紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用，特别是涉及一种紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与其在培育耐逆性提高植物中的应用。
背景技术：
在植物生长发育过程中，涉及到各种蛋白水解酶的作用。它们通过有限的水解加工使蛋白成熟，或者将贮藏蛋白降解为多肽和氨基酸，实现蛋白质的动员和氮素的转移，以满足植物生长发育如种子萌发的需要。通过转录因子对启动子的结合和对下游响应因子的水解，蛋白水解酶也可实现对基因表达的响应和调节。随着对逆境和衰老以及细胞程序化死亡研究的逐步深入，作为蛋白水解酶中的一大类，关于半胱氨酸蛋白酶的研究受到越来越多的关注。
半胱氨酸蛋白酶作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理过程。许多研究表明在环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫条件下半胱氨酸蛋白酶mRNA会累积。而在植物某些涉及细胞程序化死亡的发育阶段中，半胱氨酸蛋白酶mRNA含量也会增加，这表明半胱氨酸蛋白酶与植物细胞程序化死亡有关。半胱氨酸蛋白酶也存在于叶绿体和液泡中，可降解光合作用必需酶Rubisco(1，5-二磷酸核酮糖脱羧/加氧酶)的大亚基，在遭受水分胁迫而衰老的植物叶片中，半胱氨酸蛋白酶起着主要作用。此外，在植物的正常发育过程中，半胱氨酸蛋白酶可动员贮存蛋白，实现氮素的再利用，以供种子萌发之需，而在植物特异组织的形成，如木质部分化和通气组织形成等过程中也有半胱氨酸蛋白酶的参与。既然半胱氨酸蛋白酶具有这些重要的功能。因此，分离该编码该蛋白酶基因，并且分析其功能将具有重要的意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种来源于紫花苜蓿的半胱氨酸蛋白酶。
本发明所提供的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，名称为MsCP1，来源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №12)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由350个氨基酸残基组成。
编码上述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因(MsCP1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列2)编码序列表中SEQ ID №1的氨基酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1346个碱基组成，其编码序列为自5’端第47-1099位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增MsCP1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。
本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因导入植物组织或细胞，得到抗逆性提高的植物。
所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1可通过含有所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA1391、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。
使用MsCP1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明基因MsCP1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、花生、矮牵牛、拟南芥或大麦等植物。
本发明所提供的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因，可调控植物抵抗干旱、低温及高盐等逆境胁迫的能力，从而显著提高植物的抗逆性。该蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


图1为PCR扩增的MsCP1 cDNA中间片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为MsCP1氨基酸残基序列的序列比对结果图5为MsCP1氨基酸残基序列的相似性分析结果图6为MsCP1氨基酸序列的结构域分析结果图7为MsCP1氨基酸序列的序列分析结果图8为MsCP1真核表达载体构建过程的示意9为转基因烟草部分植株的基因组DNA和PCR鉴定结果图10为转基因烟草的Southern blot检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。
实施例1、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1 cDNA全序列的获得及其序列分析紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1全长cDNA序列的获得包括以下步骤一、MsCP1 cDNA中间片段的扩增利用RT-PCR方法，从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种中苜一号的总mRNA中克隆得到其半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1的cDNA片段，具体方法如下1、植物材料处理将紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种中苜一号种子用蒸馏水洗净后，浸种1天，催芽。播种于含石英砂的托盘中，置于光照培养箱培养，培养条件25℃，16h光照/8h黑暗。10天后，用200mmol/L NaCl溶液处理6h后可取整株植物提取RNA。
