专利名称：革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法及其专用芯片与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法及其专用芯片与试剂盒。
背景技术：
一.细菌鉴定与耐药性检测的重要意义
随着抗菌药物的广泛使用，病原菌对常见抗菌药物的耐药性不断增加，耐药菌感染的治疗已成为一个全球性难题。引起临床细菌性感染的致病菌包括需氧菌与厌氧菌，分为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类，每类又各分为球菌与杆菌。需氧革兰阳性球菌与革兰阴性杆菌是临床最常见的二类致病菌。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌由于细胞壁等结构的不同，从而导致药物对其作用机理及其耐药机制也存在显著差异，临床上对这两类细菌地临床用药具有很大差别。
抗生素是医院临床中应用最广泛的抗菌药物，在控制、预防和治疗各种感染性疾病中发挥重要作用。然而，自1939年抗生素问世以来，特别是近10年来，细菌耐药率迅速增长，医院内感染时尤其严重。
各种耐药菌的不断出现可造成严重后果，例如，导致手术治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用量增加等。耐药株还随着国际贸易及旅游业的高速发展而在全球范围蔓延。了解耐药性细菌的出现原因、发生机制，掌握并使用正确的检测方法是及时发现耐药菌株、有效预防和控制耐药性细菌扩散的关键。及时准确地掌握细菌耐药机制，对指导临床合理用药和新的抗菌药物的研制具有重要意义。
二.当前革兰氏阴性菌的主要耐药问题
革兰氏阴性菌的耐药机制比较复杂，包括四种主要耐药机制，而且可能由于不同耐药机制的协同作用而导致多重耐药。
酶对抗生素的修饰或破坏
主要是β-内酰胺酶，通过水解β-内酰胺环使抗生素失活，这是大多数致病菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制，约80％的病原菌的耐药性与其有关。现已发现的β-内酰胺酶有200种以上，β-内酰胺酶可水解常见青霉素类、头孢菌素类、碳青霉素类(亚胺培南和美罗培南)和单环类(氨曲南)中的β-内酰胺四元环。
膜通透性改变
革兰氏阴性菌的膜孔蛋白通道狭窄，能对大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障。膜通透性降低导致细菌耐药性主要原因是膜孔蛋白缺陷，如OprD孔蛋白的缺失导致铜绿假单胞菌(Huang H，Jeanteur D，Pattus F，Hancock RE.1995.Membrane topology and site-specific mutagenesis of Pseudomonas aeruginosaporin OprD.Mol Microbiol.16(5)931-41.)和肺炎克雷伯氏菌(Martinez-Martinez L，Pascual A，Hernandez-Alles S，Alvarez-Diaz D，Suarez AI，Tran J，Benedi VJ，Jacoby GA.1999.Roles of beta-lactamasesand porins in activities of carbapenems and cephalosporins againstKlebsiella pneumoniae.Antimicrob Agents Chemother.43(7)1669-73.)对亚胺培南耐药。
主动泵出机制
主动泵出机制是通过几种膜蛋白的协同作用将许多不同结构的抗生素排出菌体，从而造成细菌的多重耐药。在铜绿假单胞菌中，至少有4种主动泵出系统介导多重耐药[Masuda N，Sakagawa E，Ohya S.1995.Outer membrane proteinsresponsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother.39(3)645-9.]。其中MexAB-oprM系统是唯一组成型表达的，是铜绿假单胞菌对多种抗生素和有机物质天然耐药的主要基础。
新靶位的改变或产生
β-内酰胺类抗生素专一性地与细菌细胞内膜上的靶位点PBPs结合，干扰细胞壁肽聚糖合成而导致细菌死亡。由于PBPs的改变或产生新的有功能的PBPs，使抗生素不再发挥作用，从而导致耐药。由于革兰氏阴性菌的产酶机制和通透性等因素作用明显，PBP在耐药机制中的作用并不十分显著。
三.β-内酰胺酶
β-内酰胺酶(E.C.3.5.2.6)是一类可特异水解β-内酰胺环的酶，是导致细菌尤其是革兰氏阴性菌耐药的最主要机制，在各种耐药机制中占80％。β-内酰胺酶是由多种酶组成的蛋白家族，能水解β内酰胺抗生素。这些蛋白基因存在于细菌的染色体或质粒中。几乎在青霉素使用的同时(1940年)即报导了可对青霉素进行水解的青霉素酶[Abraham EP，Chain E.1940.An enzyme from bacteria ableto destroy penicillin.Nature.146837.]。目前G-杆菌中最引人注目的问题是细菌对第三代头孢菌素和新的广谱β-内酰胺类抗生素耐药，其主要机制是细菌产超广谱β-内酰胺酶ESBLs和Bush I组β-内酰胺酶。青霉素酶和AmpC酶的活性中心均为丝氨酸，它作为亲核试剂向β-内酰胺环的羧基进攻，形成酰化酶中间体，然后在水分子的作用下使β-内酰胺环开环失活。金属β-内酰胺酶则是以二价过渡金属Zn作为催化中心。
迄今为止报道的β-内酰胺酶已超过200种。它们在来源、底物谱、抑制剂、结构等方面存在许多差异，从而给β-内酰胺酶的系统分类带来困难。至今已有7种酶分类法的报道。其中较为实用和完善的是改进版BJM分类系统[Bush，K.，G.A.Jacoby，and A.A.Medeiros.1995.A functional classification scheme forβ-lactamases and its correlation with molecular structure.Antimicrob.Agents Chemother.391211-1233.]，主要将β-内酰胺酶分为以下4组。
Group1头孢菌素酶，为C类酶，能水解头孢菌素，但对青霉素水解作用很弱，不能被β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸)抑制，可被邻氯西林抑制，由位于染色体上的ampC基因编码产生，统称为AmpC酶，近年发现的质粒介导AmpC酶的性质与染色体介导的AmpC酶基本一致，也归于此类；
Group2青霉素酶，为A或D类酶，主要水解青霉素类，能被克拉维酸抑制(2br亚组除外)，其中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum betalactamases，ESBLs)属于A类酶，可水解第三代头孢菌素；
Group3金属β-内酰胺酶，又称碳青霉烯酶，为B类酶，包括IMP型和VIM型β-内酰胺酶，由染色体或质粒介导。活性中心有2个Zn原子，可以水解几乎所有β-内酰胺类抗生素，其活性不被克拉维酸抑制剂抑制，但可被EDTA和对氯苯甲酸汞(p-chloromercuribenzoate，pCMB)抑制；
Group4青霉素酶，分子分类不明，主要水解青霉素类，不能被克拉维酸抑制。
临床上最重要的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC)。
超广谱β-内酰胺酶(extened-spectrum β-lactamases，ESBLs)是指由质粒介导的能赋予细菌对多种β-内酰胺类抗生素耐药的一类酶，由革兰氏阴性细菌，主要是肺炎克雷伯氏菌和E.coli产生，属BJM分类系统2be组，组成型高表达，可水解广谱头孢菌素(如头孢噻肟，头孢他啶)，单环类抗生素(氨曲南)等，且能被克拉维酸，舒巴坦所抑制。ESBLs主要是由广谱酶TEM-1、TEM-2、SHV-1为基础突变产生，底物谱扩大，可对多种氧亚胺基β-内酰胺类抗生素具有催化水解作用。
目前已经发现200多种ESBLs，其中TEM型144种，SHV型53种，OXA型14种，CTX-M型24种，其他型10种。TEM、SHV和OXA型ESBLs的具体分类、氨基酸组成和pI值可参考网址http//www.lahey.org/studies/webt.htm。
CTX-M型ESBLs是我国最流行的ESBLs[Wang H，Kelkar S，Wu W，Chen M，QuinnJP.2003.Clinical Isolates of Enterobacteriaceae ProducingExtended-Spectrum beta-LactamasesPrevalence of CTX-M-3 at a Hospital inChina.Antimicrob Agents Chemother.47(2)790-3.]，其中CTX-M-11、13、14、15在我国北京和广州发现；少数ESBLs为SHV型，没有TEM型ESBLs。这可能与我国大量使用头孢噻肟有关，因此选择出对头孢噻肟耐药而对头孢他定敏感的CTX-M型ESBLs。
