专利名称：：赋予植物被调节的生长速率和生物量的核苷酸序列及相应多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分离的核酸分子及其相应被编码的多肽，所述分离的核酸分子及其相应的多肽能够调节植物生长速率、营养生长、器官大小、结构、幼苗活力和/或生物量。本发明进一步涉及使用所述核酸分子和多肽以使转基因植物、植物细胞、植物材料(plantmaterial)或植物种子与相似"IHt下生长的野生型植物相比具有调节的生长速率、营养生长、器官数量、结构、幼苗活力和/或生物量。
背景技术：
：针对农业、园艺、生物量转化及其它工业(例如造纸工业、作为蛋白质或其它化合物的制备工厂(factory)的植物)特异性改良植物能够采用分子技术而实现。例如，通过调节植物整林或其任意器官的大小或者其任意器官的数量，可以产生巨大的农业价值。与之类似，调节整林植物或植物特定的部份的大小和高度、或生长速率或幼苗活力可以使植物产出更好地适应特定的工业。例如，减小特殊农作物和树种的高度可以对于允许更容易的收获是有益的。另外，对于提供可用于加工成食物、饲料、燃料和/或化学品的更大的生物量，增加高度、厚度或器官大小、器官数量可以是有益的(见美国能源部网站(USDepartmentofEnergywebsite)的能效和可再生能源(EnergyEfficiencyandRenewableEnergy))。其它商业中需要的性状的例子包括增加插花的花茎长度，增加或改变叶片大小和形状或者增大种子和/或果实的大小。器官大小、器官数量和生物量的改变也导致诸如次级产物的组成分子的量的改变以及使植物转化为产生以上化合物的工厂。动物和人类赖以为生的食物和饲料的可再生流的获得与维持，在贯穿人类文明的历史中非常重要，并且成为农业的起源。农学、农业、农作物科学、园艺学和林业科学的专家和研究者们至今还在努力发现和生产具有加速生长潜力的植物以供养不断增加的世界人口并且保证可再生的原料的供给。在这些科学领域中的坚实的研究水平表明，世界上每个地理环境和气候中的领先者的重要水平使得为人类提供食物、飼料、化学品和能源的持续的来源通过植物育种对农作物表现进行操作已经常规实施了几个世纪。然而，这样的育种过程既是耗费时间的又是劳动密集型的。而且，适当的育秤计划必须是特定地为各相关植物物种设计的。另外，应用分子遗传学方法处理才直物以获得更好的农作物已经取得了^艮大的进步。通过植物的重组核酸的引入和表达，研究者们现在能够提供具有下述植物物种的群落，所述植物物种被特定为生长得更加有效并且无论在如何罕见的地理和/或气候环境下均可生产更多的产物。这些新方法具有的优势为其不会被限定在一种植物种，而相反可以适用于多种不同植物种(Zhang等人(2004)尸/fl"f户Ajwo/.135:615)。尽管已取得进步，但目前对于广泛适用的方法仍有根大需求，这种方为此目的，目前的发明是针对于有利地处理植物大小、器官数量、植物生长速率、植物结构和/或生物量以根据营利性和特定环境而使各种农作物的收益最大化，而在所述环境中植物必须生长，且特征在于重組DNA分子在植物中表达。
发明内容因此，本发明涉及分离的核酸分子和多肽及其在如下方面的应用生产转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子，所述植物相比于在相似或相同的条件下种植的野生型植物具有改变的生命周期，特别是改变的植物大小、营养生长、植物生长速率、器官数量、植物结构和/或生物量。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域一般技术人员所通常理解的含义一致。图1，前导(Leads)80、81、113、114、ME08328、ME01905、ME01770、ME20023(克隆18200)和ME21445,SEQIDNO.95、97、91、83、89、85、87、93、81的同源物的^i^,列比对。保守区被包括在框中。共有序列在所述比对的下方显示。具体实施方式l.发明本申请的发明可描述为但不必需限于如下示例性实施方案。本发明公开了新的分离的核酸分子、干涉这些核酸分子的核酸分子、与这些核酸分子杂交的核酸分子和由于DNA密码子简并编码相同蛋白质的分离的核酸分子。本申请的另外的实施方案还包括用本发明的分离的核酸分子编码的多肽。更加特别的是，本发明的核酸分子包括(a)编码氨基酸序列的核普酸序列，其至少有85。/。与分别对应于SEQIDNO.94、96、卯、82、88、84、86、92、80的前导80、81、113、114、ME08328、ME01905、ME01770、ME21445和ME20023中的任何一个同一；(b)与依照U)中的任何一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；(c)依照任何一个SEQIDNO.94、96、90、82、88、84、86、92、80中的核普酸序列；(d)当从沿5'端至向3'方向端阅读时，与依照(c)中任何一个核苷酸序列处于相反顺序的核苷酸序列；(e)能够干涉依照(a)的任何一个核苷酸序列的核普酸序列；(f)在低于所述杂交核酸双链体的解链温度大约40'C到大约48。C的温度下，能够与依照段(a)到段(e)的任何一个核酸形成杂交核酸双链体的核苷酸序列；和(g)编码分别对应SEQIDNO.95、97、91、83、89、85、87、93、81的前导80、81、113、114、ME08328、ME01905、ME01770、ME21445和ME20023的氨基酸序列中任何一个的核苦酸序列。本发明的另外的实施方案包括在SEQIDNO.94、95、96、97、90、91、82、83、88、89、84、85、86、87、92、93、80、81中乂〉开的那些多肽和核酸分子序列。本发明进一步实施为载体，其包含具有编码植物转录和/或翻译信号的核苷酸序列的第一核酸，以及具有依据本发明所述分离的核酸分子的核苷酸序列的第二核酸。更特别的是，所述第一和第二核酸可有效连接。甚至更为特别的是，所述第二核酸可对于第一生物是内源的，并且栽体中的任何其它核酸可对于第二生物是内源的。最为特别是，第一和第二生物可以是不同的物种。在本发明的另外的实施方案中，宿主细胞可包含依据本发明的分离的核酸分子。更特别的是，本发明的宿主细胞中发现的本发明的分离的核酸分子对于笫一生物是内源的，并且可被对于第二生物是内源的核苷^列侧接。此外，所述笫一和第二生物可以是不同的物种。甚至更为特别的是，本发明的宿主细胞可包含依据本发明的载体，所述载体本身包含依据本发明所迷的核酸分子。在本发明的另一实施方案中，本发明的分离多肽可另外包含#^*列，所述^J^酸序列至少有85%与分别对应于SEQIDNO.95、97、91、83、89、85、87、93、81的前导80、81、113、114、ME08328、ME01905、ME01770、ME21445和ME20023中的任何一个同一。本发明的其它实施方案包括将本发明的分离的核酸引入宿主细胞的方法。更特别的是，本发明的分离的核酸分子可在允许分离核酸进入宿主细胞的转运的条件下，与宿主细胞接触。更为特别的是，本发明前述实施方案中所描述的载体，可通过同样方法引入到宿主细胞中。检测方法作为本发明的实施方案也是可得的。特别的，为在样品中检测依据本发明的核酸分子的方法。更特别的是，可在允许将分离的核酸分子的核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列相比较的条件下，将依据本发明的分离的核酸分子与样品接触。这种分析的结果随后可被认为确定本发明的分离的核酸分子是否可检测以及因此是否存在于样品中。本发明的另一实施方案包括包含本发明分离的核酸分子和/或载体的植物、植物细胞、植物材料或植物种子。更特别的是，所述本发明的分离的核酸分子对于植物、植物细胞、植物材料或植物种子而言是外源的。本发明的另一实施方案包括从依据本发明植物细胞或种子中再生的植物。更特别的是，本发明的植物、由所述植物得到的植物、植物细胞、植物材料或植物种子与在相同的种植条件下的野生型植物相比，优选具有增加的大小(整体或部分)、增加的营养生长、增加的器官数量和/或增加的生物量(有时在下文中一起4皮称作增加的生物量)、致死率、不育性或观赏植物的特征。此外，转基因植物可包含本发明中的编码参与调节生长和表型特征的蛋白质的第一分离的核酸分子，和编码能够驱动在植物中表达的启动子的第二分离的核酸分子，其中生长和表型的调节组分和启动子有效连接。更优选地，所述第一分离的核酸可在本发明转基因植物中异常表达，并且所述转基因植物与缺少所述多核苷酸的祖代植物相比，表现出调节的特性，这是当所述转基因植物和祖代植物在相同环境M下栽培时。在本发明的另一实施方案中，所述调节的生长和表型特征可由于特定序列的失活，例如使用干扰RNA。另外的实施方案由以下组成依据本发明的植物、植物细胞、植物材料或植物种子，其包含本发明的分离的核酸分子，其中所述植物或由所述植物得到的植物、植物细胞、植物材料或植物种子与在相同条件下栽培的野生型植物相比，具有调节的生长和表型特征。赋予增加的生物量或活力的多核苷酸可在本发明转基因植物中异常表的生物量或活力，当所述转基因植物与所迷祖代植物在相同环境条件下栽培时。在本发明的另一实施方案中，增加的生物量或活力表型可以是由于特定序列的失活，例如使用干扰RNA。另一实施方案由以下组成依据本发明的植物、植物细胞、植物材料或植物种子，其包含本发明的分离的核酸分子，其中所述植物或由所述植物得到的植物、植物细胞、植物材料或植物种子与在相同条件下栽培的野生型植物相比，具有增加的生物量或活力。本发明的另一实施方案包括增加植物生物量或活力的方法。更特別的是，这些方法包括用依据本发明的分离的核酸分子转化植物。优选地，所述方法是增强转化的植物中生物量或活力的方法，其中所述植物可用编码本发明的多肽的核酸分子进行转化。本发明的多肽包括共有序列。所述共有序列在图1中列出。2.定义下列术语在本申请中应用生物量本文所用"生物量"指有用的包括目的产物的生物材料，所述材料将被收集并且将进一步加工以分离或浓缩所述目的产物。"生物量，，可包括果实或其部分或种子、叶或茎或根，其中这些是对于产业目的具有特殊兴趣的植物部分。"生物量"，其指植物材料，包括含有或表现所述目的产物的植物的任何一个或多个结构。转化用于完成转化的方法的例子叙述如下并包括双子叶植物的土壤杆菌属(JgraM"en'M附)介导的转化(Needleman和Wunsch(1970)/.3Zo/.B/o/.48:443;Pearson和Lipman(1988)尸ciVflr汰爿o/AS"「CASH)85:2444)，单子叶植物的土壤杆菌属介导的转化(Yamauchi等人(1996)Mo/说W.30:321-9;Xu等人(1995)7V做fMo,.27:237;Yamamoto等人(1991)尸/朋ZCe//3:371)，和生物射弹法(P.Tijessen,"HybridizationwithNucleicAcidProbes"JLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,P.C.vandderVliet,编著，c.1993byElsevier,Amsterdam),电穿孔，植物内(inplanta)技术，等等。包含外源性核酸的此类植物在此被称作，对于初级转基因植物为TQ，对于第一代为Tp功能可比蛋白质(Functionallycomparableproteins)或功能同源物这一术语描迷了具有至少一种共同功能特征的那些蛋白质。这些特征包括序列相似性、生化活性、转录模式相似性和表型活性。典型地，功能可比蛋白质共有某些序列相似性或至少一种生化活性。在该定义内，类似物浮皮认为是功能上可比的。另外，功能可比蛋白质通常共有至少一种生化和/或表型活性。功能可比蛋白质引起相似、但不必相同程度的相同特性。典型地，可比蛋白质给出相同的特性，其中对可比物之一的定量测量为另一个的至少20%;更典型的是在30-40°/。