专利名称：：针对革兰氏阴性细菌具有选择性杀菌活性的缓冲液及其使用方法
技术领域：
：本发明总体上涉及具有抑菌活性和/或杀菌活性的缓冲液领域。更具体而言，本发明涉及具有杀菌活性的缓冲液，优选地针对革兰氏阴性细菌具有杀菌活性的缓冲液。
背景技术：
：在给药(例如，通过注射)之前使用缓冲液维持pH以及溶解或稀释活性药物制剂(“API”)是常规方法。然而，很多缓冲液含有维持中性pH和培养微生物生长的组分，所述组分可导致败血病和其他一些不期望的与感染有关的并发症。革兰氏阴性细菌是一类特别麻烦的微生物，因为在医院环境中它们是常见的并且难以根除和/或控制。当病人出现败血症时，伴有这类细菌的感染趋于具有高发病率/死亡率，部分地是由于革兰氏阴性细菌是特别难以治疗的生物体。并且，革兰氏阴性细菌与水污染有关，与诸如静脉给药一同使用的长期留置导管可出现所述水污染。因此，需要具有对革兰氏阴性细菌有特异性的抗菌杀菌(anticidal)活性的缓冲液系统。
发明内容在本发明的一种实施方式中，提供一种在含有活性剂的药物制剂中选择性地杀灭革兰氏阴性细菌并抑制革兰氏阳性细菌生长的方法，所述方法包括向所述活性剂提供缓冲液，所述缓冲液具有大于约10的pH或小于约4.5的pH以及低缓冲容量，其中所述药物制剂不包括依前列醇钠(印oprostenolsodium)作为单一活性剂。除了细菌之外，所述缓冲液还可抑制真菌、霉菌或它们两者的生长。优选地，所述缓冲液具有约10至约12的pH，更优选地，所述缓冲液具有约10.2至约10.8的pH。在其他一些实施方式中，所述缓冲液具有约3至约4.5的pH，更优选地，所述缓冲液具有约3.5至约4.5的pH。所述缓冲液可包括甘氨酸；并且在特定的实施方式中，所述缓冲液是FLOLAN用无菌稀释液(即包括甘氨酸和氢氧化钠的缓冲液)，添加所述无菌稀释液以调节PH为10.2至10.8。所述活性剂可以是需要用缓冲液溶解或稀释的任何活性药物制剂并且可被注射(例如，静脉注射)。所述活性剂可以是曲前列素钠(tr印rostinilsodium)(在此有时由曲前列素指代)，优选地，提供浓度为约0.004mg/mL至约0.13mg/mL曲前列素钠。所述缓冲液可包括山梨酸或柠檬酸或肠外使用的药学上可接受的任何其他一些弱酸。所述PH可用盐酸或氢氧化钠来调节以获得3至4.5的最终pH。所述活性剂可以是需要用缓冲液溶解或稀释的任何活性药物制剂并且可被注射(例如，静脉注射)。在本发明的另一种实施方式中，提供一种用活性剂治疗哺乳动物时降低所述哺乳动物体内血流感染发生率的方法，所述方法包括将具有缓冲液的所述活性剂给药于所述哺乳动物，所述缓冲液具有大于约10的pH或小于约4.5的pH以及低缓冲容量，其中所述活性剂不是依前列醇钠，并且其中所述给药减少革兰氏阴性细菌并抑制革兰氏阳性细菌的生长。在一些实施例中，人类受体可遭受肺动脉高压。优选地，所述缓冲液具有约10至约12的pH，更优选地，所述缓冲液具有约10.2至约10.8的pH以及低缓冲容量。可选地，所述缓冲液具有优选地约3至约4.5的pH，更优选地，约3.5至约4.5的pH以及低缓冲容量。所述缓冲液可包括甘氨酸；并且在特定的实施方式中，所述缓冲液是_FLOLAN用无菌稀释液。所述活性剂可以是需要用缓冲液溶解或稀释的任何活性药物制剂并且可被注射(例如，静脉注射)。所述活性剂可以是曲前列素钠，优选地提供浓度为约0.004mg/mL至约0.13mg/mL曲前列素。所述缓冲液的选择将依赖于所期望的PH。当所述缓冲液组分应具有接近所期望的pH的pKa时，所述缓冲容量应为低的以避免在输液后血液中的pH改变。用于这种缓冲液的优选的缓冲容量是0.01以及更图1是BWFI的“空白”注射(A)和用BWFI稀释的曲前列素⑶的色谱图。图2是BNS的“空白”注射(A)和用BNS稀释的曲前列素⑶的色谱图。图3是FLOLAN用无菌稀释液(A)和FLOLAN用无菌稀释液稀释的曲前列素⑶的色谱图。图4是在L(A)和⑶处FLOLAN用无菌稀释液中o.004mg/mL曲前列素的色谱图。图5是在Tq(A)和⑶处FLOLAN用无菌稀释液中o.13mg/mL曲前列素的色谱图。图6是显示在含有0.004mg/mL曲前列素的药物制剂中针对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)或>Log6.48的数值(WFI，NS中的曲前列素)分别记录为Log1和Log6.48。