革兰氏阳性细菌全细胞分析方法

专利名称：革兰氏阳性细菌全细胞分析方法
技术领域：
本申请涉及全细胞分析领域，并且在一些实施方案中，本申请涉及抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus) (MRSA)和/或抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(staphylococci) (MR-CNS)的分析。2.引言通常通过表型方法、基因型方法或基于免疫学的方法鉴定临床样品(例如，鼻或伤口拭样、血液或尿液样品/培养物等)中的细菌。某些类型的细菌，例如抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)，在世界范围的医院快速传播，并且最近在社区内快速传播，并因而对人类健康造成严重威胁。诸如金黄色葡萄球菌(S. aureus)的细菌对甲氧苯青霉素(和所有β -内酰胺抗生素)的抗性主要与编码青霉素结合蛋白^(PBPh，也称为ΡΒΡ2')的 mecA基因的获取相关。PBP2a蛋白参与细菌细胞壁合成(参见Pinho et al.，“An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci (获取的和天然的青霉素结合蛋白协同构建抗药葡萄菌属的细胞壁)，，· PNAS，98(19) :10886-10891 (Sept. 2001))。快速且准确鉴定MRSA在预防和治疗由金黄色葡萄球菌弓丨起的疾病中被认为是重要的。表型分析通常包括在抗生素的存在下培养生物体以及检测细菌生长。为了获得结果，该检测通常需要至少两天(一天用于分离，一天用于敏感度检测)。因为某些表型特征 (例如MRSA药物抗性)需通过复杂的机制来验证，所以培养条件(盐分、温度、接种物大小等)可以显著地影响结果。在一些情况下，这会延误诊断，甚至会导致误诊。基于免疫学的PBP2a蛋白检测方法已有描述(例如Cavassini et al.， "Evaluation of MRSA-Screen,a Simple Anti-PBP 2a Slide Latex Agglutination Kit, for Rapid Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus(MRSA 筛查的评价，一种用于快速检测抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌的简易抗PBP加载玻片 Latex Agglutination 试剂盒)”，J. Clinical Microbiology, 37 (5) 1591-1594 (May, 1999))。该无细胞分析能快速检测细胞裂解物样品中的PBPh蛋白，并进而确认所述样品的至少一些生物体的甲氧苯青霉素抗性。然而，该分析常用于分析培养物中生长的生物体 (这需要一天或两天的生长)，并且不是很敏感(可靠的鉴定需要大约IO7集落形成单位)。最快速且敏感的基因型鉴定方法联合利用细菌的核酸分析和核酸扩增技术。 例如，几种分析利用聚合酶链式反应(PCR)或其它靶标扩增方法(例如，连接酶链式反应)。适用于MRSA检测的PCR分析的一些实例可见于US 5，702，895 (Matsunaga et al.)、6，156，507 (Hiramatsu et al.)和 7，074，599 (UhI et al.)中。这些 PCR 分析是无细胞分析。用于确定MRSA和MSSA的PCR分析还见于Gr5bner et al.，“Evaluation of the BD GeneOhm StaphSR Assay for Detection of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Isolates from Spiked Positive Blood Culture Bottles (对用于检测来自接种的阳性血培养瓶的抗甲氧苯青霉素抗性和甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌分离物的BD GeneOhm MaphSR分析的评价)”. J. Clin. Microbiol. ,47(6) :1689-1694(2009)中。