之间；甚至更为典型的是在50-60%之间；甚至更加典型的是在70-80%之间；甚至更加典型的为另一个的90-100%之间。异源序列"异源序列"为那些天然未有效连接的或彼此不邻接的序列。例如，玉米的启动子被认为是与拟南芥(v4m6,V/o/w/s)编码区序列异源的。而且，来自玉米中编码生长因子的基因的启动子初L认为与编码生长因子玉米受体的序列异源。天然并非来自与编码序列同一基因的调控元件序列，例如UTR或3'末端终止序列，被认为与所述编码序列异源。天然有效相连并且彼此邻接的元件相互间不是异源的。另一方面，如果其它填充序列被放置在这些相同元件之间，这些元件保持有效相连，但成为异源的。因此，启动子和表达M酸转运蛋白的玉米基因的编码序列彼此不是异源的，但是以新的方式有效连接的启动子和玉米基因的编码序列是异源的。异常表达术语"异常表达，，是指与野生型相比，增加或减少编码区向互补RNA序列的转录。这一术语还包括与野生型相比进行不同时间阶段的基因或编码区的表达和/或翻译，或者此类转录和/或翻译的抑制，和/或来自植物基因组中的非天然位置，包括来自不同植物种或来自非植物生物的基因或编码区域。序列同一性百分比在此使用的术语"序列同一性百分比"为任何所给出的查询序列和目标序列之间的同一性程度。采用计算机程序ClustalW(版本1，83，默认参数)将查询核酸或M酸序列与一个或多个目标核酸或氨基酸序列比对，该计算机程序允许核酸或蛋白质序列在它们的全长上进行比对(总体比对)。ClustalW计算查询序列与一个或多个目标序列之间的最佳匹配，并比对它们从而确定同一性、相似性和差别。一个或多个残基的空位可以被插入到查询序列、目标序列或二者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的快速配对比对，4吏用下列默认参数字长2;窗口大小4;计分方法百分比；上方对角线数量4;空位罚分5。对于核酸序列的多重比对，使用下列参数空位开放罚分10.0;空位延伸罚分5.0;权重转换是。对于蛋白质序列的快速配对比对，使用下列参数字长1;窗口大小5;计分方法百分比；上方对角线数量5;空位罚分3。对于蛋白质序列的多重比对，使用下列参数权重矩阵blosum;空位开放罚分10.0;空位延伸罚分0.05;亲水性空位开；亲水性残基Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys;残基-特定的空位罚分开。输出^L^映了序列之间关系的序列比对。可以运行ClustalW，例如，在万维网的贝勒医学院搜索引擎网站(BaylorCollegeofMedicineSearchLauncherwebsite)和在欧洲生物信息研究所网站(EuropeanBioinformaticsInstitutewebsite)运行。在功能同源物搜索的情况中，为了确保目标序列与查询序列具有相同的功能，必须沿着至少80%查询序列的长度进行比对，以使大多数查询序列被目标序列所覆盖。为了测定查询序列与目标序列之间的同一性百分比，ClustalW令最佳比对中同一性的数量除以用于比较的残基数量(排除空位)，所得结果乘以100。输出是目标序列关于查询序列的同一性百分比。注意，同一性百分比的值可以近似到十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14向下近似到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78,19向上近似到78.2。调节区(RegulatoryRegions):术语"调节区"为这样的核苷酸序列，即当所述核苷酸序列有效连接到序列上时，影响序列的转录起始或翻译起始或转录终止，和所述过程的速率，和/或转录或翻译产物的稳定性和/或移动性。在此使用的术语"有效连接"为调节区和所迷序列的定位，以使得能够产生所述影响。调节区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导元件、蛋白质结合序列、5，和3'未翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列和内含子。调节区被分为两类，启动子和其它调节区。幼苗活力在此使用的"幼苗活力，，为植物特性，借此，在相似条件下与野生型或对照相比较，使得植物从土壤中更快出现，具有增加的发芽率(即，更快发芽)，具有更快和更大的幼苗生长和/或在冷条件更快发芽。幼苗活力通常被定义为包含了种子性质，所述种子性质决定了"正常幼苗在大范围田间M下的快速、均匀出现和发育的潜力"。严谨性(stringency):在此使用的"严谨性"为核酸分子探针长度、核酸分子探针组成(G+C含量)，盐浓度，有机溶剂浓度和杂交温度和/或洗涤条件的函数。依照不同于Tm的温度，通常通过参数Tm衡量严谨性，所述Tm是这样的温度，在此温度下杂交测定中50。/。的互补核酸分子杂交。高严谨性条件为提供了Tm-5°C至Tm-10。C的条件的那些。中度或适中严谨性条件为提供了Tm-20°C至Tm-29°C的条件的那些。低严谨性M为提供了Tm画40oC至Tm誦48。C的条件的那些。杂交条件与Tm(。C)之间的关系可用数学方程表示Tm=81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)(I)其中，N为核酸分子探针的核苷酸数量。这一方程适用于与耙序列相同的长度为14-70个核苷酸的探针。下述关于DNA-DNA杂化物Tm的方程，适用于长度范围为50至大于500个核苦酸的探针，以及包括有机溶剂(甲酰胺)的条件Tm=81.5+16.6log{[Na+]/(l+0.7[Na+)}+0.41(%G+C)-500/L0.63(甲酰胺％)(n)其中，L代表了杂化物探针的核苷酸数量(21)。方程II中的Tm受杂化物性质的影响对于DNA-RNA杂化物，Tm比计算值高10-15。C;对于RNA-RNA杂化物，Tm高20-25。C。因为当使用长探针时，同源性每降低1%，Tm就降低大约1。C(Frischauf等人(1983)/Mo/丑,W，170:827-842)，所以调整严谨性条件以利于检测相同基因或相关家族成员。假定反应平衡则得到方程II。因此，本发明的杂交最优选在探针过量并允许足够时间达到平衡的条件下进行。达到平衡所需的时间可以采用杂交緩沖液缩短，该杂交緩冲液包括杂交加速剂，例如疏酸葡聚糖或其它高容量聚合物。在杂交反应过程中或发生杂交后，可以通过改变洗涤溶液的盐和温度条件控制严谨性。当用于计算洗涤溶液的严谨性时，上述^^式同样有效。在上述范围内有优选的洗涤溶液严谨性；高严谨性比Tm低5-8。C，中度或适中严谨性比Tm低26-29。C，低严谨性比Tm低45-48。C。To:术语"T。"是指用转化培养基接种的整林植物、外植体或愈伤组织。T1:术语1\为整#^物转化时植物Tg的子代，或外植体或愈伤组织转化时再生的幼苗。T2:术语T2为植物T，的子代。T2子代为植物T,自体受精或异花传粉的结果。T3:术语T3为植物的第二代子代，所述植物为转化实验的直接结果。T3子代为植物T2自体受精或异花传粉的结果。3.本发明多核苷酸和多肽的重要特性本发明的核酸分子和多肽是有意义的，因为当所述核酸分子异常表达时(即相对于野生型在非天然位置或以增加或降低量表达)，它们产生这样的植物，所述植物与野生型相比，表现出调节的生物量、生长速率或幼苗活力，如下公开的多种实验结果所证明的。这一性状可被用于开发或最大化植物产品。例如，本发明核酸分子和多肽被用于增加基因的表达，所述基因4吏得植物具有调节的生物量、生长速率或幼苗活力。由于所述^Hf的序列和方法增加了营养生长和生长速率，因此^^开的方法可被用于提高生物量生产。例如，与未被遗传修饰用于实质性营养生长的同种植物相比，营养生长的植物具有增加的生物量产生。当与非营养生长的同种植物的生物量产生的量相比，生物量产生增加的实例包括至少5%、至少20%或甚至至少50%的增加。有花植物的生命周期大体可分为三个生长期营养阶段、花序阶段和开花阶段(后花序阶段)。在营养阶段，茎端分生组织(SAM)生成叶子，所述叶随后将确保产生能育后代所必需的能源。当接受适当的环境和发育信号时，植物开始开花或繁殖、生长，并且SAMi^花序阶段(I)并引发具有花原基的花序。在这一阶段，SAM和从叶腋中生出的次生枝条的命运是由一组分生组织身份基因(identitygene)决定的，其中一些阻碍而其中一些促进花分生组织的发育。一旦确定，植物进入其中生成花器官的后花序阶段。如果所述使植物开花或繁殖生长的适当的环境和发育信号被中断，植物将不能i^繁殖生长，从而维持营养生长。种子或幼苗活力是极大地影响植物(例如作物植物)成功生长的重要特征。不良的环境条件，例如干旱、潮湿、冷或热条件，能够影响植物生长周期，以及种子活力(即在这样的条件下活力和强度能区分成功和失败的作物生长)。幼苗活力通常^Ml定义为包含种子的性质，所述性质确定了"正常幼苗在大范围的田间条件下的快速、均匀出现和发育的潜力"。因此，开发具有增加的活力的植物种子是有利的。例如，增强幼苗活力将有助于谷类植物如稻、玉米、小麦等的生产。对于这些作物，在种植季节冷的环境温度通常能减慢或停止生长。而且，稻的快速出现和分蘖将允许生长物开始更早的淹水灌溉，这样能保存水分和抑制弱生长。因此，寻找稻中与增加的种子活力和/或耐冷相关的基因，用以产生改良的稻品种。见，例如，Pinson，S.，"MolecularMappingofSeedlingVigorQTLsinTropicalRice",USDAAgriculturalResearchService,2000年12月16日。幼苗活力可以用不同的测试和测定衡量，包括最典型的耐冷试验和加速老化试验。本发明的一些核苷酸序列能够编码碱性-螺旋-环(bHCH)转录因子。已知转录因子通常控制途径中多种基因的表达。碱性/螺旋-环-螺旋(BHLH)蛋白质是转录因子的超家族，能以二聚体结合特定DNA耙位点。bHLH转录因子已在非植物真核细胞中被良好地表征，并且在多种生物过程中被鉴定为重要的调控组分。在动物中，已经鉴定了所述蛋白质的许多不同功能，包括控制细胞增殖和转录，通常涉及到同源或异源二聚体形成。植物转录因子的R/B碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族参与多种生长和分化过程。威性-螺旋-环-螺旋(bHLH)是蛋白质结构基序，表征了转录因子家族。基序的特征为两个a螺旋通过环连接。这一类型的转录因子一般是二聚的，每个都带有一个包含促进DNA结合的碱性氨基酸残基的螺旋。一个螺旋通常较小，并且由于环的弹性(flexibility),允许通过针对另一个螺旋折叠和填充来形成二聚体。通常较大的螺旋含有DNA结合区域。bHLH蛋白质通常结合到被称为E-框的共有序列，CANNTG上。标准的E-框为CACGTG，然而，一些bHLH转录因子会结合到不同的序列上，这些序列通常与E-框相似。在发育或细胞活性方面，bHLH转录因子常常很重要。4.本发明的多肽/多核苷酸本发明的多核苷酸和通过翻译这些多核苷酸表达的蛋白质在序列表，具体地SEQIDN094、95、96、97、90、91、82、83、88、89、84、85、86、87、92、93、80、81中列出。所述序列表也由功能可比蛋白质组成。包含其中的序列并且由共有序列之一定义的多肽，可以被用于本发明的目的，也就是使得转基因植物具有调节的生物量、生长速率和/或幼苗活力。应用多肽产生转基因植物变体和/或融合体和/或变体，制备重组DNA构建体，包括将本发明的多核苷酸序列插入到适用于植物细胞的转化的载体中。采用标准重组DNA技术(见Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，NewYork.)制备构建体并将它们引入到目的植物物种中，这是通过例如土壤杆菌介导的转化，或通过其它转化方式，例如下文所描述的。