外显子3部分序列(Seq IDNo :1的第1155-1203位)组成的DNA序列与CAT编 码序列的嵌合DNA插入pSCT质粒载体而成。具体地说，除去上述构建体pVC- A 1-474的 Nhel-Ng0MIV片段，经连接酶处理使末端平滑，再次连接，获得构建体F。
构建体G(pVCTTT) (499-501的变异CTG — TTT) 参照文献(Huez， Let al. Mol. Endocrinol. 152197-2210(2001))的方法，制备具 有表达变异5'UTR的变异外显子1的构建体G(pVCTTT)。构建体G是将由上述变异外显子 l序列和外显子2部分序列(Seq ID No :1的第1105-1205位)组成的DNA序列与CAT编码序列的嵌合DNA插入pSCT质粒载体而成。具体地说，在编码5' UTR的DNA序列中，将CTG 密码子(与Seq ID No :1的第499-501位对应)变异为TTT。通过导入该变异，从pVCTTT 转录的mRNA不能从CTG密码子(Seq ID No :1的第499-501位)开始产生蛋白质。
构建体H(oVCmut5')(变异5' UTR) 制备具有表达变异5'UTR的变异外显子1序列以及外显子2部分序列(Seq ID No : 1的第1105-1205位)与CAT编码序列的嵌合DNA的构建体H。具体地说，以对从CTG密码 子(与Seq ID No :1的第499-501位对应)开始翻译的长VEGF蛋白(以下称为"L-VEGF") 的氨基酸序列没有影响的方式，在外显子1序列中导入变异。变异是针对在编码5' UTR的 DNA序列中与Seq ID No :1的第594-915位对应的DNA区域进行的。 首先合成在编码5' UTR的DNA序列中在与Seq ID No :1的第594-915位对应的 DNA区域中有变异的4种双链寡核苷酸。各双链寡核苷酸的正义链序列如下所示。在下述 序列中，小写字母为变异位点。
片段l(Seq ID No :33) 5' -GCG AGC CGC GGG CAa GGa CCa GAa CCa GCa CCa GGgGGa GGa GTa GAa GGa
GTa GGG GCT C_3， 片段2(Seq ID No :34) 5' -GG GCT CGa GGa GTa GCa tta AAg CTa TTt GTa CAg tta ttaGGa TGc TCa CGa TTt GGg GGg GCa GTa GTa aga GCa GGa GagGCa GAa CCa AGt GGg GCa GCa AGg AGT GCT AGC-3' 片段3(Seq ID No :35) 5，-GCT AGC TCa GGa aga GAa GAa CCa CAa CCa GAa GAa GGa GAa GAa Gag Gag GAa AAa GAg GAa GAa cgt GGa CCa CAaTGG agg tta GGa GCa aga AAa CCG GGC TC-3'
片段4(Seq ID No :36) 5，_G GGC TCA TGG ACa GGa GAa GCa GCa GTa TGt GCc GatAGc GCa CCt GCa GCa aga GCa CCa CAa GCa tta GCC CGG GCCTCG-3' 使这4种双链寡核苷酸与经SacII和Xmal处理的上述构建体A(pVC)连接。另夕卜， 将片段1至4，以从上游5'侧依次连接的方式插入上述构建体A(pVC)。对于插入了具有变 异的4种片段的质粒构建体，通过DNA测序确认插入片段。由此获得的质粒构建体称为构 建体H(pVCmut5')。 (2) p53mRNA和p53蛋白的表达 在H1299细胞(无p53)中，共同导入上述p53表达载体以及作为效应物的上述各 种质粒构建体。然后，与上述实施例A2 —样，培养各导入细胞，分析外源性p53mRNA的表达 水平以及外源性p53蛋白的表达水平。同时，通过使用抗L-VEGF抗体的蛋白质免疫印迹来 分析L-VEGF的表达水平。这些结果示于图3(b)和(c)。图3(b)和(c)中，从上端数第l 段是显示p53mRNA的表达的RNA印迹结果，第2段是显示gapdh mRNA的表达的RNA印迹结 果。图3(c)中，从上端数第3段表示p53蛋白的表达，第4段表示L-VEGF蛋白的表达，第 5段表示P-肌动蛋白的表达。图3(b)中，泳道l "A"为导入构建体A的细胞，泳道2 "B" 为导入构建体B的细胞，泳道3 "C"为导入构建体C的细胞，泳道4 "D"为导入构建体D的 细胞，泳道5 "E"为导入构建体E的细胞，泳道6 "F"为导入构建体F的细胞。图3(c)中，泳道1 "NT"为未导入载体的细胞，泳道2 "mock"为导入构建体mock的细胞，泳道3 "G" 为导入构建体G的细胞，泳道4 "A"为导入构建体A的细胞，泳道"H"为导入构建体H的细 胞。"p53+"表示导入p53表达载体。另夕卜，在图3(c)中，"ns"表示由抗L-VEGF抗体检测 到的非特异性结合。 如图3(b)所示，构建体D(泳道4)和E(泳道5)与表达含有5' UTR的全长外显 子1RNA的构建体A导入细胞(泳道1) 一样，具有下调p53mRNA表达的能力。构建体D具 有从外显子1的第659位开始的下游区，构建体E具有第476位-第917位以及从1176位 开始的下游区。由此可知，vegf 5' UTR的第659位-第917位的259个核苷酸(nt)的分 子参与了p53的下调。另一方面，p53的表达未被抑制的构建体B导入细胞(泳道2)、构建 体C导入细胞(泳道3)、构建体F导入细胞(泳道6)中分别缺失外显子1的第555位-第 1012位、第1位-第744位、第746位-第1012位的区域。该结果与抑制p53表达的构建 体D、E的结果相对应。 在前述的第659-917位的区域中，含有被称为内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)的独特的结构序列的一部分(Huez， Let al.Mol.Cell. Biol. 18,6178-6190(1998) ，Akiri，G. et al. Oncogene 17,227-236(1998))。因此研究了其 他基因(fgf-2、 pdgf和c-myc)的含有IRES的5' UTR是否影响p53的表达。结果示于图 4。该图是显示在H1299细胞中p53mRNA表达的RNA印迹结果，在所述的H1299细胞中共同 导入了表达各种基因的5'UTR RNA与CATmRNA的嵌合mRNA的质粒载体以及p53表达载体。 如该图所示，可确定特异性抑制p53表达的只是vegf5' UTR。 文献(Huez，I.et al. Mol. Endocrinol. 15， 2197-2210 (2001))证实，人vegf mRNA 的5'UTR有时从位于起始密码子AUG(1039-1041)上游的CUG密码子(499-501)开始，在框 内(in flame)翻译成VEGF蛋白的N末端加长的蛋白质(L-VEGF)。而且，前述的参与p53 表达抑制的RNA关键序列(第659-917位)集中于翻译成L-VEGF的上述CUG密码子的下游 区域。因此，可认为vegf 5' UTR RNA和L-VEGF蛋白哪一个都有参与p53表达抑制的可能 性。因此，对于vegf 5'UTR RNA和L-VEGF蛋白中的哪一个诱导了 p53表达的抑制，使用表 达变异5'UTR的构建体G和构建体H来确认。如上所述，构建体G中，以使起始密码子CTG 变为非起始密码子TTT (mRNA中CUG变为UUU)的方式使DNA序列发生变化。构建体H中， 对5' UTR的编码DNA序列进行置换，使得可以产生氨基酸序列不发生变化的L-VEGF蛋白， 并且，使RNA结构发生变化从而可使RNA功能完全损害。结果如图3(c)所示，构建体G(泳 道3)通过使非起始密码子变为TTT，未检测到L-VEGF蛋白，但依然抑制了 p53mRNA的表达。 另一方面，构建体H(泳道5)与具有全长5'UTR的构建体A(泳道4) 一样，产生L-VEGF蛋 白，但未表现出p53mRNA的表达抑制能力。这些结果表明，不是从5' UTR翻译的L-VEGF蛋 白，而是5' UTR通过mRNA水平具有抑制p53表达的能力。因此，通过抑制vegf mRNA中的 5' UTR的表达，或者分解所表达的5' UTR(mRNA)，可解除p53的下调。另外，从上述结果可 知，可以抑制5'UTR整体的表达，也可以例如只抑制关键序列(第659-917位)的表达。这 样，如果解除了 p53的表达抑制，那么通过p53的表达，可抑制癌细胞的生长，诱导凋亡。并 且，结果可抑制细胞的癌化和癌化细胞的生长，也可治疗癌症。
实施例A4 本实施例中确认了 vegfmRNA中的5' UTR对内源性p53表达以及p53依赖性凋亡应答的影响。本实施例中使用了表达嵌合mRNA的腺病毒骨架载体，所述嵌合mRNA是在编 码黄色荧光蛋白(Yellow fluorescentprotein， YFP)的mRNA中融合了 vegf5， UTR。
(1)重组腺病毒载体的构建 对上述实施例A2中的构建体D (pVC)使用EcoRI和Ncol处理，将得到的 EcoRI-Ncol片段与pd2EYFP-Nl(Clontech公司制造)连接。得到的质粒构建体称为 pVY。另外，对上述实施例A3中的构建体H(pVCmut5')使用EcoRI和Ncol处理，将得到 的EcoRI-Ncol片段与pd2EYFP-Nl (Clontech公司制造)连接。得到的质粒构建体称为 pVYmut5'。 对pVY、 pVYmut5，和pd2EYFP-Nl (对照)使用EcoRI和Notl处理，将切下的片段 使用Klenow片段处理使其变得平滑。然后，将各平滑化的片段克隆至pShuttleCMV载体。 得到的质粒载体分别称为pShuttleCMV-VY、pShuttleCMV-VYmut5'和pShuttleCMV-YFP(对 照)。这些质粒载体的构建通过DNA测序确认。接着，在BJ5183细菌中，通过在腺病毒骨 架质粒pAdEasy-l以及经PmeI处理的各质粒pShuttleCMV-VY、 pShuttleCMV-VYmut5'和 pShuttleCMV-YFP之间进行同源重组，制备重组腺病毒载体Ad-VY、 Ad-VYmut5'和Ad-YFP。 然后，将这些重组腺病毒载体用Pacl进一步处理，使用JetPEI (Polyplus-transfection 公司)导入HEK293细胞(ATCC)中。将复制的病毒通过CsCl平衡密度梯度离心法纯化， 在-8(TC保存备用。对病毒的蚀斑形成单位的功能滴定通过HEK293细胞的终点稀释感染 (end-point dilution infection)来确认。另外，以下试验针对单个批次的各重组腺病毒 载体Ad-VY、 Ad-VYmut5'和Ad-YFP。 Ad-VY是表达在编码YFP的mRNA中融合了 vegf mRNA全长5'UTR而成的嵌合mRNA 的重组载体(以下称为"Ad-VEGF5' ") 。 Ad-VYmut5'是具有在编码YFP的mRNA中融合了 如上述图3(a)的构建体H(pVCmut5')所示的变异5'UTR而成的嵌合基因的载体。Ad-YFP 是表达编码YFP的mRNA、并且未插入vegf基因的5' UTR的对照载体(以下也称"Ad-对 昭")。 (2)内源性p53的表达