无细胞测定分析的一个缺点是丧失了细胞形态，细胞形态在细菌鉴定中通常是有价值的。而且无细胞分析不太可能用于确定(或至少牵涉更复杂的设计来确定)混合的生物群体(参见=Grobneret al. (2009)，第 1691 页第 1 栏，第二段标题“Analysis of blood culture bottles spiked with mixtures of staphylococcal isolates(对接禾中有葡萄球菌分离物混合物的血培养瓶的分析)”下的对分析混合群体的PCR分析缺陷的讨论)。保护形态以及更容易鉴定样品中的混合细菌群体和/或消除由于混合群体而导致的假阳性结果的潜在风险的一个途径是进行全细胞分析，例如原位(细胞内)分析。为了通过全细胞分析确定细菌内的性状(例如甲氧苯青霉素抗性)，通常分析细菌的染色体脱氧核糖核酸(DNA)、mRNA或细胞蛋白。一些性状还与天然的质粒相关。本文公开的发明不涉及细胞蛋白分析来确定性状。尽管有很多报道关于真核细胞中mRNA的原位杂交(ISH)分析，但是对细菌中mRNA 或染色体DNA的基于ISH分析的报道似乎并不常见。至少在一定程度上是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁的特性，对革兰氏阳性细菌的基于ISH的分析被证实有很多问题(参见例如 Furakawa et al. ，“Comprehensive Analysis of Cell Wall-Permeabilizing Conditions for Highly Sensitive Fluorescence In Situ Hybridization (对高敏感性焚光原位杂交的细胞壁透化条件的综合分析)”，Microbes Environ.，21 (4) :227-234 (2006))。而且，对mRNA和染色体DNA的基于ISH的分析也由于细菌中mRNA的低拷贝数和不稳定性而变得复杂(参见例如 Coleman et al.的弓|言，“mRNA—targeted fluorescent in—situ hybridization(FISH)of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification(不用模板扩增或酪胺信号放大的靶向革兰氏阴性细菌 mRNA 的荧光原位杂交(FISH)) ”，J. Microbiological Methods, 71 :246-255 (2007)) 至少有三篇报道关于对革兰氏阳性细菌中mRNA的成功的基于ISH的分析 (参见Hahn et al. , "Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes (通过利用地高辛标记的探针的全细胞杂交检测链霉菌细胞中的 mRNA)，，，Applied and Environmental Microbiology, 59 (8) 2753-2757(Aug. 1993) ；Wagner et al. , “In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria(对利斯塔氏菌属中的毒力因子mRNA和16S rRNA的原位检测)”，FEiWS Microbiol. Lett, 160(1) :159-168 (Mar. 1998)；和H6nerlage et al.， "Detection of mRNA of nprM in Bacillus meqaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization(通过全细胞杂交检测土壤中生长的巨大芽孢杆菌ATTC 14581 中的 nprM mRNA) ”，Arch. Microbiol.，163 :235-241 (1995))。在 Hahn et al. ψ, Streptomyces violacelatus (S. violacelatus)经基因工程而含有插入的质粒(质粒Pl J673)，该质粒包含允许核糖体RNA (rRNA)和信使RNA (mRNA ；插入的质粒产生高拷贝数的mRNA)成为靶标的硫链丝菌素抗性(tsr)基因(摘要)(参见第 2753页，第2栏)。因此，所述细菌不是天然存在的。然而，天然细菌(即未插入质粒的细菌)没有表现出任何杂交信号(参见第2755-2756页，连接段落)。