载体主链可以是本领域中通常应用的任意的那些，例如质粒、病毒、人工染色体、BAC、YAC、PAC以及载体，例如细菌-酵母穿梭载体、k噬菌体栽体、T-DNA融合栽体和质粒载体(见Shizuya等人(1992)iVa汰^cflw/.C/&4，89:8794-8797;Hamilton等人(1996)7Vflf/.5W.fAS"A93:9975-9979;Burke等人(1987)S"^i"，236:806-812;SternbergN.等人(1990)/Voc7V"rf爿ow/6/SJ.，87:103-7;Bradshaw等人(1995)7Vmc/^c,Vfc及es，23:4850-4856;Frischauf等人(1983)/.Mo/5/o/，170:827-842;Huynh等人，Glover醒(编著)DNACloning:ApracticalApproach,第1巻Oxford:IRLPress(1985);Walden等人(1990)Mo/CW/必/o/l:175-194)。通常，所述构建体包括含有本发明核酸分子的载体，所述核酸分子带有任何所需的转录和/或翻译的调控序列，例如启动子、UTR和3'末端终止序列。载体也可包括，例如复制起点、支架附着区(SAR)、标记物、同源序列和内含子。载体还可以包括赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。所述标记物可以优选地编码杀生物剂抗性性状，尤其是抗生素抗性(例如对卡那霉素、博来霉素或潮霉素的抗性)，或除草剂抗性(例如对草甘磷、氯磺隆或草IT磷(phosphinotricin)的抗性)。可以理解的是，在重组多核苷酸中存在不只一个调节区，例如，内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导元件。因此，不只一个调节区可与所述序列有效连接。为将启动子序列与序列"有效连接"，所述序列的翻译读框的翻译起始位点被通常定位在所述启动子下游的1个和大约50个核苷酸之间。然而，启动子可^^定位在所述翻译起始位点上游多至大约5,000个核苷酸，或所述转录起始位点上游大约2,000个核苷酸。启动子通常至少包含核心(基础)启动子。启动子还可包括至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。例如，适合的增强子为来自章鱼碱合酶(ocs)基因上游的顺式-调节元件(-212至-154)。Fromm等人，rAeZVfl"fCW/1:977-984(1989)。基础启动子是装配转录起始所必须的转录复合体的最小序列。基础启动子一般包括"TATA框"元件，其可位于转录起始位点上游大约15个至大约35个核苷酸之间。基础启动子也可包括"CCAAT框"元件(典型地序列CCAAT)和/或GGGCG序列，其可位于转录起始位点上游大约40个至大约200个核苷酸之间，通常在大约60个至大约120个核苷酸之间。待包括的启动子的选择取决于多种因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、预期表达水平和细胞或组织优先表达。相对于序列适当选取和定位启动子和其它调节区以调节所迷序列表达，对于本领域一般技术人员而言是一项常规操作。一些适当的启动子仅仅或显著在某些细胞类型中起始转录。例如，可以使用在繁殖组织(例如，果实、胚珠、花粉、雌蕊、雌配子体、卵细胞、中央细胞、珠心、胚柄、助细胞、花、胚胎组织、胚嚢、胚、合子、胚乳、珠被或种皮)中显著有活性的启动子。因此，本文所使用的细胞类型或组织优先启动子是这样的启动子，其驱动在耙组织中优先表达，但是也可以引起在其它细胞类型或组织中的一些表达。在植物基因组DNA中鉴定和表征启动子区域的方法包括，例如，在下述文献中叙述Jordano，等人，7V朋《Ce〃，1:855-866(1989);Bustos，等人，iV朋/Ce//，1:839-854(1989);Green,等人，/.7,4035-4044(1988);Meier，等人/Vfl"fCW/，3，309-316(1991);和Zhang等人"/V"Wi^戸/ofo^110:1069-1079(1996)。各种类型的启动子的例子描述如下。一些表示如下的启动子的更多细节在美国专利申请Ser.No.60/505,689、60/518,075、60/544,771、60/558,869、60/583,691、60/619,181、60/637,140、10/950,321、10/957,569、11/058,689、11/172,703、11/208,308和PCT/US05/23639中叙述。要了解启动子可以基于其在一种植物物种中的活性符合一种分类标准，但是基于它在另一种植物物种中的活性满足不同的分类标准。其它调节区5'未翻译区(UTR)能够被包括在本文所叙述的核酸构建体中。5，UTR被转录，但是未被翻译，且位于转录开始位点和翻译起始密码子之间，且可包括+l核普酸。3，UTR可位于翻译终止密码子和转录末端之间。UTR可具有特定功能，如增加mRNA稳定性或减弱翻译。3，UTR的例子包括但不限于多腺苷酸化信号和转录终止序列，例如，胭脂碱合酶终止序列。多种启动子可用于驱动本发明的多核苷酸的表达。此类启动子的核苷酸序列在SEQIDNO:1-79中列出。其中一些可以是广&达的启动子，其它可以是更加組织优先的。当启动子在多数但不必是全部的植物组织或植物细胞中启动转录时，它可被称为"广泛地表达"。例如，广泛表达的启动子可在一个或多个枝条、枝条顶端(尖)和叶中启动有效连接的序列的转录，但在組织例如根或茎中弱或根本不启动。作为另外的实例，广j^达的启动子可以在一个或多个茎、枝条、枝条顶端(尖)和叶中启动有效连接的序列的转录，但是在组织例如花的繁殖组织和发育种子中弱或根本不启动转录。本文提供的包括在核酸构建体中的广泛表达的启动子的非限制性实例包括p326(SEQIDNO:76)、YP0144(SEQIDNO:55)、YP01卯(SEQIDNO:59)、pl3879(SEQIDNO:75)、YP0050(SEQIDNO:35)、p32449(SEQIDNO:77)、21876(SEQIDNO:1)、YP0158(SEQIDNO:57)、YP0214(SEQIDNO:61)、YP0380(SEQIDNO:70)、PT0848(SEQIDNO:26)和PT0633(SEQIDNO:7)。另外的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合酶(MAS)启动子、源自于根瘤土壤杆菌T-DNA的l，或2，启动子、玄参花叶病毒34S启动子、肌动蛋白启动子诸如稻肌动蛋白启动子、泛素启动子诸如玉米泛素-1启动子。有些情况下，CaMV35S启动子被排除在广泛表达启动子的类别之外。根活性启动子驱动在根组织中的转录，所述根組织例如，根内皮层、根表皮或根维管組织。在一些实施方案中，根活性启动子为根-优先型启动子，例如，仅在或显著在根组织中驱动转录。根-优先型启动子包括YP0128(SEQIDNO:52)、YP0275(SEQIDNO:63)、PT0625(SEQIDNO:6)、PT0660(SEQIDNO:9)、PT0683(SEQIDNO:14)和PT0758(SEQIDNO:22)。其它才艮优先型启动子包括PT0613(SEQIDNO:5)、PT0672(SEQIDNO:11)、PT0688(SEQIDNO:15)和PT0837(SEQIDNO:24)，其主要在根组织中驱动转录，并且以较小的程度在胚珠和/或种子中驱动转录。其它根-优先型启动子的实例包括CaMV35S启动子的根特异性亚域(Lam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.Usa86:7890-7894(1989))，Conkling等人，Physiol.93:1203-1211(1990)报道的根细胞特异性启动子和烟草RD2基因启动子。在一些实施方案中，在成熟中的胚乳中驱动转录的启动子可以是有用的。来自成熟胚乳启动子的转录通常在受精后开始，并主要发生于种子发育期间的胚乳组织中，并且通常在细胞化期(cellularizationphase)最高。最合适的是显著在成熟中的胚乳中有活性的启动子，尽管有时能够使用在其它组织中也有活性的启动子。可以包含在本文提供的核酸构建体中的成熟中胚乳启动子的非限制性实例包括油茱籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子(Bustos等人(1989)Plantcell1(9):839-853)、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子(Riggs等人(1989)PlantCell1(6):609-621)、ACP启动子(Baerson等人(1993)PlantMolBoil,22(2):255-267)、硬脂酰-ACP去饱和酶基因(Slocombe等人(1994)PlantPhysoil104(4):167-176)、卩-伴大豆球蛋白的大豆a，亚基启动子(Chen等人(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:8560-8564)、油质蛋白启动子(Hong等人(1997)PlantMolBoil34(3):549-555)和玉米醇溶蛋白启动子，例如15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子和27kD玉米醇溶蛋白启动子。同样适合的为来源于稻的谷蛋白-1基因的Osgt-l启动子(Zheng等人(1993)A/o/.CW/5"/.13:5829-5842),p-淀粉酶基因启动子和大麦的大麦醇溶蛋白基因启动子。其它成熟胚乳启动子包括YP0092(SEQIDNO:38)、PT0676(SEQIDNO:12)、和PT0708(SEQIDNO:17)。在子房组织如胚珠壁和中果皮中驱动转录的启动子也可以是有用的，例如聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonidase)启动子、香蕉TRX启动子和瓜肌动蛋白启动子。优先在胚珠中驱动基因表达的其它这类启动子为YP0007(SEQIDNO:30)、YP0111(SEQIDNO:46)、YP0092(SEQIDNO:38)、YP0103(SEQIDNO:43)、YP0028(SEQIDNO:33)、YP0121(SEQIDNO:51)、YP0008(SEQIDNO:31)、YP0039(SEQIDNO:34)、YP0115(SEQIDNO:47)、YP0119(SEQIDNO:49)、YP0120(SEQIDNO:50)和YP0374(SEQIDNO:68)。在本发明的一些其它实施方案中，可以使用胚嚢/早期胚乳启动子，从而在极核和/或中夹细胞中，或在极核前体中，但不在卵细胞或卵细胞前体中驱动目的序列的转录。最合适的是仅在或显著在极核或其前体和/或中央细胞中驱动表达的启动子。使用胚嚢/早期胚乳优先型启动子也可以发现从极核扩展进入早期胚乳发育的转录模式，尽管在细胞化期期间和之后转录在晚期胚乳发育中通常显著降低。合子或正在发育的胚中的表达通常不与胚嚢/早期胚乳启动子一起存在。可适用的启动子包括来自以下基因的启动子拟南芥viviparous-l(参阅GenBankNo.U93215);拟南芥atmycl(参阅Urao(1996)PlantMol,Biol"32:571-57;Conceicao(1994)Plant,5:493-505);拟南芥FIE(GenBankNo.AF129516);拟南芥MEA;拟南芥FIS2(GenBankNo.AF096096)和FIE1.1(U.S.专利6，卯6，244)。