2、总RNA的提取参照张劲松等人的方法(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25(5)659-669)提取RNA，具体方法为将苜蓿叶片在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/L十二烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/Lβ巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/L LiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高、较完整的RNA，-20℃贮存备用。
3、MsCP1 cDNA中间片段的扩增比较现已公开的植物紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的氨基酸残基序列，寻找保守区域，并根据保守区域序列设计一对简并引物，引物序列如下CP15’-CAGGG(TA)T(CG)(AG)TG(TC)GG(TA)TC(GT)TG(TC)TGG-3’CP25’-(AG)TC(AG)CA(AG)TCCACAAGCTG(CT)TG(CT)TC-3’以步骤2提取的紫花苜蓿RNA为模板，用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒(Promega，Cat.No.M1701)并参照试剂盒说明书反转合成其第一链cDNA，反应体系及条件为2ug RNA模板，1.0ul Oligo(dT)18，5ul 5×RT缓冲液，1.25uldNTP(10mmol/L)，1ul RNA酶蛋白质抑制剂(RNAasin)，1ul逆转录酶，42℃反应60min，70℃变性5min，将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。
再以获得的第一链cDNA为模板，在引物CP1和CP2的引导下，PCR扩增MsCP1 cDNA的中间片段，25ul PCR反应体系为2μl cDNA模板，0.5μl Taq polymerase(Promega，5U/μl)，2.5μl 10×PCR buffer，2.5μl MgCl2(25mmol/L)，0.5μl dNTPs(各10mmol/L)，CP1和CP2(浓度均为10mmol/L)各2μl，ddH2O 13μl。反应条件为先94℃变性4分钟；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；最后72℃延伸5min。反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为分子量标准(DL2000)，泳道1为PCR扩增的MsCP1 cDNA片段)，经PCR扩增获得了长度约150bp的目的片段。
回收并纯化长度约150bp的目的片段，取回收纯化的PCR产物5ul、1ul pMD-18T载体和连接缓冲液5ul，混匀后16℃连接12-24小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pMD-MsCP1，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由117个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID №4的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中SEQ ID №4由39个氨基酸残基组成，其中自氨基端第1-8位和第31-38位氨基酸残基为保守序列。
二、MsCP1 cDNA的5’和3’UTR(非翻译区)的克隆根据步骤一得到的cDNA序列设计特异性3’端特异引物(GSP15’-ATTCAGCACAACTGGAGCTTTGGAG-3’)和5’端特异引物(GSP25’-GCAGCCAAAGTTATTGAAAGCACCAGCA-3’)，通过RACE的方法进一步扩增得到MsCP1 cDNA的5’和3’端UTR片段。
以紫花苜蓿RNA为模板，分别在3’端特异引物GSP1和5’端特异引物GSP2的引导下，用SMART RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech，Cat.no.K1811-1)并参照试剂盒说明书RT-PCR扩增MsCP1 cDNA的3’和5’末端片段。3’RACE的扩增条件为94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，共35个循环。5’RACE的扩增条件为先94℃变性5s，72℃延伸3min，共5个循环；然后94℃变性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，共5个循环；最后94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，共25个循环。反应结束后，对3’RACE和5’RACE产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，3’RACE产物检测结果如图2所示(泳道M为分子量标准(DL2000)，泳道1为3’RACE产物)，经PCR扩增获得了长度约800bp的DNA片段；5’RACE产物检测结果如图3所示(泳道M为分子量标准(DL2000)，泳道1为5’RACE产物)，经PCR扩增获得了长度约600bp的DNA片段。回收并纯化3’RACE和5’RACE产物，分别连接入pMD-18T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆提质粒，得到分别含有3’UTR和5’UTR的重组质粒，分别命名为pMD-3’UTR和pMD-5’UTR，对其进行测序，测序结果表明MsCP1 cDNA的5’端序列具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №5由638个碱基组成，3’端序列具有序列表中SEQ ID №6的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №6由824个碱基组成。
