专利名称：赋予植物调节的植物生长速率和生物量的核苷酸序列及相应多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离的核酸分子及其编码的相应多肽，所述核酸分子和多肽能够在植物中调节植物生长速率、营养生长、器官尺寸、构造幼苗活力(architecture seedling vigor)和/或生物量。本发明还涉及使用核酸分子和多肽制备与相似条件下生长的野生型植物相比，具有调节的生长速率、营养生长、器官数、构造(architecture)、幼苗活力和/或生物量的转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子。
背景技术：
可以使用分子技术获得明确改进用于农业、园艺、生物量转化和其他工业(例如造纸工业，植物作为蛋白质或其他化合物的生产工厂)的植物。例如，调节植物的整体尺寸或其任何器官的尺寸或其任何器官的数量可获得巨大的农业价值。
类似地，调节整株植物的尺寸和高度、或植物的特定部分、或生长速率、或幼苗活力可以生产更适合于具体工业的植物。例如，通过允许更容易的收获，降低特定作物和树种的高度可以是有益的。或者，通过提供可用于加工成食物、饲料、燃料和/或化学品的更多的生物量，增加高度、厚度或器官尺寸、器官数可以是有益的(见美国能源部网站有关的能效和可再生能源)。商业上想要的性状的其他实例包括提高切花花茎的长度、提高或改变叶的尺寸和形状，或增大种子和/或果实的尺寸。器官尺寸、器官数和生物量的变化也导致组分分子(如次级产物)的质量改变并将植物转化为生产这些化合物的工厂。
动物和人类赖以为生的食物和饲料的可再生流动的获得与维持，在贯穿人类文明的历史中非常重要，并且成为农业的起源。农业科学、农业、农作物科学、园艺学和森林科学领域的专家和研究人员甚至在今天仍致力于发现和生产具有提高的生长潜能的植物，以供养增加的世界人口和保证可再现原材料的供应。在这些领域中的科学的坚实的研究水平表明，世界上每个地理环境和气候中领导者对于为人类提供可持续的食品、饲料、化学品和能源来源所赋予的重要性水平。
作物性能的控制已经通过植物育种常规地进行了数个世纪。然而育种过程是既耗时又费力的。另外，对于各有关的植物物种必须特定地设计适当的育种程序。
另一方面，在使用分子遗传方法控制植物以提供更好的作物中获得了长足的进步。通过在植物中引入和表达重组的核酸分子，研究人员目前准备好了提供给社会下述植物物种，所述植物物种被改造为即使在特定的地理和/或气候环境下也能更有效地生长和生产更多的产物。这些新的方法具有不局限于一个植物物种而是可应用于多个不同植物物种的优点(Zhang等人(2004)Plant Physiol.135615)。
尽管有该进展，但是今天持续存在对可普遍应用的方法的巨大需要，所述方法改进森林或农业植物生长，以适应特定环境条件所决定的具体的需要。为此，本发明涉及有利地控制植物尺寸、器官数、植物生长速率、植物构造和/或生物量，以根据利益寻求(benefit sought)和作物必须生长的具体环境来最大化多种作物的益处，其特征在于在植物中表达重组的DNA分子。这些分子可来自于植物自身并简单地以更高或更低水平表达，或所述分子可来自不同的植物物种。
发明概述 因此，本发明涉及分离的核酸分子和多肽，及其在制备下述转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子中的用途，所述转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子与相似或相同条件下生长的野生型植物相比具有改变的生命周期，尤其是植物尺寸、营养生长、植物生长速率、器官数、植物构造和/或生物量。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
附图概述
图1.Lead 29(ME04717)，SEQ ID NO.93的同源物的氨基酸序列比对。保守区包在框中。共有序列在比对下方显示。
图2.Lead 36(ME03195)，SEQ ID NO.99的同源物的氨基酸序列比对。保守区包在框中。共有序列在比对下方显示。
图3.Lead 15(ME04077)，SEQ ID NO.81的同源物的氨基酸序列比对。保守区包在框中。共有序列在比对下方显示。
图4.Lead ME04012，SEQ ID NO.110的同源物的氨基酸序列比对。保守区包在框中。共有序列在比对下方显示。
图5.Lead克隆691319，SEQ ID NO.104的同源物的氨基酸序列比对。保守区包在框中。共有序列在比对下方显示。
发明详述 1.本发明 本申请的发明可以通过以下示范性实施方案描述，但不必须仅限于此。
本发明公开了新的分离的核酸分子，干扰这些核酸分子的核酸分子，与这些核酸分子杂交的核酸分子，和由于DNA密码子的简并性而编码相同蛋白质的分离的核酸分子。本发明的其他的实施方案还包括本发明的分离的核酸分子所编码的多肽。
更具体地，本发明的核酸分子包括(a)编码氨基酸序列的核苷酸序列，其与Lead15、28、29、36、ME04012和克隆691319(分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103)中任一个至少85％相同的，(b)与根据(a)的核苷酸序列中任一个互补的核苷酸序列，(c)根据任一SEQ IDNo.80、90、92、98、109和103的核苷酸序列，(d)当以5’到3’方向阅读时，与根据(c)的任一核苷酸序列反向的核苷酸序列，(e)能够干扰根据(a)的核苷酸序列中任一个的核苷酸序列，(f)在比杂交核酸双链体的解链温度低约40℃到约48℃的温度下能够与根据段落(a)-(e)中任一个的核酸形成杂交核酸双链体的核苷酸序列，和(g)编码Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319(分别对应于SEQ ID No.81、91、93、99、110和104)的氨基酸序列中任一个的核苷酸序列。
本发明的其他实施方案包括SEQ ID No.80、81、90、91、92、93、98、99、109、110、103和104中公开的那些多肽和核酸分子序列。
本发明还涉及包含第一核酸和第二核酸的载体，所述第一核酸具有编码植物转录和/或翻译信号的核苷酸序列，所述第二核酸具有根据本发明的分离的核酸分子的核苷酸序列。更具体地，所述第一和第二核酸可以有效连接。进一步更具体地，所述第二核酸对第一生物可以是内源的，且载体中任何其他核酸对第二生物可以是内源的。最具体地，所述第一和第二生物可以是不同的物种。
在本发明的另一实施方案中，宿主细胞可包含根据本发明的分离的核酸分子。更具体地，存在于本发明的宿主细胞中的本发明的分离的核酸分子对第一生物可以是内源的，并可以侧接对第二生物是内源的核苷酸序列。另外，第一生物和第二生物可以是不同的物种。进一步更具体地，本发明的宿主细胞可包含根据本发明的载体，所述载体自身包含根据本发明的核酸分子。
在本发明的另一实施方案中，本发明的分离的多肽可另外包含与Lead15、28、29、36、ME04012和克隆691319(分别对应于SEQ ID No.81、91、93、99、110和104)中任一个至少85％相同的氨基酸序列。
本发明的其他实施方案包括将本发明的分离的核酸引入宿主细胞中的方法。更具体地，本发明的分离的核酸分子可以在下述条件下与宿主细胞接触，所述条件允许将分离的核酸转运进宿主细胞中。进一步更具体地，在本发明前述实施方案中所述的载体可以通过相同方法引入宿主细胞中。
也可以获得作为本发明实施方案的检测方法。具体地，用于检测样品中本发明的核酸分子的方法。更具体地，根据本发明的分离的核酸分子可以在下述条件下与样品接触，所述条件允许将分离的核酸分子的核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列比较。然后考虑这类分析的结果，以确定本发明的分离的核酸分子是否是可检测的，从而确定其是否存在于样品中。
本发明的另一实施方案包括植物、植物细胞、植物材料或植物种子，其包含本发明的分离的核酸分子和/或载体。更具体地，本发明的分离的核酸分子对所述植物、植物细胞、植物材料或植物种子可以是外源的。
本发明的另一实施方案包括从本发明的植物细胞或种子再生的植物。更具体地，从本发明的植物、植物细胞、植物材料或植物种子衍生的植物与在相同条件下培养的野生型植物相比，优选地具有增加的尺寸(整株或部分)、增加的营养生长、增加的器官数和/或增加的生物量(有时在下文中统称为增加的生物量)、致死率、不育性或观赏特征。另外，转基因植物可包含本发明的第一个分离的核酸分子(其编码涉及调节生长和表型特征的蛋白质)和第二个分离的核酸分子(其编码能够驱动在植物中表达的启动子)，其中所述生长和表型调节组件与所述启动子有效连接。更优选地，第一个分离的核酸可以在本发明的转基因植物中异常表达(mis-expressed)，并且当转基因植物和祖先植物(progenitor plant)在相同的环境条件下培养时，转基因植物显示与没有该基因的祖先植物相比被调节的特征。在本发明的另一实施方案中，被调节的生长和表型特征可以归因于使用例如干扰RNA将具体序列灭活。
另一实施方案由包含本发明的分离的核酸分子的本发明的植物、植物细胞、植物材料或植物种子组成，其中来自所述植物、植物细胞、植物材料或植物种子的一种或多种植物与在相同条件下培养的野生型植物相比，具有调节的生长和表型特征。
赋予增加的生物量或活力的多核苷酸可以在本发明的转基因植物中异常表达，且当转基因植物与祖先植物在相同的环境条件下培养时，转基因植物与缺乏该多核苷酸的祖先植物相比显示增加的生物量或活力。在本发明的另一实施方案中，增加的生物量或活力表型可以归因于使用例如干扰RNA将具体序列灭活。
另一实施方案由包含本发明的分离的核酸分子的本发明的植物、植物细胞、植物材料或植物种子组成，其中衍生自所述植物、植物细胞、植物材料或植物种子的植物与在相同条件下培养的野生型植物相比，具有增加的生物量和活力。
本发明的另一实施方案包括在植物中增强生物量或活力的方法。更具体地，这些方法包括用本发明的分离的核酸分子转化植物。优选地，该方法是在转化的植物中增加生物量或增强活力的方法，其中所述植物用编码本发明的多肽的核酸分子转化。
本发明的多肽含有共有序列。共有序列是图1-5中所示的共有序列。
2.定义 在该申请通篇中使用以下术语 生物量本文所使用的“生物量”是指包含目的产物的有用的生物材料，所述材料要被收集并且旨在进行进一步加工，以分离或浓缩目的产物。“生物量”可包括果实或其部分或种子、叶或茎或根(当其是就工业目的而言尤其感兴趣的植物部分时)。“生物量”涉及植物材料时，包括含有或代表目的产物的任何一种或多种植物构造。
转化可以完成转化的手段的实例在下文中描述，并包括农杆菌介导的转化(双子叶植物(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)852444)，单子叶植物(Yamauchi等人(1996)Plant Mol Biol.30321-9；Xu等人(1995)PlantMol.Biol.27237；Yamamoto等人(1991)Plant Cell 3371)和生物射弹方法(P.Tijessen，“Hybridization with Nucleic Acid Probes”In LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，P.C.vand der Vliet编著，c.1993，Elsevier，Amsterdam)、电穿孔、植物中(in planta)技术等等。含有外源核酸的这类植物在本文中作为原始的转基因植物而言称作T0，作为第一代而言称作T1。
功能可比较的(comparable)蛋白质或功能同源物该术语描述了具有至少一个共有的功能特征的蛋白质。这类特征包括序列相似性、生物化学活性、转录模式相似性和表型活性。一般而言，功能可比较的蛋白质共有一些序列相似性或至少一种生物化学活性。在该定义中，类似物被认为是功能可比较的。另外，功能可比较的蛋白质通常共有至少一种生物化学和/或表型活性。
功能可比较的蛋白质会导致同一特征达到相似但不必须相同的程度。一般而言，当可比较的物体之一的定量测量为另一的至少20％；更一般地在30％到40％之间；进一步更一般地在50-60％之间；进一步更一般地在70％到80％之间；进一步更一般地在另一个的90％到100％之间时，可比较的蛋白质给出相同的特征。
异源序列“异源序列”是天然不彼此有效连接或不连续的序列。例如，来自玉米的启动子被认为对拟南芥(Arabidopsis)编码区序列是异源的。另外，来自玉米生长因子编码基因的启动子被认为对于编码玉米生长因子受体的序列而言是异源的。天然中不起源于作为编码序列的相同基因的调节元件序列(如UTR或3’端终止序列)被认为对于所述编码序列而言是异源的。天然有效连接和彼此连续的元件彼此不是异源的。另一方面，如果其他填充序列被置于这些相同的元件之间，则它们虽然仍然有效连接，但是成为异源的。因此，表达氨基酸转运蛋白的玉米基因的启动子和编码序列彼此不是异源的，但是以新方式有效连接的玉米基因的启动子和编码序列是异源的。
异常表达术语“异常表达”是指与野生型相比，编码区转录成为互补RNA序列的提高或降低。该术语还包括与野生型相比，在不同的时间段中和/或来自植物基因组中非天然位点(包括来自不同植物物种或来自非植物生物的基因或编码区)的基因或编码区的表达和/或翻译，或这类转录和/或翻译的抑制。
序列同一性百分比本文所使用的术语“序列同一性百分比”是指任何给定查询序列和目的序列(subject sequence)之间的同一性程度。使用计算机程序ClustalW(1.83版本，默认参数)将查询核酸或氨基酸序列与一个或多个目的核酸或氨基酸序列比对，所述计算机程序允许在核酸或蛋白质序列的整个长度上进行比对(全局比对)。
ClustalW计算查询序列和一个或多个受试序列之间的最佳匹配，并对它们进行比对，从而能够测定同一性、相似性和差异。可以向查询序列、受试序列或该二者中插入一个或多个残基的缺口，以最大化序列比对。对核酸序列的快速配对比对而言，使用以下的默认参数字段长度(wordsize)2；窗口尺寸4；记分法百分比；顶部对角线数(number of topdiagonal)4；和缺口罚分5。对于核酸序列的多重比对而言，使用以下的参数缺口打开罚分10.0；缺口延伸罚分5.0；权重转换是。对于蛋白质序列的快速配对比对而言，使用以下的参数字段长度1；窗口尺寸5；记分法百分比；顶部对角线数5；和缺口罚分3。对于蛋白质序列的多重比对而言，使用以下的参数权重矩阵(weight matrix)blosum；缺口打开罚分10.0；缺口延伸罚分0.05；亲水缺口开；亲水残基Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异的缺口罚分开。输出的是反映序列之间相互关系的序列比对。ClustalW可以在环球网上的例如Baylor College of Medicine Search Launcher网页上和EuropeanBioinformatics Institute网页上运行。
在功能同源物搜索的情况下，为了确保受试序列具有与查询序列相同的功能，比对必须沿着查询序列长度的至少80％，使得查询序列的大部分被受试序列覆盖。为了测定查询序列和受试序列之间的同一性百分比，ClustalW用最佳比对中的同一数除以比较的残基数(排除缺口位置)，并将结果乘以100。输出值是受试序列相对于查询序列的同一性百分比。注意到同一性百分比值可以被近似至最接近的十分位。例如，78.11，78.12，78.13和78.14被近似为78.1，而78.15，78.16，78.17，78.18和78.19被接近至78.2。
调节区术语“调节区”是指核苷酸序列，其与序列有效连接时影响所述序列的转率起始或翻译起始或转录终止，以及所述过程的速率，和/或转录或翻译产物的稳定性和/或迁移率。本文所使用的术语“有效连接”是指放置调节区与所述序列使得能够产生所述影响。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列和内含子。调节区可以被分为两类启动子和其他调节区。
幼苗活力本文所使用的“幼苗活力”是指植物特性，其中植物与相似条件下的野生型或对照相比，更快地从土壤中萌发、具有提高的发芽率(即萌发更快)、具有更快和更大的幼苗生长和/或在寒冷条件下萌发更快。幼苗活力通常被定义为包括下述种子性质，所述性质确定了“在广泛的田间条件下正常幼苗快速、均一萌发和发育的能力”。