内源性p53mRNA的表达 对HCT116细胞(亲本细胞、野生型p53)，根据现已公知的方法，分别感染上述各 重组腺病毒载体Ad-VY、 Ad-VYmut5'和Ad-YFP，持续12小时。然后，用90 y mol/L的5-FU 处理感染的各细胞以预定时间(0、6、12小时)。对处理后的细胞，通过RNA印迹分析内源 性p53mRNA、外源性vegf-YFP mRNA和外源性YFP mRNA的表达水平。HCT116的培养使用含 有10%胎牛血清和100ii g/ml(100units/ml)链霉素的McCoy' s 5A培养基，在温度37°C、 5%0)2的条件下进行(下同)。结果示于图5(a)。图5(a)是显示各细胞中内源性p53mRNA 的表达的RNA印迹结果。该图中，从上端数第1段表示内源性p53mRNA的表达，第2段表 示vegf-YFP嵌合mRNA或YFPmRNA的表达，第3段表示gapdh mRNA的表达。在该图中，泳 道1 3 "Ad-对照"是对照Ad-YFP的导入细胞的结果，泳道4 6 "Ad-VEGFmut5'"是 Ad-VYmut5'的导入细胞的结果，泳道7 9 "Ad-VEGF5'"是Ad-VY的导入细胞的结果。另 外，"5-FU"的数值表示在5-FU存在下的培养时间(h)。另夕卜，"0h"表示未经5-FU处理。
内源性p53蛋白的生成 与前述一样，对用各重组腺病毒载体感染12小时的细胞，用120iimol/L的5-FU处理预定时间(0、9、18小时)。对处理后的细胞，通过蛋白质免疫印迹分析内源性p53蛋白 的表达水平。结果示于图5(b)。图5(b)中，从上端数第l段表示内源性p53蛋白的表达， 第2段表示P-肌动蛋白的表达。该图中的泳道编号与上述图5(a)相同。
d53通路诱导的各种某闵的mRNA的表汰 与前述一样，对用各重组腺病毒载体感染的细胞，用120 ii mol/L的5-FU处理预定 时间(0、9、 18小时)。对处理后的细胞，通过RNA印迹分析noxa mRNA、bax mRNA和p21mRNA 的表达水平。结果示于图5(c)。图5(c)中，从上端数第l段表示noxa mRNA的表达，第2 段表示bax mRNA的表达，第3段表示p21mRNA的表达，第4段表示gapdh mRNA的表达。该 图中的泳道编号与上述图5(a)相同。 如图5(a)的泳道7 9所示，在过量表达vegf 5'UTR(未变异)的细胞(Ad-VY) 中，内源性p53mRNA的表达量明显降低。而且，如图5(b)的泳道7 9所示，受5-FU作用 的p53蛋白的蓄积也受到vegf5' UTR的明显抑制。进而，如图5(c)的泳道7 9所示，结 果是作为p53的靶基因的noxa、 bax和p21的mRNA的表达诱导也被抑制。与此相反，如图 5 (a)所示，在泳道4 6的表达vegf变异5'UTR的细胞(Ad-VYmut5')和泳道1 3的对 照细胞(Ad-对照)中，确认了内源性p53mRNA的表达，而且，确认了随着5-FU处理时间的 延长，p53mRNA的表达量增加。同时，如图5(b)所示，受5-FU作用的p53蛋白的蓄积也随 着5-FU处理时间的延长而增加。进而，如图5(c)所示，结果是确认了作为p53的靶基因的 noxa、 bax和p21的mRNA的表达也被诱导。
(3)p53依赖性凋亡应答 与前述一样，将用各重组腺病毒载体感染12小时的细胞用预定浓度(0、30、60、 120 ii mol/L)的5-FU处理60小时。与上述实施例Al —样，确认处理后的细胞的凋亡(％ ) (平均值士SD，n二3)。结果示于图6(d)。图6(d)是显示各种细胞的凋亡比例(％ )随 5-FU浓度变化而变化的图。该图中，O表示对照Ad-YFP的导入细胞(Ad-对照)的结果，□ 表示Ad-VYmut5'的导入细胞(Ad-VYmut5')的结果，B表示Ad-VY的导入细胞(Ad-VEGF5') 的结果。另外，图6(e)中也是一样的。 另外，与前述一样，对用各重组腺病毒载体感染12小时的细胞，用120iimol/L的 5-FU处理预定时间(0、12、24、48、60小时)，确认凋亡(％ )(平均值士SD，n = 3)。结果示 于图6(e)。图6(e)是显示经5_FU处理的各种细胞的凋亡比例(％ )随时间变化的图。
如图6(d)和(e)所示，表达vegf 5'UTR的细胞(Ad-VY、B )对由5-FU诱导的凋 亡表现出明显的耐性。特别是，如该图(d)所示，在5-FU浓度为30 ii mol/L或60 y mol/L 时，5'UTR导致凋亡被完全抑制。如该图(e)所示，确认了随着5-FU的处理时间的延长，凋 亡大幅度增加。与此相反，在表达vegf变异5'UTR的细胞(Ad-VYmut5'、口 )中，未表现出 对凋亡的耐性。而且，如图6(d)所示，凋亡比例依赖于5-FU浓度而提高，如图6(e)所示， 凋亡比例依赖于5-FU的处理时间而提高。该结果与不表达vegf 5'UTR的细胞(Ad-对照、 〇)的结果相同，并与图5(b)、 (c)所示的p53通路活化的结果相对应。
实施例A5 确认了由vegf 5' UTR导致所表达的内源性p53mRNA分解的可能性。
(1) vegf 5， UTR诱导p53mRNA的分解 与上述实施例A4—样，在H1299细胞(无p53)中，共同导入上述p53表达载体以及上述各重组质粒载体pVC、pVCmut5'或空载体(mock)，培养12小时。从各导入细胞回收 RNA，通过变性琼脂糖凝胶电泳来分离RNA，通过RNA印迹检测外源性p53mRNA和p53mRNA分 解产物。结果示于图7(a)。图7(a)是显示各细胞中外源性p53mRNA及其分解产物的照片。 在该图中，泳道1 "mock"是导入空载体的细胞的结果，泳道2 "VEGFmut5'"是导入pVCmut5' 的细胞的结果，泳道3 "VEGF5'"是导入pVC的细胞的结果。印迹照片的左侧显示有RNA标 记(Ambion公司制造)的大小(nt)。 如该图(a)的泳道3所示，确认了 vegf5' UTR的表达导致所表达的p53mRNA分 解。与此相反，在不表达vegf5' UTR的情况下(泳道1)或者表达变异型vegf5' UTR的情 况下(泳道2)，虽然表达p53mRNA，但未确认有其分解产物。该结果表明，vegf5' UTR RNA 对p53mRNA的表达在转录后水平上进行抑制。 (2)在5'UTR介导的p53mRNA的分解中翻译抑制剂放线菌酮(cycloheximide)的 影响 首先，在H1299(无p53)中共同导入上述p53表达载体以及上述各重组质粒载体 pVC、 pVCmut5'，培养8小时。然后，在存在或不存在终浓度为50 y g/ml的放线菌酮的条件 下，将各导入细胞处理16小时。对处理后的细胞通过RNA印迹确认p53mRNA的表达水平。 结果示于图7(b)。图7(b)是显示各细胞中p53mRNA的表达的RNA印迹结果。该图中，从 上端数第1段表示p53mRNA的表达，第2段表示g即dhmRNA的表达。在该图中，泳道1和 3 "VEGF5'"为表达vegf5' UTR的pVC导入细胞，泳道2和4 "VEGF mut5'"为表达变性 5'UTR的pVCmut5'导入细胞。另外，"_"和"+ "表示有无放线菌酮(CHX)的存在。
如该图(b)所示，确认了经放线菌酮处理(泳道3、4)与未添加放线菌酮(泳道1、 2)相比较，由vegf 5' UTR导致的p53mRNA的沉默被显著抑制。该结果说明，在vegf5' UTR 介导的p53mRNA的沉默中有翻译过程参与。 (3)在体外vegf5' UTR RNA与p53mRNA的直接相互作用 已知RNA介导的基因沉默的机制是通过形成碱基对而导致的目标RNA与调控RNA 的直接的相互作用。因此，分析了 vegf5' UTR和p53mRNA的直接相互作用。
将上述实施例A2中的质粒载体D (pVC)、实施例A3中的H (pVCmut5')和pc53表达 载体(pcDNA3. l-p53)通过BsaBI和XbaI处理而成为线状。以这些线状化DNA为模板，使用 mMESSAGEmMACHINE试剂盒(Ambion公司制造)，通过ML转录法，分别合成5'末端被帽化 的RNA。合成RNA通过260nm吸光度以及琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色来定量。将各RNA溶 解于没有RNA酶的水中，将此溶液在9(TC加热3分钟，然后慢慢冷却至25 °C 。将各RNA以如 图7(c)所示的组合、每种等量(lpmol)地与含有Mg"的缓冲液混合，在37t:温育60分钟。 上述缓冲液是可导致RNA内部分子聚集的高盐浓度的、含有10mmol/L Tris-HCl (pH7. 5)、 50mmol/L KCl、5mmol/LMgCl2和40U/ml RNasin (注册商标，Promega公司制造)的水溶液。 将该温育后的样品上样至1. 8%未变性琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色。
结果示于图7 (c)。该图是显示体外vegf5' UTR RNA与p53mRNA会合的照片。该 图中，"VEGF mut5' UTR RNA"是变异型5， UTR RNA，"VEGF 5， UTR RNA"是5' UTR RNA(野 生型)，"p53RNA"是p53 mRNA。各泳道上侧的"+、 表示在上述含Mg2+缓冲液内温育的RNA的组合。另 外，在该图中，箭头指示5' UTR RNA与p53mRNA的异源双链。
如该图的泳道3所示，确认了参与p53mRNA衰减的vegf5' UTRRNA与p53mRNA形成了异源双链。另一方面，如泳道4所示，不参与p53mRNA衰减
的变异vegf5' UTR RNA不与mRNA形成异源双链。 (4)翻译过程与vegf5' UTR RNA介导的p53mRNA衰减的关联性 vegf5' UTR与p53mRNA形成异源双链后，进行无细胞蛋白质合成反应(无细胞翻
译反应)，确认了翻译过程对p53mRNA分解的影响。 (5) p53mRNA及其分解产物的检测 与上述(3) —样，使变异5'UTR RNA或5'UTR与p53mRNA—起温育。如上所述，变 异5' UTR RNA与p53mRNA通过温育形成异源双链。然后，使用该处理后的RNA样品，在不存 在或存在放线菌酮(终浓度50iU/ml)的条件下，或者，在由蔗糖密度梯度离心分离法制备 的纯化核糖体的存在下，进行无细胞蛋白质合成反应。无细胞蛋白质合成参照论文(Huez， Let al.Mol. Cell. Biol. 18,6178-6190(1998))或者使用Wako PURE系统(商品名，Wako Chemical公司制造)，根据其使用说明书进行。 对上述反应液通过RNA印迹分析p53mRNA及其分解产物。结果示于图8 (d)。该图 是显示在vegf5' UTR RNA共存下，无细胞蛋白质合成反应液中的p53mRNA及其分解产物的 RNA印迹结果。该图中，泳道2、5、8 "VEGF mut5'"是将变异5' UTR RNA与p53mRNA —起温 育的样品的结果，泳道3、6、9 "VEGF 5'"是将5'UTR RNA(野生型)与p53—起温育的样品 的结果，泳道1、4、7 "-"是只温育p53mRNA的样品的结果。泳道4 6 "+放线菌酮"、泳道 7 8 "+核糖体"分别表示在放线菌酮存在下和在纯化核糖体存在下进行无细胞蛋白质合 成。 结果，如该图所示，在p53mRNA与5'UTR RNA形成了异源双链的体系(泳道3)中， 在不存在放线菌酮的条件下，确认了 p53mRNA的部分分解。而且在该体系中，通过加入翻译 抑制剂放线菌酮，p53mRNA的部分分解被完全阻断。再者，在形成该异源双链的体系中，即 使只添加纯化核糖体，也确认有p53mRNA部分分解。这些结果说明，异源双链RNA与核糖体 之间的相互作用可启动vegf5' UTR介导的p53mRNA的分解。据此推测，p53mRNA的部分分 解成为细胞内进一步衰减的触发器。与此相反，在不存在5'UTR RNA的系统(泳道1、4、7) 以及变异5'UTR与p53共存的系统(泳道2、5、8)中，在不存在放线菌酮的条件下，不会导 致p53mRNA的分解。