三、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1全长cDNA序列的获得利用步骤一和步骤一获得的长度分别为117bp，638bp和824bp片段之间的重叠区，借助DNA拼接软件contig得到MsCP1的全长cDNA序列。该序列具有序列表中SEQID №2的多核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №2由1346个碱基组成，其编码框为自5’端第47-第1099位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №1由350个氨基酸残基组成。
四、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因及其编码蛋白的序列分析1、MsCP1核苷酸序列同源性分析对MsCP1的核苷酸序列进行相似性分析，分析结果如表1所示，表明其与PsCP(GenBank号CAA92583.1)的相似性最高，与其它植物的半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列也有较高的同源性，如紫云英(Cicer arietinum)、大豆、杏(Prunusarmeniaca)、拟南芥、烟草、玉米、花椰菜、大麦和多花黑麦草(Lolium multiflorum)等，但同源性最高的为豆科植物，如豌豆、紫云英和大豆，表明MsCP1的核苷酸序列具有种属特异性和密码子偏爱性。
表1 紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列在GenBank中的同源性比较结果

2、紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶MsCP1的蛋白序列分析1)MsCP1氨基酸序列的同源性分析对紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶MsCP1的氨基酸序列进行序列比对并进行相似性分析，比对序列为PsCP(emb|CAA92583.1)、AtAALP(gb|AAN31820.1)、BoCP5(gb|AAL60582.1)、PaCP(gb|AAB97142.1)、NTCP-23(dbj|BAA96501.1)、PeTH3(gb|AAC49361.1)、LeCYP-3(emb|CAA88629.1)、aleurain(emb|CAA28804.1)、LmSEE1(emb|CAB71032.1)和ZmSEEl(emb|CAA68192.1)，序列比对结果如图4所示(阴影部分为相同序列)，相似性分析结果如表2和图5所示，MsCP1的氨基酸序列与PsCP的相似性高达91％，与其它植物的半胱氨酸蛋白酶也有较高的同源性，如拟南芥、烟草、番茄、大麦、花椰菜、杏(Prunus armeniaca)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)和矮牵牛(Petunia×hybrida)等，推断所克隆的克隆的基因MsCP1是紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因。
表2 紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的氨基酸残基序列的同源性比较结果


3、MsCP1的结构域分析对MsCP1的氨基酸序列进行结构域分析，结果如图6和表3所示，其含有一个保守结构域(CD)，CD为papain家族所共有，表明MsCP1属于papain蛋白家族，再在http//ca.expasy.org/网站上用Scan prosite程序对MsCP1编码蛋白的氨基酸序列进行分析，分析结果如图7所示(下划线部分所示为推测的信号肽，阴影部分为液泡定位信号，“*”表示ERFNIN motif位点；“◎”表示保守活性位点；“◆’表示潜在的糖基化位点；

表示CK2磷酸化位点；

表示PKC磷酸化位点)，表明MsCP1含有papain家族保守活性位点Cys157、is297和Asn317具有6个Cys残基参与二硫键的形成；缺乏C端结构域，N端具有由16个疏水氨基酸构成的信号序列，含有ERFNIN花式和液泡定位的NPIR模式，因此MsCP1可能定位于液泡内；分析结果还表明MsCP1可能在翻译后发生多种修饰，其含有3个潜在的N-linked糖基化位点Asn-X-Ser/Thr，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个蛋白激酶C磷酸化位点和11个N-肉豆蔻酰化位点(未标出)。
表3 MsCP1的保守结构域的比对结果

实施例2、MsCP1转基因烟草的抗逆性分析一、MsCP1转基因烟草的获得及其鉴定1、MsCP1真核表达载体的构建根据实施例l克隆的MsCP1 cDNA全长序列设计引物CPF和CPR(引物CPR中去掉了终止密码子，以与GUS基因融合)，引物序列如下CPF5’-GC

TGAAAGATGGCACAGTGGACG-3’(方框内碱基为限制性内切酶Xba I识别位点)CPR5’-CG

GGCCACAACAGGATA-3’(方框内碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)