严格度本文所使用的“严格度”是核酸分子探针长度、核酸分子探针组成(G+C含量)、盐浓度、有机溶剂浓度和杂交温度和/或洗涤条件的函数。严格度一般由参数Tm测量，是与Tm偏差的温度，所述Tm是杂交实验中50％的互补核酸分子杂交的温度。高严格度条件是提供Tm-5℃到Tm-10℃的条件的那些。中等或适中严格度条件是提供Tm-20℃到Tm-29℃的条件。低严格度条件是提供Tm-40℃到Tm-48℃的条件的那些。杂交条件和Tm(以℃计)之间的关系以下述数学等式表达 Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)(I) 其中N是核酸分子探针的核苷酸数。该等式适用于与靶序列相同的长度为14到70个核苷酸的探针。下述针对DNA-DNA杂交体的Tm的等式适用于具有50到大于500个核苷酸范围内长度的探针，和包含有机溶剂(甲酰胺)的条件 Tm＝81.5+16.6log{[Na+]/(1+0.7[Na+])}+0.41(％G+C)-500/L0.63(％甲酰胺) (II) 其中L表示杂交体中探针的核苷酸数(21)。等式II的Tm受杂交体性质的影响对于DNA-RNA杂交体而言，Tm比计算值高10-15℃；对RNA-RNA杂交体而言，Tm高20-25℃。因为使用长探针时，同源性每降低1％时Tm降低约1℃(Frischauf等人(1983)J.Mol Biol，170827-842)，所以可以调节严格度条件以帮助相同基因或相关家族成员的检测。
等式II是假定反应是平衡的而推出的。因此，本发明的杂交最优选在下述条件下进行探针过量并允许足够的时间以达到平衡。可以通过使用杂交缓冲液来缩短达到平衡需要的时间，所述杂交缓冲液包含杂交加速剂如硫酸葡聚糖或另一种高容积(volumn)多聚体。
杂交反应期间或杂交发生之后，可以通过改变洗涤溶液的盐和温度条件来控制严格度。上述式子在用于计算洗涤溶液的严格度时是等效的。优选的洗涤溶液严格度位于上述范围内高严格度低于Tm5-8℃，中等或适中严格度低于Tm26-29℃，低严格度低于Tm45-48℃。
T0术语“T0”是指用接种转化培养基的整株植物、外植体或愈伤组织。
T1术语T1在整株植物转化的情况下是指T0植物的子代，或在外植体或愈伤组织转化的情况下是指再生的幼苗。
T2术语T2是指T1植物的子代。T2子代是T1植物自体受精或异花传粉的结果。
T3术语T3是指下述植物的第二代子代，所述植物是转化实验的直接结果。T3子代是T2植物自花受精或异花传粉的结果。
3.本发明的多核苷酸和多肽的重要特性 本发明的多核苷酸和多肽是感兴趣的，因为当核酸分子被异常表达(即在非天然位点表达，或相对于野生型以被提高或降低的量表达)时它们产生下述植物，所述植物显示与野生型植物相比具有调节的生物量、生长速率或幼苗活力，如下文公开的多个实验的结果所证实。该形状可以被用于开发或最大化植物产品。例如，本发明的核酸分子和多肽被用于提高基因的表达，这引起植物具有调节的生物量、生长速率或幼苗活力。
因为公开的序列和方法提高营养生长和生长速率，所以公开的方法能够用于增加生物量的生产。例如，营养性生长的植物与下述植物相比具有增加的生物量生产，所述植物是相同物种但是未经遗传修饰为主要是营养生长。生物量生产提高的实例包括与并非营养生长的相同物种植物的生物量生产量相比，至少5％、至少20％、或甚至至少50％的提高。
本发明Lead 36的序列及其功能类似物尤其给被转化的植物提供了增强的产率(包括果实产率和每英亩产率)、轻微早熟和更紧密的结构(morecompact stature)(20％、30％、40％或60％更紧密)与更短的茎，但是没有提供成比例降低的生物量。在马铃薯中，这导致在更紧密的植物上具有提高的植物果实产率。在稻中，这导致植物具有提高的分蘗量。本发明的Lead 29的序列及其功能同源物尤其给被转化的植物提供了增加的产率(包括果实产率和每英亩产率)、轻微早熟和更紧密的结构(20％、30％、40％或60％更紧密)与更短的茎。在马铃薯中这导致在更紧密的植物上具有提高的植物果实产率。在稻中，这导致植物具有提高的分蘗量。本发明的Lead 15和28的序列及其功能同源物尤其给被转化的植物提供了增加的产率，包括果实产率和每英亩产率。在马铃薯中这导致在更紧密的植物上具有提高的植物果实产率。在稻中，这导致植物具有提高的分蘗量。
开花植物的生命周期一般可以被分为三个生长期营养期、花序期和花期(晚花序期)。在营养期中，顶端分生组织(SAM)产生叶，所述叶之后会保证生产能育子代所需的资源。接受到合适的环境和发育信号后，植物转入花生长或生殖生长，SAM进入花序期(I)并产生带有花原基的花序。在该期中，SAM和叶腋中产生的次级枝(secondary shoot)的命运由一组分生组织鉴定基因(meristem identity gene)确定，所述基因中一些阻止花分生组织的发育，一些促进花分生组织的发育。确立之后，植物进入后花序期(Xu等人(1995)Plant Mol.Biol.27237)，在该期中产生花器官。如果植物转入花生长或生殖生长的适当环境和发育信号被破坏，则植物不能够进入生殖生长，因此维持营养生长。
种子或幼苗活力是通常能够显著影响植物(如作物植物)成功生长的重要特性。不利的环境条件(如干燥、潮湿、冷或热条件)能够影响植物生长周期，和种子的活力(即在这类条件下的生活力和强度能够在成功和失败的作物生长之间区分)。幼苗活力通常被定义为包括下述种子性质，所述性质确定了“在广泛的田间条件下正常幼苗快速、均一萌发和发育的能力”。因此，开发具有提高的活力的植物种子会是有利的。
例如，提高的幼苗活力对于谷类植物如稻、玉米、小麦等生产会是有利的。对这些作物而言，通常通过在种植季节降低环境温度来减缓或停止生长。另外，稻的快速萌发和分蘗会允许栽培者开始更早的灌溉，这会省水并防止弱生长。因此，寻找稻中与提高的种子活力和/或冷耐性相关的基因，以产生改进的稻变种。见例如Pinson，S.，“Molecular Mapping ofSeedling Vigor QTLs in Tropical Rice”，USDA Agricultural ResearchService，2000年12月16日。
幼苗活力已经通过不同的测试和实验测量，包括最一般的冷耐受测试和加速老化测试。
本发明的一些核苷酸序列编码碱性-螺旋-环(bHCH)转录因子。已知转录因子通常控制一个途径中多个基因的表达。碱性/螺旋-环-螺旋(BHLH)蛋白质是作为二聚体与特异DNA靶位点结合的转录因子超家族。bHLH转录因子已经在非植物的真核生物中进行了详细表征，并已被鉴定为不同的生物学过程中重要的调节组件。已经鉴定了这些蛋白质在动物中的许多不同的功能，包括控制通常涉及同源二聚体形成和异源二聚体形成的细胞增殖和转录。植物转录因子的R/B碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族的成员涉及多种生长和分化过程。
碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)是一种蛋白质结构基序，其表征了一个转录因子家族。该基序的特征在于通过环连结的两个α螺旋。该类型的转录因子通常是二聚体的，各带有一个含碱性氨基酸残基的螺旋，所述碱性氨基酸残基促进DNA结合。一个螺旋通常较小，并由于环的柔性而允许通过与另一螺旋折叠和装填(packing)形成二聚体。较大的螺旋通常含有DNA结合区。BHLH蛋白质通常与称作E-盒的共有序列CANNTG结合。规范的E-盒是CACGTG，然而一些bHLH转录因子与不同的序列结合，所述不同的序列常与E-盒类似。bHLH转录因子在发育或细胞活性中常是重要的。
4.本发明的多核苷酸/多肽 本发明的多核苷酸和通过翻译这些多核苷酸表达的蛋白质在序列表中公开，具体为SEQ ID NO.80、81、90、91、92、93、98、99、109、110、103和104。序列表也由功能可比较的蛋白质组成。包含共有序列之一中的或共有序列之一定义的序列的多肽可以就本发明的目的使用，即用于制备具有调节的生物量、生长速率和/后幼苗活力的转基因植物。
5.多核苷酸制备转基因植物的用途 为了使用本发明的序列或其组合或其部分和/或突变体和/或融合物和/或变体，制备重组的DNA构建体，所述DNA构建体包含插入载体中的本发明的多核苷酸序列并且适用于转化植物细胞。构建体可以使用标准重组DNA技术(见Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory印制，1989，New York.)制备，并可以通过例如农杆菌介导的转化或通过其他转化手段(例如下文所公开的)被引入目的植物物种中。
载体主链可以是本领域一般使用的任何载体，例如质粒，病毒，人工染色体，BAC，YAC，PAC和载体，如例如细菌-酵母穿梭载体、λ噬菌体载体、T-DNA融合载体和质粒载体(见Shizuya等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，898794-8797；Hamilton等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，939975-9979；Burke等人(1987)Science，236806-812；Sternberg N.等人(1990)Proc Natl Acad Sci美国.，87103-7；Bradshaw等人(1995)Nucl Acids Res，234850-4856；Frischauf等人(1983)J.MolBiol，170827-842；Huynh等人，Glover NM(编著)DNA CloningApractical Approach，第1卷OxfordIRL印制(1985)；Walden等人(1990)Mol Cell Biol 1175-194)。
通常，构建体包含含本发明核酸分子的载体，所述载体具有任何想要的转录和/或翻译调节序列，如例如启动子、UTR和3’端终止序列。载体可还包含例如复制起点、支架附着区(SAR)、标记物、同源序列和内含子。载体可还包含赋予植物细胞可选择表型的标记物基因。标记物可优选地编码杀生物剂抗性形状，尤其是抗生素抗性(如针对例如卡那霉素、博来霉素或潮霉素的抗性)或除草剂抗性(如针对例如草甘膦、氯磺隆(chlorosulfuron)或草酊磷(phosphinotricin)的抗性)。
应当理解多于一种调节区可存在于重组多核苷酸中，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。因此，多于一种调节区可以与所述序列有效连接。
为了将启动子序列与序列“有效连接”，一般可以将所述序列的翻译读码框的翻译起点置于启动子下游一个和约十五个核苷酸之间。然而，启动子可以被置于翻译起点上游差不多约5,000个核苷酸处，或转录起点上游约2,000个核苷酸处。启动子一般包含至少一个核心(基本)启动子。启动子还可以包含至少一个控制元件，如增强子序列、上游元件或下游激活区(UAR)。例如，合适的增强子是章鱼碱合酶(ocs)基因上游区域(-212到-154)的顺式调节元件。Fromm等人，The Plant Cell 1977-984(1989)。
基本启动子是转录起始所需的转录复合物装配必需的最小序列。基本启动子常常包含可位于转录起始位点上游约15个到约35个核苷酸之间的“TATA盒”元件。基本启动子还可包含“CCAAT盒”元件(一般为序列CCAAT)和/或GGGCG序列，其可位于转录起点上游约40和约200个核苷酸之间，一般为上游约60到约120个核苷酸之间。
待包含的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、选择性、可诱导性、期望的表达水平和细胞或组织优先表达。通过适当地选择和放置与所述序列相关的启动子和其他调节区来调节序列的表达对本领域技术人员而言是常规问题。
一些合适的启动子仅在或主要在某些细胞类型中起始转录。例如，可以使用主要在生殖组织(例如果实、胚珠、花粉、雌蕊、雌配子体、卵细胞、中央细胞、珠心、胚柄、助细胞、花、胚性组织、胚囊、胚、合子、胚乳、珠被或种皮)中有活性的启动子。因此，本文所使用的细胞类型或组织优先的启动子是指优先在靶组织中驱动表达，但是在其他细胞类型或组织中也可导致一些表达的启动子。用于鉴定和表征植物基因组DNA中启动子区的方法包括例如以下参考文献中描述的那些方法Jordano，等人，Plant Cell，1855-866(1989)；Bustos，等人，Plant Cell，1839-854(1989)；Green，等人，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，等人，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang，等人，Plant Physiology 1101069-1079(1996)。
多种启动子种类的实例在下文描述。下文指出的一些启动子在美国专利申请序列号60/505,689；60/518,075；60/544,771；60/558,869；60/583,691；60/619,181；60/637,140；10/950,321；10/957,569；11/058,689；11/172,703；11/208,308和PCT/US05/23639中更详细地描述。应当明白启动子可以基于它在一种植物物种中的活性满足一种分类标准，但是基于它在另一种植物物种中的活性满足不同的分类标准。
其他调节区5’非翻译区(UTR)可以包含在本文所述的核酸构建体中。5’UTR被转录，但是不被翻译，并位于转录物的起点和转录起始密码子之间，并可包括+1核苷酸。3’UTR可位于转录终止密码子和转录物末端之间。UTR可具有如提高mRNA稳定性或减弱翻译的具体功能。3’UTR的实例包括但不限于多腺苷酸化信号和转录终止序列，例如胭脂氨酸合成酶终止序列。
可使用多种启动子驱动本发明基因的表达。这类启动子的核苷酸序列公开于SEQ ID NO:1-79。其中一些是广泛表达的启动子，其他是更加组织优先的。
当启动子在许多(但不必须是全部)植物组织或植物细胞中促进转录时，其可以被称作是“广泛表达的”。例如，广泛表达的启动子可以在一个或多个枝条、枝端(顶端)和叶中促进有效连接的序列转录，但是在如根或茎的组织中弱促进或完全不促进转录。另一个实例是，广泛表达的启动子能够在一个或多个茎、枝条、枝端(顶端)和叶中促进有效连接的序列转录，但是在如花和产生种子的生殖组织中能够弱促进或完全不促进转录。可以包含在本文提供的核酸构建体中的广泛表达启动子的非限制性实例包括p326(SEQ ID NO:76)、YP0144(SEQ ID NO:55)、YP0190(SEQ ID NO:59)、p13879(SEQ ID NO:75)、YP0050(SEQ ID NO:35)、p32449(SEQ ID NO:77)、21876(SEQ ID NO:1)、YP0158(SEQ ID NO:57)、YP0214(SEQ IDNO:61)、YP0380(SEQ ID NO:70)、PT0848(SEQ ID NO:26)和PT0633(SEQ ID NO:7)。其他的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、来自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA的1’或2’启动子、玄参花叶病毒34S启动子、诸如稻肌动蛋白启动子的肌动蛋白启动子，以及诸如玉米泛素-1启动子的泛素启动子。在一些情况下，CaMV 35S启动子从广泛表达的启动子范畴中被排除。
根活性启动子在根组织(例如根内皮层、根表皮或根维管组织)中驱动转录。在一些实施方案中，根活性启动子是根优先的启动子，即仅在或主要在根组织中驱动转录。根优先的启动子包括YP0128(SEQ ID NO:52)、YP0275(SEQ ID NO:63)、PT0625(SEQ ID NO:6)、PT0660(SEQ IDNO:9)、PT0683(SEQ ID NO:14)和PT0758(SEQ ID NO:22)。其他根优先的启动子包括PT0613(SEQ ID NO:5)、PT0672(SEQ ID NO:11)、PT0688(SEQ ID NO:15)和PT0837(SEQ ID NO:24)，其主要在根组织中驱动转录，在胚珠和/或种子中较低程度地驱动转录。根优先的启动子的其他实例包括CaMV 35S启动子的根特异的亚结构域(Lam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国867890-7894(1989))、Conkling等人，Plant Physiol.931203-1211(1990)报导的根细胞特异启动子和烟草RD2基因启动子。
在一些实施方案中，在成熟中的胚乳中驱动转录的启动子可以是有用的。来自成熟胚乳启动子的转录通常在受精之后开始，并主要发生于种子发育期间的胚乳组织中，并且通常在细胞化期(cellularization phase)最高。最合适的是主要在成熟中的胚乳中有活性的启动子，尽管有时能够使用在其他组织中也有活性的启动子。可以包含在本文提供的核酸构建体中的成熟中胚乳启动子的非限制性实例包括油菜籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子(Bustos等人(1989)Plant Cell 1(9)839-853)、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子(Riggs等人(1989)Plant Cell 1(6)609-621)、ACP启动子(Baerson等人(1993)Plant Mol Biol，22(2)255-267)、硬脂酰-ACP去饱和酶基因(Slocombe等人(1994)Plant Physiol 104(4)167-176)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的大豆α′亚基启动子(Chen等人(1986)Proc Natl Acad Sci美国838560-8564)、油质蛋白启动子(Hong等人(1997)Plant Mol Biol 34(3)549-555)和玉米醇溶蛋白启动子(如15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子和27kD玉米醇溶蛋白启动子)。也合适的是来自稻谷蛋白-1基因的Osgt-1启动子(Zheng等人(1993)Mol.CellBiol.135829-5842)、β-淀粉酶基因启动子和大麦醇溶蛋白基因启动子。其他成熟中胚乳启动子包括YP0092(SEQ ID NO:38)、PT0676(SEQ ID NO:12)和PT0708(SEQ ID NO:17)。