图6至图15的图例如下(空心圆):FLOLAN用无菌稀释液中的FLOLAN(实心圆)FLOLAN用无菌稀释液中的曲前列素(空心方形)注射用无菌水中的曲前列素(实心方形)注射用抑菌水中的曲前列素(空心菱形)标准(0.9%)盐水中的曲前列素(实心菱形)抑菌标准盐水中的曲前列素(空心三角形)注射用5%葡萄糖水溶液中(D5W)的曲前列素。图7是显示在含有0.004mg/mL曲前列素的药物制剂中针对大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)记录为Log1。图8是显示在含有0.004mg/mL曲前列素的药物制剂中针对绿脓杆菌(革兰氏阴4性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)或彡Log6.48的数值(D5W中的曲前列素)分别记录为Log1和Log6.48。图9是显示在含有0.004mg/mL曲前列素的药物制剂中针对白色念珠菌(真菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。图10是显示在含有0.004mg/mL曲前列素的药物制剂中针对黑曲霉菌(霉菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。图11是显示在含有0.13mg/mL曲前列素的药物制剂中针对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)或彡Log6.48的数值(WFI，NS,D5W中的曲前列素)分别记录为Log1和Log6.48。图12是显示在含有0.13mg/mL曲前列素的药物制剂中针对大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)或彡Log6.48的数值(NS中的曲前列素)分别记录为Log1和Log6.48。图13是显示在含有0.13mg/mL曲前列素的药物制剂中针对绿脓杆菌(革兰氏阴性细菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。SLog1的数值(无菌稀释液中的曲前列素)记录为Log1。图14是显示在含有0.13mg/mL曲前列素的药物制剂中针对白色念珠菌(真菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。在0.25小时时NS中的曲前列素的数值彡Log3.48记录为Log3.48。图15是显示在含有0.13mg/mL曲前列素的药物制剂中针对黑曲霉菌(霉菌)各种缓冲液系统的随时间(天)的抗菌活性(CFU)图。具体实施例方式本发明涉及药物制剂中维持特定pH范围的缓冲液系统作为抗菌杀菌剂的使用。在此使用的术语“缓冲液”是指可用来溶解固体(例如，冻干的)药物的或作为稀释液稀释液体药物的、具有受控PH的任何溶液。根据本发明，在此描述的缓冲液维持pH表现出对大部分(如果不是全部的话)微生物(包括细菌、霉菌和真菌)的抑菌活性并进一步表现出对革兰氏阴性细菌的杀菌活性。革兰氏阴性细菌的例子包括大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、莫拉氏菌、螺旋杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、蛭弧菌、军团菌、淋病奈瑟氏菌、和脑膜炎奈瑟氏球菌。革兰氏阴性细菌是医院环境中常见的感染源，因此，维持PH大于10或小于约4.5以及低缓冲容量的、对革兰氏阴性细菌具有特异性的杀菌能力的缓冲液是所期望的。作为实施例，革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌杆菌、利斯特氏菌、葡萄球菌、链球菌、肠球菌和梭状芽孢杆菌。“抑菌”被定义为在缓冲液中阻止或避免可能存在的或开始存在的微生物扩增的能力。换言之，“抑菌”活性不包括杀菌活性，杀菌活性在此被定义为在缓冲液中杀灭可能存在或开始存在的微生物的活性。