以紫花苜蓿RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，在引物CPF和CPR的引导下，PCR扩增MsCP1全长序列(退火温度为56℃)，反应结束后，回收约1000bp的PCR扩增产物，将其用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切后，回收目的片段，-20℃保存备用。再用分步单酶切的方法对pBI121进行酶切，先用Xba I在37℃下酶切后回收酶切片段，再对回收片段用BamH I在30℃下进行酶切，回收线性大片段。将经酶切的MsCP1片段与线性化载体pBI121进行连接，20.0mL连接反应体系及反应条件为pBI121线性大片段3.0mL，MsCP1片段9.0mL，10×T4DNA连接酶缓冲液2.0mL，T4DNA连接酶(350U/mL)1.0mL，ddH2O 5.0mL，16℃保温16h，得到MsCP1的植物表达载体，命名为pBI-CP，其构建流程图如8所示。
2、转化烟草1)农杆菌感受态细胞的制备a.挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3mL含100μg/mL链霉素(Str)的YEB液体培养基，28℃振荡培养12小时；b.取上述经培养的菌液500mL接种于50mL YEB(含100μg/mL Str)液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；d.5000rpm离心5min，弃去培养基；e.加入10mL 0.15mol/L NaCl溶液悬浮农杆菌细胞，5000rpm离心5min；f.用1mL预冷的20mmol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴，24h内使用，或分装成每管200mL，液氮中速冻1min，置-80℃保存备用。
2)农杆菌的转化和阳性克隆的鉴定a.取200mL农杆菌感受态细胞，加入1μg质粒pBI-CP，冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃慢速(140rpm)振荡培养4h；b.10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素(Kan)和100μg/mL Str的YEB平板上，28℃倒置培养48h；c.挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养基中(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振荡培养12小时；d.小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，用引物CPF和CPR进行PCR鉴定，将获得的阳性质粒命名为pBI-CP-GUS。
3)烟草的转化a.取转化成功的阳性农杆菌按1∶100接种于YEB液体培养液(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振荡培养；b.取上述菌液按1∶50接种于YEB液体培养液(含50μg/mL Kan和100μg/mL Str)，28℃振荡培养，进行二次活化；c.当OD600达到0.6时，5000rpm离心5min收集菌体，用1/2MS液体培养基(pH7.0)洗菌一次，并将其稀释至5倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用；d.选取30天苗龄的烟草无菌苗，切下成熟叶片，用5-10mm打孔器制取叶盘外植体；e.将新制备的叶盘外植体投入已准备好的农杆菌菌液中，侵染15min，同时留出一部分叶盘作对照，分别为CK1未侵染叶盘放入B0培养基(MS+2μg/mL 6-BA+0.5μg/mL IAA)上，检测培养基的有效性；CK2未侵染叶盘放入B0培养基上，检测抗生素的有效性；f.将侵染过的叶盘放在表明铺有一张无菌滤纸的B0培养基上，28℃暗处共培养两天；g.将叶盘转入含有400μg/mL Carb和50μg/mL Kan的B培养基上，28℃见光培养，10-15天继代一次；h.当抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有200μg/mL Carb和75μg/mL Kan的T培养基(MS+200mg/mL Carb+75mg/mL Kan)上生根，15-20天后生根完全，即可移栽温室；i.收集T1代种子。
3、转基因烟草的鉴定1)PCR鉴定先用PCR的方法对步骤2的转基因烟草进行鉴定，包括以下步骤(1)烟草基因组DNA的少量提取采用CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)法，提取步骤2)转化烟草叶片的DNA，具体方法如下a.取叶片洗净晾干，放入液氮致冷、研磨；b.加入65℃预热的CTAB提取液900mL；c.65℃水浴15-20min，每隔2min颠倒一次；d.冷却后加入500mL氯仿/异戊醇(24∶1)，剧烈摇动5min；e.6000-8000rpm，4℃离心10min；f.取上清液，重复d、e两步；g.取上清液，加入1/10体积的3mol/L NaAc和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀；
h.12000rpm，4℃离心15min，倒掉上清液；i.70％乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后溶于TE(或双蒸水)中；j.取少许DNA，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9中的图A所示，表明获得了纯度较高的DNA，-20℃贮存备用。