在子房组织如胚珠壁和中果皮中驱动转录的启动子也可以是有用的，例如聚半乳糖醛酸酐酶(polygalacturonidase)启动子、香蕉TRX启动子和瓜肌动蛋白启动子。优先在胚珠中驱动基因表达的其他这类启动子为YP0007(SEQ ID NO:30)、YP0111(SEQ ID NO:46)、YP0092(SEQ ID NO:38)、YP0103(SEQ ID NO:43)、YP0028(SEQ ID NO:33)、YP0121(SEQID NO:51)、YP0008(SEQ ID NO:31)、YP0039(SEQ ID NO:34)、YP0115(SEQ ID NO:47)、YP0119(SEQ ID NO:49)、YP0120(SEQ ID NO:50)和YP0374(SEQ ID NO:68)。
在本发明的一些其他实施方案中，可以使用胚囊/早期胚乳启动子，从而在极核(polar nuclei)和/或中央细胞中，或在极核前体中，但不在卵细胞或卵细胞前体中驱动目的序列的转录。最合适的是仅在或主要在极核或其前体，和/或中央细胞中驱动表达的启动子。使用胚囊/早期胚乳优先的启动子也可以发现从极核扩展进入早期胚乳发育的转录模式，尽管在细胞化期期间和之后转录在晚期胚乳发育中通常显著降低。合子或正在发育的胚中的表达通常不与胚囊/早期胚乳启动子一起存在。
可适用的启动子包括来自以下基因的启动子拟南芥viviparous-1(见GenBank号U93215)；拟南芥atmycl(见Urao(1996)Plant Mol.Biol.，32571-57；Conceicao(1994)Plant，5493-505)；拟南芥FIE(GenBank号AF129516)；拟南芥MEA；拟南芥FIS2(GenBank号AF096096)和FIE1.1(美国专利6,906,244)。可适用的其他启动子可包括来自以下基因的启动子玉米MAC1(见Sheridan(1996)Genetics，1421009-1020)；玉米Cat3(见GenBank号L05934；Abler(1993)Plant Mol.Biol.，2210131-1038)。其他启动子包括以下的拟南芥启动子YP0039(SEQ ID NO34)、YP0101(SEQID NO:41)、YP0102(SEQ ID NO:42)、YP0110(SEQ ID NO:45)、YP0117(SEQ ID NO:48)、YP0119(SEQ ID NO:49)、YP0137(SEQ ID NO:53)、DME、YP0285(SEQ ID NO:64)和YP0212(SEQ ID NO:60)。可适用的其他启动子包括以下的稻启动子p530c10、pOsFIE2-2、pOsMEA、pOsYp102和pOsYp285。
优先在受精后的合子细胞中驱动转录的启动子能够提供胚优先的表达，并可适用于本发明。最合适的是在心形阶段之前优先在早期胚中驱动转录的启动子，但是晚期和成熟胚中的表达也是合适的。胚优先的启动子包括大麦脂质转移蛋白(Ltp1)启动子(Plant Cell Rep(2001)20647-654，YP0097(SEQ ID NO:40)、YP0107(SEQ ID NO:44)、YP0088(SEQ ID NO:37)、YP0143(SEQ ID NO:54)、YP0156(SEQ ID NO:56)、PT0650(SEQ IDNO:8)、PT0695(SEQ ID NO:16)、PT0723(SEQ ID NO:19)、PT0838(SEQID NO:25)、PT0879(SEQ ID NO:28)和PT0740(SEQ ID NO:20)。
在光合组织中有活性从而驱动绿色组织(如叶和茎)中转录的启动子是本发明尤其感兴趣的。最合适的是仅在或主要在这类组织中驱动表达的启动子。这类启动子的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子如来自美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等人(1990)Plant Mol.Biol.15921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等人(1994)Plant Physiol.104997-1006)、来自稻的cab1R启动子(Luan等人(1992)Plant Cell4971-981)、来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等人(1993)Proc Natl Acad.Sci美国909586-9590)、烟草Lhcb1＊2启动子(Cerdan等人(1997)Plant Mol.Biol.33245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truernit等人(1995)Planta 196564-570)和来自菠菜的类囊体膜蛋白质启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其他启动子为PT0535(SEQID NO:3)、PT0668(SEQ ID NO:2)、PT0886(SEQ ID NO:29)、PR0924(SEQ ID NO:78)、YP0144(SEQ ID NO:55)、YP0380(SEQ ID NO:70)和PT0585(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一些实施方案中，可期望诱导型启动子。诱导型启动子响应外界刺激(如化学物质或环境刺激)驱动转录。例如，诱导型启动子可响胁迫素(如赤霉素或乙烯)或响应光照或干旱而赋予转录。干旱诱导型启动子的实例为YP0380(SEQ ID NO:70)、PT0848(SEQ ID NO:26)、YP0381(SEQ ID NO:71)、YP0337(SEQ ID NO:66)、YP0337(SEQ ID NO:66)、PT0633(SEQ ID NO:7)、YP0374(SEQ ID NO:68)、PT0710(SEQ IDNO:18)、YP0356(SEQ ID NO:67)、YP0385(SEQ ID NO:73)、YP0396(SEQ ID NO:74)、YP0384(SEQ ID NO:72)、YP0384(SEQ ID NO:72)、PT0688(SEQ ID NO:15)、YP0286(SEQ ID NO:65)、YP0377(SEQ ID NO:69)和PD1367(SEQ ID NO:79)。被氮诱导的启动子的实例为PT0863(SEQID NO:27)、PT0829(SEQ ID NO:23)、PT0665(SEQ ID NO:10)和PT0886(SEQ ID NO:29)。黑暗诱导的启动子的实例为PR0924(SEQ ID NO:78)。
其他启动子其他种类的启动子包括但不仅限于叶优先的、茎/枝条优先的、愈伤组织优先的、保卫细胞优先的如PT0678(SEQ ID NO:13)和衰老优先的启动子。如上述参考专利申请中所述，被命名为YP0086(SEQ IDNO:36)、YP0188(SEQ ID NO:58)、YP0263(SEQ ID NO:62)、PT0758(SEQ ID NO:22)、PT0743(SEQ ID NO:21)、PT0829(SEQ ID NO:23)、YP0119(SEQ ID NO:49)和YP0096(SEQ ID NO:39)的启动子也可是有用的。
或者，可以使用两组分系统完成异常表达，其中第一组分由转基因植物组成，所述转基因植物包含与启动子有效连接的转录激活剂，第二组分由下述转基因植物组成，所述转基因植物包含与转录激活剂的靶结合序列/区有效连接的本发明的核酸分子。将两种转基因植物杂交，并且本发明的核酸分子在所述植物子代中表达。在本发明的另一备选的实施方案中，可以通过将两组分系统的序列转化进同一转基因植物株系中完成异常表达。
另一种选择在于在目的植物物种中抑制生物量或活力调节多肽的表达。术语“表达”是指通过多核苷酸的转录(即通过RNA聚合酶的酶作用)将多核苷酸中编码的遗传信息转化为RNA，并通过mRNA的翻译转化为蛋白质。“增量调节”或“激活”是指相对于基底或天然状态而言，提高表达产物的产生，而“减量调节”或“阻抑”是指相对于基底或天然状态而言降低产生。
大量基于核酸的方法可用于在植物中抑制蛋白质表达，包括反义RNA、核酶指导的RNA切割和干扰RNA(RNAi)。反义技术是一种公知的方法。在该方法中，来自内源基因的核酸区段被克隆并与启动子有效连接，从而RNA的反义链被转录。然后如上所述将重组载体转化进植物中，并产生RNA的反义链。核酸区段不必须是待阻抑的内源基因的整个序列，而通常是基本上与待阻抑的内源基因的至少一部分相同。一般而言，可以使用更高的同源性来补偿更短序列的使用。通常使用至少30个核苷酸的序列(例如至少40、50、80、100、200、500个核苷酸或更多)。
因此，例如本文提供的分离的核酸可以是编码生物量调节多肽的上述核酸之一的反义核酸。降低编码生物量调节多肽的基因的转录或翻译产物水平的核酸被转录为与生物量调节或生长速率调节多肽的有义编码序列类似或相同的反义核酸。或者，分离核酸的转录产物可以与生物量生长速率调节多肽的有义编码序列类似或相同，但是其为未多腺苷酸化的、缺乏5’帽结构的、或含有不可剪接的内含子的RNA。
在另一种方法中，核酸可以被转录为核酶或催化性RNA，其影响mRNA的表达(见美国专利号6,423,885)。核酶可以被设计为与实际上任何靶标RNA特异地配对并在特定位置切割磷酸二酯主链，从而功能性地灭活靶RNA。异源核酸可以编码下述核酶，所述核酶被设计为切割具体的mRNA转录物，从而防止多肽的表达。锤头状核酶适用于破坏具体的mRNA，尽管可以使用在位点特异识别序列处切割mRNA的多种核酶。锤头状核酶在由侧翼区指定的位置切割mRNA，所述侧翼区与靶mRNA形成互补的碱基对。唯一的要求是靶RNA含有5′-UG-3′核苷酸序列。锤头状核酶的构建和产生是本领域已知的。见例如美国专利号5,254,678和WO02/46449以及其中所引的参考文献。锤头状核酶序列可以被植入稳定的RNA如转运RNA(tRNA)中，以提高体内切割效率。Perriman，等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.美国，92(13)6175-6179；de Feyter and Gaudron，Methods in Molecular Biology，74卷，43章，＂Expressing Ribozymes inPlants＂，Turner，P.C编著，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。RNA核糖核酸内切酶可以是有用的，如噬热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然存在的RNA核糖核酸内切酶和已经由Cech与合作者广泛描述的RNA核糖核酸内切酶。见例如美国专利号4,987,071。
可使用基于RNA干扰(RNAi)的方法。RNA干扰是调节基因表达和病毒复制的一种细胞机制。该机制被认为是由双链小干扰RNA分子介导的。细胞通过破坏内源mRNA来应答这类双链RNA，所述内源mRNA具有与双链RNA相同的序列。用于设计和制备干扰RNA的方法是本领域技术人员已知的；见例如WO 99/32619和WO 01/75164。例如，可以制备下述构建体，所述构建体含有被转录为干扰RNA的序列。这类RNA可以是与其自身退火的RNA，例如具有茎-环结构的双链RNA。双链RNA茎部分的一条链包含与目的多肽的有义编码序列相似或相同的序列，其长度为约10个核苷酸到约2,500个核苷酸。与有义编码序列相似或相同的序列的长度可以是从10个核苷酸到500个核苷酸、从15个核苷酸到300个核苷酸、从20个核苷酸到100个核苷酸或从25个核苷酸到100个核苷酸。双链RNA茎部分的另一条链包含目的生物量调节多肽的反义序列，并可具有比正义序列相应长度有义序列更短、相同、或更长的长度。双链RNA的环部分可以是从10个核苷酸到5,000个核苷酸，例如从15个核苷酸到1,000个核苷酸、从20个核苷酸到500个核苷酸或从25个核苷酸到200个核苷酸。RNA的环部分可包含内含子。见例如WO 99/53050。
在用于抑制植物中基因表达的一些基于核酸的方法中，合适的核酸可以是核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链上被修饰，以促进例如核酸的稳定性、杂交或溶解度。碱基部分上的修饰包括脱氧尿苷成为脱氧胸苷，和5-甲基-2’-脱氧胞苷和5-溴-2’-脱氧胞苷成为脱氧胞苷。糖部分上的修饰包括核糖的2’羟基修饰形成2’-O-甲基或2’-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸酯主链以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉代环或肽核酸连接，其中所述脱氧核糖磷酸酯主链被假肽主链代替，并保留四个碱基。见例如Summerton和Weller，1997，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.，7187-195；Hyrup等人，1996，Bioorgan.Med.Chem.，45-23。另外，脱氧磷酸酯主链可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、氨基磷酸酯(phosphoroamidite)或烷基硫酸三酯主链代替。
转化 本发明的核酸分子可通过多种技术被引入适当宿主植物的基因组或细胞中。能够转化大量高等植物物种的这些技术是公知的，并描述于技术和科学文献中(见例如Weising等人(1988)Ann.Rev.Genet.，22421以及Christou(1995)Euphytica，8513-27)。
可用本领域已知的多种技术将DNA引入植物宿主细胞中。这些技术包括例如通过注射(Newell(2000))、显微注射(Griesbach(1987)Plant Sci.5069-77)、DNA的电穿孔(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.美国825824)、PEG(Paszkowski等人(1984)EMBO J.32717)、使用生物射弹(Klein等人(1987)Nature 327773)、细胞或原生质体融合(Willmitzer，L.(1993)Transgenic Plants.InIotechnology，A Multi-VolumeComprehensive treatise(H.J.Rehm，G.Reed，A.Püler，P.Stadler编著，2卷，627-659，VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge))和使用根瘤农杆菌(Crit.Rev.Plant.Sci.41-46；Fromm等人(1990)Biotechnology 8833-844)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(Cho等人(200o)Planta210195-204)的T-DNA，或其他细菌宿主(Brootghaerts等人(2005)Nature433629-633)转化植物细胞。
另外，本发明可期望本领域技术人员公知的大量非稳定转化方法。这类方法包括，但不仅限于瞬时表达(Lincoln等人(1998)Plant Mol.Biol.Rep.161-4)和病毒转染(Lacomme等人(2001)，“Genetically EngineeredViruses”(C.J.A.Ring and E.D.Blair编著)，59-99页，BIOS ScientificPublishers，Ltd.Oxford，UK)。
种子获自转化的植物并被用于测试稳定性和遗传特性。一般地，培养两代或更多世代以确保表型特征被稳定维持和传递。