可适用的其它启动子可包括来自以下基因的启动子玉米MAC1(参阅Sheridan(1996)Genetics,142:1009-1020);玉米Cat3(参阅GenBankNo.L05934;Abler(1993)PlantMol.Biol"22:10131-1038)。其它启动子包括下列拟南芥启动子YP0039(SEQIDNO:34)、YPOIOI(SEQIDNO:41)、YP0102(SEQIDNO:42)、YPOllO(SEQIDNO:45)、YP0117(SEQIDNO:48)、YP0119(SEQIDNO:49)、YP0137(SEQIDNO:53)、DME、YP0285(SEQIDNO:64)和YP0212(SEQIDNO:60)。其它有用的启动子包括下列稻启动子p530cl0、pOsFIE2-2、pOsMEA、pOsYpl02和pOsYp285。在受精后在合子细胞中优先驱动转录的启动子可提供胚优先型表达并对于本发明是有用的。最合适的是在心期之前优先在早期胚中驱动转录的启动子，但晚期和成熟胚中的表达也是适合的。胚优先启动子包括大麦脂质转移蛋白(Ltpl)启动子(7V朋,(2001)20:647-654、YP0097(SEQIDNO:40)、YP0107(SEQIDNO:44)、YP0088(SEQIDNO:37)、YP0143(SEQIDNO:54)、YP0156(SEQIDNO:56)、PT0650(SEQIDNO:8)、PT0695(SEQIDNO:16)、PT0723(SEQIDNO:19)、PT0838(SEQIDNO:25)、PT0879(SEQIDNO:28)和PT0740(SEQIDNO:20)。在光合組织中有活性从而驱动绿色组织(如叶和茎)中转录的启动子是本发明尤其感兴趣的。最合适的是仅在或显著在这类组织中驱动表达的启动子。这类启动子的实例包括核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子如来自美洲落叶树(Larixlaricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.35:773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等人(1990)PlantMol.Biol.15:921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等人(1994)PlantPhysiol.104:997-1006)、来自稻的cablR启动子(Luan等人(1992)PlantCell4:971-981)、来自玉米的丙酮酸盐正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等人(1993)ProcNatlAcad.SciUSA90:9586-9590)、烟草Lhcbl*2启动子(Cerdan等人(1997)PlantMol.Biol.33:245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+共输送体启动子(Tmernit等人(1995)Planta196:564-570)和来自菠菜的类嚢体膜蛋白质启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。在荽、叶和绿色组织中驱动转录的其它启动子为PT0535(SEQIDNO:3)、PT0668(SEQIDNO:2)、PT0886(SEQIDNO:29)、PR0924(SEQIDNO:78)、YP0144(SEQIDNO:55)、YP0380(SEQIDNO:70)和PT0585(SEQIDNO:4)。在本发明的一些其它实施方案中，可期望诱导型启动子。诱导型启动子响应外界刺激(如化学剂或环境刺激)驱动转录。例如，诱导型启动子可响应激素(如赤霉素或乙烯)或响应光照或千旱而赋予转录。干旱谦导型启动子(inediblepromoters)的实例为YP0380(SEQIDNO:70)、PT0848(SEQIDNO:26)、YP0381(SEQIDNO:71)、YP0337(SEQIDNO:66)、YP0337(SEQIDNO:66)、PT0633(SEQID戮7)、YP0374(SEQIDNO:68)、PT0710(SEQIDNO:18)、YP0356(SEQIDNO:67)、YP0385(SEQIDNO:73)、YP0396(SEQIDNO:74)、YP0384(SEQIDNO:72)、YP0384(SEQIDNO:72)、PT0688(SEQIDNO:15)、YP0286(SEQIDNO:65)、YP0377(SEQIDNO:69)和PD1367(SEQIDNO:79)。氮i秀导的启动子的实例为PT0863(SEQIDNO:27)、PT0829(SEQIDNO:23)、PT0665(SEQIDNO:IO)和PT0886(SEQIDNO:29)。阴暗(shade)诱导型启动子的例子为PR0924(SEQIDNO:78)。其它启动子启动子的其它类型包括但不限于叶优先的、茎/冲支条优先的、愈伤组织优先的、保卫细胞优先的(如PT0678(SEQIDNO:13))和衰老优先的启动子。如上述$I用的专利申请所叙述，被指定为YP0086(SEQIDNO:36)、YP0188(SEQIDNO:58)、YP0263(SEQIDNO:62)、PT0758(SEQIDNO:22)、PT0743(SEQIDNO:21)、PT0829(SEQIDNO:23)、YP0119(SEQIDNO:49)和YP0096(SEQIDNO:39)的启动子，可同样是有用的。可选地，可以使用两组分系统完成异常表达，其中第一组分由转基因植物组成，所述转基因植物包含与启动子有效连接的转录激活子，第二组分由下述转基因植物组成，所述转基因植物包含与转录激活子的耙结合序列/区有效连接的本发明的核酸分子。将两种转基因植物杂交，并且本发明的核酸分子在所迷植物子代中表达。在本发明的另一备选的实施方案中，可以通过将两组分系统的序列转化进一种转基因植物抹系中完成异常表达。另一种选择在于在目的植物物种中抑制生物量或活力调控多肽的表达。术语"表达"是指通过多核苷酸的转录(即通过RNA聚合酶的酶作用)将多核苷酸中编码的遗传信息转化为RNA，并通过mRNA的翻译转化为蛋白质的过程。"上调"或"激活"是指相对于基底或天然状态而言，增加表达产物的产生的调节，而"下调"或"阻抑"是指相对于基底或天然状态而言降低产生的调节。大量基于核酸的方法可以被用于在植物中抑制蛋白质表达，包括反义RNA、核酶指导的RNA切割和干扰RNA(RNAi)。反义技术是一种公知的方法。在该方法中，来自内源基因的核酸区段被克隆并与启动子有效连接，从而RNA的反义链被转录。然后如上所述将重组栽体转化进植物中，并产生RNA的反义链。核酸区段不必须是待阻抑的内源基因的整个序列，但是通常U本上与待阻抑的内源基因的至少一部分同一。一般而言，可以使用更高的同源性来补偿更短序列的使用。通常使用至少30个核苷酸的序列(例如至少40、50、80、100、200、500个核苷酸或更多)。因此，例如本文提供的分离的核酸可以是编码生物量调控多肽的上述核酸之一的反义核酸。降低编码生物量调控多肽的基因的转录或翻译产物水平的核酸^皮转录为与生物量调控或生长速率调控多肽的有义编码序列类似或同一的反义核酸。可选地，分离的核酸的转录产物可以与生物量生长速率调控多肽的有义编码序列类似或同一，但是其为未多腺苦酸化的、缺乏5，帽结构的、或含有不可剪接的内含子的RNA。在另一种方法中，核酸可以被转录为核酶或催化RNA,其影响mRNA的表达(参阅U.S.专利No.6,423,885)。核酶可以被i殳计为与实际上任何靼标RNA特异地配对并在特定位置切割磷酸二酯主链，从而功能性地灭活扭RNA。异源核酸可以编码下述核酶，所述核酶,皮i殳计为切割特定mRNA转录物，从而防止多肽的表达。锤头状核酶适用于破坏特定mRNA，尽管可以使用在位点特异识别序列处切割mRNA的多种核酶。锤头状核酶在由侧翼区指定的位置切割mRNA，所述侧翼区与耙mRNA形成互补的碱基对。唯一的要求是耙RNA含有5'-UG-3'核苦酸序列。锤头状核酶的构建和生产是本领域已知的。参阅例如U.S.专利No.5，254，678和WO02/46449以及其中所引的参考文献。锤头状核酶序列可以被植入稳定的RNA如转移RNA(tRNA)中，以提高体内切割效率。Perriman等人(1995)Proc.Natl，Acad.Sci.USA，92(13):6175-6179;deFeyter和Gaud腦，MethodsinMolecularBiology,74巻，第43章，"ExpressingRibozymesinPlants",Turner,P.C编著，HumanaPressInc.，Totowa，NJ。RNA核糖核酸内切酶可以是有用的，如噬热四膜虫(TetrahymenathermophiIa)中天然存在的RNA核糖核酸内切酶和已经由Cech与合作者广泛描述的RNA核糖核酸内切酶。参阅例如U.S,专利No.4,987,071。可使用基于RNA干扰(RNAi)的方法。RNA干扰是调节基因表达和病毒复制的细胞机制。该机制被认为是由双链小千扰RNA分子介导的。细胞通过破坏内源mRNA来应答这类双链RNA，所述内源mRNA具有与双链RNA相同的序列。用于设计和制备干扰RNA的方法是本领域技术人员已知的；参阅例如WO99/32619和WO01/75164。例如，可以制备下述构建体，所述构建体舍有被转录为干扰RNA的序列。这类RNA可以是与其自身退火的RNA，例如具有茎-环结构的双链RNA。双链RNA茎部分的一条链包含与目的多肽的有义编码序列相似或同一的序列，其长度为约10个核苷酸到约2,500个核苷酸。与有义编码序列相似或同一的序列的长度可以是从10个核普酸到500个核苷酸、从15个核苦酸到300个核苦酸、从20个核苷酸到100个核苷酸或从25个核普酸到100个核苷酸。双链RNA茎部分的另一条链包含目的生物量调控多肽的反义序列，并可具有比有义序列相应长度更短、相同、或更长的长度。双链RNA的环部分可以是从10个核苦酸到5,000个核苷酸，例如从15个核苷酸到l，OOO个核苷酸、从20个核苷酸到500个核苷酸或从25个核苷酸到200个核苷酸。RNA的环部分可包含内含子。参阅例如WO99/53050。在用于抑制植物中基因表达的一些基于核酸的方法中，合适的核酸可以是核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链上被修饰，以促进例如核酸的稳定性、杂交或溶解度。g部分上的修饰包括脱氧尿苷成为脱氧胸苷，以及5-甲基-2，-脱氧胞苷和5-溴-2，-脱氧胞苷成为脱氧胞苷。糖部分上的修饰包括核糖糖的2，羟基的修饰形成2，-0-曱基或2，-0-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸酯主链可以被修饰以生产吗啉代核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉代环或肽核酸连接，其中所述脱氧磷酸酯(deoxyphosphate)主链被假肽主链代替，并保留四个碱基。参阅例如Summerton和Weller，1997，Antise獄NucleicAcidDrugDev.,7:187-195;Hyrup等人，1996，Bioorgan.Med.Chem"4:5-23。另外，脱氧砩酸酯主链可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、phosphoroamidite或烷基磷酸三酯主链代替。转化本发明中的核酸分子可以通过多种技术被引入到适当宿主植物的基因组或细胞中。能转化多种高等植物物种的这些技术，是众所周知的，并且在技术与科学文献中描述(见，例如，Weising等人(1988)Zev.GertW.，22:421和Christou(1995)五"p/^rfc"，85:13-27)。