(6)p53蛋白的检测 接着确认了 5' UTR介导的p53mRNA部分分解对p53蛋白的翻译的影响。
与上述(4) 一样，将各RNA以图8(e)所示的组合温育，进行无细胞蛋白质合成。 另外，在无细胞蛋白质合成的反应液中，共存有[35S]甲硫氨酸。然后，将体外合成的P53蛋 白，通过使用12X聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分离，将干燥后的凝胶进行放射自显影。结 果示于图8(e)。该图是显示在vegf 5'UTR共存下的、在无细胞蛋白质反应液中的p53蛋 白的合成的放射自显影。在该图中，"VEGF mut5' RNA"表示变异5' UTR，"VEGF 5' RNA"表 示5， UTR(野生型)，"p53RNA"表示p53mRNA。 如该图所示，在p53mRNA与vegf5' UTR RNA形成了异源双链的体系(泳道3)中， 与不存在vegf5' UTR的体系(泳道1)和变异vegf5' UTR的体系(泳道2)相比较，p53蛋 白合成被显著抑制。
实施例A6 在实施例A3中得知，vegf5' UTR的第659-917位的259个核苷酸(nt)的分子在 p53的下调中是必要的。因此，进一步限定参与p53下调的、vegf5' UTR中的关键序列。
(1)质粒构建体 人VEGF皿的编码基因(vegf基因)的外显子1以及下述各种质粒构建体与上述 实施例A2 —样，基于前述各文献制备。由下述构建体表达的vegf mRNA的区域在图9中给 出。 构建体vegf mRNA(Dl65mSPHA3')(全长vegf mRNA) 在质粒载体pSCT的Xbal-Xhol部位，插入除去内含子的全长vegfmRNA的编码 DNA(Bornes， S. et al. J. Biol. Chem. 279， 18717-18726 (2004))。将得到的质粒构建体作为 构建体vegfmRNA (pl65mSPHA3')。另外，在导入该质粒构建体的细胞中，表达vegf165基因 的全长mRNA。 构建体BC019867RNA (16-780) 购买IMAGE Clone(Clone ID 4153053， Open Biosystems公司)。它是将编码 vegf基因外显子1的5' UTR中的规定区域(16-780位区域)的DNA片段插入质粒载体 pCMV-SP0RT6的Notl-Sall部位而成。根据NCBI编号BC019867,将该质粒构建体作为构建 体BC019867RNA。另外，在导入该质粒构建体的细胞中，表达vegf mRNA 5'UTR的16-780 位的区域。 构建体BC011177RNA (526-1216) 购买IMAGE Clone (Clone ID 4150451， Open Biosystems公司)。它是将编码vegf 基因外显子1的第526-1104位的区域和内含子1的第1-112位的区域的DNA片段插入质 粒载体pCMV-SP0RT6的Notl-Sall部位而成。根据NCBI编号BC019867,将该质粒构建体 作为构建体BC011177RNA。另外，在导入该质粒载体的细胞中，表达Seq ID No :45所示的 vegf前体mRNA的第526-1216位的区域。
构建体vegf IresRNA (600-879) 针对实施例A3中特定的vegfmRNA 5' UTR的第659-917位的区域，通过使用反义 寡聚DNA探针的RNA印迹进行解析。结果示于图10。图10是显示各种人癌细胞株中vegf 的RNA片段的RNA印迹结果。如该图所示，可发现，在各种癌细胞株中存在由链长约200 300碱基组成的小分子RNA，该小分子RNA在人正常成纤维细胞中几乎不表达。因此，通过 变性琼脂糖凝胶电泳法对含有该小分子RNA的成分进行分离，通过常规方法(参考文献 Kawano，M.et al. Nucleic Acid Res. 33(3) :1040-1050(2005))克隆上述小分子RNA。测定 得到的RNA的碱基序列，是vegfmRNA的5' UTR中的第600-879位的区域组成的RNA产物。 该小分子RNA被单独命名为工RES-r^lated旦mall RNA (IresRNA)。然后，将上述通过克隆 得到的cDNA再克隆至质粒载体pcDNA3. 1的XhoI-HindIII部位。将得到的质粒构建体作 为构建体vegflresRNA。在导入该质粒构建体的细胞中，表达vegf mRNA的5'UTR中的第 600-879位的区域。
构建体vegf mRNA变异1 如图9所示，制备表达在vegf mRNA的5'UTR中第594-745位的区域内有变异 的mRNA的构建体。具体地说，在上述构建体vegf mRNA(pl65mSPHA3')的SacII-Nhel部位，将双链的下述片段1和片段2从5'侧按该顺序连接。下述正义链中的小写字母是变异 的碱基。这样得到的质粒构建体称为构建体vegf mRNA变异l。在导入该质粒的细胞中， vegf5' UTR中的第594-741位的区域发生变异。
片段1 (vegf 5' UTR的第589-639位)
正义链(Seq ID No :37) 5，-GGG CAa GGa CCa GAa CCa GCa CCa GGg GGa GGa GTaGAa GGa GTa GGG GCT_3，
反义链(Seq ID No :38) 5' -CCTACTCCTTCTACTCCTCCCCCTGGTGCTGGTTCTGGTCCTTGCCCGC-3'
片段2 (vegf 5， UTR的第640-745位)
正义链(Seq ID No :39) 5' -CGa GGa GTa GCa tta AAg CTa TTt GTa CAg tta tta GGaTGc TCa CGa TTt GGg GGg GCa GTa GTa aga GCa GGa Gag GCaGAa CCa AGt GGg GCa GCa AGg AGT G_3，
反义链(Seq ID No :40)
GAGCATCCTAATAACTGTACAAATAGCTTTAATGCTACTCCTCGAGCC-3'
构建体vegf mRNA变异2 如图9所示，制备表达在vegf mRNA的5' UTR中第746-915位的区域内有变异的
mRNA的构建体。具体地说，在上述构建体vegf mRNA (pl65mSPHA3')的Nhel-Xmal部位，将双
链的下述片段3和片段4从5'侧按该顺序连接。下述正义链中的小写字母是变异的碱基。
这样获得的质粒构建体称为构建体vegf mRNA变异2。导入该质粒的细胞中，vegf5'UTR中
的第753-915位的区域发生变异。 片段3 (vegf 5， UTR的第746-850位) 正义链(Seq ID No :41) 5，_CT AGC TCa GGa aga GAa GAa CCa CAa CCa GAa GAa GGaGAa GAa GAgGAg GAa AAa Gag GAa GAa cgt GGa CCa CAa TGGagg tta GGa GCa aga AAa CCG GGC T_3，
反义链(Seq ID No :42)
TTCTTCTGGTTGTGGTTCTTCTCTTCCTGAG-3， 片段4(vegf 5' UTR的第851-917位) 正义链(Seq ID No :43) 5'-CA TGG ACa GGa GAa GCa GCa GTa TGt GCc Gat AGc GCaCCt GCa GCaaga GCa
CCa CAa GCa tta GC-3' 反义链(Seq ID No :44)
CCATGAGCC-3' (2) p53mRNA的表达 在H1299细胞(无p53)中共同导入上述p53表达载体以及上述各种质粒构建体。 然后，与上述实施例A2—样，培养各导入细胞，分析p53mRNA的表达水平。结果示于图11 (a) 和(b)。图11 (a)和(b)中，从上端数第1段是显示p53mRNA的表达的RNA印迹结果，第2
41段是显示gapdh mRNA的表达的RNA印迹结果。在两图中，"-"为只导入p53表达载体的细 胞，是p53mRNA表达的对照(泳道1)。 如该图(a)所示，在表达第600-879位的mRNA(泳道5)的细胞中，与表达全长vegf mRNA(泳道2)的细胞一样，未确认p53mRNA的表达。因此，结合上述实施例A2中确定的结 果(第659-917位)，可将参与p53表达沉默的序列限定在vegf mRNA的第659-879位。
另外，如该图(a)所示，在分别表达第16-780位的mRNA (泳道3)和Seq ID No :45 的第526-1216位的mRNA(泳道4)的细胞中，与表达全长vegf mRNA(泳道2)的细胞一样， 未确认p53mRNA的表达。这些各种mRNA共同含有第600-780位的区域。因此，结合上述实 施例A2中确定的结果(第659-917位)，可将参与p53表达沉默的序列限定在vegfmRNA的 第659-780位。 再者，如该图(b)所示，第753-915位发生变异的vegf mRNA变异2(泳道3)与 表达全长vegf mRNA(泳道4)的细胞一样，未确认p53mRNA的表达。但是，第594-741位 发生变异的vegf mRNA变异1 (泳道2)与p53mRNA的对照(泳道1)在同样的位置确认了 p53mRNA的表达。由此，结合上述实施例A2的结果以及上述图11 (a)的结果，可知第659 741位的区域参与p53表达的沉默。 因此，通过分解含有例如vegf mRNA中第659-879位、第659-780位、第659-741位 等序列的RNA序列，或者抑制向上述RNA序列的转录，可避免p53mRNA的表达抑制。由此， 例如，可抑制癌细胞的生长和生存，预防癌化，治疗癌症等。
实施例A7 向小鼠移植vegf 5' UTR的表达细胞，确认对皿的癌细胞生长的影响。
使用上述实施例A4中制备的质粒构建体pVY和新制备的质粒构建体pVY变异。 pVY变异是将实施例A6中制成的构建体vegf mRNA变异1的SacII-Nhel部位切出，替换 pVY的SacII-NheI部位，从而制成。将这些质粒构建体分别导入HCT116细胞(亲本细胞， 野生型p53)中，分别建立对抗生素G418具有耐性的克隆，每种2株。将得到的各细胞株 作为"pVY细胞株(G3株和G5株)"和"pVY变异细胞株(D5株和E4株)"。将这些各种 细胞株5X106个使用27号注射器分别移植到裸小鼠的大腿部皮下。移植后，对第5、7、9、 12、14、16、19、21、26、28天形成的肿瘤，测定长度和宽度，用下式计算肿瘤的体积。将导入 pd2EYFP(只表达YFP的构建体)的细胞同样地移植到小鼠中，进行测定，作为对照。
体积=(长度X宽度2) X 0. 5 结果示于图12和图13。图12(a)和(b)分别是移植了 pVY细胞株和pVY变异细 胞株的小鼠的照片(移植后28天)。该图(a)是移植了表达野生型vegf5'UTR的导入细胞 的小鼠，左侧是pVY细胞株G3的结果，右侧是pVY细胞株G5的结果。该图(b)是移植了表 达变异vegf5' UTR的导入细胞的小鼠，左侧是pVY变异细胞株D4的结果，右侧是pVY变异 细胞株E4的结果。并且，图13是显示移植了这4种细胞株的小鼠的肿瘤体积随时间变化 的图。如图12(a)所示，在移植了表达野生型vegf 5' UTR的pVY细胞株的小鼠中，移植患 部的肿瘤明显增大。与此相反，在移植了表达变异vegf5'UTR的pVY变异细胞株的小鼠中， 如图12(b)所示，几乎未发现肿瘤的生长。从图13的曲线图中还可看出，该肿瘤体积的变 化在移植了表达野生型5' UTR的pVY细胞株的小鼠(參和B )中被确认是随时间增大的， 另一方面，移植了表达变异5'UTR的pVY变异细胞株的小鼠(O和口)与对照小鼠(△)