对样品进行酶学处理， 以透化革兰氏阳性细菌。与针对mRNA的探针的杂交反应进行超过16小时(参见第27M 页，第2栏，底部)。还需要注意的是，除了通过使用质粒增加细菌的mRNA含量之外，仍需进行信号扩增。具体而言，将由抗地高辛抗体偶联的碱性磷酸酶的活性产生的水不溶性染料用于对细胞进行染色来进行ISH分析，所述抗地高辛抗体通过与多个地高辛标签(每个探针)相互作用与转录物探针连接(参见，第27M-2755页，连接段落)。Wagner et al.与上文所述相似，对细胞壁进行酶学消化以透化细菌。还值得注意的是，使用四种单标记的针对iap-mRNA的探针和很亮的荧光染料检测mRNA靶标的尝试没有成功(参见第166页，第1-2栏，连接段落)。并且，联合使用单一酶(辣根过氧化物酶)标记的探针和荧光素酪胺(一种信号扩增技术)检测mRNA靶标的尝试被证实是不令人满意的(参见第166-167页)。然而，包含与偶联有辣根过氧化物酶(一种信号扩增技术)的抗地高辛抗体片段结合的多个地高辛标签的转录物探针被用于通过荧光素酪胺的催化沉积来检测单核细胞增生李斯特氏菌细胞中的iap(侵袭相关蛋白)-mRNA(参见摘要和第167页)。与地高辛标记的针对mRNA的探针的杂交反应进行超过5小时(参见第 162页，第2栏，最后一段)。同样地，在H&ierlageet al.中，对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞进行酶学处理以透化该细菌(参见第237页，标题“全细胞杂交”下的第1栏)。同样地，包含与偶联有碱性磷酸酶(一种信号扩增技术)的抗地高辛抗体片段结合的多个地高辛标签 (参见第236页第2栏的“探针”)的转录物探针(与硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐联合)用于产生染色的细胞和检测巨大芽孢杆菌中nprM的mRNA。与转录物探针的杂交进行16小时。从前述可以清楚地了解到，为了成功分析革兰氏阳性细菌中的mRNA，Hahn et al.、Wagner et al和H0nerlage et al.均利用1)酶学处理以透化细菌细胞；2)具有多个地高辛标签的转录物探针(通常较长(即长度大于IOObp)) ；3)通过基于酶的信号扩增技术间接检测所述多个地高辛标签；和4)相当长的探针杂交步骤(即5-16小时)。似乎没有任何文献报道在不使用包含多个标签的标记的转录物探针和/或应用扩增技术(例如，信号扩增和/或诸如原位PCR的原位核酸扩增)进行间接检测的条件下能明确检测革兰氏阳性细菌全细胞中的mRNA。此外，似乎没有任何报道是关于如何检测葡萄球菌全细胞中的mRNA。科技文献中这种明显的欠缺可能至少在一定程度上是由于上文提到的mRNA(以及染色体DNA)的低拷贝数及其在细菌中的不稳定性，以及与革兰氏阳性细菌细胞壁的透化相关的难题，该难题使得全细胞(例如ISH和荧光原位杂交(FISH))分析技术复杂化。3.定义为了解释本说明书和所附的权利要求书的目的，将应用以下定义，并且只要合适， 以单数形式使用的术语也包括复数形式，且反之亦然。在下文列出的任何定义与任何其它文件中该词的使用产生矛盾的情况下，以下文列出的定义为准来解释本说明书及其相关的权利要求书的范围和意图。尽管如此，通过引用并入本文的任何文件的范围和含义不应为下文所提供的定义所改变。而且，所述并入的文件应当按照本领域技术人员基于其内容和公开并参照本文提供的说明书内容进行解释。使用“或”表示“和/或”，除非另外指明或使用“和/或”明显不合适时。使用“a” 表示“一个或多个”，除非另外指明或使用“一个或多个”明显不合适时。“包含(comprise) ”、 “包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括(includes) ” 和“包括(including)”可互换使用，并且并非意图限制。此外，当一个或多个实施方案的描述使用术语“包含(comprising)”时，本领域技术人员应当理解，在一些具体的情况下，也可以
使用表述“基本由......组成(consisting essentially of)”和/或“由......组成