微生物在此被广泛地定义以包括单细胞生物体，例如细菌、真菌和霉菌。本发明人已研究了具有高pH(>10)或低pH(<4.5)的缓冲液对革兰氏阴性细菌具有特异性的杀菌活性并且对革兰氏阳性细菌以及其他一些微生物具有抑菌活性。无需理论支持或不受理论限制，目前人们相信革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌在生物化学(可能是细胞壁的生物化学)方面的差别导致它们对高PH缓冲液的差别敏感度。在本发明的内容中，“高”PH是约9至约12的pH值，优选地约10至约12。在本发明优选的实施方式中，缓冲液具有约10.2至约10.8或约3.5至约4.5的pH。除了高pH之外，本发明人已研究了包括甘氨酸的所述缓冲液是特别有优势的。在这些实施方式中，甘氨酸以约30%至约80%的浓度(w/w)存在，优选地，以约45%至约65%的浓度(w/w)存在，并且最优选地，以约50%至约60%的浓度(w/w)存在。术语“约”在此用以认可本领域中计算和测量中固有的不精确并且用以包括所记载的数字“附近”的微小的和认可的变化。除了甘氨酸之外，在此所描述的缓冲液可包括任何其他缓冲液系统(包括那些本领域已知的)，所述缓冲液系统可维持PH在在此所阐述的范围内。在本发明特定的实施方式中，FLOLAN(依前列醇钠)用稀释液使用甘氨酸作为缓冲液组分。如下将会更具体地描述，出乎意料地发现FLOLAN用缓冲液对革兰氏阴性细菌具有特异性的抗菌杀菌活性并且对剩余的微生物具有抑菌活性。所述FLOLAN用稀释液包括含有94mg甘氨酸、73.3mg氯化钠和氢氧化钠的50mL稀释液，添加所述稀释液以调节PH为10.2至10.8(甘氨酸中约44%NaCl)。在此所描述的缓冲液可适用于任何活性药物成分(“API”)，所述活性药物成分在高PH条件下稳定并且API的化学性质基本不使所述缓冲液的pH下降低于例如约10。因此，尽管描述了下面的实施例，本发明不应被限制于任何一种或任何一类API，而且也不应被限制于限定的浓度范围。进一步地，所述缓冲液的新颖的并且出乎意料的抗菌杀菌性质可以是特别适合于通过注射给药的药物。确实，在本发明的一种实施方式中，期望在此所描述的高PH缓冲液以及低pH缓冲液的使用可在用活性剂治疗哺乳动物时降低所述哺乳动物体内血流感染发生率。然而，应当注意的是，本发明不限于所规定的用于注射(包括静脉注射)的药物，而是需要溶解和/或稀释的任何药物(例如，用于口服给药)。在本发明特定的实施方式中，所描述的缓冲液系统与曲前列素钠一同使用。更具体而言，如下将以实施例的方式公开，所述FLOLAN用稀释液被用以缓冲曲前列素钠。实施例用100-mLCADD递送装置执行曲前列素的相容性研究。更具体而言，确定了用抑菌注射用水(“BWFI”)或抑菌标准盐水(“BNS”)稀释曲前列素的相容性和稳定性，所述抑菌注射用水和所述抑菌标准盐水与对羟基苯甲酸酯一同保存。制备0.004mg/mL和0.13mg/mL曲前列素的样品溶液，这包括可规定的曲前列素的整个浓度范围，并将所述样品溶液放置在SIMADeltec,Inc.CADD-Lagacyl(6400型)抽吸递送装置中，当所述样品溶液在40°C以及环境相对湿度(“RH”)下被保存时，所述抽吸递送装置连续抽吸52小时。在特定时间点(例如，Ttl，开始，24小时以及52小时)，在抽吸之后从管的远端收集样品并表征所述样品的外观、PH和曲前列素的浓度。此外，所述溶液接受抗菌效力测试(“AET”)达一段类似时间(约两天)。随后执行类似的实验程序测试佛罗兰复溶溶液(Flolanreconstitutedsolution)0然而，由于药物在溶液中有限的稳定性，在室温条件下，仅八小时后，对FLOLAN执行无菌性和AET测试。曲前列素的稳定性通过充分证实的显示稳定性的HPLC分析来监测。为了确定对羟基苯甲酸酯(存在于“抑菌”溶液中)在色谱分析中是否将会导致干扰曲前列素，初步实验确定对羟基苯甲酸酯“峰”不干扰曲前列素“峰”或任何杂质“峰”不干扰曲前列素“峰”。使用HPLC分析BWFI溶液和BNS溶液以及在BWFI和BNS中稀释的曲前列素。图1和图2显示来自对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸乙酯的对羟基苯甲酸酯峰不干扰(例如，重叠)曲前列素的峰。