头孢菌素酶(AmpC酶)在分子结构上具有同源性，都属于分子分类的C类酶。AmpC酶存在于大多数肠杆科细菌和铜绿假单胞菌中，由染色体或质粒介导。
最初AmpC酶由染色体介导，自然发生，主要见于阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌及铜绿假单胞菌中。近年来出现向质粒转移的趋势。质粒中的AmpC没有调控基因，呈持续高表达(DHA-1除外)，且由于质粒的快速复制(导致突变增加)和可转移性(导致散播快)，造成更多的菌株耐药。1989年报导了第一个对头孢西定和头孢替坦耐药的质粒介导AmpC酶CMY-1，其pI值为8.0，该酶可将耐药性从K.pneumoniae转移到E.coli中(Bauernfeind，A.，Y.Chong，andS.Schweighart.1989.Extended broad spectrum β-lactamase in Klebsiellapneumoniae including resistance to cephamycins.Infection 17316-321.)，此后，越来越多的质粒介导AmpC酶被发现和报道，它们可对氧亚氨基类和7α-甲氧基类头孢菌素耐药，而且介导这些酶的质粒是可传递的。质粒介导AmpC主要分布在K.pneumoniae和其他肠杆菌中。并以平均每年1～2个新质粒的速度增加，这是一种新的危险，应引起足够重视。
现已发现33种质粒介导的AmpC酶，根据其与染色体介导的AmpC酶氨基酸同源性可分为6组[Philippon A，Arlet G，Jacoby GA.2002.Plasmid-determinedAmpC-type beta-lactamases.Antimicrob Agents Chemother.46(1)1-11.]MOX-CMY组，CMY-LAT组(由于来源于Citrobacter，也称为CIT组)，DHA组，ACC组EBC组和FOX组。其中CIT组的基因cmy-2是世界上分布最广的一个质粒介导的AmpC基因，在亚洲，美洲和欧洲等地区均有发现[Philippon A，Arlet G，JacobyGA.2002.Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamases.Antimicrob AgentsChemother.46(1)1-11.]。质粒介导的AmpC酶底物谱广，可水解氧亚氨基类，(如第三代头孢菌素)和7α-甲氧基类头孢菌素(如头孢西丁)等抗生素，而且该类酶与染色体介导的AmpC酶一样，不被酶抑制剂克拉维酸等抑制。另外，质粒介导的AmpC与特异孔蛋白缺失联合作用，可导致对碳青霉烯类抗生素耐药，如产质粒介导CMY-4和缺失孔蛋白的K.pneumoniae的协同作用对亚胺培南产生耐药[CaoVT，Arlet G，Ericsson BM，Tammelin A，Courvalin P，Lambert T.2000.Emergence of imipenem resistance in Klebsiella pneumoniae owing tocombination of plasmid-mediated CMY-4 and permeability alteration.JAntimicrob Chemother.46(6)895-900.]，这给治疗带来很大难题。
四.ESBLs和AmpC检测方法
纸片扩散法
筛选试验选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松药敏纸片中的至少2种，用MH琼脂培养基培养待测菌，测量抑菌环直径，按NCCLS标准进行判断。确认试验是使用头孢他啶和头孢他啶加克拉维酸；头孢噻肟和头孢噻肟加克拉维酸；分别测量2种纸片单独及加克拉维酸的抑菌环直径。加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径相差≥5mm可确认为ESBLs菌株。该方法敏感率为84.4％。
双纸片协同法
将菌液涂布在MH琼脂平板上，然后将一张含有酶抑制剂(如阿莫西林+克拉维酸)药敏纸片贴在中心，再贴1张三代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟或头孢曲松)或氨曲南纸片，如头孢他啶纸片向克拉维酸纸片方向抑菌区增大则显示ESBLs存在。该方法敏感率在79％左右。
检测最低抑菌浓度(MIC)(即琼脂稀释法)
筛选试验选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上，用MH肉汤(标准肉汤稀释法)稀释，根据NCCLS推荐的筛选标准，凡头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CTRX)等三代头孢霉素及氨曲南(ATZ)MIC超过2mg/ml的菌株都应怀疑是产ESBLs菌。确认试验是根据NCCLS推荐的筛选和确认ESBLs的标准进行判断。选用头孢噻肟(或头孢他啶)进行单独稀释及头孢噻肟(或头孢他啶)加克拉维酸(固定浓度为4mg/L)进行稀释；如果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值≥8倍，可确认为ESBLs菌株。
Etest法
Etest ESBLs试条一侧含有头孢他啶，另一侧含有头孢他啶+克拉维酸，抗生素浓度两端最高，向中间呈浓度梯度递减。将E-test试条贴于接种待测菌的MH平皿上，孵育18～24小时，读取两端抑菌线的MIC值，如果头孢他啶的MIC值大于头孢他啶+克拉维酸MIC值4倍以上，则判定为ESBLs阳性。此法操作简单，但试条价格较为昂贵。
三维实验
将敏感菌株如大肠埃希菌ATCC25922涂布在平板上，然后贴上药敏纸片，在离纸片3mm处打一个小孔，内加菌液或破胞液，35℃孵育过夜，如出现待测菌液或破胞液干扰敏感菌株形成抑菌环的现象则判断为阳性。该试验敏感率达到95％。但操作繁琐，须专业人员进行操作。
以上表型检测方法(除三维实验外)只对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌进行检测，不检测其他肠杆菌科细菌，也不能检测AmpC，三维实验可检测AmpC，但临床实验室很难进行操作。
除上述检测耐药表型的方法外，另外还有一些分子方法进行检测，如检测ESBLs的等电点(等电聚焦电泳IEF)，分析酶的底物谱及抑制物谱来分型或PCR扩增等。其中分子生物学方法的优点在于快速准确，当MIC处于耐药的临界值时，分子生物学方法可为治疗提供有力的依据。但是，常规的分子生物学检测指标单一，因而实用性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒。
本发明所提供的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒，包括扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对，和检测所述革兰氏阴性菌菌株耐药基因探针；
所述扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50个核苷酸，优选为15-35个核苷酸；所述扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对中的正向引物或反向引物的5’端连接上通用加尾序列；所述通用加尾序列的5’端被荧光标记；被连接上所述通用加尾序列的正向引物或反向引物的5’端被荧光标记；所述通用加尾序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；
所述检测革兰氏阴性菌菌株耐药基因探针的大小均为15-50个核苷酸；所述探针的5’端连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-18个寡聚dT。
该试剂盒中，所述革兰氏阴性细菌是指经革兰氏染色鉴定为革兰氏染色阴性的菌株。所述耐药基因是指革兰氏阴性菌的耐药基因。所述引物是指用于进行PCR，特别是多重不对称PCR扩增的核苷酸序列。所述探针是指和上述PCR产物进行杂交的核苷酸序列。
所述待测革兰氏阴性细菌菌株包括大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等肠杆菌科细菌。
所述耐药基因包括tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