(consisting of) ”描述所述实施方案。本文所用的“抗体”是指免疫球蛋白或能参与抗体/抗原结合相互作用的免疫球蛋白片段或衍生物。对抗体、抗体片段以及抗体/抗体片段检测方法以及相关主题的技术特征的讨论可见于Pierce Catalog and Handbook，1994 (Τ章)中。抗体包括例如，免疫球蛋白的各种类别和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM0抗体片段包括诸如Fab、SCFV、F(ab'分子。抗体衍生物包括具有添加或取代的抗体或其
片段，例如嵌合抗体。可以通过重组方法或本领域已知的任何其它方式从人或动物来源、从杂交瘤得到抗体。本文所用的“细胞透化剂”是指用于处理细菌细胞从而改变细胞壁/外膜使得其它分析试剂(例如，探针、检测试剂、抗体等)能穿透(并因而能进入)所述细菌细胞的一种试剂、两种或更多种试剂、试剂混合物或制剂。可用作细胞透化剂的酶的一些实例包括下列酶溶葡萄球菌素、溶菌酶和蛋白酶(例如蛋白酶-K和/或无色肽酶)。当使用多种试剂来透化细菌细胞时，透化剂可以被依次添加、同时添加、或使用一些试剂被依次添加且一些被同时添加的组合。简单而言，对试剂与细菌接触的方式没有限制，只要该过程足以透化细菌细胞。在一些实施方案中，可以通过使样品与细胞透化剂接触来实施本文所公开的方法。本文所用的“嵌合体”是指包含两类或更多类不同子单元的子单元的寡聚物。例如，嵌合体可以包含脱氧核糖核酸(DNA)和锁核酸(LNA)的子单元、可以包含DNA和核糖核酸(RNA)的子单元、可以包含DNA和肽核酸(PNA)的子单元、可以包含DNA、LNA和PNA的子单元、或者可以包含RNA和LNA的子单元等。应当理解，文献中称为LNA探针的通常是嵌合体(按照该定义)，因为所述“LNA探针”通常将仅一种或数种LNA核苷酸并入寡聚物中。 其余的核苷酸通常是标准DNA或RNA核苷酸。本文所用的“针对染色体DNA、针对mRNA和/或针对天然质粒的标记探针”是指每一种都用一种或多种标签进行标记的探针(在一些实施方案中，探针仅包含一种标签)，其中所述探针被选择为与分析中待确定的细菌(例如选定的革兰氏阳性细菌)的染色体DNA、 mRNA和/或天然质粒中的靶标以高度的特异性结合。之所以选择染色体DNA、mRNA和/或天然质粒靶标，是因为其编码分析中待确定的选定性状(和/或与选定的性状相关)。本文所用的“确定”是指基于研究、数据、推理和/或计算而作出决定。根据本文中该术语的上下文/用法，确定的一些实例视情况包括检测、鉴定和/或定位(细菌和/或性状)。本文所用的“固定”是指能使细胞核酸(DNA和RNA)的完整性和细胞形态基本保持的样本保存和/或灭菌。可以使用含有一种或多种固定剂的一种或多种溶液通过化学方法进行固定，和/或可以通过机械方法进行固定，例如通过在显微镜载玻片上制备涂片，随后通过将载玻片穿过火焰或将载玻片置于加热仪上来加热涂片。本文所用的“固定剂”是指用来处理细菌细胞从而保存和/或制备用于显微镜分析的细菌细胞的一种试剂、两种或更多种试剂、试剂混合物、制剂或者甚至是过程(与试剂 (包括混合物或制剂)的使用有关或无关)。固定剂的一些实例包括多聚甲醛、戊二醛、甲醇和乙醇。当使用多种试剂来固定细菌时，所述试剂可以被依次添加、同时添加、或利用一些试剂被依次添加且一些被同时添加的组合。在一些实施方案中，可以通过使样品与固定剂接触来实施本文所公开的方法。本文所用的“异质的”和“同质的”是针对细菌菌株而言，并且是指相同菌株的部分或所有细菌是否表现出选定性状的表达(或相同表达程度)。具体而言，同质菌株的细菌表现出所述性状的表达(或大体上相同的表达程度)，而异质菌株则不是这样。本文所用的“总体上”是指将相关主题视为整体而不是零散的。本文所用的“标签”是指组合物(例如，杂交探针)的结构单元(或视具体情况为多个结构单元)，所述结构单元使得可以通过仪器和/或方法检测所述组合物。标签的非限制性实例包括荧光团、发色团、半抗原、放射性同位素和量子点。在一些实施方案中，可以联合使用两种或更多种上述标签，以便使得所述组合物可被检测或可被独立地(唯一地)检测。与“标签(label)，，同义的(即可互换的)一些词语是“可检测的部分”、“标签(tag)，， 和“标记”。本文所用的“mRNA诱导剂”是指当与(例如培养物中的)活的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌接触时，能诱导所述细菌产生mRNA并因而升高所述细菌细胞中的mRNA浓度的一种试剂、两种或更多种试剂、试剂混合物或制剂。