专利名称：革兰氏阳性细菌核酸提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种革兰氏阳性细菌核酸提取方法。
背景技术：
细菌是引发大多数感染性疾病的病原体，引起临床细菌感染的致病菌均分为革兰氏阳性菌和阴性菌二大类。目前为止，在人类感染的细菌谱中虽然革兰氏阴性菌仍占有主要地位，但是革兰氏阳性菌的感染率却有着逐年增加的趋势，现已可占到全部细菌感染的30-40%，其中95%为凝固酶阴性葡糖球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌。无论是用于致病微生物检测的分子诊断技术，还是用于细菌分子生物学研究的转录组研究技术，其第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸(包括RNA和DNA)的提取，这直接影响着这些检测技术的结果。
众所周知，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁等结构有着很大的差别，革兰氏阳性菌由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取(尤其是RNA)方面，效果一直不很理想。目前革兰氏阳性菌的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用的破壁方法主要包括超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前被广泛采用的市场销售的细菌RNA提取试剂盒产品是Invitrogen公司的RiboPure -Bacteria试剂盒和QIAGEN公司的PureLink RNA Mini试剂盒等。这些试剂盒的价格昂贵,操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从各种革兰氏阳性菌中高效、快捷的提取核酸，已成为了目前分子诊断技术和转录组研究等技术推广和应用的一个瓶颈。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂。本发明提供的试剂，由提取液A和提取液B组成；所述提取液A按照如下方法制备将Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5_20mM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Bri j58、所述3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 05%-0. 2% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1-0. 5% (体积百分含量)；所述提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为(99-98) : I : I。所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；所述提取液A的pH值为7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具体为7. 5 ；所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7. 5。 所述提取液A中，所述Tri s在所述提取液A中的浓度为IOmM ；
所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ；所述SDS、所述 Tween 80、所述 Triton X-100、所述 Brij 58、所述 3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1% ；所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%;所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98 : I : I。本发明的第二个目的是提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤先将所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳 性细菌裂解液。所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为I U g-5g 400 u I 400iU，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg 400 u I 400 u I0所述反应时间为12-18min ;所述反应时间具体为15min ；所述反应温度为60_70°C ;所述反应温度具体为65°C。所述离心的温度为0_4°C ;所述离心的温度具体为4°C ；所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；所述离心的转速为10000-15000rpm,所述离心的转速具体为12000rpm,离心半径为 10cm。在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4°C，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为(TC，所述静置时间具体为5分钟。所述混合的方式采用震荡混匀，所述混合的时间为10-15分钟；所述混合的时间具体为15分钟。在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。所述上层水相与所述氯仿的体积比为I : (0.8-1. 5)，所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1:1。所述离心的温度为0_4°C ;所述离心的温度具体为4°C ；所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为 10cm。本发明的第三个目的是提供一种革兰氏阳性细菌RNA的提取试剂。本发明提供的试剂，由所述试剂、结合液和洗涤液组成；所述结合液为浓度为4. 6M的异硫氰酸胍水溶液；所述洗涤液为70% (体积百分含量)乙醇水溶液。所述结合液和所述洗涤液的溶剂均为DEPC水。所述试剂、所述结合液和洗涤液均为独立包装。