所述tem是指144种tem型超广谱β-内酰胺酶tem-1到tem-144基因；所述shv是指53种SHV型超广谱β-内酰胺酶shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70基因；所述ctx-m-1-type是指CTX-M-1型超广谱β-内酰胺酶基因，包括ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1基因；所述ctx-m-9-type是指CTX-M-9型超广谱β-内酰胺酶基因，包括ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2基因；所述mox是指cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2头孢菌素酶基因；所述cit是指cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4基因；所述dha是指DHA组头孢菌素酶dha-1、dha-2基因；所述acc是指ACC组头孢菌素酶aac-1基因；所述ebc是指EBC组头孢菌素酶mir-1和act-1基因和阴沟肠杆菌染色体介导的ampC基因；所述fox是指FOX组头孢菌素酶fox-1～6基因。
扩增所述tem的正向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列；可扩增144种TEM型超广谱β-内酰胺酶tem-1到tem-144基因。
扩增所述shv的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列5的核苷酸序列；可扩增53种SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
扩增所述ctx-m-1-type的正向引物具有序列表中序列6的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列7的核苷酸序列；可扩增6种CTX-M-1型超广谱β-内酰胺酶ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1基因。
扩增所述ctx-m-9-type的正向引物具有序列表中序列8的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列9的核苷酸序列；可扩增9种CTX-M-9型超广谱β-内酰胺酶基因ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2。
扩增所述mox的正向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列；可扩增7种头孢菌素酶基因cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2。
扩增所述cit的正向引物具有序列表中序列12的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列13的核苷酸序列；可扩增12种基因cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4。
扩增所述dha的正向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列15的核苷酸序列；可扩增2种DHA组头孢菌素酶基因dha-1和dha-2。
扩增所述acc的正向引物具有序列表中序列16的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列17的核苷酸序列；可扩增1种ACC组头孢菌素酶基因aac-1。
扩增所述ebc的正向引物具有序列表中序列18的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列19的核苷酸序列；可扩增3种EBC组头孢菌素酶基因mir-1，act-1和阴沟肠杆菌染色体介导的ampC基因。
扩增所述fox的正向引物具有序列表中序列20的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列21的核苷酸序列；可扩增6种FOX组头孢菌素酶基因fox-1～6基因。
所述试剂盒还包括表面化学质控探针，杂交质控探针，阴性对照探针和所述杂交质控探针的靶标；所述探针的大小均为15-35个核苷酸；所述杂交质控探针和阴性对照探针的5’端均连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-18个寡聚dT。
所述检测耐药基因探针包括tem通用探针，shv通用探针，ctx-m-1-type通用探针，ctx-m-9-type通用探针，mox通用探针，cit通用探针，dha通用探针，acc通用探针，ebc通用探针和fox通用探针及shv分型探针；所述shv分型探针由检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针和检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针。
所述tem通用探针具有序列表中序列22的核苷酸序列，可检测144种TEM型的超广谱β-内酰胺酶基因tem-1到tem-144。
所述shv通用探针具有序列表中序列33的核苷酸序列，可检测53种SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述ctx-m-1-type通用探针具有序列表中序列24的核苷酸序列，可检测6种CTX-M-1型超广谱β-内酰胺酶基因ctx-m-1、ctx-m-3、ctx-m-10、ctx-m-12、ctx-m-15和fec-1。
所述ctx-m-9-type通用探针具有序列表中序列23的核苷酸序列，可检测9种CTX-M-9型超广谱β-内酰胺酶基因ctx-m-9、ctx-m-13、ctx-m-14、ctx-m-16、ctx-m-17、ctx-m-19、ctx-m-21、ctx-m-27和Toho-2。
所述mox通用探针具有序列表中序列25的核苷酸序列，可检测7种头孢菌素酶基因cmy-1、cmy-8～11，mox-1和mox-2。
所述cit通用探针具有序列表中序列26的核苷酸序列，可检测12种基因cmy-2、bil-1、cmy-2b，cmy-4～7、cmy-12、lat-1～4。
所述dha通用探针具有序列表中序列27的核苷酸序列，可检测2种DHA组头孢菌素酶基因dha-1和dha-2。
所述acc通用探针具有序列表中序列28的核苷酸序列，可检测1种ACC组头孢菌素酶基因aac-1。
所述ebc通用探针具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；具有序列表中序列29核苷酸序列的ebc通用探针可检测1种EBC组阴沟肠杆菌染色体介导的头孢菌素酶ampC基因；具有序列表中序列30核苷酸序列的ebc通用探针可检测1种EBC组头孢菌素酶基因mir-1；具有序列表中序列31核苷酸序列的ebc通用探针可检测1种EBC组头孢菌素酶基因act-1。
所述fox通用探针具有序列表中序列32的核苷酸序列，可检测6种FOX组头孢菌素酶基因fox-1到fox-6。
所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列34的核苷酸序列，可检测32种自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1、shv-6、shv-8、shv-11、shv-14、shv-16、shv-19、shv-24～28、shv-31～33、shv-35～38、shv-40～44、shv-48～51、shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列35的核苷酸序列，可检测18种自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-2～5、shv-2a、shv-7、shv-9、shv-10、shv-12、shv-15、shv-20～22、shv-30、shv-34、shv-39、shv-45和shv-46。
所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列36的核苷酸序列，可检测3种自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-13、shv-18和shv-29。