通过提高细菌中mRNA的浓度，全细胞分析中探针/mRNA复合物(和相关的细菌染色)的形成可大大提高，并从而增强确定。在一些实施方案中，可以通过使样品与mRNA诱导剂接触来实施本文所公开的方法。“mRNA诱导剂”的实例是抗生素。本文所用的“混合群体”是指两种或更多种不同的细菌菌株的混合物。本文所用的“天然质粒”是指存在于天然状态的细菌(即，细菌是从环境和/ 或天然来源(例如诸如人的宿主生物)获得的)中的质粒。天然质粒与通过人为干预/操作而被有意插入细菌中的质粒有区别(参见例如，Hahn et al. , Applied and Environmental Microbiology, 59 (8) :2753-2757 (Aug. 1993)所描述的具有插入质粒的工程化的 S. Violacelatus 细菌)。本文所用的“核酸”是指由核苷酸子单元形成的含有核碱基的聚合物，所述核苷酸子单元由核碱基、核糖或2’-脱氧核糖和磷酸酯基团组成。核酸的一些实例是DNA和RNA。本文所用的“核酸类似物”是指由子单元形成的含有核碱基的聚合物，其中所述子单元包含核碱基和不是核糖或2’ -脱氧核糖的糖部分和/或不是磷酸酯基团的连接 (在糖单元之间)。核酸类似物的非限制性实例是锁核酸(LNA 参见例如，US 6，043，060、 7，053，199、7，217，805 和 7，427，672)。参见Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (月太核酸、吗琳代禾口相关的反义生物分子)，，，Chapter 7,"Chemistry of Locked Nucleic Acids(LNA)(锁核酸(LNA)化学)，，，Springer Science & Business，2006 对 LNA 化学的综述。本文所用的“核酸模拟物”是指由子单元形成的含有核碱基的聚合物，其中所述子单元包含核碱基和主链结构，所述主链结构不是糖部分(或包含糖部分)，但是能与核酸序列特异地结合。核酸模拟物的实例是肽核酸(PNA 参见例如，5，539，082,5, 527，675、 5，623，049、5，714，331、5，718，262、5，736，336、5，773，571、5，766，855、5，786，461、 5，837，459,5, 891，625,5, 972，610,5, 986，053,6, 107，470、W092/20702 和 W092/20703)。 核酸模拟物的另一实例是吗啉代寡聚物。(参见Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (月太核酸、吗琳代禾口相关的反义生物分子)”，Chapter 6，“Morpholinos and PNAs Compared(吗啉代与 PNA 的比较)，，， Springer Science & Business，2006对PNA与吗啉代之间差异的讨论。核酸模拟物的另一实例是吡咯烷基聚酰胺(PP)。如美国专利第6，403，763号、第6，713，603号、第6，716，961 号和第 7，098，321 号以及 Vilaivan et al. ,"Hybridization of Pyrrolidinyl Peptide Nucleic Acids and DNA-Selectivity, Base-Pairing Specificity and Direction of Binding(吡咯烷基肽核酸和DNA的杂交选择性、碱基配对特异性和结合的方向)”， Organic Letters, 8 (9) :1897-1900(2006)中所描述的，PP是包含核碱基和聚酰胺主链的寡聚物。本文所用的“核碱基”是指天然存在的核碱基和制备能序列特异地结合核酸的聚合物的技术人员公知的非天然存在的杂环部分。合适的核碱基的非限制性实例包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2，6- 二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9_(7_脱氮-8-氮-鸟嘌呤)和N8-(7-脱氮-8-氮-腺嘌呤)。合适的核碱基的其它非限制性实例包括Buchardt et al. (W092/20702或W092/20703)的图2(A)和2 (B)中所列出的那些核碱基。