42的结果相比几乎没有变化。由该结果可知，vegf5'UTR RNA可显著地促进皿的肿瘤形成。
实施例A8 确认vegf 5' UTR关联RNA赋予细胞抗癌剂耐性的能力。 与上述实施例A6 —样，将构建体vegf mRNA、构建体BC019867RNA(16-780)、构建 体BC011177RNA(526-1216)、构建体vegflresRNA(600-879)分别导入HCT116(亲本细胞， 野生型p53)。然后，将导入的细胞用如下所示的终浓度的各种抗癌剂处理60小时，对处理 后的细胞与上述实施例A1同样地测定凋亡率(％ )。作为抗癌剂，使用喜树碱(40nmo1/ L)、顺铂(2 ii g/ml)、阿霉素(160nM)、依托泊苷(60 y mol/L) 、5_FU(80 y mol/L)以及亚叶酸 (5iimol/L)与5-FU(10iimol/L)的组合。另外，作为对照细胞，使用导入空载体pcDNA3. 1 的细胞。 该结果示于图14。图14显示表达各种vegf5' UTR关联RNA的细胞在经各种抗 癌剂处理时的凋亡比例。在该图中，从左侧起，各柱分别为对照、构建体vegf mRNA、构建体 BC019867RNA、构建体BC011177RNA、构建体vegflresRNA(600-879)的导入结果。通常，抗癌 剂导致诱导凋亡，所以由该结果可知各细胞中表达的vegf5' UTR关联RNA是否抑制了抗癌 剂的效果，也就是说，是否赋予细胞抗癌剂耐性。如该图所示，在所有细胞中均确认了比对 照细胞更低的凋亡(％)。即，可知各细胞中表达的vegf5'UTR关联RNA导致细胞表现出抗 癌剂耐性。因此，这表明，通过抑制癌细胞中vegf5' UTR关联RNA的表达，或者通过分解所 表达的vegf5' UTR关联RNA，可增强细胞的抗癌剂感受性。
实施例A9 实施例A8中，确认了 vegf5' UTR RNA向细胞赋予抗癌剂耐性。因此，确认通过以 vegf5' UTR为耙标的siRNA，使表达的vegf5' UTRRNA分解，可增强细胞对抗癌剂的感受性。
将前述的表达vegf siRNA#l、 #2的重组载体以及表达对照siRNA的载体分别 导入HCT116(亲本细胞，野生型p53)。作为对照细胞，使用未导入表达siRNA的重组载 体的HCT116细胞。将这4种细胞，在存在或不存在以下所示终浓度的各种抗癌剂的条件 下，处理60小时。作为上述抗癌剂，使用依托泊苷(20iimol/L)、阿霉素(170nmol/L)、 5-FU(40 ii mol/L)。然后对处理后的细胞与实施例Al同样地确认凋亡(％ )。
另外，通过使vegfsiRNAftl或siRNAft2表达而敲除vegf mRNA时，VEGF蛋白也无法 合成。已知VEGF蛋白对于癌细胞起生存因子的作用，可导致抗癌剂耐性。S卩，vegf siRNA 可同时阻断vegf 5'UTR RNA的功能和VEGF蛋白的功能。为了使阻断vegf 5'UTR RNA的 功能的效果更加明确，对于导入vegf siRNA的细胞，在培养上清中添加重组VEGF蛋白(R&D 公司制造，以下称"rVEGF")，补充由siRNA导致减少的VEGF蛋白。另外，HCT116细胞正常 分泌的VEGF蛋白水平经实验测定为0. 7 lng/ml。因此，在本实施例中，向上述4种细胞 中添加lng/ml的rVEGF蛋白。由此，通过真正地由siRNA敲除vegf5' UTR RNA，确认抗癌 剂感受性的增强。然后，对于这些导入细胞，在相同条件下，用抗癌剂进行处理。
这些结果示于图15。该图是显示使用各种抗癌剂时各细胞的凋亡(％ )的图。凋 亡比例越高，可断定抗癌剂感受性越强。在该图中，(a)是显示抗癌剂依托泊苷感受性的凋 亡结果，(b)是显示抗癌剂阿霉素感受性的凋亡结果，(c)是显示抗癌剂5-FU感受性的凋亡 结果。在各图中，"NT"表示未导入表达siRNA的重组载体的对照细胞，"对照siRNA"表示 对照siRNA的表达细胞，"VEGF siRNA#l"表示siRNA#l的表达细胞，"VEGF siRNAft2"表示
43siRNA#2的表达细胞。而且在该图中，空白的柱(□)表示未经抗癌剂处理，黑色的柱(■) 表示经抗癌剂处理，斜线的柱表示进行rVEGF处理并且进行抗癌剂处理。
在图15(a) 、 (b)和(c)中的任意一个中，在不表达siRNA的细胞(NT)和表达 对照siRNA的细胞(对照siRNA)中，即使添加低浓度的依托泊苷(20 y mol/L)、阿霉素 (170nmol/L)、5-FU(40iimol/L)也未诱导显著的凋亡增强。从这些结果可知，在未敲除 vegf 5' UTR RNA的癌细胞中，具有抗癌剂耐性。与此相反，表达siRNA#l或siRNA#2的细 胞与未处理(□)相比较，经低浓度的抗癌剂处理即可显著增强凋亡。另外，这种凋亡的增 强即使用rVEGF蛋白处理(斜线)也几乎不受影响。即认为，对这些抗癌剂的感受性增强 的原因不是siRNA导致内源性VEGF蛋白减少，主要是siRNA导致vegf 5' UTR RNA(包括 vegf mRNA)被敲除。这些结果说明，除了以前作为癌症治疗目标而受到重视的VEGF蛋白之 夕卜，将vegf 5' UTR关联RNA作为治疗目标也很重要。
实施例A10 确认各种siRNA导致细胞的抗癌剂感受性增强。 将前述的vegf siRNA#l载体 vegf siRNA#5载体以及对照siRNA载体导入 HCT116(亲本细胞，野生型p53)。然后将导入的细胞用以下所示的终浓度的各种抗癌剂处 理60小时。作为抗癌剂，使用阿霉素(170nmol/L)、依托泊苷(20 y mol/L) 、5_FU(40 y mol/ L)以及亚叶酸(5iimol/L)与5-FU(10iimol/L)的组合、丝裂霉素C(l y g/mL)、紫杉醇 (5nmol/L)、长春新碱(12. 5nmol/L)、顺铂(1 y g/ml)。然后对处理后的细胞计算存活率的 相对值(％ )。上述相对值以导入表达对照siRNA的重组载体的细胞的存活细胞数为100% 而求得。 该结果示于图16。该图是显示导入各种重组载体的细胞经抗癌剂处理时的相对 存活率(％)的图。在该图中，从左侧起，各柱为导入对照siRNA载体、vegfsiRNAftl载体 vegf siRNAft5载体的结果。如该图所示，表达siRNA#l #5的所有细胞与表达对照siRNA 的细胞相比，经抗癌剂处理后，存活细胞的相对值充分且确实地降低。从这些结果可知， siRNA#l #5中的任意一种siRNA均可提高细胞的抗癌剂感受性。从这些结果可以说，通 过siRNA#l #5攻击vegf5' UTR RNA，可有效抑制癌细胞的生长和存活，这些siRNA作为 抗癌剂以及作为已有抗癌剂的并用剂是极其有用的。
实施例All 制备表达部分缺失的p53mRNA的构建体，确定与vegf5'UTR相互作用的关键序列。
所制备的构建体的概况如图17(a)所示。通过PCR制备p53基因的CDS、上述CDS 的5'区缺失的cDNA(A5'p53)以及上述CDS的3'区缺失的cDNA。上述CDS对应于Seq ID No :2表示的人p53成熟mRNA全序列中第252 1434位的RNA， A 5' p53是与Seq ID No :2中第252 1434位的区域中，第252 551位缺失的RNA相对应的cDNA， A3'p53是 与Seq ID No :2中第252 1434位的区域中，第1133-1433位缺失的RNA相对应的cDNA。 将这些cDNA分别插入pcDNA3. 1载体(Invitrogen公司)的BamHI/EcoRI位点。这些质粒 构建体与实施例A2的质粒构建体A(pVC)或质粒构建体H(pVCmut5')在H1299细胞中共表 达。然后，对这些细胞，通过RT-PCR法检测外源性p53mRNA的表达水平。结果示于图17(b) 的照片。在该图中，pVC表示构建体A，mut5'表示构建体H。 如该图所示，5'末端缺失的A5' p53不会被vegf 5' UTR RNA沉默。与此相反，
443'末端缺失的A 3' p53与野生型p53mRNA —样，被vegf5' UTRRNA沉默。从该结果可知， p53mRNA中的与vegf5'UTR相互作用的区域是包括Seq ID No :2中第252 551位的区域 的RNA。 实施例Bl 表汰vegf IresRNA的细胞的恶件转化 为了查明vegf IresRNA是否促进肿瘤细胞的恶性化，进行以下实验。
(l)vegf IresRNA的表达 将vegf mRNA的5' UTR中Seq ID No :1所示的第600-879位的vegflresRNA的 全长cDNA插入质粒载体pcDNA3. l(Invitrogen公司制造)中，制备vegf IresRNA表达载 体(pcDNA-vegf Ires)。将该vegf IresRNA表达载体(pcDNA-vegflres)导入HCT116(亲 本细胞，野生型p53)中，用抗生素G418选择可稳定过量表达vegf IresRNA的2个细胞克 隆。这样建立起来的2个vegf IresRNA表达细胞以下称为vegf Ires_#l和vegfIres-#2。 另外，作为mock处理，在HCT116细胞中导入没有上述插入物的质粒载体pcDNA3. l，对导入 的细胞克隆通过上述抗生素G418进行选择。该细胞克隆以下称为mock。然后，对这些细胞 克隆中的vegflresRNA的表达通过RNA印迹确认。 这些结果示于图18 (a)。图18 (a)是显示各细胞中RNA的表达的RNA印迹结果，从 上端数第1段表示vegflresRNA的表达，第2段表示内参照gapdh mRNA的表达。如该图所 示，在mock中，几乎未发现vegf IresRNA的表达。与此相反，在表达vegf IresRNA的vegf Ires_#l和vegf Ires_#2中分别观察到vegf IresRNA的表达。 [O599] (2) vegflresRNA对顺钼的p53mRNA表达诱导能力的影响 接着，将这些稳定表达vegf IresRNA的细胞株，分别在存在或不存在5 ii g/mL 的抗癌剂顺铂的条件下，处理预定时间(0、6、8、12、24小时)后，通过定量RT-PCR分析 p53mRNA的表达水平，通过蛋白质免疫印迹分析p53蛋白的表达水平。另外，对mock细胞也 进行同样的处理，分析表达水平。 这些结果示于图18(b)和(c)。该图(b)是各细胞中p53mRNA表达量的结果，纵 轴是p53mRNA表达量与对照g即dh mRNA表达量之比。该图(c)是各细胞中p53蛋白的表 达量的结果。如该图(b)和(c)所示，与未经顺铂处理的mock(Oh)相比较，在经顺铂处理 的mock(6、12h)中，顺钼诱导了 p53mRNA的表达，p53mRNA和p53蛋白的表达量显著增加。 与此相反，对于vegf IresRNA-#l和vegf Ires_#2，未经顺铂处理(0h)时，与mock(0h)相 比较，内源性p53mRNA和p53蛋白的本底表达量减少。另外，vegf IresRNA_#l (6、 12h)和 vegf Ires-#2(6、12h)与mock(6、12h)相反，未观察到p53mRNA和p53蛋白的表达诱导。这 样，通过vegf IresRNA的表达，在mock中确认的顺铂的p53mRNA表达诱导能力显著降低， 由此可知，vegf IresRNA可抑制p53的表达诱导。