所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列37的核苷酸序列，可检测41种自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～3，shv-6，shv-8，shv-11，shv-13～14，shv-16，shv-2a，shv-19～21，shv-24～30，shv-32～44，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列38的核苷酸序列，可检测12种自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-4、shv-5、shv-7、shv-9、shv-10、shv-12、shv-15、shv-18、shv-22、shv-31、shv-45和shv-46。
所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列39的核苷酸序列，可检测39种自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～10，shv-14，shv-16，shv-18～22，shv-24，shv-26～28，shv-30，shv-32，shv-33～34，shv-38～39，shv-41～46，shv-48～51，shv-57和shv-59。
所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列40的核苷酸序列，可检测14种自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-2a、shv-11～13、shv-15、shv-25、shv-29、shv-31、shv-35～37、shv-40、shv-53和shv-70。
所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列41的核苷酸序列，可检测47种自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～6，shv-8～13，shv-15～16，shv-2a，shv-19～22，shv-24～28，shv-31～33，shv-35～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列42的核苷酸序列，可检测6种自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-7、shv-14、shv-18、shv-29、shv-30和shv-34。
所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列43的核苷酸序列，可检测52种自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～9，shv-11～16，shv-2a，shv-18～22，shv-24～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列44的核苷酸序列，可检测1种自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-10。
所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列45的核苷酸序列，可检测50种自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-1～5、shv-7、shv-9～16，shv-2a，shv-18～22，shv-25～46，shv-48～51，shv-53，shv-57，shv-59和shv-70。
所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列46的核苷酸序列，可检测1种自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-6。
所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列47的核苷酸序列，可检测1种自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-8。
所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列48的核苷酸序列，可检测1种自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因shv-24。
所述表面化学质控探针具有序列表中序列49的核苷酸序列，杂交质控探针具有序列表中序列50的核苷酸序列，所述杂交质控探针的靶标具有序列表中序列51的核苷酸序列，阴性对照探针具有序列表中序列52的核苷酸序列。
上述探针固定于载体上。
所述载体可为硅片、用各种功能基团修饰的玻片或用各种功能基团衍生的膜，优选为带有醛基基团的玻片。
所述试剂盒还包括进行PCR反应和分子杂交的反应液，和50％的二甲基亚砜(DMSO)作为杂交反应的空白对照。
本发明的第二个目的是提供一种利用上述革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒进行革兰氏阴性细菌耐药基因检测的方法。
本发明所提供的革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法，包括以下步骤
1)利用所述试剂盒中的引物进行PCR，扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因；
2)将步骤1)得到的扩增产物与所述试剂盒中的革兰氏阴性菌耐药基因探针进行杂交，确定待测革兰氏阴性细菌所含耐药基因。
所述PCR为多重不对称PCR。
所述PCR扩增待测革兰氏阴性细菌菌株的耐药基因的引物对中的两条正反向引物浓度可均相同。
所述PCR扩增待测革兰氏阴性细菌菌株的耐药基因的引物对中的两条正反向引物中，5’端连接上所述5′通用加尾序列的一条引物的浓度可为另一条引物的5-100倍，优选为2.5倍。
所述PCR扩增温度循环分为两个阶段第一阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-25个(20个左右的具体范围)温度循环；第二阶段的每个温度循环由变性和延伸两个步骤组成，包括10-25个(20个左右的具体范围)温度循环。
所述第二阶段的延伸温度为60-80℃，优选为70℃。
革兰氏染色是非常简便(＜10min)的临床常规检测，本发明通过染色将阳性菌与阴性菌快速分开后，再用基因芯片进行检测，本发明针对的是最常见的革兰氏阴性菌及其最主要的耐药基因，具有明显的临床针对性和实用价值。本发明极大的缩短检测时间和增强临床实用性，对于细菌感染的合理用药及个性化治疗、控制耐药菌株的传播流行等，具有非常重要的意义。
本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法及其专用试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高，应用范围广，特异性高，检测结果稳定，可靠性高的特点。
图1为实施例1芯片的探针排布示意图2为实施例1的芯片检测肺炎克雷伯氏菌耐药基因的结果
图3为实施例1的芯片检测大肠杆菌Z302耐药基因的结果
图4为实施例1的芯片检测阴沟肠杆菌的耐药基因
具体实施例方式
下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
在本发明的多重不对称PCR扩增体系里，DNA聚合酶、dNTP、Mg2+浓度和反应缓冲液等组分与常规PCR相同，并可根据不同的反应予以优化。不同之处在于使用的引物一条基因特异性引物与常规PCR相同，而在另一条基因特异引物的5’末端加上一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾(如表1中的5′通用加尾序列)。两条引物的浓度可相同。不同基因特异性引物可加上相同序列尾(如表1中的5′通用加尾序列)。PCR扩增温度循环分为两个阶段(参见表4)第一阶段同常规PCR，包括变性、退火和延伸三个步骤，退火温度根据特异基因引物的Tm值可相应调整，同样地，延伸时间也可根据扩增片段长度调整。经约20个温度循环后，立即开始第二个阶段。第二个阶段的温度循环只有变性和延伸两个步骤，延伸反应的温度约为70℃。在前20个温度循环的扩增反应里，由于退火温度与基因特异性引物Tm值相当，两条基因特异性引物可进行普通的PCR扩增。而在后20个温度循环，只有加尾的基因特异性引物(较长，其全长的Tm值较高)可以退火延伸，从而达到制备单链的目的。其中，本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒包括的引物如表1。