本发明的第三个目的是提供一种革兰氏阳性细菌RNA的提取方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述试剂中的所述结合液和无水乙醇混匀，得到混合液；2)将步骤I)得到的混合液过柱纯化，用所述试剂中的洗涤液洗脱、收集洗脱液，即得到RNA。步骤I)中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述结合液和所述无水乙醇的体积比为I :3:3;步骤2)中，所述过柱纯化包括如下步骤
A、将所述步骤I)得到的混合液转移到结合柱中，离心；B、向步骤A得到的结合柱中加入所述试剂中的所述洗涤液，离心；C、向步骤B得到的结合柱再次加入所述洗涤液，离心；D、向步骤D得到的结合柱中加入DEPC水，离心、收集洗脱液，得到RNA。步骤2)A、B、C中，所述离心的离心力均为7500_8000g，离心时间均为25-30秒，离心温度均为23-25°C ；步骤2) D中，所述静置时间为2-5分钟，所述静置温度为23_25°C ；步骤2) E中，所述离心力为7500_8000g，所述离心时间为1-1. 5分钟。步骤2)A、B、C中，所述离心的离心力均为8000g，离心时间均为30秒，离心温度均为 25 0C ；步骤2) D中，所述静置时间为2、3或5分钟,所述静置温度为25°C ；步骤2) E中，所述离心力为8000g，所述离心时间为I分钟。本发明第四个目的是提供一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的提取方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液；2)、将步骤I)得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因组DNA。步骤I)中，所述消化温度为37°C，所述消化时间为30分钟。本发明的第五个目的是提供一种革兰氏阳性细菌基因组DNA和RNA的提取方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将所述的方法得到的去除细胞成分的核酸提取液、浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液，2)将步骤I)得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇洗涤，得到基因组DNA和总RNA混合物。步骤I)中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为I : 0. I : 2. 5。步骤2)中，所述离心的转速为12000rpm，离心半径为10cm，所述离心的温度为4°C，所述离心的时间为15分钟。步骤I)中，所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。在步骤I)后和步骤2)前还包括如下步骤将所述混合液静置的步骤；
所述静置的时间为30分钟，所述静置的温度为-20°C。所述革兰氏阳性细菌为耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。所述的试剂或所述的方法或所述的试剂或所述的方法在鉴定革兰氏阳性细菌和/或检测革兰氏阳性细菌的基因转录中的应用也是本发明保护 的范围。本发明的实验证明，本发明提供了一种高效提取革兰氏阳性细菌核酸的方法，能够同时提取革兰氏阳性细菌的RNA和基因组DNA，或者选择性提取RNA或基因组DNA，其主要特定是操作简单，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
图I为耻垢分枝杆菌提取的核酸的甲醛变性胶电泳2为耻垢分枝杆菌提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图3为金黄色葡萄球菌提取的核酸的甲醛变性胶电泳图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所用的试剂如提取液A 按照如下方法制备将 Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100, Brij58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为IOmM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3- [ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1% (体积百分含量);提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为98 : I : I。提取液A的pH值具体为7. 5 ;提取液B的pH值具体为7. 5。实施例I、分枝杆菌的核酸提取分枝杆菌是一类典型的革兰氏阳性菌，其中包含多种高危害的致病菌，例如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等，该类细菌的核酸提取在病原体分子诊断中具有重要意义。选取危险度较低的耻垢分枝杆菌作为模型，验证本发明所述的核酸提取方法在革兰氏阳性菌一耻垢分枝杆菌中的核酸提取效果。菌株耻垢分枝杆菌(拉丁名Mycobacterium smegmatis、菌株购自美国ATCC,菌株号 19420，)试剂提取液A，提取液B，氯仿，无水乙醇，75%乙醇，RNase A (7000units/ml)，结合柱(购自MN公司，产品目录号740903)，结合液(浓度为4. 6M的异硫氰酸胍水溶液)，洗涤液(70% (体积百分含量)乙醇水溶液)，pH5. 2的3M醋酸钠溶液，DEPC水，灭菌水，甲醛，溴酌■蓝，MOPs (出售公司 Amresco,产品目录号 Amresco M215), TBE buffer (配方 0. 09mol/LTris-硼酸 0. 002mol/L EDTA)培养基LB培养基I、提取核酸I)耻垢分枝杆菌的培养与保存在超净工作台内将耻垢分枝杆菌划线接种于LB (Luria-Bertani Agar Medium)培养基平板以进行复苏，将平板在培养箱中倒置，37°C孵育过夜(12h)。待长出单菌落后，挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，37°C孵育过夜，将菌液按ImL/管进行分装，_20°C冻存备用。2)去除革兰氏阳性细菌的细胞壁A、裂解 取Iml的冻存菌液，融化后装入1.5ml的离心管中，在室温(25 °C )条件下12000rpm离心2分钟，用移液枪将上清液吸走。