(3) vegf IresRNA对各种抗癌剂诱导凋亡的影响 确认了各种细胞对抗癌剂5-FU、依托泊苷、丝裂霉素C(匪C)和顺铂诱导的凋亡的 抵抗性，以及vegf IresRNA对凋亡的影响。将上述(2)的vegf Ires_#l、 vegf Ires_#2、 mock和未导入载体的HCT116(亲本细胞)用5-FU(120 y mol/L)、依托泊苷(10践ol/L)、 匪C(6iig/ml)、顺铂(5iig/ml)处理60小时，诱导凋亡。诱导后的细胞凋亡通过前述的凋 亡评价2的方法检测(平均值±SD， n = 4)。
这些结果示于图18(d)。该图是显示各细胞中的凋亡阳性细胞的比例的图。在该 图中，"亲本"是亲本细胞HCT116的结果。如该图所示，HCT116(亲本)和mock对任何抗 癌剂的剌激都有约30%左右的细胞被诱导凋亡，对任何抗癌剂均不表现耐性。与此相反， vegfIresRNA-#l和vegf Ires_#2对任何抗癌剂的剌激，最多约10%左右的细胞被诱导凋 亡，与HCT116(亲本)和mock相比，比例显著降低。由该结果可知，vegf IresRNA可赋予 细胞凋亡抵抗性。 (4)vegf IresRNA导致体血细胞的恶性转化 然后，分别将上述(2)的vegf Ires_#l 、 vegfIres-#2和mock (5 X 106细胞)，使用 27号注射器移植到无胸腺的裸小鼠的大腿部皮下。移植后，经过预定时间(0、5、9、13、17、 21天)，与实施例A7同样地测定所形成的肿瘤的体积(平均值士SEM，n = 5)。作为对照， 将未导入表达载体的HCT116细胞同样地移植到小鼠中，测定肿瘤体积。结果示于图18(e)。 该图是显示移植了这些细胞株的小鼠中的肿瘤体积随时间变化的图。另外，分别将vegf Ires-#1以及未导入表达载体的对照HCT116细胞(1Xl(f个)，使用27号注射器移植到裸 小鼠的腹腔内，在移植后的第35天剖腹观察所形成的肿瘤。结果示于图19(f)。该图是小 鼠的剖开腹部的照片，箭头指示所形成的肿瘤。在该图中，左图是移植vegflresRNA表达细 胞的结果，右图是移植对照细胞的结果。 如图18(e)所示，vegf Ires-ftl和vegf Ires_#2与mock相比，在短期内分别形成 明显较大的肿瘤。另外，如图19(f)所示，在可评价恶性度高的肿瘤细胞的性质的腹腔内移 植模型中，也发现表达vegf IresRNA的细胞，与对照细胞相比，表现出显著的造肿瘤功能。 从以上结果可知，vegf IresRNA在生物体内可明显促进肿瘤形成。
实施例B2 vegf siRNA抑制细胞的肿瘤形成能力的效果 在表达针对vegf的siRNA的细胞中，确认了对生物体内的肿瘤形成能力的效果。 将前述的表达siRNA#l的vegf siRNAftl载体导入来自人大肠癌的HCT116细胞株(野生 型p53)中，使用抗生素Brasticidin选择。得到的细胞克隆以下称为si-vegf#l细胞株。
另外，作为对照，与前述同样地，使用插入了与脊椎动物的已知基因没有相同性的序列(Seq IDNo :46 :5' _gaaatgtactgcgcgtggagacgttttggccactgactgacgtctccacgcagtacattt_3，) 的双链寡核苷酸的pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR载体(Invitrogen公司)(对照siRNA载体)。同 样地，通过该对照siRNA载体导入HCT16细胞株，将导入的细胞通过上述抗生素选择。得到 的细胞克隆以下称为si-对照细胞株。而且，与上述实施例C2—样，分别将上述si-vegfftl 细胞株和si-对照细胞株移植到裸小鼠的大腿部皮下，预定时间后测定肿瘤体积(各n = 5)。 这些结果示于图20。该图是显示在移植了这些细胞株的小鼠中肿瘤体积随时间 的变化的图。在该图中，由空白的符号表示的#1 #5si-Vegf#l是移植了表达siRNA#l的 Si-vegf#l细胞的结果，涂黑的符号表示的#1 #5对照是移植了 si-对照细胞的结果。
如该图所示，在移植了 si-对照细胞的小鼠(对照)中，确认了肿瘤随时间而增 大。与此相反，在移植了表达siRNAftl的si-vegf#l细胞的小鼠(si-vegf#l)中，观察到显 著的肿瘤形成的抑制、肿瘤增大的抑制。从这些结果可知，使用以vegfmRNA中的外显子1 为靶标的siRNA，可显著地抑制肿瘤形成以及已形成的肿瘤的增大。
实施例B3 vegf siRNA促讲凋亡感受件 (l)vegf siRNA抑制vegf mRNA或vegf IresRNA的表达 确认vegf siRNA是否能够促进细胞的凋亡感受性。除了使用HCT116 (亲本 细胞，野生型p53)代替H印G2细胞(野生型p53)之外，其他与上述实施例Al —样，在 HCT116(亲本细胞，野生型p53)中分别导入前述的表达siRNAftl的vegf siRNA#l载体、表 达VegfsiRNA#2载体的#2以及对照siRNA载体。然后，对于导入18小时后的细胞，通过定 量RT-PCR分析vegf mRNA和g即dh mRNA的表达水平(平均值± SD， n = 4)，通过RNA印迹 分析vegf IresRNA和gapdh mRNA的表达水平。对于未导入上述重组载体的HCT116也进 行同样的分析。定量RT-PCR除了使用vegf mRNA用引物组以外，其他与上述实施例Bl同 样地进行。 这些结果示于图21(a)。在该图中，左侧是各细胞中vegf mRNA的表达量解析 结果，纵轴表示vegf mRNA与gapdh mRNA之比。在该图中，右图是显示各细胞中的vegf IresRNA的表达的RNA印迹结果，上段显示vegf IresRNA的结果，下段显示gapdh mRNA的 结果。在该图中，"无"是未导入重组载体的细胞的结果，"si-对照"是导入对照siRNA载 体的细胞的结果，si-vegf#l是导入vegf siRNA#l载体的细胞的结果，si-vegf#2是导入 vegf siRNA#2载体的细胞的结果(下同)。 如图21(a)的左图所示，通过导入vegf siRNAftl载体或vegfsiRNAft2载体，HCT116 中的vegfmRNA的表达量显著减少。另外，如图21(a)的右侧的照片所示，通过导入vegf siRNA#l载体或vegf siRNA#2载体，vegf IresRNA的表达量与对照细胞相比减少。特别 是，在导入vegfsiRNAft2载体的细胞中，vegf IresRNA的表达量显著减少。从以上结果可 知，siRNA#l和siRNA#2可导致vegf IresRNA的敲除。 [OS19] (2) vegf siRNA促进凋亡感受性 使用诱导p53依赖性凋亡的抗癌剂5-FU处理各种细胞，分析凋亡的感受性。在 HCT116(亲本细胞)和p53缺失细胞HCT116中，分别导入前述的表达siRNA#l的vegf siRNA#l载体、表达siRNA#2的vegfsiRNA#2载体和对照siRNA载体。然后，将导入18小时 后的细胞，在存在80 ii mol/L 5-FU的条件下(+)或者不存在5_FU的条件下(-)处理60小 时。对处理后的细胞基于前述的凋亡评价2计算凋亡阳性细胞的比例(％ )(平均值±SD， n = 4)。 这些结果示于图21(b)。该图是显示各细胞的凋亡(％)的图。在该图中，亲本 HCT116是表达p53的亲本细胞HCT116，p53-K0HCT116是p53缺失的HCT116细胞，"无转染" 是未导入重组载体的细胞，si-对照、Si-veg#l和Si-vegf#2分别与图21 (a)相同。另外， 对于5-FU，" + "表示5-FU存在下的处理，"-"表示不存在5-FU的处理(下同)。如该图所 示，p53缺失细胞HCT116的凋亡比例经5-FU处理后略有增加，但即使进一步表达siRNA#l 或siRNAft2，也几乎没观察到增加。与此相反，在亲本细胞HCT116中，通过表达siRNA#l或 siRNA#2并进行5-FU处理，凋亡比例显著增加。该结果表明，siRNA#l或siRNA#2导致凋亡 感受性增强要依赖于p53。 (3) vegf siRNA促进p53mRNA和p53蛋白的表达 从上述(1)和(2)的结果可知晓vegf IresRNA在p53癌抑制途径中的负面影响。
47因此，确认在导入vegf siRNA的细胞中内源性p53的表达水平。具体地说，将与前述同样 的导入后的亲本细胞HCT166，在存在80 ii mol/L 5-FU的条件下(+)或者不存在5-FU的条 件下(_)处理8小时，然后通过定量RT-PCR分析p53mRNA的表达(平均值±SD， n = 4)。 另外，将上述导入后的细胞在存在80 ii mol/L 5-FU的条件下(+)，处理预定时间(0、8、16、 24小时)后，通过前述的蛋白质免疫印迹检测p53蛋白。 这些结果示于图21 (c)和(d)。图21 (c)是显示各细胞中p53mRNA的表达量的图， 纵轴表示p53mRNA与gapdh mRNA之比。在该图中，对于5-FU，" + "表示5-FU存在下的处理， "-"表示不存在5-FU时的处理。图21(d)是表示各细胞中p53蛋白的表达的蛋白质免疫 印迹结果。在该图中，5-FU的值表示经5-FU处理的时间(小时)。在这两图中，si-对照、 si-veg#l和si-vegf#2分别与图21 (a)相同。如该图(c)所示，在表达siRNA#l或siRNA#2 的细胞中，由于vegf IresRNA减少，mRNA的表达量与对照相比增加。而且，通过对这样的细 胞再进行5-FU处理，p53mRNA的表达量可显著增加。另外，如该图(d)所示，在表达siRNA#l 或siRNAft2的细胞中，p53蛋白的表达量与对照相比，同样也是增加的。而且，通过对这样的 细胞再进行5-FU处理，p53蛋白的表达量可显著增加。从以上结果可知，通过由vegf siRNA 导致的vegflresRNA的敲除，由5-FU诱导的p53mRNA和p53蛋白的表达增加。
(4) vegf siRNA促进由p53诱导的mRNA的表达 确认由vegf siRNA敲除vegf IresRNA引起的、由5-FU诱导的p53mRNA的表达增 加是否会诱导p53的靶基因bax基因或noxa基因的mRNA的表达。在亲本细胞HCT116中 导入与前述一样的对照siRNA载体、vegf siRNA#l载体或vegf siRNA#2载体，对获得的细 胞在存在80 ii mol/L 5-FU的条件下(+)或不存在5-FU的条件下(-)处理24小时，然后通 过定量RT-PCR分析bax mRNA和noxa mRNA的表达(平均值±SD， n = 4)。
这些结果示于图22(e)。该图是显示p53耙基因的mRNA的表达量的图。在该图 中，左图是bax mRNA的结果，纵轴表示bax mRNA与gapdh mRNA之比。在该图中，右图是 noxa mRNA的结果，纵轴表示noxa mRNA与g即dh mRNA之比。如该图所示，由于siRNA#l或 siRNA#2的表达，5-FU处理对bax mRNA和noxa mRNA的表达诱导与对照相比均有显著提高。 从该结果可以认为，由于siRNA#l或siRNA#2的表达，bax、 noxa等凋亡相关基因的表达量 增加，结果可增强凋亡感受性。 (5)p53mRNA、 vegf IresRNA和vegf mRNA的关系 将HCT116 (亲本细胞)暴露于可上调p53mRNA表达的遗传毒性应激。具体地说， 将HCT116用5-FU(80iimol/L)、丝裂霉素C(匪C，6iig/ml)或顺钼(5 y g/ml)处理预定时间 (0、6、12小时)后，通过RNA印迹确认p53mRNA、 vegf IresRNA、 vegf mRNA的表达。另外， 将HCT116暴露于UV-B持续1分钟，并在预定时间(6、12小时)的非暴露条件下之后，同样 地确认表达。 这些结果示于图22 (f)。如该图所示，由5-FU、匪C或UV照射而受到应激的细胞的 vegf IresRNA和vegf mRNA均有显著增加，由此抑制p53mRNA的表达。与此相反，顺钼使 p53mRNA的表达增加，vegflresRNA的表达减少。该结果可由顺铂在vegfmRNA表达之后抑制 vegflresRNA的产生这一结果来证实。这一相反的相关关系证明vegflresRNA具有p53表 达的阻抑物的作用。另外，据报道，p53可在转录水平上抑制VEGF的表达。因此认为，vegf IresRNA通过沉默p53的表达而为VEGF的产生提供正反馈回路。