本领域普通技术人员知道表达盒被稳定地插入转基因植物并确定是有效的之后，其可以通过有性杂交被引入其他植物中。可以使用大量标准育种技术中的任何一种，这取决于待杂交的物种。
本发明的核酸分子可被用于赋予被改变的开花时间的形状。
本发明的核酸分子编码来自任何生物的，但是优选存在于植物、真菌、细菌或动物中的适当的蛋白质。
本发明的方法能应用于任何植物，优选属于被子植物纲(Angiospermae)和裸子植物纲(Gymnospermae)的高等植物。双子叶植物(Dicotylodenae)和单子叶植物(Monocotyledonae)亚纲的植物是尤其合适的。属于例如以下目的双子叶植物也是合适的Magniolales、八角茴香目(Illiciales)、樟目(Laurales)、胡椒目(Piperales)、Aristochiales、睡莲目(Nymphaeales)、毛茛目(Ranunculales)、Papeverales、瓶子草科(Sarraceniaceae)、昆栏树目(Trochodendrales)、金缕梅目(Hamamelidales)、Eucomiales、塞子木目(Leitneriales)、杨梅目(Myricales)、壳斗目(Fagales)、木麻黄目(Casuarinales)、石竹目(Caryophyllales)、肉穗果目(Batales)、蓼目(Polygonales)、白花丹目(Plumbaginales)、五桠果目(Dilleniales)、山茶目(Theales)、锦葵目(Malvales)、荨麻目(Urticales)、玉蕊目(Lecythidales)、堇菜目(Violales)、杨柳目(Salicales)、白花菜目(Capparales)、杜鹃花目(Ericales)、Diapensales、柿树目(Ebenales)、报春花目(Primulales)、蔷薇目(Rosales)、豆目(Fabales)、川苔草目(Podostemales)、小二仙草目(Haloragales)、桃金娘目(Myrtales)、山茱萸目(Cornales)、山龙眼目(Proteales)、檀香目(Santales)、大花草目(Rafflesiales)、卫矛目(Celastrales)、大戟目(Euphorbiales)、鼠李目(Rhamnales)、无患子目(Sapindales)、胡桃目(Juglandales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、远志目(Polygalales)、伞形目(Umbellales)、龙胆目(Gentianales)、花葱目(Polemoniales)、唇形目(Lamiales)、车前目(Plantaginales)、玄参目(Scrophulariales)、桔梗目(Campanulales)、茜草目(Rubiales)、川续断目(Dipsacales)和菊目(Asterales)。属于以下目的单子叶植物也可适用于本发明的实施方案泽泻目(Alismatales)、水鳖目(Hydrocharitales)、莰藻目(Najadales)、霉草目(Triuridales)、鸭跖草目(Commelinales)、谷精草目(Eriocaulales)、帚灯草目(Restionales)、禾本目(Poales)、灯心草目(Juncales)、莎草目(Cyperales)、香蒲目(Typhales)、凤梨目(Bromeliales)、姜目(Zingiberales)、槟榔目(Arecales)、巴拿马草目(Cyclanthales)、露兜树目(Pandanales)、天南星目(Arales)、Lilliales和兰目(Orchidales)。其它的实例包括，但不限于属于裸子植物纲的植物，为松目(Pinales)、银杏目(Ginkgoales)、苏铁目(Cycadales)和买麻藤目(Gnetales)。
本发明的方法优选地应用于对于农业、园艺、用于生物转化的生物量和/或林业重要或有意义的植物。非限定性的实例包括，例如，烟草、oilseed rape(欧洲油菜)、糖萝卜(sugar beet)、马铃薯、番茄、黄瓜、胡椒、菜豆(beans)、豌豆、柑橘属水果、鳄梨、桃、苹果、梨、浆果、李(plumbs)、瓜、茄子、棉花、大豆、向日葵、蔷薇、猩猩木、碧冬茄、银胶菊、甘蓝、菠菜、苜蓿、朝鲜蓟、甘蔗、含羞草、Servicealespedera、玉米、小麦、稻、黑麦、大麦、高粱和草类(如柳枝稷(switch grass)、芦竹(giant reed)、狗牙根、石茅高粱或草皮草(turf grass))、黍、大麻、香蕉、杨、桉树和松类。感兴趣的是种植用于能量生产的盆栽(所谓的能量作物)，即所谓的能源作物，例如，阔叶植物如苜蓿、大麻、菊芋以及草类如高梁、柳枝稷、石茅高粱的禾本科植物。
本发明包括的同源物 本领域已知，序列中的一个或多个氨基酸可以被其他氨基酸取代，所述其他氨基酸的电荷和极性与被取代的氨基酸相似(即保守氨基酸取代)，导致生物学/功能上的沉默改变。多肽序列中氨基酸的保守取代可以选自该氨基酸属于的种类的其他成员。氨基酸可以被分为以下四组(1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)的氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水的)氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。
由于不同的核酸序列编码具有一个或多个保守氨基酸改变的蛋白质的事实，本发明的核酸分子可包含与编码下述蛋白质或其片段的核酸分子(分别为SEQ ID No.80，90，92，98，109和103)不同的序列，所述蛋白质或其片段选自Lead15、28、29、36、ME04012和克隆691319。
本发明的多肽或其片段的生物学功能等效物可以具有约10个或更少的保守氨基酸改变，更优选约7个或更少的保守氨基酸改变，最优选约5个或更少的保守氨基酸改变。在本发明的一个优选的实施方案中，多肽具有约5个和约500个之间的保守改变，更优选约10个和约300个之间的保守改变，进一步更优选约25个和约150个之间的保守改变，并最优选约5个和约25个之间的保守改变或1个和约5个之间的保守改变。
鉴定有用的核酸分子及其相应的核苷酸序列 通过使用多种筛选鉴定本发明的核酸分子及其核苷酸序列，所述筛选预测下述核苷酸序列，所述核苷酸序列给植物提供改变的尺寸、营养生长、生长速率、器官数、植物构造和/或生物量。因此，使用一种或多种以下的筛选鉴定本发明的核苷酸(和氨基酸)序列。
本发明还由以下实施例进一步例证。所述实施例不旨在以任何方式限制本申请及其用途的范围。
6.证实本发明的多核苷酸和多肽有用性的实验 一般方案 农杆菌介导的拟南芥转化 用Ti质粒转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Wassilewskija(WS)植物，所述质粒在相对于35S启动子为有义的方向上含有克隆。适用于这类构建体CRS338的Ti质粒载体含有Ceres-构建的植物可选择标记基因膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其赋予被转化的植物除草剂抗性。
通常选择十个独立转化事件并在T1世代中评价它们的定性表型。
土壤混合物的制备将24L SunshineMix #5土壤(Sun Gro Horticulture，Ltd.，Bellevue，WA)与16L Therm-O-Rock蛭石(Therm-O-Rock West，Inc.，Chandler，AZ)在水泥混合机(cement mixer)中混合，制备60:40的土壤混合物。向该土壤混合物中添加2 Tbsp Marathon 1％颗粒(Hummert，EarthCity，MO)、3 Tbsp
14-14-14(Hummert，Earth City，MO)和1 Tbsp Peters肥料20-20-20(J.R.Peters，Inc.，Allentown，PA)，这些被添加的成分首先被添加进3加仑水中，然后添加进土壤中并充分混合。一般用土壤混合物填充4-英寸直径的花盆。然后用8-英寸的尼龙膜方块覆盖花盆。
种植使用60mL注射器抽吸35mL的种子混合物。向每盆中添加25滴。在花盆顶部放置透明的繁殖盖子(propagation dome)，然后将盆置于55％阴影的编织物下并通过添加1英寸水进行地下灌溉(subirrigated)。
植物培养种植后3到4天，去除盖子和阴影编织物。根据需要给植物浇水。7-10天后，使用镊子将花盆间苗至每盆20株植物。2周后，用Peters肥料以每加仑水1 Tsp的比率对所有的植物进行地下灌溉。当花芽(bolt)约5-10厘米长时，将其在第一节和茎底部之间修剪以诱导次生花芽(secondary bolt)。修剪后6到7天进行浸泡浸润(Dipping infiltration)。
农杆菌的制备向150mL新鲜的YEB中添加各0.1mL的羧苄西林、壮观霉素和利福平(各为100mg/ml的储存浓度)。获得农杆菌起子板(starter block)(含有生长至OD600约1.0的农杆菌培养物的96-孔板)并通过从起子板的适当孔中转移1mL来接种每种构建体一个培养瓶。然后将培养物在27℃振荡培养。达到约1.0的OD600(约24小时)后将培养物离心。向重悬的农杆菌沉淀物中添加200mL浸润培养基。浸润培养基通过向900mL水中添加2.2g MS盐、50g蔗糖和5μl2mg/ml苄氨基嘌呤制备。
浸泡浸润将花盆倒置并浸入水中5分钟，从而植物的地上部分被置于农杆菌悬浮液中。允许植物正常生长并收集种子。
异常表达突变体的高通量表型筛选将种子均匀分散进盆内水饱和的土壤中，并置于黑暗的4℃冷藏室中两夜以促进均一的萌发。然后将花盆从冷藏室中移出并用55％的阴影编织物覆盖4-5天。在该阶段子叶完全展开。向植物喷洒
(Sanofi Aventis，Paris，法国)(稀释在48盎司水中的3ml
)并每3-4天重复，直到仅剩下转化体为止。
筛选在四个阶段常规地进行筛选幼苗、莲座、开花和衰老。
·幼苗-子叶形成之后、但是第3片真叶开始形成之前的时间。
·莲座-从第三片真叶形成直到初生花芽(primary bolt)开始伸长之间的时间。
·开花-从初生花芽形成到衰老开始的时间(除了注意开花时间本身以外，大部分观察应该在约50％的花已开放的阶段进行)。
·衰老-衰老开始之后的时间(除“延迟的衰老”外，大部分观察应当在植物已经完全干燥后进行)。然后收集种子。
筛选针对增加的尺寸、营养生长和/或生物量的筛选通过如下进行测量(特别是T2测量) ·开花日期＝播种和第一个花序形成之间的天数。
·开花时的莲座叶数＝第一个花序形成时存在的莲座叶数。
·莲座面积＝最初的花序形成时的莲座面积，使用式((LxW)＊3.14)/4。
·高度＝从底部到顶部的最长花序长度。该测量在开花终止/衰老开始时进行。
·初生花序厚度＝从底部向上2.5cm的初生花序直径。该测量在开花终止/衰老开始时进行。
·花序数＝单个花序的总数。该测量在开花结束/衰老开始时进行。
使用PCR在一个随机选择的T2植物中扩增cDNA插入片段。然后对该PCR产物测序以证实植物中的序列。
结果 如上所述针对调节的生长和表型特征筛选目的基因转化的植物。观察包括涉及整株植物以及植物部分(如根和叶)的观察。对于各个多核苷酸序列的转化体的观察在序列表中针对各个被测试的核苷酸序列和相应的编码多肽进行标注。调节的特征(即观察到的表型)通过“各方面特征”领域中的条目对各个序列进行标注。序列表中针对各相关序列标注的“表型”还包括基于观察的该序列的有用效用的陈述。
可以根据用于观察的有关植物组织和用于制备该转化体的核苷酸序列/多肽的得到的效用/有用性对多种转化体做出的观察分类。表1将序列表中的简短标注与下述内容相关针对各转化体标注的观察结果(“描述”一栏)、观察的组织、因而伴随着转化体的表型，和插入的核苷酸序列和编码的多肽的得到的效用/有用性(“翻译”一栏)。
对本发明的一些多核苷酸/多肽而言，序列表还包括(在“各方面特征”部分中)对重要的被鉴定的显性和该结构域的相应功能的指示，或通过与公众可获得的pfam数据库比较而鉴定的指示。
表1 从表1和序列表中记录的结果可以看出，本发明的核苷酸/多肽适用于(取决于各个个体序列)制备具有改变的生长和表型特征的植物，所述特征包括 a.调节的植物尺寸，包括提高和降低的高度或长度； b.调节的营养生长(提高的或降低的)； c.调节的器官数； d.增加的生物量； e.不育性； f.幼苗致死率； g.加速的作物发育或收获； h.加速的开花时间； i.推迟的开花时间； j.推迟的衰老； k.增强的干旱或胁迫耐性； l.提高的叶绿素和光合能力； m.提高的花色素苷含量； n.增加的根生长，和提高的营养摄取； o.提高或降低的种子重量或尺寸，提高的种子碳或氮含量； p.改变的(包括提高的)种子/果实产率或改变的果实含量； q.增强的叶(foliage)； r.用于在植物中制备营养补给物/药物的有用性； s.植物致死率； t.降低种子纤维含量以提供提高的可消化性； u.改变的观赏外观，具有改变的叶、花、颜色或叶(foliage)； v.改变的植物不育性； w.增强的在阴暗处生长的能力； x.增强的生物胁迫耐性； y.增强的对密度和低肥料的耐性； z.增强的对高或低pH、对低或高氮或磷酸盐的耐性； aa.增强的对氧化胁迫的耐性； bb.增强的化学组成； cc.改变的叶形状； dd.增强的抗生素胁迫耐性； ee.提高的对寒冷胁迫的耐性； ff.提高的淀粉含量； gg.降低的种子数或无种子； hh.增强的植物强度； ii.改变的花长度； jj.更长的花序； kk.改变的种子纤维含量； ll.改变的果实形状； mm.改变的果实组成； nn.改变的种子产率； oo.改变的植物构造，如改变的分枝量或角度、改变的叶结构、或改变的种子结构；和 pp.增强的阴影回避(shade avoidance)。
实施例1Lead28-ME04701-克隆1952-cDNA 13499809(SEQ IDNO:90) T1植物的定性分析 所有10个事件产生比对照具有更多叶的莲座和更多的花序。植物还比对照稍小(表1-1)。转基因“对照”是一组植物，所述植物表达不同的35S::cDNA，但是不能与未转化的WS野生型区别。对表型评分的该方法对于我们的大规模形态学表型项目而言是典型的。
表1-1.在35S::cDNA 13499809 T1事件中观察到的定性表型 T2植物的定量分析 在T2世代中对事件ME04701-08和ME04701-09进行更详细的评价。选择这两种事件是因为它们具有最有利的表型。种植18个个体并针对两种事件进行观察。转基因植物在0.05的统计学显著性水平上显示提高的花序数(表1-2)。与T1植物不同，T2植物不比对照具有显著更多的叶。ME04701-08比对照开花稍晚。ME04701-09具有比对照显著更大的莲座。表中标注为ME04701-08和ME04701-09的所有植物是显示目的表型的T1的分离子代(segregating progeny)。表中被标记为-08或-09对照的所有植物是不显示所述表型和不含有转基因的T2分离子代(内部对照；表1-2)。
测试植物的分离频率提示每个事件含有单个插入片段，如通过卡方检验所计算的那样(表1-2和数据未显示)。
对两种事件而言，花序数的增加比使用35S启动子表达该cDNA时观察到的增加少得多(数据未显示)。该证据进一步支持了我们的假说基因产物的表达/剂量程度与观察到的表型强度高度相关。通过使用具有不同表达模式的启动子，我们能够保持先前观察到的35S表型的阳性表型，并去除先前观察到的不育性的不利方面。当然，交换(trade-off)减少阳性表型，尽管保持其是显著的。
表1-2.在p326F::cDNA13499809 T2事件中观察到的定量表型(PIT＝初生花序厚度)
LEAD概括/讨论 ·具有适当启动子的Lead 28/cDNA 13499809的过表达导致花序数的增加。因为这是富含甘氨酸的蛋白质(GRP)很可能存在对细胞壁结构的作用，该作用影响细胞增大(expansion)或粘附、细胞平面的不同定位，和/或花序起始的不同可能性。将该基因与编码具有AP2的未知蛋白质的基因组合会是有趣的，所述具有AP2的蛋白质也影响植物生长和发育。
·该多核苷酸/蛋白质可特别适用于在分生组织中控制细胞分裂数/速率而不破坏总体植物形态。其可在作物中与适当的启动子一起被开发，以调节许多个体器官的尺寸和生长速率。
·提高的营养生物量可以给出提高的来源:吸收比例，和提高的碳成为蔗糖和淀粉的固定，导致提高的产率。
·更多花序给出更多花和因而更多种子的机会。提高的生物量与花序数的组合可给出产率的显著提高。
番茄大田试验结果 在质粒p326的控制下将克隆1952转化进番茄中。选择四个独立的转基因事件进行大田测试。结果显示于下表1-3中。平均而言，存在每株植物的总果实重量、果实重量和红色果实百分比的提高。事件4未显示性能的改进。如果在平均植物重量分析中不考虑事件4，则果实重量和红色果实百分比各提高至对照的约115％。
表1-3-来自番茄大田试验的结果 实施例2Lead 29-ME04717-克隆123905-cDNA 12562634(SEQ IDNO:92) ·Ceres cDNA 12562634在326D启动子控制下的异位表达诱导了大量表型，包括 ·提高的花序数 ·开花后持续出现莲座叶，产生总体提高的叶数。