(2)转基因植株的PCR检测a.35S启动子检测引物序列如下P35S-15’-CTTACGCAGCAGGTCTCATCA-3’P35S-25’-CCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3’以转化烟草叶片的DNA为模板，在引物P35S-1和P35S-2的引导下，用PCR的方法进行35S启动子的检测(退火温度为54℃)，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9中的图B所示(泳道0为作为阴性对照的未转化植株，泳道1-11为转化植株，泳道M为Marker)，阳性转基因植株可扩增出长度约为530bp的DNA片段。
b.GUS基因的检测引物序列如下GUSF5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’GUSR5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’以转化烟草叶片的DNA为模板，在引物GUSF和GUSR的引导下，用PCR的方法进行35S启动子的检测(退火温度为54℃)，反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9中的图C所示(泳道0为作为阴性对照的未转化植株，泳道1-12为转化植株，泳道M为Marker)，阳性转基因植株可扩增出长度约为750bp的DNA片段。
c.MsCP1基因全长的检测以转化烟草叶片的DNA为模板，在引物CPF和CPR的引导下，用PCR的方法进行检测(退火温度为56℃)，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9中的图D所示(泳道0为作为阴性对照的未转化植株，泳道1-6为转化植株，泳道M为Marker，泳道+为阳性对照质粒pBI-CP-GUS)，阳性转基因植株可扩增出长度约为1Kb的DNA片段。
d.MsCP1-GUS片段的检测引物序列如下AnF5’-CGGGATCCTTGGAGTCAGCTTAC-3’
GUSR5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’以转化烟草叶片的DNA为模板，在引物AnF和GUSR的引导下，用PCR的方法进行35S启动子的检测(退火温度为54℃)，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9中的图E所示(泳道1-5为转化植株，泳道M为分子量标准(DL2000))，阳性转基因植株可扩增出长度约为2Kb的DNA片段。
2)Southern blot检测对步骤1)经鉴定获得的阳性转基因植株用Southern blot的方法做进一步检测，所用探针为GUS基因的部分片段(序列表中序列7)，具体方法为将基因组DNA用限制性内切酶Hind III进行酶切，取少量酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后，切下分子量标准，EB染色，凝胶条的一侧放一把透明的塑料尺照像。依次对凝胶进行如下处理0.25mol/L HCl中浸泡胶20min，凝胶中溴酚蓝变为黄色；变性液(0.5mmol/L NaOH，1.5mmol/L NaCl)中处理凝胶45min；中和液(0.5mmol/LTris-HCl(pH 7.0)，1.5mmol/L NaCl)中浸泡胶30min。采用毛细管转移方法将DNA转移至尼龙膜。2×SSC漂洗尼龙膜，吹干或晾干后于80℃烘30min-1h。预杂交与杂交5×SSC预湿的杂交膜放入杂交管中，带有DNA片段的一面向里，加入15mL预热到65℃的Church缓冲液(含1％BSA，1mM EDTA，0.25mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.2)，7％SDS)预杂交5小时以上，加入变性好的探针，于65℃杂交16小时。杂交结束后，分别用2×SSC+0.5％SDS，1×SSC+0.5％SDS，0.5×SSC+0.5％SDS和0.1×SSC+0.1％SDS在65℃下洗膜，每次15分钟，并不断用射线监控仪检测信号。洗完后，用滤纸吸掉膜表面的水分，保鲜膜包好，放入暗盒，-70℃放射自显影。杂交结果如图10所示(泳道1为对照质粒pBI-CP-GUS；泳道2-10为转基因植株；泳道11为阴性对照(未转化植株))，其中泳道2-10显示出明显的杂交条带，表明其为阳性转基因植株。
4、阳性植株的筛选用下述方法对步骤3鉴定出的阳性转基因植株进行筛选a.制备MS(0.43％MS盐，3％蔗糖，1％琼脂，用KOH调pH至5.7)选择培养基；b.T1代种子表面消毒(70％乙醇浸种2min，0.5％次氯酸钠浸种10min，无菌水洗5次，每次2min)；c.将种子平铺于含相应抗生素(40μg/mL Kan和50μg/mL羧苄西啉钠)的MS选择培养基中，密度为1000-2000粒种子/皿；d.4℃春化3天，移入生长箱中(22℃恒温，24小时光照，光强为30-40μmol.m-2.s-1)
e.7天后挑选转化体，表现为真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中；f.将转化体转至正常的MS培养基中，10天后转入土壤；g.收获T2代种子，备用观察，并做生理生化鉴定，得到遗传稳定的转基因植株。
二、MsCP1转基因烟草的抗逆性鉴定1、转基因植株的耐盐性鉴定将野生型烟草种子和步骤一获得的T3代MsCP1转基因烟草种子分别在1/4MS，和含100ug/mL Kan的抗性平板上萌发，在抗性平板上生长两周后，将幼苗载入土中，在室温中培养两周后进行NaCl胁迫处理，用0、10Mm、100mM、200mM的NaCl浇灌植株，两天浇灌一次。两周后观察表型，并将上述供测植株从培养土中取出，取地上部分测鲜重、干重，同时，取上述植物材料在70℃烘烤至恒重后称干重，并用Z 5300型原子吸收光谱仪进行Na+含量的测定。