表1 本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒包括的引物
表2 本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒包括的特异探针
注R＝A或G；杂交质控靶标用于对杂交过程进行质控。
探针(表2)和PCR产物进行杂交的技术及条件对本领域技术人员是已知的。例如杂交条件如下中度严谨条件，即在50-60℃，5×SSC杂交1-2小时后，用溶液2×SSC，0.1％SDS，pH8.0进行洗涤，然后用蒸馏水室温洗涤2分钟。作为高度严谨杂交条件，也可能使用更高的温度进行杂交(例如在65-70℃)。
对于高选择性，优选地是使用相对较低的盐浓度和/或较高的温度条件，例如盐浓度从0.02mol/L到0.15mol/L，温度从50℃到65℃。
在本发明的一个优选实施例中，在检测中使用的是反向杂交技术，即将探针固定在载体上，合适的载体优选地是硅片、用各种功能基团修饰的玻片及用各种功能基团(例如硝基)衍生的膜(例如尼龙膜、硝酸纤维素膜等)，最优选地是带有醛基基团的玻片。将来源于样品的经过标记，优选地是荧光标记的扩增PCR产物变性后，与固定在玻片上的探针进行杂交，在该过程中，根据核酸探针的长度、组成及预期杂合子(即标记的PCR产物与探针的结合)的熔解温度来选择温度、离子强度、pH和其他缓冲液条件(杂交参见Wahl，G.M.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76(1979)3683-3687)。
为了检测待测革兰氏阴性菌株所含耐药基因，应对靶核酸与探针杂交的杂交信号进行分析例如，典型地，杂交信号通过荧光扫描仪，例如GenePix4000B扫描仪(Axon Instruments，Inc.，CA，USA)进行检测，并通过合适软件(例如，Genepix3.0)对杂交信号进行分析。
下面结合实施例进一步阐述本发明。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、利用本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒进行肺炎克雷伯氏菌的耐药基因检测
1、检测目标及引物、探针
本试剂盒的检测目标包括革兰氏阴性菌的耐药基因tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
引物和探针的详细信息如表1，表2。
引物和探针均由上海博亚生物技术公司合成。部分引物5′端的TAMRA荧光标记和探针5′端氨基修饰也由上海博亚生物技术公司完成。
2、革兰氏阴性细菌耐药检测基因芯片的制备
1)带有醛基基团的基质制备
将玻璃基质浸泡于洗液中，室温过夜。用自来水冲洗以洗净玻璃基质上的酸液，蒸馏水冲洗三次，去离子水漂洗一次，再用去离子水冲洗一次。离心甩干玻璃基质，在110℃干燥15分钟，彻底干燥玻璃基质。将玻璃基质浸入1％APTES(异丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中，在室温下用摇床轻摇1小时。用95％乙醇清洗处理过的玻璃基质，先冲洗一次，再漂洗一次。将洗净的玻璃基质放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，关闭通气阀，110℃处理20分钟。然后将凉至室温的玻璃基质浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400mL 12.5％戊二醛溶液100mL 50％的戊二醛，300mL磷酸盐缓冲液(1mol/L NaH2PO430mL，2.628g NaCl)，调pH值到7.0)，室温下轻摇4小时。将玻璃基质从戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去离子水冲洗两次，离心甩干，室温干燥。
2)制备表面固定有探针的玻璃基质(基因芯片)
将表2中的探针溶于50％的DMSO中，终浓度为10μmol/L。采用Cartesian的点样仪(Cartesian Technologies，Inc.，CA，USA)按照图1的样式(11行×9列)点样，除表面化学质控探针PBB-0201090和杂交质控(EC)探针PBB-0204652重复点样6个点外，每种探针每次重复点样3个点，杂交质控靶标不点样。图1中，H表示表面化学质控探针PBB-0201090，O表示作为杂交反应的空白对照50％的二甲基亚砜(DMSO)，P表示杂交质控(EC)探针PBB-0204652，S表示shv通用探针PBB-0201006，m238A表示shv分型探针238位A PBB-0201039，m238S表示shv分型探针238位S PBB-0201013，w238表示shv分型探针238位GPBB-0201012，w240表示shv分型探针240位E PBB-0201014，m240表示shv分型探针240位K PBB-0201015，w35表示shv分型探针35位L PBB-0201016，m35表示shv分型探针35位Q PBB-0201017，w43表示shv分型探针43位R PBB-0201029，m43表示shv分型探针43位S PBB-0201030，w130表示shv分型探针130位SpBB-0201044，m130表示shv分型探针130位G pBB-0201045，w179表示shv分型探针179位D pBB-0201040，m179A表示shv分型探针179位A pBB-0201041，m179N表示shv分型探针179位N pBB-0201042，m179G表示shv分型探针179位GpBB-0201043，9表示ctx-m-9-type通用探针PBB-0201032，1表示ctx-m-1-type通用探针PBB-0201033，T表示tem通用探针pBB-0201027，M表示mox通用探针PBB-0201031，C表示cit通用探针PBB-0201025，D表示dha通用探针PBB-0401031，A表示acc通用探针PBB-0201035，F表示fox通用探针PBB-0201063，E1表示ebc通用探针PBB-0401051，E2表示ebc通用探针PBB-0201036，E3表示ebc通用探针PBB-0201037，N表示阴性对照探针PBB-HC10。
将点好的玻璃基质在室温中放置过夜以干燥玻璃基质，然后室温下将玻璃基质在0.2％的SDS中浸泡两次，每次2分钟，振动。将玻璃基质用去离子水冲洗两次，去离子水漂洗一次，离心甩干。把玻璃基质转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300mL 1×PBS中，再加入100mL无水乙醇)，室温摇床轻摇5分钟。将玻璃基质用去离子水冲洗一次，去离子水漂洗两次，每次1分钟，离心甩干。
3、细菌培养与核酸提取
使用表3中的3株革兰氏阴性细菌菌株进行试验。其中体外药敏试验结果为根据Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)标准方法所得的实验结果。
表3 待检测菌株的已知信息
注a药物CAZ-t头孢他啶；CLA-克拉维酸(固定浓度为4μg/ml；CTX-头孢噻肟；FOX-头孢西丁；IMP-亚胺培南。
bK.pneumoniaeKlebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。
在超净工作台内将细菌划线接种于MH(Mueller Hinton Agar Medium)培养基平板以分离单菌落，将平板在孵箱中倒置，35℃孵育24h。
从培养细菌的MH平板上沾取一单菌落，加到100μl 1×TE中。然后将离心管95℃水浴5min，置4℃备用。
4、核酸扩增
多重不对称PCR反应体系的组成如下1×MasterMix(北京天为时代)；表1中除5′通用加尾序列外的其余10对基因特异性引物(加尾引物0.1μmol/L，不加尾引物0.04μmol/L)；1μL菌液或1μL无菌水(作为空白对照)。反应总体积为25μL。
PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行，采用表4的多重不对称PCR扩增热循环程序。
表4 多重不对称PCR扩增热循环程序
5、芯片杂交及信号检测
杂交反应液的配制如表5所示。
表5 杂交反应液
在杂交盒(HybriCassettesTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)内加入200μl蒸馏水，以防止杂交反应液蒸发，将表面固定有反应物的玻璃基质及盖片(SmartCoverTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)放置于杂交盒中。杂交反应液加热至95℃保持5分钟使PCR产物充分变性后，立即置于冰水混合物中冷却。取13μL杂交反应液通过盖片上的小孔加入盖片和玻璃基质之间的空隙中，盖好杂交盒，54℃杂交90分钟。取出芯片，浸入2×SSC，0.2％ SDS的溶液中，室温摇床轻摇5分钟。再将芯片用去离子水漂洗两次，每次2分钟，离心甩干。