·Ceres cDNA 12562634的异常表达可适用于提高分枝和花序数。这可对种子数具有显著的影响。
T1植物的定性分析 使用326D启动子，10个事件中的9个产生比对照具有更多叶的莲座和更多的花序(表1)。所述9个事件之一还具有生育力缺陷，与使用35S::cDNA12562634观察到的非常相似。转基因“对照”是表达不同的35S::cDNA构建体并且不能与未转化的WS野生型区分的一组植物。对表型评分的该方法对于我们的大规模形态学表型项目而言是典型的。
表2-1.在p326D::cDNA12562634T1事件中观察到的定性表型(选择具有最有利表型的2个事件用于T2评价) T2植物的定量分析 在T2世代中对事件ME04717-03和ME04717-05进行更详细的评价。种植18个个体并针对两种事件进行观察。转基因植物在0.05的统计学显著性水平上显示提高的花序数。ME04717-03还具有比对照显著更大的莲座。表2-2中标注为ME04717-03和ME04717-05的所有植物是显示目的表型的T1的分离子代。表2-2中被标记为-03或-05对照的所有植物是不显示所述表型和不含有转基因的T2分离子代(内部对照；表2-2)。
测试植物的分离频率提示每个事件含有单个插入片段，如通过卡方检验所计算的那样(数据未显示)。
应当注意对下文记录的事件而言，花序数的提高比35S::cDNA12532634事件中观察到的提高更少(数据未显示)。该报告中未显示的其他p326D::cDNA 12532634 T2事件含有多个插入片段。这些含多个插入片段的事件的一些T2子代显示与35S::cDNA 12532634事件的T2子代相似的一些负面作用(生育力缺陷和矮化)。该证据进一步支持了我们的假说基因产物的表达/剂量程度与观察到的表型强度高度相关。通过使用新的启动子和创建具有单个插入片段的转基因体，我们能够保持先前观察到的35S表型的阳性表型，并去除先前观察到的不利方面。完成该目标的一个结果是减轻阳性表型的程度，尽管保持其在非常显著的水平上。
表2-2.在p326D::cDNA 12562634T2事件中观察到的定量表型(PIT＝初生花序厚度)
LEAD概括/讨论 ·Ceres cDNA 12562634在326D启动子控制下的异位表达诱导了大量表型，包括提高的花序数和更多的叶。
·Ceres cDNA 12562634的异常表达可用于增加分枝和花序数。这可对种子数具有显著的影响。
·还可能存在对收获指数的正面影响，尽管并未测量。
·该基因/蛋白质可特别适用于在分生组织中控制细胞分裂速率而不破坏总体植物形态。其可在作物中与适当的启动子一起被开发，以调节许多个体器官的尺寸和生长速率。
·提高的营养生物量可以给出提高的来源吸收比例，和提高的碳成为蔗糖和淀粉的固定，导致提高的产率。
·更多花序给出更多花和因而更多种子的机会。提高的生物量与花序数的组合可给出产率的显著改进。
番茄大田试验结果 在质粒p326的控制下将克隆123905转化进番茄中。在大田中表征4个独立的转基因事件。最初评价大量的独立事件并根据基因的表达、单个插入片段的存在和在温室中观察到的植物表型选择4个事件进行进一步的分析。在随机化的完全区组(block)设计中将纯合的T2种子种植在大田中。每个事件具有相应的对照株系。植物重量、个体植物总重、每株植物的总果实重量、每株植物的红色果实百分比，以及收获指数的结果在下表2-3中显示。结果指出事件1或21具有显著降低的叶量，同时保持与对照相当的产率。因此，它们的收获指数提高。这些事件还有提高的每株植物红色果实百分比。事件14具有提高的生物量和产率。
表2-3——番茄大田试验结果 每株植物 114 21 26 均值 叶/茎重量 C5 1410.0 1537.1 1294.4 1564.1 1451.4 C5对照 1866.4 1215.9 1738.8 1766.0 1646.8 果实重量C5 4300.5 4936.5 4122.5 4159.0 4379.6 C5-对照 4293.5 4608.5 4098.0 4877.0 4469.3 红色果实百分比 C5 35.3 33.2 56.2 36.9 40.4 C5-对照 16.7 33.0 45.8 34.8 32.6 收获指数C5 75％ 76％ 76％ 73％ 75％ C5-对照 70％ 79％ 70％ 73％ 73％ 总而言之，用基因123905转化的番茄植物与对照相比趋向于具有更多的分枝和叶，以及更多的果实。
稻大田试验结果 在p326的控制下将基因123905转化进稻栽培种Kitaake中。在随机化的完全区组设计中在大田里评价五个(5)独立的转基因事件。评价的性状为每株植物的分蘗、开花所需天数、叶角、植物高度、以克/植物计的生物量、以克/植物计的产率和以克计的总盆产率，这些结果在下文显示于表2-4、2-5和2-6中。各事件导致每株植物分蘗数的提高。
表2-4——来自稻大田试验的结果 每株植物的 第一次开花 中期开花所 植物 植物数 大致叶角 分蘗 所需天数 需天数 123905-1 1060 7.1 22 3233.1 123905-4-6 200 8.2 19 2845 123905-8-3 650 7.4 28 3332.1 123905-12-3 300 8.9 22 3338.6 Kitaake对照 1200 5.4 22 3131.2 若干事件显示高度的显著降低。事件8-3显示与对照相比高度、生物量和产率的提高。尽管一般产率更低且株高显著降低，但是事件1和事件12产生与对照相似的生物量，这指示相对于对照而言生物量密度的提高。
表2-5——来自稻大田试验的结果生物量 产率 每盆总产率 植物高度(cm)(克/植物)(克/植物)(gms) 123905-1 54.0 25.3 12.52417.0 123905-4-637.0 19.6 7.82 116.5 123905-8-365.5 30.6 14.9 668.8 123905-12-3 48.8 23.3 10.02312.3 Kitaake 61.2 26.7 13.59537.5 对稻中降低的株高的观察 在p326的控制下将基因123905转化进稻栽培种Kitaake中。进行测量以测定长度降低的节间，其中节间I是最上部的节间，节间V是最低的节间。在具有相对于对照显著降低的株高的事件1、4和12中，节间III和IV的长度显著降低，而节间I和II仅轻微降低或完全未降低。
表2-6——来自稻大田试验的结果 对稻中萌发的观察 转基因株系123905-1和123905-12-3比Kitaake对照种子萌发快1到2天。
实施例3Lead36-ME03195-克隆679923-cDNA 13594332(SEQ IDNO:98) Ceres大豆cDNA文库中的克隆679923含有cDNA 13594332，所述cDNA13594332编码了与拟南芥LEAFY PETIOLE(LEP)基因类似的转录因子。该蛋白质序列含有AP2结构域。该cDNA被置于Ceres异常表达流水线中，因为其被确定为已知的拟南芥基因(LEP)推定的直向同源物。
T1植物的定性分析 与对照相比，所有5个事件均产生具有轻微弯曲的叶(有很少或没有叶柄延长)的更大的莲座，和非常短的花序。这些植物开花时间也推迟若干天，并且不具有生育力缺陷(表3-1)。转基因“对照”是表达不同的35S::cDNA融合物并且不能与未转化的WS野生型区分的一组植物。对表型评分的该方法对于我们的大规模形态学表型项目而言是典型的。收集种子后，同样明显的是这些植物产生了相对于它们高度的典型突变体而言显著更大量的种子。
表3-1.在35S::cDNA 13594332 T1事件中观察到的定性表型 T2植物的定量分析 从对T1的观察产生的原始假说是35S::cDNA 13594332植物可具有显著提高的收获指数。在T2世代中对事件ME03195-02和ME03195-04进行更详细的评价以检验该假说。种植18个个体并针对两种事件进行观察。测试植物的分离频率提示每个事件含有单个插入片段，如通过卡方检验所计算的那样(数据未显示)。
在详细的T2分析后，我们关于转基因植物确定以下信息(除非另有说明，以下的结果通过t-检验在0.05或更好水平上是统计学显著的) ·开花时间(开花所需天数)比对照晚5-8天。
·开花时的莲座叶数提高了约2.5片叶。
·莲座面积比对照大2-3倍。
·高度为对照的约1/2。
·总种子重量与对照无显著差异。
·总植物干重比事件-04稍大，与事件-02的对照无差异。
·收获指数比对照稍低。
·每单位植物高度产生相当于对照两倍的种子。
细节可见表3-2和3-3。
表3-2.在p35S::cDNA 13594332 T2事件中观察到的定量表型
表3-3.在p35S::cDNA 13594332 T2事件中观察到的定量表型
事件-02和-04各具有三个T2植物，所述T2植物显示严重得多的上述表型。这些植物开花严重推迟，具有很少的花序延长，并且几乎不育。从使用这些植物株系的其他实验(数据未显示)中，我们确定有害的表型归因于剂量/纯合掺入效应，提示半合子/杂合植物具有提高的每单位高度种子产品的有益性状，但是纯合株系给出阴性表型。我们的统计学分析将内部对照与含有转基因和有益表型的植物进行比较。在表3-2和3-3的统计学分析中除去所有具有有害表型的含转基因的植物。
实施例4ME04012-Gemini ID 5000F6(SEQ ID NO:109) ME04012含有编码推定的细胞色素P450的基因组克隆。在针对干旱耐性测定植物株系ME04012时，事件-03中15/20个植物显示植物构造表型。6/15个是仅显示波浪状茎的较弱版本。9/15个是强壮的并显示波浪状茎、降低的高度和降低的分枝与叶柄角。
实施例5Lead 15-ME04077-克隆92459-cDNA 12561537(SEQ IDNO:80) Ceres拟南芥cDNA文库中的克隆92459含有编码拟南芥MADSAffecting Flowering 1(MAF1)的cDNA 12561537。将该cDNA置于Ceres异常表达流水线中，因为其为转录因子。转录因子是尤其感兴趣的，因为它们能够同时影响许多基因，因此它们被过量表达时在拟南芥中具有产生改变的表型的增加可能性。
Ceres cDNA 12561537在35S启动子控制下的异位表达诱导了大量表型，包括 ·更高的植物 ·更厚的花序 ·更大的莲座 ·提高的莲座叶数 ·推迟开花 Ceres cDNA 12561537的异常表达可用于提高整株植物尺寸/生物量。
T1植物的定性分析 与对照相比，所有十个事件开花晚、产生具有更多叶的更大的莲座和高的、厚的花序(表5-1)。转基因“对照”是表达不同的35S::cDNA的一组植物，其不能与未转化的WS野生型区分。对表型评分的该方法对于我们的大规模形态学表型项目而言是典型的。
表5-1.在35S::cDNA 12561537 T1事件中观察到的定性表型 T2植物的定量分析 在T2世代中对事件ME04077-06和ME04077-10进行更详细的评价。种植18个个体并针对事件06进行观察，种植17个个体并针对事件10进行观察。对两个事件而言，转基因植物均在0.05的统计学显著水平上显示提高的初生花序厚度、增加的莲座叶数、更大的莲座和开花时间的推迟(表5-2)。两个事件的植物均明显比对照高得多，但是仅事件-10通过t-检验在0.05的统计学显著水平上定量地更高。如果对事件-06而言能够获得更大量的内部对照，则该事件应非常可能落入通过相同检验的相同显著性程度内。两个事件均具有正常的生育力。表中标记为ME04077-06和ME04077-10的所有植物均为T1事件的分离子代，所述T1事件我们已在测试中证实含有转基因。表中标注为-06对照或-10对照的所有植物是在测试中不含转基因的T2分离子代(内部对照)。
两种事件均产生比对照显著更多的种子，如对典型的、能育的、开花晚的植物所期望的那样。
事件ME04077-06具有12个显示有益的表型的含转基因植物和3个显示野生型的含转基因的植物(这三个在表5-2的统计学分析中省略)。事件ME04077-10具有9个显示有益表型的含转基因植物和1个显示野生型的含转基因植物。我们的统计学分析将内部对照与具有有益表型的含转基因植物进行比较。
测试中转基因的分离频率提示每个事件含有单个插入片段，如通过卡方检验所计算的那样。对两个事件而言，T2种子均分离为3R:1S(数据未显示)。
表5-2.在35S::cDNA 12561537 T2事件中观察到的定量表型
LEAD概括/讨论 ·带有强组成型启动子(35S)的cDNA 12561537的异位表达导致更高的植物，所述植物具有更厚的花序、更大的莲座和更多的莲座叶。
·通过该表达观察到的植物尺寸提高伴随着开花时间的推迟，但是生育力不降低。
·其还可以是适用于提高根生长的基因，假设在根分生组织和根尖细胞中具有相似的表达模式。
·提高的营养生物量可以给出提高的比例，和提高的碳成为蔗糖和淀粉的固定，导致提高的产率。
·更高的花序给出更多花并从而给出更多种子的机会。提高的生物量和花序高度的组合可给出产率的显著提高。
·更厚的花序可防止针对风、雨或干旱的“折断(snap)”。
·生物量优点和假定的光合优点可适用于玉米和大豆。
·该基因/蛋白质可特别适用于在分生组织中控制细胞分裂数/速率而不破坏总体植物形态学。其可在作物中与适当的启动子一起被开发，以调节许多个体器官的尺寸和生长速率。该蛋白质可适用于在玉米中创建更坚强的茎以防止“折断”。
番茄大田试验结果 在质粒p13879的控制下将该Lead 15(克隆92459)转化进番茄中。选择1个转基因事件用于大田测试。该事件显示生物量的提高，如下表5-3的结果所示。
表5-3番茄大田试验结果 实施例6-功能性同源物序列的测定 使用上文实施例1-5中所述的“LEAD”序列鉴定前导序列(lead)的功能同源物，并且所述功能同源物与这些序列被用于确定给定组的前导和功能同源物序列的共有序列。
如果受试序列和查询序列编码具有相似功能和/或活性的蛋白质，则认为受试序列是查询序列的功能同源物。使用已知为Reciprocal BLAST(Rivera等人，Proc.Natl Acad.Sci.美国，1998，956239-6244)的程序鉴定来自于下述数据库的可能的功能同源物序列，所述数据库由所有可获得的公开和专利的肽序列组成，包括来自NCBI的NR和来自Ceres克隆的肽翻译结果。
在开始Reciprocal BLAST程序之前，使用BLAST针对来自其来源物种的所有肽进行特定查询多肽搜索，从而鉴定与查询多肽具有80％或更多序列同一性并且在比对中具有沿较短序列85％或更多的比对长度的多肽。查询多肽和任何上述被鉴定的多肽被命名为聚类(cluster)。
主要的Reciprocal BLAST程序由两轮BLAST搜索组成；正向搜索和反向搜索。在正向搜索步骤中，针对来自目的物种的所有蛋白质序列BLAST来自来源物种SA的查询多肽序列“多肽A”。使用10-5的E-值界限和35％的同一性界限确定上好结果(top hit)。在上好结果中，具有最低E-值的序列被命名为最佳结果，并被认为是可能的功能同源物。与最佳结果或最初的查询多肽具有80％或更高序列同一性的任何其他上好结果也被认为是可能的功能同源物。针对所有目的物种重复该程序。
在一次反向搜索中，在正向搜索中鉴定的来自所有物种的上好结果被用于进行BLAST搜索，所述搜索针对来自来源物种SA的所有蛋白质或多肽序列。来自正向搜索的下述上好结果也被认为是可能的功能同源物，所述上好结果将来自上述聚类的多肽回归为其最佳结果。
通过手工检查可能的功能同源物序列来鉴定功能同源物。代表性的功能同源物显示于图1-5中。各图代表前导/查询序列的分组，所述序列与相应的被鉴定的功能同源物受试序列比对。对前导序列及其相应的功能同源物序列进行比对，以鉴定保守的氨基酸和确定共有序列，所述共有序列含有在被比对序列中具体位置上频繁出现的氨基酸残基，如图1-5所示。
然后各共有序列由被鉴定和编号的保守区或结构域组成，一些保守区被保守区之间的一个或多个氨基酸残基(用短线(-)表示)隔开。
因此，本发明的有用多肽包括图1-5所示的各前导和功能同源物序列，以及这些图中所示的共有序列。本发明还包括以所述共有序列和被鉴定的保守区为基础构建的其他有用的多肽。因此，有用的多肽包括下述多肽，所述多肽包含图1-5中所列各个图中各比对表中的一个或多个编号的保守区，其中所述保守区可以被短线隔开。有用的多肽还包括下述多肽，所述多肽包含选自图1-5的各个比对表中所有编号的保守区，或者包含各个比对表中所有编号的保守区并且按照选自图1-5中的各个比对表中所示的顺序。有用的多肽也包括下述多肽，所述多肽包含各个比对表中所有编号的保守区并且依照选自图1-5中的各个比对表中所示的顺序，其中保守区被短线隔开，其中两个相邻保守区之间的各个短线由比对表中所示的氨基酸组成。合适的多肽还包括下述多肽，所述多肽包含各个比对表中所有编号的保守区并且按照选自图1-5中的各个比对表中所示的顺序，其中保守区被短线隔开，其中两个相邻保守区之间的各个短线由针对前导和/或功能同源物序列的比对表中定义具体短线的位置上所示的氨基酸组成。共有序列中的这类短线可以在下述长度范围内变化比对序列之一的最小短线数的长度，高达比对序列之一的最高短线数的长度。