本领域已知的多种技术可用于将DNA引入植物宿主细胞。这些技术包括通过以下转化植物细胞注射(Newell(2000))、显微注射(Griesbach(1987)50:69-77)、DNA电穿孔(Fromm等人(1985)7V"汰ScZ.r/5^82:5824)、PEG(Paszkowski等人(1984)五Af必O/.3:2717)、使用生物射弹(Klein等人(1987)A^""327:7")、细胞或原生质体的融合(Willmitzer，L.(1993)TransgenicPlants.In:Iotechnology，AMulti陽VolumeComprehensivetreatise(H.J.Rehm，GLReed,A.Puler，P.Stadler,编著,2t627-659，VCHWeinheim國NewYork-Basel-Cambridge))，以及通过使用根瘤土壤杆菌(CWfcJev.P/flW.Sd.Fromm等人(1990)丑,Vfec/mofogy8:833画844)或毛才艮土壤杆菌(JgraAflcten.wwW^ogwi^)(Cho等人(2000)尸/朋似210:195-204)或其它细菌宿主(Brootghaerts等人(2005)7Va似"433:629-633)的T-DNA。此外，本发明可以需要多种本领域技术人员熟知的非稳定转化法。所述方法包括但不限于，瞬时表达(Lincoln等人(1998)PlantMol.Biol.Rep.16:1-4)和病毒转染(Lacomme等人(2001)，"GeneticallyEngineeredViruses"(C.J.A.Ring和E.D.Blair编著).第59-99页，BIOSScientificPublishers,Ltd.Oxford,UK)。种子得自转化的植物并被用于测试稳定性和遗传特性。一般地，培养两代或更多世代以确保表型特征被稳定维持和传递。本领域一般技术人员能够了解，在表达盒稳定地掺入到转基因植物中并被确认有效后，通过有性杂交能将其引入到其它植物中。根据待杂交物种，能够采用多种标准育种技术的任一种。本发明的核酸分子可以用于赋予改变的开花时间的性状。本发明的核酸分子编码来自任何生物的适当蛋白质，但是所述蛋白质优选在植物、真菌、细菌或动物中发现。本发明中的方法能应用于任何植物，优选属于被子植物纲(Angiospermae)和棵子植物纲(Gymnospermae)的高等植物。双子叶植物(Dicotylodenae)和单子叶植物(Monocotyledonae)亚纲的植物是尤其合适的。属于例如以下目的双子叶植物也是合适的Magniolales、八角茴香目(niiciales)、樟目(Laurales)、胡椒目(Piperales)、Aristochiales、睡莲目(Nymphaeales)、毛K目(Ranunculales)、Papeverales、瓶子草科(Sarraceniaceae)、昆栏树目(Trochodendrales)、金缘梅目(Hamamelidales)、Eucomiales、塞子木目(Leitneriales)、杨梅目(Myricales)、壳斗目(Fagales)、木麻黄目(Casuarinales)、石竹目(Caryophyllales)、肉穗果目(Batales)、蓼目(Polygonales)、白花丹目(Phimbagmales)、五桠果目(Dilleniales)、山茶目(Theales)、锦葵目(Malvales)、荨麻目(Urticales)、玉蕊目(Lecythidales)、堇菜目(Violales)、杨柳目(Salicales)、白花菜目(Capparales)、杜鹃花目(Ericales)、Diapensales、柿树目(Ebenales)、花目(Primulales)、蔷薇目(Rosales)、豆目(Fabales)、川茧草目(Podostemales)、小二仙草目(Haloragales)、书匕金4良目(Myrtales)、山茱萸目(Cornales)、山龙眼目(Proteales)、檀香目(Santales)、大花草目(Rafflesiales)、卫矛目(Celastrales)、大戟目(Euphorbiales)、鼠李目(Rhamnales)、无患子目(Sapindales)、胡桃目(Juglandales)、栊牛儿苗目(Geraniales)、远志目(Polygalales)、伞形目(Umbellales)、龙胆目(Gentianales)、花葱目(Polemoniales)、唇形目(Lamiales)、车前目(Plantaginales)、玄参目(Scrophulariales)、桔梗目(Campanulales)、萏草目(Rubiales)、川续断目(Dipsacales)和菊目(Asterales)。属于例如以下目的单子叶植物也可适用于本发明的实施方案泽泻目(Alismatales)、水鳘目(Hydrocharitales)、莰藻目(Najadales)、霉草目(Triuridales)、鸭跖草目(Commelinales)、谷精草目(Eriocaulales)、帚灯草目(Restionales)、禾本目(Poales)、灯心草目(Juncales)、莎草目(Cyperales)、香蒲目(Typhales)、凤梨目(Bromeliaks)、姜目(Zingiberales)、槟榔目(Arecales)、巴拿马草目(Cyclanthaies)、露兜树目(Pandanales)、天南星目(Arales)、Lilliales和兰目(Orchidales)。其它的实例包括，但不限于属于棵子植物纲的植物，为松目(Pinales)、银杏目(Ginkgoales)、苏铁目(Cycadales)和买麻藤目(Gnetales)。本发明的方法优选地应用于对于农业、园艺、用于生物转化的生物量和/或林业重要或有意义的植物。非限定性的实例包括，例如，烟草、欧洲油菜(oilseedrape)、糖萝卜(sugarbeet)、番茄、马铃薯、黄瓜、胡椒、菜豆(beans)、豌豆、柑橘属水果、If梨、桃、苹果、梨、浆果、李(plumbs)、瓜、茄子、棉花、大豆、向日葵、蔷薇、猩猩木、碧冬茄、银胶菊、甘蓝、菠菜、苜蓿、朝鲜蓟、甘蔗、含羞草、Servicealespedera、玉米、小麦、稻、黑麦、大麦、高粱和草类(如柳枝稷(switchgrass)、，竹(giantreed)、狗牙根、石茅高粱或草皮草(turfgrass))、黍、大麻、香蕉、杨、桉树和松类。感兴趣的是种植用于能量生产的盆栽(所谓的能量作物)，即所谓的能源作物，例如，阔叶植物如苜蓿、M、菊芋以及草类如高粱、柳枝稷、石茅高粱等。本发明包括的同源物本领域已知序列中的一个或多个氨基酸可以被其它M酸取代，所述导致生物学/功能上的沉默改变。多肽序列中氨基酸的保守取代可以选自该氨基酸所属分类的其它成员。氨基酸可以被分为以下四組(1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)的氮基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水的)氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。不同的核,列编码具有一个或多个保守M酸变化的蛋白质，由于以上事实，本发明的核酸分子可包括不同于编码蛋白质或其片断的序列的序列，所述蛋白质或其片段分别选自前导80、81、113、114、ME08328、ME0190S、ME01770、ME21445和ME20023,分别为SEQIDNO.95、97、91、83、89、85、87、93和81。本发明的多肽的生物学功能等价物或其片断可具有大约10个或更少的保守M酸变化，更为优选的是大约7个或更少的保守氨基酸变化，最为优选的是大约5个或更少的保守氨基酸变化。在本发明的优选的实施方案中，所述多肽具有大约5个到大约500个之间的保守变化，更优选的是大约10个到大约300个之间的保守变化，甚至更为优选的是大约25个到大约150个之间的保守变化，以及最为优选的是大约5个到大约25个之间的保守变化或1个到大约5个之间的保守变化。有用核酸分子及其相应的核苷酸序列的鉴定通过使用多种筛选鉴定本发明的核酸分子及其核苷酸序列，所述篩选预测下述核苷酸序列，所述核苷酸序列给植物提供改变的大小、营养生长、生长速率、器官数、植物构造和/或生物量。。因此，一个或多个下述筛选，被用于鉴定本发明的核苷酸(和氨基酸)序列。本发明被以下实例进一步例证。所述实例不旨在以任何方式限制本申请及其应用的范围。6.证实本发明的多核苷酸和多肽的有用性的实验一般方案土壤杆菌介导的拟南芥转化用Ti质粒转化野生型拟南芥Wassilewskija(WS)植物，所i^t粒在相对于35S启动子为有义的方向上含有克隆。适用于这类构建体CRS338的Ti质粒载体含有Ceres-构建的植物可选择标记基因膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其对被转化的植物赋予除草剂抗性。通常选择十个独立转化事件并在T,世代中评价它们的定性表型。土壤混合物的制备将24LSimshineMix#5土壤(加拿大阳光园艺公司(SunGroHorticulture,Ltd.)，Bellevue，WA)与16LTherm誦O-Rock虫至石(维斯特特姆-O-洛克公司(Therm誦O-RockWest,Inc.)，Chandler,AZ)在7JC泥搅拌器(cementmixer)中混合，制造60:40的土壤混合物。向该土壤混合物中添加2汤匙Marathon1%颗粒(海默特土地公司(Hummert，EarthCity,)MO)、3汤匙OSMOCOTE1414-14(海默特土地公司(Hummert，EarthCity,)MO)和1汤匙Peters肥料20-20-20(J.R.皮特^^司(J.R.Peters,Inc.)，Allentown，PA)，所述被添加物首先被添加进3加仑水中，然后添加进土壤中并充分混合。一般用土壤混合物填充4-英寸直径的花盆。然后用8-英寸方形尼龙膜网覆盖花盆。种植使用60mL注射器抽吸35mL的种子混合物。向每盆中添加25滴。在花盆顶部放置透明的繁殖盖子(propagationdome),然后将所述盆置于55%遮蓬(shadecloth)下并通过添加1英寸水进行地下灌溉。植物维持在种植后3到4天，将盖子和遮篷移去。按需要给植物加水。在7到10天后，用镊子使花盆稀疏至每盆20林植物。在2周后，所有的植物用Peters肥料以每加仑水1汤匙的比例地下灌溉。当抽苔(bolt)为大约5-10cm长时，其被在第一节和茎基部修剪以引发次生抽苔。修剪后6到7天后进4亍浸入式浸润(dippinginfiltration)。土壤杆菌的制备将羧节西林、壮观霉素和利福平(各储存浓度为100mg/ml)各O.lmL加入到150mL新鲜YEB中。得到土壤杆菌起子板(starterblock)(具有生长至OD綱大约为1.0的土壤杆菌培养物的96并通过在起子板中从适当的孔移取lmL来接种每种构建体一个培养瓶。然后在27。C下摇动培养培养物。将培养物在达到OD6(H)大约为1.0(大约24个小时)后离心。将200mL浸润培养基加入到重悬的土壤杆菌沉淀物中。浸润培养基通过加入2,2gMS盐、50g蔗糖和5nl2mg/ml节氨基嘌呤到900mL水中而制备。浸入式浸润花盆被倒置且浸没5分钟以使植物的地上部分位于土壤杆菌的悬浮液中。^f吏植物正常地生长且收集种子。异常表达突变体的高通量表型筛选种子被均衡地分布在花盆中7jc饱和土壤中，并置于黑暗4。C冷却器中两夜以促进均匀发芽。然后从冷却器中移出花盆，并将其用55%遮篷盖住4-5天。在该阶段下子叶充分展开。在植物上喷雾FINALE(三若埃文缇丝公司(SanofiAventis)，Paris,France)(3mLFINALE⑧稀释到48oz.水中)并每3-4天重复直到仅剩下转化体。