实施例B4 vegf IresRNA中与p53mRNA的相互作用区域的识别
(l)vegf IresRNA对p53mRNA的表达的影响 与上述实施例Bl同样地，制备vegf IresRNA表达载体(pcDNA-vegflres)。在 p53缺失的HCT116细胞(无p53)中，共同导入上述实施例A2的p53表达载体和上述vegf IresRNA表达载体(pcDNA-vegf Ires)，在18小时后通过RNA印迹确认p53mRNA和vegf IresRNA的表达。再者，作为mock处理，将没有插入物的表达质粒载体pcDNA3. 1和上述p53 表达载体共同导入p53缺失的HCT116细胞中。该细胞克隆以下称为mock。对mock也同样 地确认RNA表达。 这些结果示于图23(a)。图23 (a)中，左图是显示各细胞中的p53mRNA的表达的 RNA印迹结果，右图是显示各细胞中的vegflresRNA的表达的RNA印迹结果。在该图中，mock 是mock处理的细胞，vegf IresRNA是导入vegf IresRNA表达载体的细胞，p53 " + "表示 导入p53表达载体，"-"表示未导入该载体。如该图所示，在不表达vegf IresRNA的细胞 mock中，p53mRNA被大量地检测到。与此相反，在表达vegf IresRNA的细胞vegflresRNA 中，诱导了 p53mRNA的分解。这些结果表明，vegf5'UTR，特别是vegf IresRNA在转录后抑 制p53的表达。 (2) vegflresRNA中与p53mRNA的相互作用区域的识别 从前述结果可知，vegf IresRNA在转录后负向控制p53mRNA的表达量。因此，对 vegf IresRNA中的与p53mRNA的相互作用区域进行进一步识别。 使用核酸的二级结构预测软件mFold 3. 2，预测vegf IresRNA和p53mRNA的二 级结构。然后，基于该预测的二级结构，使用ViennaRNA fold算法，预测vegf IresRNA和 p53mRNA的互补区域。该结果示于图23 (b)和(c)。两图分别显示vegf IresRNA与p53mRNA 的互补区域的比对。如该图(b)所示，在Seq ID No:l中的vegf IresRNA的第694-714位 与Seq ID No :2中的p53mRNA的第462-481位之间，以及如该图(c)所示，在Seq ID No : 1中的vegf IresRNA的第693-714位与Seq ID No :2中的p53mRNA的第462-491位之间， 确认了互补区域。已知该Seq IDNo :1中的第693-714位的区域在vegf IresRNA的二级结 构中是形成茎环结构的区域。图24(d)中示出vegf IresRNA的二级结构(茎环结构)的 概况。 (3)vegf IresRNA中茎环变异的影响 用以下方法确认vegf IresRNA中的茎环结构是否参与p53mRNA的沉默。制备表达 vegf IresRNA的茎环部分缺失的vegf IresRNA (del_l)和vegf IresRNA (del_2)的表达载 体(del-1)和(del-2)。 vegf IresRNA中的缺失部分如图24(e)所示。在该图(e)中，只 显示出在上述图24(d)的vegf IresRNA的二级结构中由矩形围成的区域。该图的左侧是 vegf IresRNA (del-1)，该图的右侧是vegf IresRNA (del_2) 。vegf IresRNA (del_l)部分缺 失了vegf IresRNA中第693-714位的上述区域，具体地说，如图24(e)所示，缺失了形成茎 环的基本部分的第691-703位的区域。另外，vegf IresRNA(del_2)缺失了 vegf IresRNA 中第711-718位以及第721-723位的区域，具体地说，如图24(e)所示，缺失了茎环前端的 环部分，形成较短的茎环。 表达载体(del-1)和(del-2)按以下方式制备。首先，将上述实施例Bl的vegfIresRNA表达载体(pcDNA-vegf Ires)用Nhel切断，在其中插入编码vegf IresRNA (del_l) 和vegf IresRNA(del-2)的寡核苷酸。下面给出编码vegf IresRNA(del_l)的寡核苷酸以 及编码vegf IresRNA (del-2)的寡核苷酸。
del-1寡核苷酸(Seq ID No :91) 5, -gctagcggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaac ttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttctccgcgcgggggaagccgagccgagcggagccgcgagaagtgct 3gc_3， del-2寡核苷酸(Seq ID No :92) 5, -gctagcggagcccgcgcccggaggcggggtggagggggtcggggctcgcggcgtcgcactgaaac ttttcgtccaacttctgggctgttctcgcttcggaggagccgtggtccgcgcccccgagcggagccgcgagaagtg ctagc-3' 然后，将表达载体(del-1)、表达载体(del-2)或上述vegf IresRNA表达载体与 上述实施例A2中的p53表达载体共同导入p53缺失的HCT116，18小时后，通过RNA印迹 确认p53mRNA和vegf IresRNA的表达。另外，作为mock处理，将没有插入物的表达质粒 载体pcDNA3. 1和上述p53表达载体共同导入p53缺失的HCT116，同样地确认表达。另外， HCT116(无p53)的培养使用含有10%胎牛血清和100iig/ml(100units/ml)的链霉素的 McCoy' s 5A培养基，在温度37°C、5% C02的条件下进行(下同)。 这些结果示于图24(f)。该图(f)是显示各细胞中的RNA的表达的RNA印迹结果， 从上端数第1段显示p53mRNA的表达，第2段显示vegf IresRNA的表达，第3段显示内参照 gapdh mRNA的表达。另外，p53 " + "表示导入p53表达载体。在该图中，vegf IresRNA(wt) 是导入表达载体vegf IresRNA的细胞，vegf IresRNA (del-l)是导入表达载体vegf IresRNA (del-1)的细胞，vegf Ires(del-2)是导入表达载体(del_2)的细胞。如该图的 vegf IresRNA (wt)所示，在表达全长vegflresRNA和p53mRNA的情况下，观察到p53mRNA 和vegf IresRNA的沉默。另一方面，如vegf IresRNA(del_l)和vegf IresRNA(del_2)所 示，在共同表达vegf IresRNA的部分缺失变异体以及p53的情况下，p53mRNA的表达量与 mock相同，并且未发现vegf IresRNA的分解。由此表明，vegf IresRNA(del-1)和vegf IresRNA (del-2)没有沉默p53的能力。从以上结果可知，在由vegflresRNA导致的p53mRNA 的沉默中，vegf IresRNA中的第693-714位的区域附近的茎环结构起了重要的作用。
(4)通过vegf IresmRNA的茎环与p53mRNA的结合 确认vegf IresRNA通过前述的茎环结构与p53mRNA结合的可能性。首先，与前述 同样地，在p53缺失的HCT116中，共同导入上述RNAPull-Down试验中记载的上述p53表达 载体以及表达各种vegflresRNA的表达载体。然后通过前述的RNA Pull-Down试验，确认 是否有PCR产物的扩增。 这些结果示于图24(g)。在该图中，vegf IresRNA (wt)是导入vegf IresRNA表 达载体的细胞，vegf IresRNA (del-1)是导入表达载体vegf IresRNA (del_l)的细胞，vegf IresRNA (del-2)是导入表达载体vegf IresRNA (del-2)的细胞。RT(-)是没有反转录酶的 阴性对照，vegf IresRNA cDNA和p53cDNA是PCR的阳性对照。如该图的vegflresRNA (wt) 所示，在表达野生型全长vegf IresRNA和p53的情况下，可确认p53的扩增。从该结果可 知，野生型全长vegf IresRNA结合了 p53mRNA。另一方面，如vegf IresRNA (del-1)和vegfIresRNA(del-2)所示，在共同表达vegf IresRNA的部分缺失变异体以及p53的情况下，
未发现p53的扩增。从该结果可知，vegf IresRNA(del-1)和vegf IresRNA(del_2)不与
p53mRNA结合。这表明，p53mRNA与vegf IresRNA是通过vegf IresRNA的第693-714位的
区域附近的茎环结构结合的。从以上结果可以推测，vegf IresRNA中，除了与p53互补的
序列，其茎环结构也在p53mRNA的分解诱导中起重要作用。 实施例CI d53DEC0Y LNA-DNA的效果 使用与vegf IresRNA相互作用的p53mRNA区域作为DECOYDNA，确认对于由vegf IresRNA导致的p53mRNA沉默以及癌细胞死亡的效果。 从上述实施例B4的结果可以认为，与vegf IresRNA相互作用的p53mRNA的区 域是包括第462-491位的碱基的区域。因此，作为野生型p53DEC0Y，制备与p53mRNA的第 462-482位的序列相对应的LNA-DNA。将其称为野生型p53DEC0Y。同时制备在该序列中导 入变异的LNA-DNA。将其称为变异型p53DEC0Y。这些序列如下所示。在变异型p53DEC0Y 中，大写字母的碱基是与野生型p53DEC0Y不同的变异位点。
野生型p53DEC0Y(Seq ID No :93)
5， -ccccgcgtggcccctgcacca-3，
变异型p53DEC0Y(Seq ID No :94)
5， -cccGCcCACCcGGctgGTcca-3' 然后，在p53缺失的HCT116中，共同导入上述实施例A2的p53表达载体、上述实 施例Bl的vegflresRNA表达载体以及上述野生型或变异型p53DEC0Y，通过RNA印迹分析 p53mRNA的表达。另外，在共同导入上述vegf IresRNA表达载体和上述p53表达载体且未 导入DECOY的p53缺失的HCTl 16 (vegf IresRNA)中、在共同导入没有上述插入物的质粒载 体pcDNA3. 1和上述p53表达载体且未导入DECOY的p53缺失的HCT116(mock)中、在未导 入表达载体和DECOY的p53缺失的HCT116中，同样地分析p53mRNA的表达。