结果对T3代转基因烟草和对照烟草进行盐处理两周后，在0、10mM的NaCl盐胁迫下，无论是野生型还是转基因烟草植株长势都很正常。但是在100mM，200mM的NaCl处理下，野生型烟草的根生长受到抑制，且变短变粗、分叉减少，叶片变黄，基部叶片脱落并伴有坏死。转基因烟草的根的生长情况明显优于对照，没有受到明显的生长限制。在盐胁迫下，转基因烟草地上部分的鲜重、干重明显高于野生型；如在100mM的NaCl处理下，与未经盐处理的相比，野生型烟草的鲜重下降了42％，而转基因烟草却仅下降约21％。上述实验结果表明本发明的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶蛋白与基因可以增强植物的耐盐性，从而可作为植物耐盐基因工程的侯选基因加以应用，用来改良植物的耐盐性状。
2、转基因植株的抗旱性鉴定将野生型和T3转基因烟草种子分别在1/4MS，和含100ug/mL Kan的抗性平板上萌发，在抗性平板上生长两周后，将幼苗载入土中，在室温中培养两周后进行干旱胁迫处理。分别于第一周、两周、三周后观察表型，并将上述材料从培养土中取出，取地上部分测鲜重、干重。
结果对T3代转基因烟草和对照烟草进行干旱胁迫一周后，无论是野生型还是转基因烟草植株长势都很正常。但是在干旱处理二周后、三周后，野生型烟草的根生长受到抑制，且变短变粗、分叉减少，叶片变黄，基部叶片脱落并伴有坏死。但转基因烟草的根的生长情况明显优于对照，在二周后没有受到明显的生长限制，在处理17天后开始叶片才开始发黄。上述实验结果表明本发明的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶蛋白与基因可以增强植物的抗旱性，从而可作为植物抗旱基因工程的侯选基因加以应用，用来改良植物的抗旱性状。
序列表<160>7<210>1<211>350<212>PRT<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>1Met Ala Gln Trp Thr Leu Leu Ile Val Phe Phe Cys Val Ala Thr Ala1 5 10 15Ala Ala Gly Leu Ser Phe His Asp Ser Asn Pro Ile Arg Met Val Ser20 25 30Asp Met Glu Lys Gln Leu Leu Gln Val Ile Gly Glu Ser Arg His Ala35 40 45Val Ser Phe Ala Arg Phe Ala Asn Arg Tyr Gly Lys Arg Tyr Asp Thr50 55 60Val Asp Glu Met Lys Arg Arg Phe Lys Ile Phe Ser Glu Asn Leu Gln65 70 75 80Leu Ile Glu Ser Thr Asn Lys Lys Arg Leu Gly Tyr Thr Leu Gly Val85 90 95Asn His Phe Ala Asp Trp Thr Trp Glu Glu Phe Arg Ser His Arg Leu100 105 110Gly Ala Ala Gln Asn Cys Ser Ala Thr Leu Lys Gly Asn His Arg Ile115 120 125Thr Asp Val Val Leu Pro Ala Glu Lys Asp Trp Arg Lys Glu Gly Ile130 135 140Val Ser Glu Val Lys Asp Gln Gly His Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe145 150 155 160Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Lys165 170 175
Asn lle Ser Leu Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Ala Gly Ala Phe180 185 190Asn Asn Phe Gly Cys Asn Gly Gly Leu Pro Ser Gln Ala Phe Glu Tyr195 200 205Ile Lys Tyr Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala Tyr Pro Tyr Thr210 215 220Gly Gln Asn Gly Pro Cys Lys Phe Thr Ser Glu Asp Val Ala Val Gln225 230 235 240Val Leu Gly Ser Val Asn Ile Thr Leu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Lys245 250 255His Ala Val Ala Phe Ala Arg Pro Val Ser Val Ala Phe Glu Val Val260 265 270Asp Asp Phe Arg Leu Tyr Lys Lys Gly Val Tyr Thr Ser Thr Thr Cys275 280 285Gly Asn Thr Pro Met Asp Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr290 295 300Gly Ile Glu Asp Gly Val Pro Tyr Trp Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly305 310 315 320Gly Glu Trp Gly Asp His Gly Tyr Phe Lys Met Glu Met Gly Lys Asn325 330 335Met Cys Gly Val Ala Thr Cys Ser Ser Tyr Pro Val Val Ala340 345 350<210>2<211>1346<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>2acgcggggag agccgtagaa gcagagtttt tagttgagag tgaaagatgg cacagtggac 60gctccttatc gttttcttct gcgtggccac cgccgccgcc ggattgagct tccacgactc120caatcctatt cggatggtct ccgacatgga aaagcagctt cttcaggtca tcggagaatc180