篩选常规筛选以四个阶段进行操作幼苗、莲座、开花和衰老。。幼苗-从子叶出现后但在第3片真叶开始生成之前的时间。。莲座-从第3片真叶出现直到初级抽苜开始延伸前之间的时间。。开花-从初级抽苔的出现到衰老开始的时间(除了注意开花时间本身外，大多数观察应该在大约50。/。的花开后的阶段进行)。。衰老-从衰老开始后的时间(除了"延迟的衰老"，大多数观察应该在所迷植物完全干燥后进行)。然后收集种子。。筛选对于增加的大小、营养生长和/或生物量的篩选用测量操作进行，特别地，T2的测量按如下进行。抽苔(Bolt)的天数-从j番种种子到第一个花序出现之间的天数。。抽苔处莲座叶的数量=第一个花序出现时存在的莲座叶的数量。。莲座面积-初始花序出现时的莲座面积，使用式(LxW^3.14)/4。。M-最长的花序从底部到顶端的长度。这一测量在开花结束/衰老开始时进行。。初级花序厚度=初始花序从底部向上2.5cm处的直径。这一测量在开花结束/衰老开始时进行。。花序数量=单独花序的总数。这一测量在开花结束/衰老开始时进行。PCR被应用于在一林随机选择的T2植物中扩增cDNA插入片段。该PCR产物1^#被测序以确定植物中的序列。篩选对于低硝酸铵生长条件耐受的超级库(superpool)产生超级库，且分别来自十个超级库中的2000个种子集合在一起并应用琼脂上的低硝酸铵筛选进行测定。低硝酸铵生长培养基，pH5.7,如下0.5xMS无N(植物技术公司(PhytoTech))、0.5%蔗糖(西格玛公司(Sigma))、240jiMNH4N03(EM科技公司(EMScience))、0.5gMES7K合物(西格玛公司(Sigma))、0.8%植物琼脂(Phytagar)(EM科技公司(EMScience))。使用每平方板45mL培养基。拟南芥cvWS在具有0.01%TritonX-100(v/v)的50%Cloroxt灭菌五分钟，用无菌蒸馏去离子水洗涤四次并在使用前在4。C黑暗中储存3天。种子以每板100个种子的密度放置。野生型种子作为对照使用。平板在22。C在ConviroiT生长室中孵育，并使用白炽与荧光灯(~100pEinsteins发光强度)组合的16:8小时亮:暗循环，以及70%湿度。幼苗在14天后进行每天篩选。候选幼苗相对于野生型对照更大或保持更绿色更久。DNA被从每个候选植物中分离并测序以确定哪个转基因存在。琼脂上幼苗低硝酸铵测定培养基和种子如上述制备。来自各自包含同样的多核苷酸的5林异常表i^K系事件的种子被播种在两排，每排10个种子。每块平板包含五个事件，总共100个种子。包含野生型种子的对照平板也^皮制备。平板随后在4。C中孵育至少两天。在4。C冷处理几天后，平板在22。C在ConviroiT生长室中孵育，并使用白炽与荧光灯(~100nEinsteins发光强度)组合的16:8小时亮:暗循环以及70%湿度。14天后，经过45分钟暗适应，用CF图^象仪(特克乐吉克公司(TechnologicaLtd.))每天扫描平板。用CF图像仪定量幼苗的最佳量子(quantum)产量(Fv/Fm)，作为光合健康的量度(细节见下)。为了定量幼苗的大小，在氮胁迫明显和野生型幼苗生长停止一天后，也用平板式光扫描器(易普森公司(Epson))扫描平板。在所有野生型植物完全变黄后停止捕获影像。在扫描的最后一天，打开平板，用Final,(10ml在48oz.Murashige&Skoog液体培养基中)自由喷雾，再放回生长室。喷雾两天后，在通过CF图像仪进行荧光观察的准备中，将平板在密封的盒子中放置45分钟，来进行适应。抗FinaleTM的植物呈红色，而对Final,敏感的植物呈蓝色。捕获影像后，将植物分为转基因(抗性)或非转基因(敏感性)状态。将非转基因植物(即非转基因分离子)作为内部对照。幼苗光合效率或通过光系统II的电子转移，由最大荧光信号(Fm)和可变荧光(Fv)之间的关系评价。本文中最佳量子产量(Fv/Fm)的减小指示了胁迫，并因此可应用于监控在氮胁迫条件下与非转基因植物相比转基因植物的表现。既然大量的氮在维持光合装置中^^费，氮缺乏可导致反应中心分解和光合效率减小。因此，从图象捕获采集开始到植物死亡，就每林幼苗而言，Fv/Fm比率4吏用FluroImager2软件(KevinOxborough和JohnBartington)确定。每林植物莲座面积也可应用WinRHIZO软件(莱茵特仪器公司(RegentInstruments))分析以分析用Epson平板式扫描仪捕获的图象。低硝酸铵^的测定按上述方法制备培养基和种子。对于通过上述低硝酸铵测定的异常表,系，将事件的T2和T3世代种子与野生型种子一起铺板，最终密度为每平板100粒种子。平板含有IO粒种子/排，具有四排的10粒T2种子，接着是两排野生型种子，随后是四排T3种子。然后将平板在4'C下孵育至少两天。在4。C冷处理几天后，平板在22。C在ConviroiT生长室中孵育，并使用白炽与荧光灯(100nEinsteins发光强度)组合的16:8小时亮:暗循环以及70%湿度。14天后，经过45分钟暗适应，用CF图像仪(特克乐吉克公司(TechnologicaLtd.))每天扫描平板。用CF图像仪定量幼苗的最佳量子(quantum)产量(Fv/Fm)，作为光合健康的量度。为了定量幼苗的大小，在氮胁迫明显和野生型幼苗生长停止一天后，用平板式光扫描器(易普森公司(Epson))扫描平板。在所有野生型植物完全变黄后停止捕获影像。在扫描的最后一天，打开平板，用FinaleTM(10ml在48oz.Murashige&Skoog液体培养基中)自由喷雾，再放回生长室。喷雾两天后，在用于通过CF图像仪进行荧光观察的准备中，将平板在密封的盒子中放置45分钟来适应。抗FinaleTM的植物呈红色，而对FinaleTM敏感的植物呈蓝色。捕获影像后，将植物分为转基因(抗性)或非转基因(敏感性)状态。将非转基因植物(即非转基因分离子)作为内部对照。采用Flurolmager2软件(KevinOxborough和JohnBartington)须'J定每林幼苗的Fv/Fm比率。每林植物莲座面积也可应用WinRHIZO软件(莱茵特仪器公司(RegentInstruments))分析以分析用Epson平板式扫描仪捕获的图象。结果如上所述针对受调控的生长和表型特征筛选用目的基因转化的植物。观察包括涉及整林植物以及植物部分(如根和叶)的观察。对于各个多核的编码多肽进行记录。受调控的特征(即观察到的表型)通过"各方面特征，，领域中的条目对各自序列进行标注。序列表中针对各相关序列标注的"表型"还包括基于观察的该序列的有用效用的陈述。多肽的得到的效用沐用性对多种转化体做出的观察分类。表l将序列表中的简短标注与下述内斜目关针对各转化体标注的观察结果("描述"一栏)、观察的组织、因而伴随着转化体的表型，和插入的核普酸序列和编码的多肽的得到的效用/有用性("翻译"一栏)。对本发明的一些多核苷^/多肽而言，序列表还包括(在"各方面特征，，部分中)对重要的被鉴定的显性基因和该结构域的相应功能的指示，或通过与7>众可获得的pfam数据库比较而鉴定的指示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>c.受调控的器官数；d.提高的生物量；e.不育性；f.幼苗致死率；g.加速的农作物发育或收获；h.加速的开花时间；i.推迟的开花时间；j.推迟的衰老；k.增强的干旱或胁迫耐受性；1.提高的叶绿素和光合能力；m.提高的花色素苷含量；n.提高的根生长，和提高的营^4聂取；o.提高或降低的种子重量或尺寸，提高的种子碳或氮含量；p.经修饰的(包括提高的)种子/果实产量或经修饰的果实含量；q.增强的叶(foliage);r.用于在植物中制造营养制品/药物的有用性；s.植物致死率；t.降低种子纤维含量以提供提高的可消化性；u.经修饰的》见赏外观，其具有经〗务饰的叶、花、颜色或叶(foliage);v.经修饰的在植物中的不育性；w.增强的在阴暗中生长的能力；x.增强的生物胁迫耐受性；y.增强的对密度和低肥料的耐受性；z.增强的对高或低pH、对低或高氮或磷酸盐的耐受性；aa.增强的对氧化胁迫的耐受性；bb.增强的化学组成；cc.改变的叶形状；dd.增强的非生物胁迫耐受性；ee.提高的对冷胁迫的耐受性；ff.提高的淀粉含量；gg.降低的种子数或无种子；hh.增强的植物强度；ii.经修饰的花长度；jj.更长的花序；kk.经修饰的种子纤维含量；11.经修饰的果实形状；mm.经修饰的果实组成；nn.经修饰的种子产量；oo.经修饰的植物构造，如经修饰的分支量或角度、经修饰的叶结构、或经《，饰的种子结构；和pp.增强的阴暗回避(shadeavoidance)。实施例1-前导別(ME08386);克隆733804SEOIDNO.94前导80(SEQIDNO.94)编码来自小麦的92个氨基酸bHLH转录因子。用该序列改造的植物表现出.增强的生长，尤其在含低硝酸盐培养基上；.在含低硝酸盐培养基上增强的光合作用；.延长的下胚轴、窄的叶子且通常是扁平的花序。克隆733804编码bHLH转录因子，其可使经受氮缺乏胁迫的植物提高生长且改善光合效率。转录因子通常在途径中控制多个基因的表达。例如，克隆733804可参与控制途径中的若千基因的表达，例如TCA循环的碳流通(carbonflux)(Yanagisawa等人，2004)。相关的拟南芥bHLH转录因子和潜在的直向同源物(60%同一性，克隆8607)也能够赋予相似的低氮胁逸表型。由于克隆733804和克隆8607的获功能表型在小麦和拟南芥之间是保守的，这些基因对于在广泛的作物中改善氮胁迫耐受性、增加氮^f吏用效率以及增强幼苗活力，可具有直接的应用。材料及方法Tl事件的生成和表型评价。如上所述，用Ti质粒转化野生型拟南芥Wassilewskija(WS)植物，所述质粒在相对于35S启动子为有义的方向上含有克隆733804。适用于这类构建体CRS338的Ti质粒载体含有Ceres-构建的植物可选择标记基因膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其对被转化的植物赋予除草剂抗性。选择十个独立转化事件并在T,世代中评价它们的定性表型。以下描述了步骤l)从低硝酸盐耐受性超级库筛选中鉴定候选者；2)在第二和第三世代中确定表型；以及3)确定显著阴性表型的缺乏。针对低硝酸盐生长条件耐受性筛选超级库62-71。将各自来自超级库62-71的两千个种子集合在一起并铺板在低硝酸盐培养基上。从每一候选植物中分离出DNA并测序以确定哪个转基因存在。在低硝酸盐生长条件下的ME08386的生长M及种植计划采用五个T2事件(-01、-03、-04、-08和-09)来完成对低硝酸盐条件(300KN03MS培养基)耐受性的评价。随后，在低硝酸盐条件下评价所有鉴定的低硝酸盐耐受候选物在两世代中在低确酸盐和FinaleTM上测试的4个独立事件在两世代中，事件-01、-04、-08和-09比对照显箸更大并且具有更好的光合效率五个事件的T3代种子。结果就对低硝酸盐条件幼苗耐受性从超级库筛选鉴定ME08386。就在低硝酸盐生长培养基上比对照更大或更绿的幼苗来筛选超级库62-71。就19个候选幼苗获得转基因序列。将19个候选序列中的两个与ME08386进行BLAST.针对FinaleTM抗性，ME08386的四个事件示出3:l的分离。在T2代中，针对FinaleTM抗性，事件-01、-04、-08和-093:1(R:S)分离(数据未示出)。ME08386的四个事件示出了两代中在低硝酸盐生长条件下生长显著提高在T2代和T3代两代中，如在低硝酸盐测定中所述，播种ME08386的5个事件。在该研究中，将事件中的转基因植物在14天的幼苗面积与在相同板上集合的非转基因分离子的幼苗面积进行比较。采用假定不等方差的单侧t检验，两世代中四个事件-01、-04、-08和-09在当p-0.05时显著(表1-1)。