这些结果示于图25(a)。该图是显示各细胞中的p53mRNA的表达的RNA印迹结 果。在该图中，"无转染"表示未导入表达载体的细胞的结果，"vegf IresRNA"表示导入上 述vegf IresRNA表达载体的细胞的结果，"mock"表示导入pcDNA3. 1的细胞的结果，"vegf IresRNA+p53decoy变体"表示共同导入上述变异型p53DEC0Y和上述vegf IresRNA表达 载体的细胞的结果，"vegf IresRNA+p53decoy"表示共同导入上述野生型p53DEC0Y和上述 vegf IresRNA表达载体的结果。另外，p53 " + "表示导入p53表达载体，p53 "-"表示未导 入p53表达载体。如该图所示，在未导入DECOY的"vegf IresRNA"中，p53mRNA表达量非 常少，认为受到沉默作用。另外，在导入变异型p53DEC0Y的"vegflresRNA+p53decoy变体" 中，p53RNA的表达量也很少，认为同样受到沉默作用。与此相反，在导入野生型p53DEC0Y的 "vegf IresRNA+p53decoy"中，确认了比"vegf IresRNA"更高的表达量，显示出与mock同 等的p53mRNA表达量。由此可知，p53DEC0Y可抑制vegf IresRNA对内源性p53mRNA的沉 默作用，增加p53mRNA的表达量。 另外，对于野生型和变异型p53DEC0Y，确认了对癌细胞的凋亡感受性的影响。
在HCT116细胞(野生型p53)中分别导入上述野生型和变异型p53DEC0Y LNA-DNA。将导入上述DECOY的细胞使用含有10%胎牛血清和100 y g/ml (100units/ml)链
51霉素的McCoy' s 5A培养基培养，基于上述凋亡评价2计算存活率的相对值(％ )。上述相 对值以未经5-FU处理的细胞的存活细胞数为100%求得。同时，对于未导入DECOY的HCT 细胞(p53)，同样地计算存活率。 这些结果示于图25(b)。该图是显示各细胞的存活率(％)的图。在该图中，"无"是 未导入DECOY的细胞的结果，"p53decoy"是导入野生型p53DEC0Y的细胞的结果，"p53decoy 变体"是导入变异型p53DEC0Y的细胞的结果。如该图所示，在导入野生型p53DEC0Y的细 胞中，与未导入细胞以及导入变异型p53DEC0Y的细胞相比，经5-FU(40iimol/L)处理后的 细胞的存活率降低。从这些结果可知，与vegflresRNA相互作用的p53mRNA区域，通过用作 DECOY，可用于防止p53mRNA分解，诱导细胞死亡。上述DECOY可作为本发明的p53结合抑 制剂以及p53表达促进剂使用。
实施例C2
Vegf反义DNA的效果 对于与p53mRNA相互作用的vegf IresRNA的区域互补的反义DNA，确认对于由 vegf IresRNA导致的p53mRNA沉默以及癌细胞死亡的效果。 由上述实施例B4的结果可以认为，与p53mRNA相互作用的vegflresRNA的区域是 包括第693-714位的碱基的区域。因此，制造与该区域互补的反义LNA-DNA。将其称为野 生型vegf反义物。同时制备在该序列中导入变异的反义LNA-DNA。将该序列称为变异型 vegf反义物。它们的序列如下所示。在变异型反义物中，大写字母的碱基是与野生型反义 物不同的变异位点。 野生型vegf反义物(Seq ID No :74)
5， -ccccgcgcggaccacggctcct-3，
变异型vegf反义物(Seq ID No :95)
5， _cccGCcCGggTcGTcCgcAccA-3， 这些结果示于图26(a)。该图是显示各细胞中的p53mRNA的表达的RNA印迹的结 果。在该图中，"vegf IresRNA"是导入上述vegflresRNA表达载体的细胞的结果，"vegf IresRNA+AS变体"是共同导入上述变异型vegf反义物和上述vegf IresRNA表达载体的细 胞的结果，"vegf IresRNA+AS"是共同导入上述野生型vegf反义物和上述vegflresRNA表 达载体的细胞的结果。另外，p53 " + "表示导入p53表达载体。如该图所示，在未导入上述 反义物的"vegf IresRNA"中，p53mRNA的表达量非常少，表明受到沉默作用。而且，在导入变 异型反义物的"vegflresRNA+AS变体"中，同样地，p53mRNA的表达量很少，表明受到沉默作 用。与此相反，在共同导入野生型vegf反义物的"vegflresRNA+AS"中，与"vegf IresRNA" 相比，确认了较多的表达量。由此可知，vegf反义物可抑制vegf IresRNA对内源性p53mRNA 的沉默作用，增加p53mRNA的表达量。 另外，对于野生型和变异型vegf反义物，确认了对癌细胞的凋亡感受性的影响。
在HCT116细胞(野生型p53)中分别导入了上述野生型和变异型vegf反义物。对 于导入了上述反义物的细胞，与上述实施例C4 一样计算存活率的相对值(％ )。上述相对 值以未经5-FU处理的细胞的存活细胞数为100%求得。同时，对于未导入vegf反义物的 HCT细胞(野生型p53)也同样地计算存活率。 这些结果示于图26(b)。该图是显示各细胞的存活率(％)的图。在该图中，"无"是未导入vegf反义物的细胞的结果，"vegf 5' -AS"是导入野生型vegf反义物的细胞的结 果，"vegf5' -AS变体"是导入变异型vegf反义物的细胞的结果。如该图所示，野生型vegf 反义物的导入细胞与未导入的细胞("无")相比，经5-FU(40ymol/L)处理后的细胞的存 活率显著降低。从这些结果可知，与p53mRNA相互作用的vegflresRNA的区域，通过用作反 义物，可用于防止p53mRNA分解，诱导由抗癌剂导致的细胞死亡。上述反义物可作为本发明 的p53结合抑制剂以及p53表达促进剂使用。
产业上利用的可能性 如上所述，根据本发明，通过抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与p53mRNA 结合，可促进p53的表达，因此可促进依赖于p53转录的、参与凋亡的基因的转录。因此，最 终可促进目标细胞的凋亡的进行。特别是在医疗领域中，细胞的凋亡可用于预防肿瘤的恶 化和治疗癌症，所以本发明成为在癌症等的治疗中的有用的手段。另外，已知在p53表达量 降低的肿瘤细胞中，对抗癌剂的感受性下降，表现出抗癌剂耐性。但是，根据本发明，可提高 细胞对抗癌剂的感受性，所以可使现已公知的抗癌剂高效地发挥作用。如上所述，可以说， 本发明在以癌症等的治疗为代表的医疗领域中是极其优良的方法。
权利要求
一种促进细胞中p53基因表达的方法，其特征在于，抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA结合，从而促进p53基因的表达。
2. 根据权利要求1所述的促进p53表达的方法，其中，所述抑制从vegf-A基因转录的 外显子1的RNA与从p53基因转录的mRNA结合的方法包括从下述步骤(al) 步骤(a3) 中选出的至少一个步骤(al)分解从vegf-A基因的外显子1转录的RNA ; (a2)抑制从vegf-A基因的外显子1转录RNA ;(a3)使从vegf-A基因的外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA之外的其他核 酸相结合，从而抑制所述RNA与从p53基因转录的mRNA的结合。
3. 根据权利要求2所述的促进p53表达的方法，其中，作为上述步骤(al)中分解对象 的目标RNA以及作为上述步骤(a2)中转录抑制对象的目标RNA至少是由Seq ID No :1中 第600位-第879位的序列的全部或部分序列构成的RNA。
4. 根据权利要求3所述的促进方法，其中，所述目标RNA是从下述(1) (16)中选出 的至少一种RNA :(1) Seq ID No :(2) Seq ID No :(3) Seq ID No :(4) Seq ID No :(5) Seq ID No :(6) Seq ID No :(7) Seq ID No :(8) Seq ID No :(9) Seq ID No :(10) Seq ID No(11) Seq ID No(12) Seq ID No(13) Seq ID No(14) vegf mRNA(15) vegf mRNA(16) vegf mRNA
5. 根据权利要求3所述的促进p53表达的方法，包括上述步骤(al)和上述步骤(a2) 中的任意一个步骤，在上述步骤(al)中，通过从siRNA、可由核糖核酸酶分解而游离出siRNA的siRNA前 体、反义物以及核酶中选出的至少一种结合抑制剂，使上述目标RNA分解，在上述步骤(a2)中，通过从siRNA、可由核糖核酸酶分解而游离出siRNA的siRNA前 体、反义物、核酶以及DECOY核酸中选出的至少一种结合抑制剂，使上述目标RNA的转录被 抑制。
6. 根据权利要求5所述的促进p53表达的方法，其中，在上述步骤(al)中，上述结合抑 制剂为siRNA， 1中第600位-第879位的序列组成的RNA 1中第659位-第879位的序列组成的RNA 1中第659位-第780位的序列组成的RNA 1中第659位-第752位的序列组成的RNA 1中第659位-第745位的序列组成的RNA 1中第694位-第714位的序列组成的RNA 1中第693位-第714位的序列组成的RNA 1中第691位-第703位的序列组成的RNA 1中第711位-第723位的序列组成的RNA :1中第16位-第780位的序列组成的RNA :1中第659位-第917位的序列组成的RNA :1中第526位-第1104位的序列组成的RNA :45中第526位-第1216位的序列组成的RNA 中的5' UTR RNA 中的外显子1的RNA上述siRNA的反义链是从下述(#1) (#17)中选出的至少一种-agcaaggcaaggcuccaaugcrm_3， (Seq ID No -agagcagcaaggcaaggcuccrm_3， (Seq ID No -cacgaccgcuuaccuuggcaurm_3， (Seq ID No -uagcacuucucgcggcuccgcrm_3， (Seq ID No -cgagcuagcacuucucgcggcrm_3， (Seq ID No -uggacgaaaaguuucagugcgacgcrm_3， (Seq ID No -agaaguuggacgaaaaguuucagugrm_3， (Seq ID No -gaaguuggacgaaaaguuucagugcrm_3， (Seq ID No -ggacgaaaaguuucagugcgacgccrm_3， (Seq ID No4)6)8)10)12)14) 16) 18) 20)UUgg3Cg3333g皿UC3gUgCg3Cg皿--3，(SeqIDNo:22)3g33g皿gg3Cg朋33g皿UC3gUg皿--3，(SeqIDNo:61)3g皿UC3gUgCg3CgCCgCg3gCCC皿--3，(SeqIDNo:63)g朋gCg3g朋C3gCCC3g朋g皿gg皿--3，(SeqIDNo:65)3gC33ggC33ggCUCC33UgC3CCC皿--3，(SeqIDNo:67)3g3gC3gC33ggC33ggCUCC33Ug皿--3，(SeqIDNo:69)cgagcimgc3c皿cucgcggcuccg皿--3，(SeqIDNo:71)CgCgg3CC3CggCUCCUCCg朋gCg皿--3，(SeqIDNo:73)#15' #25' #35' #45' #55' #65' #75' #85' #95' #105， #115， #125， #135， #145， #155， #165， #175，