这类有用的多肽还可以具有下述长度(氨基酸残基总数)，所述长度等于针对共有序列所鉴定的长度，或在选自图1-5中各个比对表中鉴定的任何给定的前导和功能同源物序列家族的最短到最长序列范围内变化。
本发明还包括编码上述多肽的核苷酸及其互补序列，并包括以遗传密码子的简并性为基础的可选序列。
如此描述本发明后，本领域的普通技术人员应当明白，可对用于进行本发明的材料和方法进行多种修饰。这类修饰应当被认为属于由下文的权利要求书定义的本发明范围内。
来自本文所列的专利和期刊文献的各参考文献通过这类引用明确以其整体并入本文。
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<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1024)
<223>Ceres启动子YP0214
<400>61
<210>62
<211>911
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(911)
<223>Ceres启动子YP0263
<400>62
<210>63
<211>999
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(999)
<223>Ceres启动子YP0275
<400>63
<210>64
<211>981
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(981)
<223>Ceres启动子YP0285
<400>64
<210>65
<211>996
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(996)
<223>Ceres启动子YP0286
<400>65
<210>66
<211>1000
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1000)
<223>Ceres启动子YP0337
<400>66
<210>67
<211>1000
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1000)
<223>Ceres启动子YP0356
<400>67
<210>68
<211>1000
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1000)
<223>Ceres启动子YP0374
<400>68
<210>69
<211>998
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(998)
<223>Ceres启动子YP0377
<400>69
<210>70
<211>999
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(999)
<223>Ceres启动子YP0380
<400>70
<210>71
<211>1000
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1000)
<223>Ceres启动子YP0381
<400>71
<210>72
<211>999
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(999)
<223>Ceres启动子YP0384
<400>72
<210>73
<211>998
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(998)
<223>Ceres启动子YP0385
<400>73
<210>74
<211>1000
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1000)
<223>Ceres启动子YP0396
<400>74
<210>75
<211>1514
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1514)
<223>Ceres启动子p13879
<400>75
<210>76
<211>1954
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1954)
<223>Ceres启动子p326
<400>76
<210>77
<211>2016
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2016)
<223>Ceres启动子p32449
<400>77
<210>78
<211>1024
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1024)
<223>Ceres启动子PR0924
<400>78
<210>79
<211>857
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(857)
<223>Ceres启动子PD1367
<220>
<221>misc_feature
<222>(116)..(116)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(136)..(136)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(154)..(154)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(159)..(159)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(168)..(168)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(172)..(172)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(175)..(175)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(679)..(679)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(680)..(680)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(686)..(686)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(724)..(724)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<220>
<221>misc_feature
<222>(737)..(737)
<223>n是a、c、t、g、未知的，或其他
<400>79
<210>80
<211>884
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(884)
<223>Ceres CLONE ID号92459
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(884)
<223>也称为Ceres ME株系ME04077
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(884)
<223>也称为Ceres LEAD号15
<220>
<221>CDS
<222>(42)..(663)
<223>标识为SEQ ID NO81
<400>80
<210>81
<211>206
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(206)
<223>Ceres CLONE ID号92459
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(206)
<223>也称为Ceres CDNA ID号23361912
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(206)
<223>也称为Ceres ME株系ME04077
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(206)
<223>也称为Ceres LEAD号15
<220>
<221>misc_feature
<222>(117)..(166)
<223>Pfam名称K-box；Pfam说明K-box re.g.ion
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(59)
<223>Pfam名称SRF-TF；Pfam说明SRF-型转录因子(DNA-结合和二聚化结构域)
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型开花推迟
适用于推迟开花时间
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型深绿色
适用于提高叶绿素和光合能力
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型大
适用于制备更大的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型花序
适用于制备具有改变的花的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型茎生叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型莲座叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型锯齿叶缘
适用于制备具有增加的生物量和叶的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型锯齿叶缘
适用于制备具有增加的生物量和叶的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型植物尺寸
适用于制备具有增加的尺寸和叶的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型强壮
适用于制备具有更强壮的植物
<400>81
<210>82
<211>201
<212>PRT
<213>芜青(Brassica rapa)亚种pekinensis
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(201)
<223>Public GI号71834745
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(201)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
6.50E-66且同一性百分比为75.2
<400>82
<210>83
<211>196
<212>PRT
<213>欧洲油菜(Brassica napus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Public GI号31580813
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
3.09E-59且同一性百分比为67.5
<400>83
<210>84
<211>197
<212>PRT
<213>甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Publ ic GI号34591565
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
3.50E-58且同一性百分比为67.0
<400>84
<210>85
<211>197
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<220>
<221>mi sc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Ceres CLONE ID号1065387
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
1.30E-60且同一性百分比为67.0
<400>85
<210>86
<211>197
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Public GI号17933450
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(197)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
1.59E-60且同一性百分比为66.8
<400>86
<210>87
<211>196
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Public GI号17933456
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
4.99E-59且同一性百分比为66.4
<400>87
<210>88
<211>196
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Ceres CLONE ID号1091989
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
4.99E-59且同一性百分比为66.4
<400>88
<210>89
<211>196
<212>PRT
<213>欧洲油菜
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Public GI号17933458
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(196)
<223>Ceres CLONE ID号92459(SEQ ID NO.81)的功能同源物，与SEQ ID NO.81的e-值为
1.19E-57且同一性百分比为65.6
<400>89
<210>90
<211>614
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(614)
<223>Ceres CLONE ID号1952
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(614)
<223>也称为Ceres ME株系ME04701
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(614)
<223>也称为Ceres LEAD号28
<220>
<221>CDS
<222>(30)..(429)
<223>标识为SEQ ID NO91
<400>90
<210>91
<211>133
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(133)
<223>Ceres CLONE ID号1952
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(133)
<223>也称为Ceres ME株系ME04701
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(133)
<223>也称为Ceres LEAD号28
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型花序
适用于制备具有改变的花的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型莲座叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型植物构造
适用于制备具有提高的植物构造的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型分裂的莲座
适用于制备具有增加的生物量的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型披针形
适用于制备具有增加的生物量和叶的植物
<400>91
<210>92
<211>1383
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1383)