表1-1在低硝酸盐上生长14天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗面积<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>在两代中，ME08386的四个事件显示出在低硝酸盐生长条件下光合效率显著提高。T2代和T3代两代中，如在低硝酸盐测定中所述，播种ME08386的5个事件。在该研究中，按照Fv/Fra来测量幼苗的光合效率，比较事件中的转基因植物与在相同板上集合的非转基因分离子。采用假定不等方差的单侧t检验，两世代中四个事件-01、-04、-08和-09在p=0.05时显著(表1-2)。表l-2在低硝酸盐上生长14天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗光合效率的T检验比较抹系转基因集合的非转基因t检验事件Fv/FmiiFv/FmnP值ME08386ME08386-010.59290.56170.00982ME08386ME08386-01-990.64320.56178.76E-07ME08386ME08386-040.61310.56190.00338ME08386ME08386-04-990.61280.56190.00402ME08386ME08386-080.62280.52214.69E-05ME08386ME08386-08-990.63260.52211.59E-09ME08386ME08386-090.58300.51180.000819ME08383ME08386-09-990.58320,51180.000357Ti植物的定性分析所迷十林Tl植物中的四抹的物理形态与对照一致。注意事件-01、-03、-04、-08、-09和-10具有扁平花序，但仍能完全可育。T2植物的定性和定量分析(针对阴性表型进行筛选)ME08386的事件-01、-04、-08和-09表现没有统计上相关的阴性表型。所有四个事件示出了与在T,代中注意到的相同的扁平花序表型，但这种表型不会消极地影响产量。植物还具有稍微伸长的下胚轴和莲座叶。植物表现出稍微伸长的下胚轴、伸长的莲座叶和扁平抽苔。但就发芽率、开花期、抽苫后(post-bolting)7天后的莲座或受精(长角果数量和种子饱满)而言，实验与对照之间没有表现出可观察的或统计的差异。实施例2-前导81(ME03973)克隆8607SEOIDNO.96前导81(SEQIDNO.**)编码来自拟南芥的94个氨基酸bHLH转录因子。用该序列转化的植物表现出，增强的生长，尤其在含低硝酸盐培养基上；-在含低硝酸盐培养基上增强的光合作用；，延长的下胚轴、窄的叶子且通常是扁平的花序。克隆8607编码拟南芥碱性螺旋-环-螺旋转录因子。将克隆放置在cDNA异常表达管线(pipeline)中以检验在各种胁迫条件下，其在改善的植物性能中的效用。在加热、干旱及氮缺乏胁迫实验中，基因的表达不同，因此，能够在调节对胁迫耐受性或适应性重要的基因中起到作用。克隆8607编码bHLH转录因子，其可使经受氮缺乏胁迫的植物增加生长且改善光合效率。转录因子通常在途径中控制多个基因的表达。克隆8607可参与控制途径中的若干基因的表达，例如TCA循环的碳流通(carbonflux)(Yanagisawa等人，2004)。克隆8607的功能未知，但其受到氮胁迫调节显示其能够在对氮缺乏的植物应答中起作用。相关小麦bHLH转录因子和潜在直向同源物(60%同一性；克隆733804)也能够赋予相似的低氮胁*型。由于克隆733804和克隆8607的获功能表型在小麦和拟南芥之间是保守的，这些基因对于在广泛的作物中改善氮胁迫耐受性、增加氮使用效率以及增强幼苗活力，可具有直接的应用。事件的生成和表型评价。如上所述，用Ti质粒转化野生型拟南芥Wassilewskija(WS)植物，所迷质粒在相对于35S启动子为有义的方向上含有克隆8607。适用于这类构建体CRS338的Ti质粒载体含有Ceres-构建的植物可选择标记基因膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其对被转化的植物赋予除草剂抗性。对于每个CeresSOP5-HTP植物表型分析，选择五个独立转化事件并在T,世代中评价它们的定性表型。以下描述了步骤l)从低硝酸盐耐受性超级库筛选中鉴定候选者；2)在第二和第三世代中确定表型；以及3)确定显著阴性表型的缺乏。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>针对低硝酸盐生长条件耐受性筛选超级库22-31。将各自来自超级库22-31的两千个种子集合在一起并铺板在低硝酸盐培养基上。从每一候选植物中分离DNA并测序以确定哪个转基因存在。在低硝酸盐生长条件下的ME03973的生长M及种植计划采用四个T2事件(-01、-02、-03和-05)来完成对低硝酸盐条件(300jtMKN03MS培养基)耐受性的评价。随后，在低硝酸盐条件下评价所有四个事件中的T3代种子。结果就对低硝酸盐条件幼苗耐受性从超级库筛选中鉴定ME03973。就在低硝酸盐生长培养基上比对照更大或更绿的幼苗来筛选超级库27。从候选者中鉴定出林系ME03973。就在低硝酸盐生长培养基上比对照更大或更绿的幼苗来筛选超级库22-31。就39个候选幼苗获得转基因序列。将39个候选序列中的一个与ME03973进行BLAST。针对FinaleTM抗性，ME03973的三个事件示出3:l的分离。在Tz代中，针对FinaleTM抗性，事件陽Ol、-03和-053:1(R:S)分离。ME039"的三个事件示出了两代中在低硝酸盐生长条件下生长显著提兩。在L代和T3代两代中，在低硝酸盐测定上测试ME03973的四个事件。在该研究中，将事件中的转基因植物在14天的幼苗面积与在相同板上集合的非转基因分离子的幼苗面积进行比较。采用假定不等方差的单侧t检验，两世代中三个事件-01、-03和-05在当p-0.05时显著(表2-l)。表2-l在低硝酸盐上生长14天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗面积_的T检验比较_转基因集合的非转基因T检验<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>在两代中，ME03973的三个事件显示出在低硝酸盐生长条件下光合效率显著提尚。T2代和T3代两代中，在低硝酸盐测定上测试了ME03973的四个事件。在该研究中，按照Fv/Fm来测量幼苗的光合效率，比较事件中的转基因植物与在相同板上集合的非转基因分离子。采用假定不等方差的单侧t检验，两世代中三个事件-01、-03和-05在p=0.05时显著(表2-2)。表2-2在低滩酸盐上生长14天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗光合<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>ME03973ME03973-050.61290.54200.000375ME03973ME03973-05-990.63260.54208.18E-06Tj植物的定性分析所述十林植物中的所记录的物理形态与对照一致。然而，很可能的是，伸长的下胚轴和莲座叶以及扁平花序为表型，该表型存在于T，植物中，但是太细^:以至于注意不到。T2植物的定性和定量分析(针对阴性表型进行筛选ME03973的事件-01、-03和-05表现没有统计上相关的阴性表型。然而，所有事件示出了如在T,代中所注意到的扁平花序表型，但是这种表型并不消极地影响产量。植物还具有稍微伸长的下胚轴和莲座叶。植物展示这些事件具有稍微伸长的下胚轴、伸长的莲座叶和扁平抽苔，但就发芽率、开花期、抽苔后7天的莲座面积或受精(长角果数量和种子饱满)而言，实验与对照之间没有表现出可观察的或统计的差异。实施例3-前导113(ME08317):克隆560948SEOIDNO.90构造事件/世代植物阶段测定结果35S::560948-01^2分离植物幼苗性当p<0.05时显著35S::560948-05^2分离植物幼苗性当p<0.05时显著35S::560948-01^3分离植物幼苗性当p<0.05时显著35S::560948-05/1"3分离植物幼苗性当P<0.05时显著35S启动子控制下的克隆560948的异位表达^f吏得与对照相比在14天后在含低硝酸盐的培养基上增强的生长。ME08317与前导80&81同源从交互BLAST算法鉴定ME08317，与前导80&81具有在60%-70%之间的同一性。ME08317的一个事件对于单插入片段分离，而另一个事件对于2个插入片段分离。在T2代中，针对FinaleTM抗性，事件-013:1(R:S)分离。事件-0515:1(R:S)分离(数据未显示)。在两代中，ME08317的两个事件显示出在低硝酸盐生长条件下生长显著增强。来自每一T2和T3代的、表示ME08317的两个事件的种子在如低硝酸盐测定中所述的条件下播种。如使用单侧t-检验并且假定不等方差所测量的，在两代中，两个事件-01和-05,显示出在p二0.05时生长的显著提高(表3-1)。表3-l在低辨酸盐上生长14天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子间的幼苗面积的T检验比较<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>T,植物的定性分析所有事件呈现野生型。可能T2以下的形态表型存在于T,代中，但太细微以至于很难注意到。T2植物的定性和定量分析ME08317的事件-01和-05具有扁平花序和稍微伸长的下胚轴及莲座叶。实施例4-前导114(ME10686);克隆336524(SEOIDNO:82)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>35S启动子控制下的克隆336524的异位表达引起与对照相比，在包含低硝酸盐的培养基上14天后生长增强。ME10686与前导80&81同源。从交互BLAST算法鉴定ME10686，其具有与前导80&81大约60%的同一性。ME10686的两事件对于单插入片段分离。在T2代中，针对Finale⑧抗性，事件-01和-083:1(R:S)分离(数据未显示)。两代中，ME10686的两事件显示出在低硝酸铵生长条件下生长显著增强。来自每一T2和T3代的(或T3和T4代，如同事件-01的情况)、表示ME10686的两事件的种子在如低硝酸铵测定中所述的条件下播种。如使用单侧t-检验并且假定不等方差所测量的，在两代中，两个事件-01和-08，显示出在p-0.05时生长的显著提高(表4-l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1\植物的定性分析所有事件呈现野生型。可能以下的T2形态表型存在于T，代中，但太细微以至于纟lb^注意到。T2植物的定性和定量分析ME08317的事件-01和-08具有扁平花序和稍微伸长的下胚轴及莲座叶。实施例5:前导ME08328;克隆560681(SEOIDNO:88)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>ME08328与前导80&81同源。从交互BLAST算法鉴定ME08328，其具有与前导80&81大约70%的同一性。ME08328-05对于单插入片段分离。T2代中，针对Finale頃抗性，事件-053:1(R:S)分离(数据未显示)。ME08328的一个事件显示出同时在低硝酸铵和低硝酸盐生长条件下生长显著提高。代表ME08328的一个事件的种子在如低硝酸铵和低硝酸盐测定中所述的条件下播种。如使用单侧t-检验并且假定不等方差所测量的，在两代中，事件-05显示出在p-0.05时生长的显著提高(表5-l和5-2)。表5-1.