FLOLAN用无菌稀释液对曲前列素也没有色谱干扰(图3)。还执行低级线性研究以覆盖在稀溶液中的曲前列素所期望的浓度范围。制备0.002mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.lmg/mL、0.5mg/mL(从1.Omg/mL的标准溶液稀释而成)曲前列素的五种溶液并且每种溶液被注入两份。目的是证明在稀释的浓度范围内曲前列素浓度与检测器响应之间的线性关系以在分析过程中使用0.lmg/mL单点标准。所述检测器对曲前列素的响应被确定在0.002mg/mL至0.15mg/mL是线性的。实验相关系数为0.999995，其满足至少0.999的要求。0.004mg/mL曲前列素BWFI、BNS或FLOLAN用无菌稀释液的溶液由浓度为1.Omg/mL的瑞莫杜林(Remodulin)制成。0.13mg/mL曲前列素BWFI和BNS的溶液由浓度为lOmg/mL的Remodulin制成。使用包装说明书所列的程序用5mLFLOLAN用无菌稀释液复溶瓶装FLOLAN。移取四种溶液中每一种的一部分(大约2mL)用于Ttl分析。剩余的溶液装入四个单独的SIMSDeltec,Inc.100-mLMedicationCassetteReservoir中的每一个。根据厂商说明书，将所述盒子和管状物连接于CADD-LegaCyTMlPump。所述四个盒子/CADD抽吸装置被放置于40°C/环境RH的室中。将管状物的末端的针放置入密封的HPLC瓶(具有针孔)中。泵的流量设置为40mL/24小时并启动。来自各个泵的溶液被收集进入单独的HPLC瓶中(约一小时)用于在“开始”时间间隔处的测试。然后，所述针被转移至密封的废物容器(具有针孔)。在24小时和52小时时，再次收集所述溶液进入新的、密封的HPLC瓶中用于测试。分析在Ttl、开始、24小时和52小时收集到的溶液的物理外观、pH以及通过HPLC分析曲前列素。表1和表2分别总结了用BWFI和BNS稀释的曲前列素的结果。所有溶液的外观是透明的和无色的，没有明显的微粒物质。因此，所述结果显示曲前列素溶液以任一浓度溶于BWFI或BNS都没有相容性的问题。表1.BffFI中曲前列素的化学测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>LC标示量表2.BNS中曲前列素的化学测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>LC标示量FLOLAN用无菌稀释液中的曲前列素溶液获得了类似结果，其在表3中予以总结。所有溶液的外观是透明的、无色的并且没有明显的微粒物质。所述结果也显示曲前列素溶液以任一浓度溶于FLOLAN无菌稀释液都没有相容性的问题(图4和图5)。因此，所述结果显示稀释的曲前列素溶液以任一浓度溶于任何稀释溶液都没有相容性的问题。表3.FLOLAN无菌稀释液中曲前列素的化学测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>LC标示量对于曲前列素溶液而言，在40°C/环境RH的盒中52小时之后，去除所述溶液并且根据USPNF24SuppIement2<51>通过包含48小时平板接种的所有生物体执行AET。对于FLOLAN溶液而言，根据相同的程序执行所述测试，但是所述测试在室温条件下、溶液已在盒中8小时之后执行。FLOLAN也测试无菌性。1类产品(包括肠外溶液)的AETUSP要求如下对于细菌而言，在7天时相对于最初计算的总数必须具有不小于1.Olog的下降，并且在14天时相对于最初计算的总数必须具有不小于3.Olog的下降，以及在28天时相对于14天的总数没有增加。对于酵母和霉菌而言，在7天、14天、28天时相对于最初计算的总数应无增加。虽然FLOLAN稀释于Flolan用无菌稀释液满足AET的USP要求，BWFI和BNS中的曲前列素溶液却不满足AET的USP要求。这些稀释的曲前列素溶液不满足AET的原因是细菌降低率不足(主要对于革兰氏阴性细菌而言)。然而，FLOLAN用无菌稀释液中的曲前列素满足USP标准。参见，图6至图15。虽然已结合具体实施方式描述了本发明，可以理解，本发明能够做进一步修改并且本发明意欲覆盖本发明后续的任何变化、用途或更改。总体而言，本发明的实质不仅限于本申请公开的内容，而且还包括本发明所属