tcgccacgct gtctctttcg ctcgctttgc taacagatac ggcaaaagat acgataccgt 240tgatgaaatg aagcgtagat ttaagatctt ctctgagaat cttcaactta tcgaatctac 300taataagaaa cgtcttggtt acactctcgg tgttaatcat tttgctgatt ggacttggga 360ggagttcaga agtcatagac ttggtgctgc tcaaaattgt tctgctactc tcaaggggaa 420ccataggatt accgatgttg ttcttcctgc cgagaaagat tggaggaaag aaggtatagt 480cagtgaagtt aaggatcaag gccactgcgg atcatgctgg acattcagca caactggagc 540tttggagtca gcttacgcac aggccttcgg aaagaatatc tctctttctg agcagcagct 600agtggactgt gctggtgctt tcaataactt tggctgcaat ggtgggctgc catcccaagc 660ctttgaatac attaaataca atggtggcct tgagacagag gaagcatatc cctacactgg 720acaaaatggt ccctgcaaat ttacatctga agacgttgct gttcaagtcc ttggctctgt 780caatatcacc ttgggtgctg aggatgaatt gaaacatgca gttgcttttg ctcgtcccgt 840tagtgtggca tttgaggtgg ttgatgactt cagattgtac aagaaaggag tttacactag 900tacaacttgt ggcaacacac ccatggatgt gaatcatgct gttcttgctg ttgggtatgg 960aattgaagat ggtgtaccat attggctcat taaaaactca tggggaggtg aatggggtga1020ccatggctac ttcaaaatgg aaatggggaa gaatatgtgc ggtgttgcaa cttgttcatc1080ctatcctgtt gtggcctaaa tggtacggaa ggatgtgatg cccgaaaggc tacccctgtg1140aattccacct tgcatgttat gctttgtagt tcatcttaaa cgtaaaatgt atgtgagacg1200atgataagtc tttgttgata ttcttctgta aaataagttt ggagtttaga tgccatttct1260tctattcatc atataccaca ttacaaaata agattgtaaa tcatgtatta ttatcacaca1320gagacattat ctttaaaaaa aaaaaa 1346<210>3<211>117<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>3cagggatcgt gtggatcttg ctggacattc agcacaactg gagctttgga gtcagcttac 60gcacaggcct tcggaaagaa tatctctctt tctgagcaac agcttgtgga ttgtgac117<210>4<211>39
<212>PRT<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>4Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu1 5 10 15Glu Ser Ala Tyr Ala Gln Ala Phe Gly Lys Asn Ile Ser Leu Ser Glu20 25 30Gln Gln Leu Val Asp Cys Asp35<210>5<211>638<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>5aacgcgggga gagccgtaga agcagagttt ttagttgaga gtgaaagatg gcacagtgga 60cgctccttat cgttttcttc tgcgtggcca ccgccgccgc cggatttagc ttccatgact120ccaatcctat tcggatggtc tccgacatgg aggagcagct tcttcaggtc atcggagaat180ctcgccacgc tgtctctttc gctcgctttg ctaacagata cggcaaaaga tacgataccg240ttgatgaaat gaagcgtaga tttaagatct tctctgagaa tcttcaactt atcaaatcta300ctaataagaa acgtcttggt tacactctcg gtgttaatca ttttgctgat tggacttggg360aggagttcag aagtcataga cttggtgctg ctcaaaattg ttctgctact ctcaagggga420accataggat taccgatgtt gttcttcctg ccgagaaaga ttggaggaaa gaaggtatag480tcagtgaagt taaggatcaa ggccactgcg gatcatgctg gacattcagc acaactggag540ctttggagtc agcttacgca caggccttcg gaaagaatat ctctctttct gagcagcagc600tagtggactg tgctggtgct ttcaataact ttggctgc638<210>6<211>824<212>DNA