芯片荧光信号采用晶芯LuxScanTM-10K/B激光共聚焦扫描仪及其配套软件(北京博奥生物芯片有限责任公司)检测，检测条件为波长(wavelength)，555nm；PMT，80％；功率(power)，80％。
6、结果分析
芯片杂交结果如图2所示。
E298-芯片检测含tem，ctx-m-3-like，dha-1基因，与测序结果相符，分析该菌株应为对第三代头孢菌素和头孢西丁耐药，而且不被酶抑制剂克拉维酸抑制，与体外药敏试验结果相符合；
BJ-7-芯片检测含shv-2基因，与测序结果相符，分析该菌株应为对第三代头孢菌素和头孢西丁耐药，但对头孢西丁敏感，而且可被酶抑制剂克拉维酸抑制，与体外药敏试验结果相符合；
BJ-35-芯片检测含shv-1基因，与测序结果相符，分析该菌株应为对第三代头孢菌素和头孢西丁敏感，而且可被酶抑制剂克拉维酸抑制，与体外药敏试验结果相符合。
本方法所得的结果与临床常规方法所得的结果(MIC值)高度吻合。这说明本发明所提供的革兰氏阴性细菌耐药检测基因芯片试剂盒可以特异地鉴定检测目标中常见革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌所含检测目标中的耐药基因。
实施例2、利用本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒进行大肠杆菌的耐药基因检测
利用图1的芯片按照实施例1的方法检测大肠杆菌Z302的耐药基因，结果如表4和图3所示，芯片检测含tem，ctx-m-9-like，cit组基因，与测序结果相符，分析该菌株应为对第三代头孢菌素和头孢西丁耐药，而且不被酶抑制剂克拉维酸抑制，本方法所得的结果与临床常规方法所得的结果(MIC值)高度吻合。这说明本发明所提供的革兰氏阴性细菌耐药检测基因芯片试剂盒可以特异地鉴定检测目标中常见革兰氏阴性细菌大肠杆菌中所含检测目标中的耐药基因。
表4 待检测菌株的已知信息
注a药物CAZ-t头孢他啶；CLA-克拉维酸(固定浓度为4μg/ml；CTX-头孢噻肟；FOX-头孢西丁；IMP-亚胺培南。
实施例3、利用本发明的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒进行阴沟肠杆菌的耐药基因检测
利用图1的芯片按照实施例1的方法检测阴沟肠杆菌TR3104的耐药基因，结果如表5和图4所示，芯片检测含tem，ctx-m-3-like和染色体介导的EBC组基因，与测序结果相符，分析该菌株应为对第三代头孢菌素CTX和头孢西丁耐药，本方法所得的结果与临床常规方法所得的结果(MIC值)高度吻合。这说明本发明所提供的革兰氏阴性细菌耐药检测基因芯片试剂盒可以特异地鉴定检测目标中常见革兰氏阴性细菌阴沟肠杆菌中所含检测目标中的耐药基因。
表5 待检测菌株的已知信息
注a药物CAZ-t头孢他啶；CLA-克拉维酸(固定浓度为4μg/ml；CTX-头孢噻肟；FOX-头孢西丁；IMP-亚胺培南。
序列表
<160>52
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<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
tttttttttt ttggaatggc ggtattcagc gta 33
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
tttttttttt ttttcgtctc ccagctgtcg g 31
<210>25
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
tttttttttt ttcgccttgt catccagctg ca 32
<210>26
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
tttttttttt ttgctttatc cctaacgtca tcggg 35
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
tttttttttt tttgtgatcc ccttccact 29
<210>28
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
tttttttttt tttactcagc gaacccactt ca 32
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
tttttttttt ttagggaggc gttatccgt 29
<210>30
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>30
tttttttttt tttagagccc agctcaaaca g 31
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>31
tttttttttt ttcaaggttt gtggagtgac ag 32
<210>32
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>32
tttttttttt ttcggtgtgg gtcagcgcga tc 32
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>33
tttttttttt ttggctggtt tatcgccgat a 31
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>34
tttttttttt ttcggagctg gccagcgggg t 31
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>35
tttttttttt ttcggagcta gccagcgggg t 31
<210>36
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(25)
<223>r＝a或g
<400>36
tttttttttt ttcggagctg cccarcgggg t 31
<210>37
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>37
tttttttttt ttcggagctc gcgagcgggg t 31
<210>38
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38
tttttttttt ttcggagctc gcaagcgggg t 31
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>39
tttttttttt ttaattaaac taagcggaag cc 32
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>40
tttttttttt ttaattaaac aaagcggaag cc 32
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>41
tttttttttt tttgtcgggc cgcctaggca t 31
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>42
tttttttttt tttgtcgggc agcctaggca t 31
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>43
tttttttttt ttcattacca tgagcgctaa cag 33
<210>44
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>44
tttttttttt ttcattacca tgggcgctaa cag 33
<210>45
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>45
tttttttttt ttgacgcccg cgaccccact a 31
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>46
tttttttttt ttgacgcccg cgcccccact a 31