在5mg离心沉淀物(菌体湿重)中加入400ul的提取液A，用移液枪将沉淀物重悬，使微生物充分混合在提取液A中。然后再混合物中加入400ul的提取液B，在涡旋器上剧烈震荡2分钟，在震荡过程中按紧离心管的盖子，防止菌液混合物漏出。剧烈震荡结束后，将离心管放置于65°C的震荡仪中，温育I个小时，在此期间每间隔30秒剧烈震荡5秒钟。将装有裂解液离心管在冰上进行冰浴5分钟((TC)，然后将离心管在4°C的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，离心管中溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂。B、氯仿抽提在吸出的装有水相离心管中加入400ul的氯仿(所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为I : I )，将其在涡旋震荡仪上剧烈震荡，使水相与氯仿充分混匀。将装有混合物的离心管在在4°C的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，离心管中的溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。3)选择性提取基因组DNA 将氯仿抽提得到的溶液(去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液)转移至新的I. 5ml的离心管中，加入Iul的RNase A，在37°C的条件下反应30分钟，过柱纯化，得到基因组DNA。CTAB法提取细菌核酸操作步骤。a)将菌株接种于液体LB培养基中，37°C震荡培养过夜。b)取I. 5ml培养物与I. 5ml离心管中，12000rpm离心2min,将上清弃掉。c)向沉淀物中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮。TE缓冲液的配置见下表
组分浓度
Tris-HCKpH 8. 0)10mmol/L
EDTA (pH 8.0)lmmol/L
d)在悬浮液中再加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，充分震荡混匀，于37°C条件下孵育Ih。e)孵育完成后，在溶液中加入IOOul 5mol/L NaCl,充分震荡混匀。f )再加入80ul CTAB溶液，充分震荡混匀后在65°C条件下孵育lOmin。CTAB溶液的配置见下表
权利要求
1.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成； 所述提取液A按照如下方法制备将Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100, Brij58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 05%-0. 2% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1-0. 5% (体积百分含量)； 所述提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为(99-98) : I : I。
2.根据权利要求I所述的试剂，其特征在于 所述提取液A和所述提取液B均为独立包装； 所述提取液A的pH值为7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具体为7. 5 ； 所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7. 5。
3.根据权利要求I或2所述的试剂，其特征在于 所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为IOmM ； 所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ； 所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1% ；所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1% ； 所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98 : I : I。
4.一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的方法，包括如下步骤 先将权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液A与革兰氏阳性细菌混匀，再加入权利要求1-3中任一所述的试剂中的所述提取液B，混合，反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于 所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比为I U g-5g 400 u I 400iU，所述革兰氏阳性细菌的菌体湿重、所述提取液A和所述提取液B的配比具体为5mg 400 u I 400 u I0
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于 所述反应时间为12-18min ;所述反应时间具体为15min ； 所述反应温度为60-70°C ;所述反应温度具体为65°C。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于 所述离心的温度为0-4°C ;所述离心的温度具体为4°C ； 所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟； 所述离心的转速为10000-15000rpm,所述离心的转速具体为12000rpm,离心半径为IOcm0
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4°C，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为0°c，所述静置时间具体为5分钟。
9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述混合的方式采用震荡混匀，所述混合的时间为10-15分钟；所述混合的时间具体为15分钟。