<213>紫花苜蓿(Medicago sativa L.)<400>6attcagcaca actggagctt tggagtcagc ttacgcacag gccttcggaa agaatatctc 60tctttctgag cagcagctag tggactgtgc tggtgctttc aataactttg gctgcaatgg120tgggctgcca tcccaagcct ttgaatacat taaatacaat ggtggccttg agacagagga180agcatatccc tacactggac aaaatggtcc ctgcaaattt acatctgaag acgttgctgt240tcaagtcctt ggctctgtca atatcacctt gggtgctgag gatgaattga aacatgcagt300tgcttttgct cgtcccgtta gtgtggcatt tgaggtggtt gatgacttca gattgtacaa360gaaaggagtt tacactagta caacttgtgg caacacaccc atggatgtga atcatgctgt420tcttgctgtt gggtatggaa ttgaagatgg tgtaccatat tggctcatta aaaactcatg480gggaggtgaa tggggtgacc atggctactt caaaatggaa atggggaaga atatgtgcgg540tgttgcaact tgttcatcct atcctgttgt ggcctaaatg gtacggaagg atgtgatgcc600cgaaaggcta cccctgtgaa ttccaccttg catgttatgc tttgtagttc atcttaaacg660taaaatgtat gtgagacgat gataagtctt tgttgatatt cttctgtaaa ataagtttgg720agtttagatg ccatttcttc tattcatcat ataccacatt acaaaataag attgtaaatc780atgtattatt atcacacaga gacattatct ttaaaaaaaa aaaa 824<210>7<211>682<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg 60ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc120tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac180cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa240ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac300
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1.紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1所述的紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的氨基酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。
7.含有权利要求5所述表达载体的宿主菌。
8.一种提高植物耐逆性的方法，是将权利要求3所述的编码紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因导入植物组织或细胞，得到抗逆性提高的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶基因通过含有所述紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶的基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBI121、pBin19、pCAMBIA1391、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物宿主为水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、花生、矮牵牛、拟南芥或大麦。
全文摘要
本发明公开了一种紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与其在培育耐逆性提高植物中的应用。该酶是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性的蛋白质。本发明对于培育抗逆性提高的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。
文档编号C12N15/63GK1807611SQ20061000049
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月5日 优先权日2006年1月5日
发明者韩建国, 闫龙凤, 杨青川, 孙彦 申请人:中国农业大学