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>47
tttttttttt ttgacgcccg caaccccact a 31
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>48
tttttttttt ttgacgcccg cggccccact a 31
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>49
tcacttgctt ccgttgagg 19
<210>50
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>50
tttttttttt ttcctcaacg gaagcaagtg at 32
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>51
atcacttgct tccgttgagg20
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>52
tttttttttt ttcaagcagc cac2权利要求
1、革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒，包括扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对，和检测所述革兰氏阴性菌菌株耐药基因探针；
所述扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50个核苷酸，优选为15-35个核苷酸；所述扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对中的正向引物或反向引物的5’端连接上通用加尾序列；所述通用加尾序列的5’端被荧光标记；被连接上所述通用加尾序列的正向引物或反向引物的5’端被荧光标记；所述通用加尾序列具有序列表中序列1的核苷酸序列；
所述检测革兰氏阴性菌菌株耐药基因探针的大小均为15-50个核苷酸；所述探针的5’端连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-18个寡聚dT。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述待测革兰氏阴性细菌菌株包括大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。
3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述耐药基因包括tem，shv，ctx-m-1-type，ctx-m-9-type，mox，cit，dha，acc，ebc和fox。
4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于扩增所述tem的正向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列；扩增所述shv的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列5的核苷酸序列；扩增所述ctx-m-1-type的正向引物具有序列表中序列6的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列7的核苷酸序列；扩增所述
ctx-m-9-type的正向引物具有序列表中序列8的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列9的核苷酸序列；扩增所述mox的正向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列；扩增所述cit的正向引物具有序列表中序列12的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列13的核苷酸序列；扩增所述dha的正向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列15的核苷酸序列；扩增所述acc的正向引物具有序列表中序列16的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列17的核苷酸序列；扩增所述ebc的正向引物具有序列表中序列18的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列19的核苷酸序列；扩增所述fox的正向引物具有序列表中序列20的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列21的核苷酸序列。
5、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括表面化学质控探针，杂交质控探针，阴性对照探针和所述杂交质控探针的靶标；所述探针的大小均为15-35个核苷酸；所述杂交质控探针和阴性对照探针的5’端均连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-18个寡聚dT。
6、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测耐药基因探针包括tem通用探针，shv通用探针，ctx-m-1-type通用探针，ctx-m-9-type通用探针，mox通用探针，cit通用探针，dha通用探针，acc通用探针，ebc通用探针和fox通用探针及shv分型探针；所述shv分型探针由检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针和检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针。
7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述tem通用探针具有序列表中序列22的核苷酸序列；所述shv通用探针具有序列表中序列33的核苷酸序列；所述ctx-m-1-type通用探针具有序列表中序列24的核苷酸序列；所述
ctx-m-9-type通用探针具有序列表中序列23的核苷酸序列；所述mox通用探针具有序列表中序列25的核苷酸序列；所述cit通用探针具有序列表中序列26的核苷酸序列；所述dha通用探针具有序列表中序列27的核苷酸序列；所述acc通用探针具有序列表中序列28的核苷酸序列；所述ebc通用探针具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；所述fox通用探针具有序列表中序列32的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列34的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列35的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列36的核苷酸序列；所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列37的核苷酸序列；所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列38的核苷酸序列；所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列39的核苷酸序列；所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列40的核苷酸序列；所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列41的核苷酸序列；所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列42的核苷酸序列；所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列43的核苷酸序列；所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列44的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列45的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列46的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列47的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列48的核苷酸序列。