7.根据权利要求2所述的促进p53表达的方法，其中，在上述步骤(a3)中，所述的其他 核酸是从下述(Dl) (D8)中选出的至少一种核酸(Dl)Seq ID No :2中的第462位-第481位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D2)Seq ID No :2中的第462位-第482位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D3)Seq ID No :2中的第462位-第491位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D4)Seq ID No :2中的第462位-第505位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D5)Seq ID No :2中的第252位-第551位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D6)Seq ID No :1中的第694位-第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者，在所 述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D7)Seq ID No :1中的第693位-第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者，在所 述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D8)从上述(Dl) (D7)中选出的至少一种核酸中，一个或多个碱基被置换、缺失、插 入或添加而成的碱基序列组成的、并且可与从vegf-A基因的外显子l转录的RNA结合的核
8. 根据权利要求1所述的促进p53表达的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。
9. 一种在权利要求1所述的促进p53表达的方法中使用的p53表达促进剂，其特征在于，它包含可抑制从vegf-A基因的外显子1转录的RNA与从p53基因转录的 mRNA结合、并且从下述(Al) (A4)中选出的至少一种结合抑制剂(Al)可分解从vegf-A基因的外显子l转录的RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶分解 而游离出siRNA的siRNA前体、反义物以及核酶中选出的至少一种结合抑制剂；(A2)可抑制从vegf-A基因的外显子1转录RNA、并且从siRNA、可由核糖核酸酶分解而 游离出siRNA的siRNA前体、反义物、核酶以及DECOY核酸中选出的至少一种结合抑制剂；(A3)可与从vegf-A基因的外显子l转录的RNA结合、并且包含从p53基因转录的mRNA 之外的其他核酸的结合抑制剂；(A4)含有一种表达载体的结合抑制剂，所述表达载体中插入了从上述(Al) (A3)中 选出的至少一种结合抑制剂的编码DNA。
10. 根据权利要求8所述的p53表达促进剂，其中，所述(Al)的结合抑制剂分解的目标 RNA以及所述(A2)的结合抑制剂抑制转录的目标RNA至少是Seq ID No :1中第600位-第 879位的序列组成的RNA的全部或一部分。
11. 根据权利要求9所述的p53表达促进剂，其中所述的目标RNA是从下述(1) (16) 中选出的至少一种RNA :(1) Seq ID No(2) Seq ID No(3) Seq ID No(4) Seq ID No(5) Seq ID No(6) Seq ID No(7) Seq ID No(8) Seq ID No(9) Seq ID No(10) Seq ID No(11) Seq ID No(12) Seq ID No(13) Seq ID No1中第600位 1中第659位 1中第659位 1中第659位 1中第659位 1中第694位 1中第693位 1中第691位 1中第711位第879位的序歹l 第879位的序歹l 第780位的序歹l 第752位的序歹l 第745位的序歹l 第714位的序歹l 第714位的序歹l 第703位的序歹l 第723位的序歹l 第780位的序歹llj组成的RNA lj组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA ij组成的RNA:1中第16位:1中第659位-第917位的序列组成的RNA :1中第526位-第1104位的序列组成的RNA :45中第526位-第1216位的序列组成的RNA(14) vegf mRNA中的5， UTR RNA(15) vegf mRNA中的外显子1的RNA(16) vegf mRNA。
12.根据权利要求9所述的p53表达促进剂，其中，所述(Al)的结合抑制剂为siRNA， 所述siRNA的反义链是从下述(#1) (#17)中选出的至少一种#15' -agcaaggcaaggcuccaaugc皿-3' (Seq ID No#25' _agagcagcaaggcaaggcuccrm_3， (Seq ID No#35' _cacgaccgcuuaccuuggcaurm_3， (Seq ID No#45' _imgcacuucucgcggcuccgcrm_3' (Seq ID No#55' _cgagcuagcacuucucgcggcrm_3， (Seq ID No4)6)8)10)12)#65， _uggacgaaaaguuucagugcgacgcrm_3， (Seq ID No :14)#75' -agaaguuggacgaaaaguuucagug皿-3' (Seq ID No :16) #85' -gaaguuggacgaaaaguuucagugc皿-3' (Seq ID No :18) #95' -ggacgaaaaguuucagugcgacgcc皿一3' (Seq ID No :20)#105，一UUgg3Cg3333g皿UC3gUgCg3Cg皿--3，(Seq ID No:22)#115，一3g33g皿gg3Cg朋33g皿UC3gUg皿--3，(Seq ID No:61)#125，一3g皿UC3gUgCg3CgCCgCg3gCCC皿--3，(Seq ID No:63)#135，一g朋gCg3g朋C3gCCC3g朋g皿gg皿--3，(Seq ID No:65)#145，一3gC33ggC33ggCUCC33UgC3CCC皿--3，(Seq ID No:67)#155，一3g3gC3gC33ggC33ggCUCC33Ug皿--3，(Seq ID No:69)#165，一cgagcimgc3c皿cucgcggcuccg皿--3，(Seq ID No:71)#175，一CgCgg3CC3CggCUCCUCCg朋gCg皿--3，(Seq ID No:73)。
13. 根据权利要求9所述的p53表达促进剂，其中，上述(A3)的结合抑制剂中的所述其 他核酸是从下述(Dl) (D8)中选出的至少一种核酸(Dl)Seq ID No :2中的第462位-第481位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D2)Seq ID No :2中的第462位-第482位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D3)Seq ID No :2中的第462位-第491位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D4)Seq ID No :2中的第462位-第505位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D5)Seq ID No :2中的第252位-第551位的序列组成的RNA，或者，在所述序列中碱 基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D6)Seq ID No :1中的第694位-第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者，在所 述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D7)Seq ID No :1中的第693位-第714位的序列的互补序列组成的RNA，或者，在所 述序列中碱基u被碱基t置换而成的序列组成的DNA(D8)从上述(Dl) (D7)中选出的至少一种核酸中，一个或多个碱基被置换、缺失、插 入或添加而成的碱基序列组成的、并且可与从vegf-A基因的外显子l转录的RNA结合的核 酸。
14. 根据权利要求9所述的p53表达促进剂，其中，所述(A3)的结合抑制剂中的所述其 他核酸是Seq ID No :74的序列组成的DNA以及Seq ID No :93的序列组成的DNA中的任意一种。
15. —种促进细胞凋亡的方法，其特征在于，通过权利要求l所述的促进p53表达的方 法，来促进细胞内p53的表达。
16. —种用于促进细胞凋亡的凋亡促进剂，其特征在于，包含权利要求9所述的p53表 达促进剂。
17. 根据权利要求16所述的凋亡促进剂，进一步包括抗癌剂。
18. —种增强细胞对抗癌剂的感受性的方法，其特征在于，通过权利要求1所述的促进p53表达的方法，来促进所述细胞中p53的表达。
19. 一种用于增强细胞对抗癌剂的感受性的增强剂，其特征在于，它含有权利要求9所 述的p53表达促进剂。
20. —种预防或治疗癌症的方法，其特征在于，包括将权利要求9所述的p53表达促进 剂给予生物体内的癌细胞的步骤。
21. —种抗癌剂，其特征在于，它包含权利要求9所述的p53表达促进剂。
22. —种可与p53mRNA结合的结合剂，其特征在于，所述结合剂中含有核酸， 所述核酸中包括Seq ID No : 1所示的vegf-A mRNA中的第694位_第714位的序列组成的RNA。
23. —种可与vegf-A mRNA结合的结合剂，其特征在于，所述结合剂含有核酸， 所述核酸中包括Seq ID No :2所示的p53mRNA中的第462位-第481位的序列组成的RNA。
24. —种筛选可促进p53表达的表达促进剂的方法，其特征在于，包括下述步骤(A) 步骤(C):(A) 在候选物质的存在下，使权利要求22所述的p53mRNA结合剂与权利要求23所述的 vegf-A RNA结合剂接触，(B) 检测所述候选物质对所述p53mRNA结合剂与所述vegf-ARNA结合剂相结合的抑制，(C) 将抑制了所述p53mRNA结合剂与所述vegf-A RNA结合剂的结合的候选物质，选择 为p53表达促进剂。
全文摘要
提供了促进p53mRNA表达的方法以及在该方法中使用的表达促进剂。通过抑制从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA的结合，来促进p53基因的表达。上述结合的抑制可通过例如下述方式实现分解从vegf-A基因外显子1转录的RNA，抑制从vegf-A基因的外显子1转录RNA，或者，使从vegf-A基因外显子1转录的RNA与从p53基因转录的mRNA之外的其他核酸结合。
文档编号A61P43/00GK101795714SQ20088010610
公开日2010年8月4日 申请日期2008年9月5日 优先权日2007年9月7日
发明者六反一仁, 近藤茂忠 申请人:国立大学法人德岛大学