技术领域：
的公知常识或惯用手段以及可应用于前文所述的和后附的权利要求中的必要技术特征的内容。尽管上文涉及具体的优选实施方式，应当理解的是，本发明并不局限于此。本领域的技术人员会知晓对所公开的实施方式可做出各种修改，并且该修改是在本发明的范围内的。权利要求一种在含有活性剂的药物制剂中选择性杀灭革兰氏阴性细菌并且抑制革兰氏阳性细菌生长的方法，所述方法包括向所述活性剂提供具有大于约10的pH或小于约4.5的pH以及低缓冲容量的缓冲液，其中所述药物制剂不包括依前列醇钠作为单一活性剂。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述活性剂是曲前列素。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液包括甘氨酸。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述缓冲液包括甘氨酸和氢氧化钠。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液具有约10至约12的pH或2至4.5的pH以及低缓冲容量。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述缓冲液具有约10.2至约10.8的pH或约3至约4的pH以及低缓冲容量。7.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步抑制真菌、霉菌或它们两者的生长。8.如权利要求1所述的方法，其中，提供浓度为约0.001mg/mL至约lmg/mL的所述活性剂。9.如权利要求2所述的方法，其中，提供浓度为约0.004mg/mL至约0.13mg/mL的所述曲前列素。10.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将所述药物制剂注射入需要该药物制剂的哺乳动物。11.如权利要求5所述的方法，其中，将所述药物制剂通过静脉注射入需要该药物制剂的哺乳动物。12.—种用活性剂治疗哺乳动物时降低所述哺乳动物体内血流感染发生率的方法，所述方法包括将具有缓冲液的所述活性剂给药于所述哺乳动物，所述缓冲液具有大于约10的PH或小于约4.5的pH，其中，所述活性剂不是依前列醇钠，并且其中，在注射入血流之前所述给药减少革兰氏阴性细菌并抑制革兰氏阳性细菌的生长。13.如权利要求12所述的方法，其中，所述人类受体具有肺动脉高压。14.如权利要求12所述的方法，其中，将所述活性剂通过静脉给药。15.如权利要求12所述的方法，其中，所述活性剂是曲前列素。16.如权利要求12所述的方法，其中，所述缓冲液包括甘氨酸。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述缓冲液是FLOLAN用无菌稀释液。18.如权利要求12所述的方法，其中，所述缓冲液具有约10至约12的pH或约2至约4.5&pH以及低缓冲容量。19.如权利要求18所述的方法，其中，所述缓冲液具有约10.2至约10.8的pH或约3至约4.5的pH以及低缓冲容量。20.如权利要求12所述的方法，所述方法进一步抑制真菌、霉菌或它们两者的生长。21.如权利要求15所述的方法，其中，提供浓度为约0.004mg/mL至约0.13mg/mL的所述活性剂。22.如权利要求15所述的方法，其中，提供浓度为约0.004mg/mL至约0.13mg/mL的所述曲前列素钠。23.如权利要求1所述的方法，其中，所述给药是将所述药物制剂注射入需要该药物制剂的哺乳动物。全文摘要本发明提供优选地针对革兰氏阴性细菌具有杀菌活性的药物制剂用缓冲液。所述缓冲液具有大于约10的pH或小于约4.5的pH以及低缓冲容量。本发明还提供该缓冲液在降低哺乳动物体内血流感染发生率方面的使用方法。文档编号A61K47/18GK101827612SQ200880106046公开日2010年9月8日申请日期2008年9月5日优先权日2007年9月7日发明者大卫·扎卡尔代利,罗杰·杰夫斯申请人:联合治疗公司