10.根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液。
11.根据权利要求4-10中任一所述的方法，其特征在于 所述上层水相与所述氯仿的体积比为I : (0.8-1. 5)，所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为I : I。
12.根据权利要求4-11中任一所述的方法，其特征在于 所述离心的温度为0-4°C ;所述离心的温度具体为4°C ； 所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟； 所述离心的转速为10000-15000rpm,所述离心的转速具体为12000rpm,离心半径为IOcm0
13.—种革兰氏阳性细菌RNA的提取试剂，由权利要求1-3中任一所述试剂、结合液和洗涤液组成； 所述结合液为浓度为4. 6M的异硫氰酸胍水溶液； 所述洗涤液为70% (体积百分含量)乙醇水溶液。
14.根据权利要求13所述的试剂，其特征在于 所述结合液和所述洗涤液的溶剂均为DEPC水。
15.根据权利要求13或14所述的试剂，其特征在于所述权利要求1-4中任一所述试齐IJ、所述结合液和洗涤液均为独立包装。
16.一种革兰氏阳性细菌RNA的提取方法，包括如下步骤 1)将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、权利要求13-15中任一所述试剂中的所述结合液和无水乙醇混匀，得到混合液； 2)将步骤I)得到的混合液过柱纯化，用权利要求13-15中任一所述试剂中的洗涤液洗脱、收集洗脱液，即得到RNA。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述结合液和所述无水乙醇的体积比为1:3:3; 步骤2)中，所述过柱纯化包括如下步骤 A、将所述步骤I)得到的混合液转移到结合柱中，离心； B、向步骤A得到的结合柱中加入权利要求13-15中任一所述试剂中的所述洗涤液，离心； C、向步骤B得到的结合柱再次加入所述洗涤液，离心； D、向步骤D得到的结合柱中加入DEPC/K，离心、收集洗脱液，得到RNA。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于 步骤2)A、B、C中，所述离心的离心力均为7500-8000g，离心时间均为25-30秒，离心温度均为23-25°C ；步骤2) D中，所述静置时间为2-5分钟，所述静置温度为23-25°C ； 步骤2) E中，所述离心力为7500-8000g，所述离心时间为1-1. 5分钟。
19.根据权利要求16-18中任一所述的方法,其特征在于 步骤2) A、B、C中，所述离心的离心力均为8000g，离心时间均为30秒，离心温度均为25 0C ； 步骤2) D中，所述静置时间为2、3或5分钟，所述静置温度为25°C ； 步骤2) E中，所述离心力为8000g，所述离心时间为I分钟。
20.一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的提取方法，包括如下步骤 1)将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液； 2)、将步骤I)得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因组DNA。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述消化温度为37°C，所述消化时间为30分钟。
22.—种革兰氏阳性细菌基因组DNA和RNA的提取方法，包括如下步骤 1)将权利要求4-12中任一所述的方法得到的去除细胞成分的核酸提取液、浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液， 2)将步骤I)得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇洗涤，得到基因组DNA和总RNA混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述去除细胞壁革兰氏阳性细菌裂解液、所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为I : 0. I : 2. 5。
步骤2)中，所述离心的转速为12000rpm,离心半径为IOcm,所述离心的温度为4°C,所述离心的时间为15分钟。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。
25.根据权利要求22-24中任一所述的方法,其特征在于 在步骤I)后和步骤2)前还包括如下步骤将所述混合液静置的步骤； 所述静置的时间为30分钟，所述静置的温度为_20°C。
26.根据权利要求22-25中任一所述的方法,其特征在于 所述革兰氏阳性细菌为耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。
27.权利要求1-3中任一所述的试剂或权利要求4-12中任一所述的方法或权利要求13-15任一所述的试剂或权利要求16-26任一所述的方法在鉴定革兰氏阳性细菌和/或检测革兰氏阳性细菌的基因转录中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种革兰氏阳性细菌核酸提取方法。本发明提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；由提取液A和提取液B组成；所述提取液A按照如下方法制备将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A；所述提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B。本发明的实验证明，本发明提供了一种高效提取革兰氏阳性细菌核酸的方法，操作简单，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
文档编号C12R1/34GK102796727SQ20121016264
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月23日 优先权日2011年5月24日
发明者张岩, 孙义民, 杨萍, 张亮 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学