8、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述表面化学质控探针具有序列表中序列49的核苷酸序列，杂交质控探针具有序列表中序列50的核苷酸序列，杂交质控探针的靶标具有序列表中序列51的核苷酸序列，阴性对照探针具有序列表中序列52的核苷酸序列。
9、根据权利要求1至8中任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于所述探针固定于载体上。
10、根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述载体为硅片、用功能基团修饰的玻片或用功能基团衍生的膜。
11、根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于所述载体为带有醛基基团的玻片。
12、根据权利要求1至8中任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括进行PCR反应和分子杂交的反应液，和50％的二甲基亚砜。
13、利用权利要求1-12中任一权利要求所述的革兰氏阴性细菌耐药基因检测试剂盒进行革兰氏阴性细菌耐药基因检测的方法，包括以下步骤
1)利用所述试剂盒中的引物PCR扩增待测革兰氏阴性细菌菌株的耐药基因；
2)将步骤1)得到的扩增产物与所述试剂盒中的检测革兰氏阴性菌耐药基因探针进行杂交，确定待测革兰氏阴性细菌菌株所含耐药基因。
14、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR为多重不对称PCR。
15、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对中的两条正反向引物浓度均相同。
16、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测革兰氏阴性细菌菌株耐药基因的引物对中的两条正反向引物中，5’端连接上所述5′通用加尾序列的一条引物的浓度是另一条引物的1-100倍，优选为2.5倍。
17、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述PCR扩增温度循环分为两个阶段第一阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-25个温度循环；第二阶段的每个温度循环由变性和延伸两个步骤组成，包括10-25个温度循环。
18、根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述第二阶段的延伸温度为60-80℃，优选为70℃。
19、革兰氏阴性细菌耐药基因检测芯片，包括tem通用探针，shv通用探针，ctx-m-1-type通用探针，ctx-m-9-type通用探针，mox通用探针，cit通用探针，dha通用探针，acc通用探针，ebc通用探针和fox通用探针及shv分型探针；所述shv分型探针由检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针、检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针和检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针。
20、根据权利要求19所述的芯片，其特征在于所述tem通用探针具有序列表中序列22的核苷酸序列；所述shv通用探针具有序列表中序列33的核苷酸序列；所述ctx-m-1-type通用探针具有序列表中序列24的核苷酸序列；所述
ctx-m-9-type通用探针具有序列表中序列23的核苷酸序列；所述mox通用探针具有序列表中序列25的核苷酸序列；所述cit通用探针具有序列表中序列26的核苷酸序列；所述dha通用探针具有序列表中序列27的核苷酸序列；所述acc通用探针具有序列表中序列28的核苷酸序列；所述ebc通用探针具有序列表中序列29或30或31的核苷酸序列；所述fox通用探针具有序列表中序列32的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列34的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列35的核苷酸序列；所述检测自氨基端第238位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列36的核苷酸序列；所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为E的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列37的核苷酸序列；所述检测自氨基端第240位氨基酸残基为K的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列38的核苷酸序列；所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为L的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列39的核苷酸序列；所述检测自氨基端第35位氨基酸残基为Q的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列40的核苷酸序列；所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为R的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列41的核苷酸序列；所述检测自氨基端第43位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列42的核苷酸序列；所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为S的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列43的核苷酸序列；所述检测自氨基端第130位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列44的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为D的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列45的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为A的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列46的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为N的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列47的核苷酸序列；所述检测自氨基端第179位氨基酸残基为G的SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的探针具有序列表中序列48的核苷酸序列。
21、根据权利要求19或20所述的芯片，其特征在于所述芯片还包括表面化学质控探针，杂交质控探针和阴性对照探针；所述探针的大小均为15-35个核苷酸；所述杂交质控探针和阴性对照探针的5’端均连接上10-35个寡聚dT，优选连接上12-18个寡聚dT。
全文摘要
本发明公开了一种革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法及其专用芯片与试剂盒。该试剂盒包括扩增待测革兰氏阴性细菌菌株的耐药基因的引物对，和检测所述革兰氏阴性菌菌株的耐药基因探针。利用该试剂盒进行耐药基因检测的方法，包括1)利用试剂盒中的引物PCR扩增待测菌株的耐药基因；2)将扩增产物与所述检测革兰氏阴性菌耐药基因探针进行杂交，确定待测菌株所含耐药基因。本发明的试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高，应用范围广，特异性高，检测结果稳定，可靠性高的特点。
文档编号C12Q1/18GK1840693SQ200610001309
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月18日 优先权日2006年1月18日
发明者祝令香, 张治位, 蒋迪, 杜宁, 王璨, 杨华卫, 张琼, 高华方, 周玉祥, 程京 申请人:北京博奥生物芯片有限责任公司, 清华大学