在低硝酸铵上生长17天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗面积的T检验比较<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表5-2.在低硝酸盐上生长17天后，转基因幼苗与集合的非转基因分离子之间的幼苗区域的<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>l植物的定性分析所有事件显示出野生型。实施例6前导ME01905;克隆4734(SEOIDNO:84)<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>ME01卯5与前导80&81同源。从交互BLAST算法鉴定ME01905,其与前导80&81具有大约60%同一性。对于FinaleTM抗性，ME01905的两个事件表现为3:1分离在T2代中，对于FinaleTM抗性，事件-03和-053:1(R:S)分离(数据未显示)。在低硝酸铵和低硝酸盐的生长条件下，ME01905的两个事件表现出显著增强的生长代表ME01905的两个事件的种子，在^^酸铵和低硝酸盐测定中所述的条件下播种。如使用单侧t-检验并且假定不等方差所测量的，在两代中，事件-03和-05显示出在p-0.05时生长的显著提高(表6-l和表6-2)。表6-1在^^'酸铵上生长17天后，在转基因幼苗和集合的非转基因分离子间幼苗面积的T检验比较<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表6-2在低竭酸盐上生长17天后，在转基因幼苗和集合的非转基因分离子间幼苗面积的t检验比较<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>T,植物的定性分析事件-01、-02、-03和-05具有扁平花序，但仍完全可育。也注意到事件-03具有有光泽的外观。T2植物的定性和定量分析ME01905的事件-01、-02、-03和-05具有扁平花序和略微伸长的下胚轴及莲座叶。相比于对照，事件-01、-03和-05具有更小的莲座尺寸和更低的种子产量。事件-02具有正常的莲座尺寸和种子产量。实施例7:前导ME01770;克隆519(SEOIDNO:86)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>ME01770与前导80&81同源。从交互BLAST算法鉴定ME01770，其与前导80&81具有大约70%同一性。对于FinaleTM抗性，ME01770的两个事件表现为3:1分离在T2代中对于FinaleTM抗性，事件-02和-073:1(R:S)分离(数据未显示)。在低硝酸铵和低硝酸盐的生长条件下，ME01770的两个事件显示显著增强的生长代表ME01770的两个事件的种子，在低硝酸铵和低硝酸盐测定中所述的条件下播种。如使用单侧t-检验并且假定不等方差所测量的，在两代中，事件-02和-07显示出在p-0.05时生长的显著提高(表7-1和7-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>T,植物的定性分析事件-01小，具有长的下胚轴且开花前死亡。事件-08和-09具有长的下胚轴且开花前死亡。事件-03和-04小。事件-02和-05具有长的下胚轴。事件-06和-07小，具有长的下胚轴。T2植物的定性和定量分析ME01770的事件-02、-04、-05、-06和-07具有扁平花序和略樣说长的下胚轴及莲座叶。相比于对照，这些事件也具有更小的莲座和更低的种子产量。实施例8:前导ME21445;克隆653656(SEOIDNO:92)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>从交互BLAST算法鉴定ME21445,其与前导80&81具有大约80%同一性。ME2"45的多个事件表现出显著增强的生长如L幼苗，不具有明显的阴性表型。将包含326::653656构建体的经转化的种子在如高通量筛选-Tl世代方法中描述的条件下播种。多个幼苗/事件与对照相比显示出更大，但未表现出明显的阴性表型，例如减小的莲座尺寸或种子产量，如成熟植物。实施例9:前导ME20023;基因组基因座Atlg26945(SEOIDNO:80)<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>ME20023与前导80&81同源。从交互BLAST算法鉴定ME20023，其与前导80&81具有大约80%的同一性。ME21445的多个事件表现出显著增强的生长如T,幼苗，具有伸长的下胚轴、扁平花序和长方形的叶子。将包含35S::Atlg26945构建体的经转化的种子在如高通量筛选-Tl世代方法中描述的*下播种。。多个幼苗/事件与对照相比表现出更大且具有伸长的下胚轴。所述植物在成熟时表现出扁平的花序和长方形的叶子。实施例10-功能同源物序列的确定在上述实施例中所述的"前导，，序列被用以确定前导序列的功能同源物，并且与所述序列一起用以确定对于给定组的前导和功能同源物序列的共有序列。如果目标和查询序列编码具有相似的功能和/或活性的蛋白质，则所述目标序列械^人为是查询序列的功能同源物。作为交互BLAST而熟知的方法(Rivera等人，尸rac.A^/爿ow/.f/5^，1998，95:6239-6244),皮用于从由所有可用的公共和私有肽序列所组成的数据库鉴定潜在的功能同源物序列，所述肽序列包括来自NCBI的NR和来自Ceres克隆的肽翻译物。在开始交互BLAST过程之前，使用BLAST针对来自其来源物种的所有肽对特异的查询多肽进行搜索，从而鉴定与查询多肽具有80%或更多序列同一性并且在比对中具有沿较短序列85%或更多的比对长度的多肽。查询多肽和任何上述被鉴定的多肽被命名为聚簇(cluster)。主要的交互BLAST过程由两轮BLAST搜索组成；正向搜索和反向搜索。在正向搜索步骤中，针对来自目的物种的所有蛋白质序列BLAST来自来源物种SA的查询多肽序列"多肽A"。使用10-5的E-值截断量(cutoff)和35。/。的同一性截断量确定顶部匹配(tophit)。在顶部匹配中，具有最低E-值的序列被指定为最佳匹配，并被认为是潜在的功能同源物。与最佳匹配或最初的查询多肽具有80%或更多序列同一性的任何其它顶部匹配也被认为是潜在的功能同源物。针对所有目的物种重复该过程。在反向搜索轮中，在正向搜索中鉴定的来自所有物种的顶部匹配被用于进行BLAST搜索，所述搜索针对来自来源物种SA的所有蛋白质或多肽序列。来自正向搜索的下述顶部匹配也被认为是潜在的功能同源物，所述顶部匹配将来自前述聚蔟的多肽反向重现为其最佳匹配。功能同源物通过潜在功能同源物序列的手工检查而确定。代表性的功能同源物在图1中给出。该图代表一组与相应的4皮鉴定的功能同源物目标序列比对的前导/查询序列。将前导序列及其相应的功能同源物序列比对以鉴定保守的氨基酸以及确定共有序列，所述共有序列包含在比对的序列中特定位置上屡次出现的氨基酸残基，如图1中所示。然后各共有序列包含被鉴定和编号的保守区或结构域，一些保守区被保守区之间的一个或多个氨基酸残基(用短线(-)表示)隔开。因此本发明有用的多肽包括图1所示的每个前导和功能同源物序列，以及图中所示的共有序列。本发明也包括其它有用的多肽，所述多肽U于共有序列和被鉴定的保守区所构建的。因此，有用的多肽包括包含一个或多个在图1的每个比对表中被编号的保守区的那些，其中所述保守区可由短线隔开。有用的多肽还包括下述多肽，所述多肽包含图1中所有编号的保守区，可选地包含单个比对表中所有编号的保守区(并且按照图1中所示的顺序)。有用的多肽也包括下述多肽，所述多肽包含比对表中所有编号的保守区并且依照图1中所示的顺序，其中保守区,皮短线隔开，其中两个相邻保守区之间的每条短线包含针对前导和/或功能同源物序列的比对表中在定义具体短线的位置上所示的氨基酸。共有序列中的这类短线可以是以下长度，范围从被比对序列之一的短线的最小数的长度，到高达比对序列之一的短线的最高数的长度。这种有用的多肽还可具有与为共有序列所鉴定的长度相等的长度(氨基酸残基的总数)或者是在前导和图1中鉴定的功能同源物序列的任何给定家族中最短至最长序列之间范围内的长度。本发明还包括编码上述多肽的核苷酸及其互补序列，并包括以遗传密码子的简并性为基础的可选方案。如此描述本发明后，本领域的常规技术人员应当明白，可对用于实践本发明的材料和方法进行多种修饰。这类修饰应当被认为属于由下文的权利要求书定义的本发明范围内。表2概述了图1中的序列。来自本文所列的专利和期刊文献的各参考文献通过这类引用在此明确地整体引入本文。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>参考文献(1)Zhang等人(2004)尸/朋/P/r"iW.135:615..(2)Salomon等人(1984)/.3:141.(3)Herrera-Estrella等人(1983)五Mfi0/2:987.(4)Escudero等人(1996)10:355.(5)Ishida等人(1996)Ato"M祝otec/^0/ogv14:745.(6)May等人(1995)B/o/Tec/^/柳13:486)(7)Armaleo等人(1990)C"/reW17:97.(8)Smith.T.F.和Waterman,M.S.(1981)爿rfv.J/;/.2:482.(9)Needleman和Wimsch(1970)/.Afo/.48:443.(10)Pearson和Lipman(1988)Proc.A^/:爿ow/.85:2444.(11)Yamauchi等人(1996)户/朋fAfo/所o/.30:321-9.(12)Xu等人(1995)iV"WAf。/.说W.27:237.(13)Yamamoto等人(1991)/V朋fCW/3:371.(14)P.Tijessen，"HybridizationwithNucleicAcidProbes"LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,P.C.vandderVliet,编著，c.1993byElsevier,Amsterdam.(15)Bonner等人，(1973)/Mo/.所o/.81:123.(16)Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，NewYork.(17)Shizuya等人(1992)Prac.AW/,^o^.S".CASA89:8794-8797.(18)Hamilton等人(1996)Pmc.TVfl"^oifif.fASJ，93:9975-9979.(19)Burke等人(1987)Sc/e"ce，236:806-812.(20)SternbergN.等人(1990)iVociV"rf^c"f/S".C/X爿.，87:103-7.(21)Bradshaw等人(1995)7V"c/J"Vfc/f"，23:4850-4856.(22)Frischauf等人(1983)/.iV^/祝o,，170:827-842.(23)Huynh等人，GloverNM(编著)DNACloning:ApracticalApproach,Vol.1Oxford:IRLPress(1985).(24)Walden等人(19卯)Afo/CW/祝o/1:175-194.(25)Vissenberg等人(2005)/V""fCH/尸/^fiV/46:192.(26)Husebye等人(2002)尸/flW尸/y^V/128:1180.(27)Plesch等人(2001)户/"WJ28:455.(28)Weising等人(1988)j朋.及ev.GewW.，22:421.(29)C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