<223>Ceres CLONE ID号123905
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1383)
<223>也称为Ceres ME株系ME04717
<220>
<221>mi sc_feature
<222>(1)..(1383)
<223>也称为Ceres LEAD号29
<220>
<221>CDS
<222>(119)..(920)
<223>标识为SEQ ID NO93
<400>92
<210>93
<211>267
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>mi sc_feature
<222>(1)..(267)
<223>Ceres CLONE ID号123905
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(267)
<223>也称为Ceres ME株系ME04717
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(267)
<223>也称为Ceres LEAD号29
<220>
<221>misc_feature
<222>(134)..(197)
<223>Pfam名称AP2；Pfam说明AP2结构域
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型花序
适用于制备具有改变的花的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型莲座叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型植物构造
适用于制备具有提高的植物构造的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型分裂的莲座
适用于制备具有增加的生物量的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型披针形
适用于制备具有增加的生物量和叶的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型矮
适用于制备更矮的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型降低的顶端优势
适用于改变植物结构，即增加分枝
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型降低的能育性
适用于不育，遗传限制系统
<400>93
<210>94
<211>229
<212>PRT
<213>Populus balsamifera亚种trichocarpa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(229)
<223>1460991
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(229)
<223>Ceres CLONE ID号123905(SEQ ID NO.93)的功能同源物，与SEQ ID NO.93的e-值为
2.10E-35且同一性百分比为59.8
<400>94
<210>95
<211>256
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(256)
<223>Ceres CLONE ID号1494990
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(256)
<223>Ceres CLONE ID号123905(SEQ ID NO.93)的功能同源物，与SEQ ID NO.93的e-值为
4.19E-37且同一性百分比为49.2
<400>95
<210>96
<211>266
<212>PRT
<213>普通小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(266)
<223>Ceres CLONE ID号634402
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(266)
<223>Ceres CLONE ID号123905(SEQ ID NO.93)的功能同源物，与SEQ ID NO.93的e-值为
1.80E-36且同一性百分比为45.0
<400>96
<210>97
<211>274
<212>PRT
<213>稻(Oryza sativa)日本亚种
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(274)
<223>Public GI号51536200
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(274)
<223>Ceres CLONE ID号123905(SEQ ID NO.93)的功能同源物，与SEQ ID NO.93的e-值为
3.09E-34且同一性百分比为43.4
<400>97
<210>98
<211>541
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(541)
<223>Ceres CLONE ID号679923
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(541)
<223>也称为Ceres ME株系ME03195
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(541)
<223>也称为Ceres LEAD号36
<220>
<221>CDS
<222>(24)..(456)
<223>标识为SEQ ID NO99
<400>98
<210>99
<211>144
<212>PRT
<213>大豆
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(144)
<223>Ceres CLONE ID号679923
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(144)
<223>也称为Ceres ME株系ME03195
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(144)
<223>也称为Ceres LEAD号36
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(84)
<223>Pfam名称AP2；Pfam说明AP2结构域
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型开花推迟
适用于推迟开花时间
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型大
适用于制备具有改变的花的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型莲座叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型弯曲1
适用于制备具有改变的叶形状(例如弯曲的叶)的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型植物构造
适用于制备具有提高的植物构造的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型矮
适用于制备更矮的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型短叶柄
适用于制备更小的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型强壮
适用于制备具有更强壮的植物
<400>99
<210>100
<211>129
<212>PRT
<213>Populus balsamifera亚种trichocarpa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(129)
<223>1479788
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(129)
<223>Ceres CLONE ID号679923(SEQ ID NO.99)的功能同源物，与SEQ ID NO.99的e-值为
3.80E-36且同一性百分比为69.0
<400>100
<210>101
<211>143
<212>PRT
<213>Populus balsamifera亚种trichocarpa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(143)
<223>1533259
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(143)
<223>Ceres CLONE ID号679923(SEQ ID N0.99)的功能同源物，与SEQ ID NO.99的e-值为
3.49E-42且同一性百分比为66.6
<400>101
<210>102
<211>175
<212>PRT
<213>稻的日本亚种
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(175)
<223>Public GI号50941583
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(175)
<223>Ceres CLONE ID号679923(SEQ ID NO.99)的功能同源物，与SEQ ID NO.99的e-值为
1.20E-32且同一性百分比为65.8
<400>102
<210>103
<211>1681
<212>DNA
<213>大豆
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1681)
<223>Ceres CLONE ID号691319
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1681)
<223>也称为Ceres ME株系ME05057
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1681)
<223>也称为Ceres ME株系ME09233
<220>
<221>CDS
<222>(111)..(1470)
<223>标识为SEQ ID NO104
<400>103
<210>104
<211>453
<212>PRT
<213>大豆
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(453)
<223>Ceres CLONE ID号691319
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(453)
<223>也称为Ceres ME株系ME05057
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(453)
<223>也称为Ceres ME株系ME09233
<220>
<221>misc_feature
<222>(209)..(272)
<223>Pfam名称AP2；Pfam说明AP2结构域
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型莲座叶
适用于制备具有改变的叶的观赏植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型分裂的莲座
适用于制备具有增加的生物量的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型披针形
适用于制备具有增加的生物量和叶的植物
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型矮
适用于制备更矮的植物
<400>104
<210>105
<211>398
<212>PRT
<213>Populus balsamifera亚种trichocarpa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(398)
<223>1443093
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(398)
<223>Ceres CLONE ID号691319(SEQ ID NO.104)的功能同源物，与SEQ ID NO.104的e-值为
3.19E-73且同一性百分比为56.0
<400>105
<210>106
<211>393
<212>PRT
<213>Populus balsamifera subsp.trichocarpa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(393)
<223>1452324
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(393)
<223>Ceres CLONE ID号691319(SEQ ID NO.104)的功能同源物，与SEQ ID NO.104的e-值为
1.69E-67且同一性百分比为54.8
<400>106
<210>107
<211>877
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(877)
<223>Ceres CLONE ID号98850
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(626)
<223>标识为SEQ ID NO108
<400>107
<210>108
<211>192
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(192)
<223>Ceres CLONE ID号98850
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(162)
<223>Pfam名称K-box；Pfam说明K-box re.g.ion
<220>
<221>mi sc_feature
<222>(9)..(59)
<223>Pfam名称SRF-TF；Pfam说明SRF-型转录因子
(DNA-结合和二聚化结构域)
<400>108
<210>109
<211>1614
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1614)
<223>Ceres CDNA ID号36533702
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1614)
<223>也称为Ceres ME株系ME04012
<220>
<221>CDS
<222>(14)..(1523)
<223>标识为SEQ ID NO110
<400>109
<210>110
<211>503
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(503)
<223>Ceres CDNA ID号36533702
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(503)
<223>也称为Ceres ME株系ME04012
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(498)
<223>Pfam名称p450；Pfam说明Cytochrome P450
<220>
<221>misc_feature
<222>
<223>表型深绿色
适用于提高叶绿素和光合能力
<400>110
<210>111
<211>503
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(503)
<223>Public GI号42569483
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(503)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
1.49E-242且同一性百分比为89.4
<400>111
<210>112
<211>497
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(497)
<223>Public GI号2880054
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(497)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
1.69E-239且同一性百分比为89.3
<400>112
<210>113
<211>497
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(497)
<223>Public GI号22329490
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(497)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
1.49E-233且同一性百分比为86.6
<400>113
<210>114
<211>477
<212>PRT
<213>拟南芥
<220>
<221>mi sc_feature
<222>(1)..(477)
<223>Public GI号4835796
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(477)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
9.10E-218且同一性百分比为86.1
<400>114
<210>115
<211>509
<212>PRT
<213>Nepeta racemosa
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(509)
<223>Public GI号3582021
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(509)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
3.60E-113且同一性百分比为46.3
<400>115
<210>116
<211>494
<212>PRT
<213>Ammi majus
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(494)
<223>Public GI号46947673
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(494)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
1.10E-102且同一性百分比为46.0
<400>116
<210>117
<211>471
<212>PRT
<213>鳄梨(Persea americana)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(471)
<223>Public GI号117188
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(471)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
3.09E-107且同一性百分比为45.9
<400>117
<210>118
<211>529
<212>PRT
<213>稻的日本亚种
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(529)
<223>Public GI号34904242
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(529)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
2.70E-99且同一性百分比为45.5
<400>118
<210>119
<211>482
<212>PRT
<213>普通小麦
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(482)
<223>Ceres CLONE ID号921721
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(482)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
6.10E-102且同一性百分比为45.2
<400>119
<210>120
<211>515
<212>PRT
<213>普通小麦
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(515)
<223>Ceres CLONE ID号703961
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(515)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
6.10E-102且同一性百分比为45.2
<400>120
<210>121
<211>502
<212>PRT
<213>鳄梨
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(502)
<223>Public GI号25282608
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(502)
<223>Ceres CLONE ID号36533702(SEQ ID NO.110)的功能同源物，与SEQ ID NO.110的e-值为
3.69E-111且同一性百分比为45.2
<400>12权利要求
1.分离的核酸分子，其包含
(a)编码氨基酸序列的核苷酸序列，其与任一Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319至少85％相同，所述Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别为SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；
(b)与根据段(a)的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)根据任一SEQ ID No.80、90、92、98、109和103的核苷酸序列；
(d)当以5’到3’方向阅读时，与根据(c)的任一核苷酸序列反向的核苷酸序列；
(e)核苷酸序列，其为根据段(a)的核苷酸序列的干扰RNA；
(f)在比杂交核酸双链体的解链温度低约40℃到约48℃的温度下，能够与根据段(a)-(d)中任一个的核酸形成杂交核酸双链体的核苷酸序列；
(g)编码确定为Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319的氨基酸序列中任一个的核苷酸序列，所述Lead15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；或
(h)编码图1-5中任一前导序列、功能同源物或共有序列的核苷酸序列。
2.载体，其包含
(a)第一核酸，其具有编码植物转录和/或翻译信号的调节区；和
(b)第二核酸，其具有根据权利要求1的任一核苷酸序列的核苷酸序列，
其中所述第一核酸和第二核酸有效连接。
3.调节植物尺寸，调节营养生长，调节植物构造、幼苗活力、生长速率、果实和种子产率、分蘖和/或调节植物生物量的方法，所述方法包括向植物细胞中引入分离的核酸，所述分离的核酸包含选自以下的核苷酸序列
(a)编码氨基酸序列的核苷酸序列，其与任一Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319至少85％相同，所述Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；
(b)与根据段(a)的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)根据任一SEQ ID No.80、90、92、98、109和103的核苷酸序列；
(d)当以5’到3’方向阅读时，与根据(c)的任一核苷酸序列反向的核苷酸序列；
(e)核苷酸序列，其为根据段(a)的核苷酸序列的干扰RNA；
(f)在比杂交核酸双链体的解链温度低约40℃到约48℃的温度下，能够与根据段(a)-(d)中任一个的核酸形成杂交核酸双链体的核苷酸序列；
(g)编码确定为Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319的氨基酸序列中任一个的核苷酸序列，所述Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；或
(h)编码图1-5中任一前导序列、功能同源物或共有序列的核苷酸序列，其中与不包含所述核酸的对照植物的组织中相应的水平相比，从所述植物细胞产生的所述植物具有调节的植物尺寸、调节的营养生长、调节的植物构造、调节的幼苗活力和/或调节的生物量。
4.根据权利要求3的方法，其中所述共有序列包含图1-5任一比对表中鉴定的一个或多个保守区域。
5.根据权利要求4的方法，其中所述共有序列包含图1-5任一比对表中鉴定的所有保守区域。
6.根据权利要求5的方法，其中所述共有序列包含图1-5任一比对表中鉴定的所有保守区域，并顺序为图1-5中任一比对表中鉴定的顺序。
7.根据权利要求6的方法，其中所述保守区被一个或多个氨基酸残基隔开。
8.根据权利要求7的方法，其中各所述的一个或多个氨基酸在数量和种类上包含比对表中相应位置上针对前导序列和/或功能同源物序列所示的氨基酸。
9.根据权利要求8的方法，其中所述共有序列就氨基酸总数而言具有下述长度，所述长度等于图1-5之一中针对共有序列鉴定的长度，或等于任一图1-5中任何各个比对表中最短序列至最长序列范围间的长度。
10.权利要求3的方法，其中所述差异是植物尺寸、营养生长、器官数、幼苗活力、生长速率、果实和种子产率、分蘖和/或生物量水平的增加。
11.权利要求3的方法，其中所述分离的核酸与调节区有效连接。
12.权利要求11的方法，其中所述调节区是选自以下的启动子YP0092(SEQ ID NO38)、PT0676(SEQ ID NO12)、PT0708(SEQ ID NO17)、PT0613(SEQ ID NO5)、PT0672(SEQ ID NO11)、PT0678(SEQ IDNO13)、PT0688(SEQ ID NO15)、PT0837(SEQ ID NO24)、油菜籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP去饱和酶基因、β-伴大豆球蛋白的大豆α′亚基启动子、油质蛋白启动子、15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、β-淀粉酶基因启动子和大麦醇溶蛋白基因启动子。
13.权利要求11的方法，其中所述调节区是选自以下的启动子p326(SEQ ID NO76)、YP0144(SEQ ID NO55)、YP0190(SEQ ID NO59)、p13879(SEQ ID NO75)、YP0050(SEQ IDNO35)、p32449(SEQ ID NO77)、21876(SEQ ID NO1)、YP0158(SEQ ID NO57)、YP0214(SEQ IDNO61)、YP0380(SEQ ID NO70)、PT0848(SEQ ID NO26)和PT633(SEQ ID NO7)、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、来自根瘤农杆菌T-DNA的1’或2’启动子、玄参花叶病毒34S启动子、诸如稻肌动蛋白启动子的肌动蛋白启动子，以及诸如玉米泛素-1启动子的泛素启动子。
14.权利要求11的方法，其中所述调节区是选自以下的启动子核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子如来自美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子、来自小麦的Cab-1基因启动子、来自菠菜的CAB-1启动子、来自稻的cab1R启动子、来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子、烟草Lhcb1＊2启动子、拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子和来自菠菜的类囊体膜蛋白质启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS、PT0535(SEQ ID NO3)、PT0668(SEQ ID NO2)、PT0886(SEQ ID NO29)、PR0924(SEQ ID NO78)、YP0144(SEQ IDNO55)、YP0380(SEQ ID NO70)和PT0585(SEQ ID NO4)。
15.包含分离的核酸的植物细胞，所述核酸包含选自以下的核苷酸序列
(a)编码氨基酸序列的核苷酸序列，其与任一Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319至少85％相同，所述Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；
(b)与根据段(a)的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)根据任一SEQ ID No.80、90、92、98、109和103的核苷酸序列；
(d)当以5’到3’方向阅读时，与根据(c)的任一核苷酸序列反向的核苷酸序列；
(e)核苷酸序列，其为根据段(a)的核苷酸序列的干扰RNA；
(f)在比杂交核酸双链体的解链温度低约40℃到约48℃的温度下，能够与根据段(a)-(d)中任一个的核酸形成杂交核酸双链体的核苷酸序列；
(g)编码确定为Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319的氨基酸序列中任一个的核苷酸序列，所述Lead 15、28、29、36、ME04012和克隆691319分别对应于SEQ ID No.80、90、92、98、109和103；或
(h)编码图1-5中任一前导序列、功能同源物或共有序列的核苷酸序列。
16.转基因植物，其包含权利要求15的植物细胞。
17.权利要求16的植物的子代，其中与不包含所述核酸的对照植物组织中的相应水平相比，所述子代具有调节的植物尺寸、调节的营养生长、调节的植物构造、调节的幼苗活力、生长速率、果实和种子产率、分蘖和/或调节的生物量。
18.来自根据权利要求16的转基因植物的种子。
19.来自根据权利要求16的转基因植物的营养组织。
20.食物产品，其包含来自根据权利要求16的转基因植物的营养组织。
21.饲料产品，其包含来自根据权利要求16的转基因植物的营养组织。
22.用于转化为燃料或化学原料的产品，其包含来自根据权利要求16的转基因植物的营养组织。
23.用于检测样品中核酸的方法，其包括
提供根据权利要求1的分离的核酸；
将所述分离的核酸与样品在下述条件下接触，所述条件允许所述分离的核酸的核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列比较；和
分析所述比较。
24.用于促进植物中生物量增加的方法，其包括
(a)用下述核酸分子转化植物，所述核酸分子包含编码图1-5中任一前导序列、功能同源物或共有序列的核苷酸序列；和
(b)在所述被转化的植物中表达所述核苷酸序列，由此所述被转化的植物与未用所述核苷酸序列转化的植物相比，具有增加的生物量或增强的幼苗活力。
25.调节植物生物量的方法，所述方法包括改变所述植物中根据权利要求1的核酸分子的表达水平。
全文摘要
本发明涉及经分离的核酸分子及其编码的相应多肽，所述核酸分子和多肽能够赋予植物调节的植物尺寸、营养生长、器官数、植物构造、生长速率、幼苗活力、生长速率、果实和种子产率、分蘖和/或生物量的性状。本发明还涉及这些核酸分子和多肽在制备转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子中的用途，所述转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子与相似条件下生长的野生型植物相比，具有改变的植物尺寸、营养生长、器官数、植物构造、生长速率、幼苗活力和/或生物量。
文档编号C12N15/79GK101370938SQ200580052564
公开日2009年2月18日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者N·亚历山德洛夫, V·布罗沃, P·麦斯西亚, K·A·弗莱德曼, C·克里斯坦森, G·纳扎恩 申请人:塞瑞斯公司