本文所用的“一种或多种探针/染色体DNA、探针/mRNA和/或探针/质粒复合物”是指通过以下形成的复合物1)探针与样品的细菌细胞的染色体DNA分子中的靶标的结合；2)探针与样品的细菌细胞的mRNA分子中的靶标的结合；和/或3)探针与样品的细菌细胞的天然质粒核酸分子中的靶标的结合。通常，本文中用探针/染色体DNA、探针/mRNA 和/或探针/质粒复合物的形成来确定样品的细菌中的选定性状。本文所用的“一种或多种探针/rRNA复合物”是指由探针(例如杂交探针)与样品的细菌细胞的rRNA的结合所形成的复合物。本文中可以用探针/rRNA复合物的形成来确定样品中的选定革兰氏阳性细菌。本文中还可以用探针/rRNA复合物的形成来确定样品中的其它细菌，无论这些细菌是否为革兰氏阳性的。本文所用的“一种或多种第二探针/rRNA复合物”是指由第二探针(即与之前提到的探针不同的探针)与样品的细菌细胞的rRNA分子中的靶标的结合所形成的复合物。 通常，本文用第二探针/rRNA复合物的形成来确定样品中另一种(或第二种)选定的革兰氏阳性细菌或另一种细菌(例如革兰氏阴性细菌)。应当理解，在本文所述的任何分析方法中，可以使用针对(目的细菌)的rRNA的第三、第四、第五、第六(等)探针，其中每一种不同的针对rRNA的探针可以选择用于确定样品中可能存在的不同的选定细菌(其中的一些可以不是革兰氏阳性细菌)。通常，第二、第三、第四、第五、第六(等)探针中的每一种均可以独立于实施方法中所用的其它探针而进行检测，使得所述方法可作为多元方法来实施。还应当理解，第三探针可以形成第三探针/rRNA复合物，第四探针可以形成第四探针/ rRNA复合物、第五探针可以形成第五探针/rRNA复合物、第六探针可以形成第六探针/rRNA 复合物等。本文所用的“一种或多种洗涤试剂”是指用来从样品和/或样品的细菌细胞去除不同试剂和/或组分的一种试剂、两种或更多种试剂、试剂混合物或制剂。在一些实施方案中，可以通过将样品与一种或多种洗涤试剂接触的一个或多个步骤来实施本文所公开的方法。本文所用的“预杂交步骤”是指在用含有杂交探针的杂交缓冲液处理样品(例如接触)之前，用缺少杂交探针的杂交缓冲液处理所述样品(例如接触)一段时间的过程。在一些实施方案中，实施本文所公开的方法可以包括预杂交步骤，也可以不包括预杂交步骤。本文所用的“探针，，或“杂交探针，，是指能与选定的靶标结合的组合物。“杂交探针”是能通过杂交与其对应靶标结合的探针。探针的非限制性实例包括核酸寡聚物(例如 DNA、RNA等)、核酸类似物寡聚物(例如锁核酸(LNA))、核酸模拟物寡聚物(例如肽核酸 (PNA))、嵌合体、抗体和抗体片段。本文所用的“量子点”是指无机微晶体，其直径为约Inm至约IOOOnm或者约Inm至约IOOOnm之间的任何整数和小数，通常为约2nm至约50nm或约2nm至约50nm之间的任何整数和小数，或者更通常为约2nm至约20nm(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20nm)。半导体纳米晶体受激发时能发射电磁辐射(即半导体纳米晶体发光)，且包含一种或多种第一半导体材料的“核心”，并且可被第二半导体材料的“外壳”包围。由半导体外壳包围的半导体纳米晶体核心被称为“核心/外壳”半导体纳米晶体。包围的“外壳”材料的带隙能通常大于核心材料的带隙能，并且可以被选择为与“核心”基底具有接近的原子间隔。核心和/或外壳可以是包括但不限于以下的半导体材料II-vi族 (ZnS > ZnSe > ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe > SrS > SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe 等)禾口 III-V 族(GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb 等)以及IV族(Ge、Si等)材料以及以上材料的合金或混合物。在科技和专利文献中，术语“半导体纳米晶体”、“量子点”、“Qdot 纳米晶体”或“纳米晶体”可互换使用。为了本说明书的目的，这些术语还是上文定义的“量子点”的等同词。本文所用的“针对rRNA的探针”是指选择为能与rRNA分子中的靶标结合的探针。 针对rRNA的探针可以用可检测的部分进行标记或者可以是无标记的。如果是无标记的，则由rRNA探针与其细菌中靶标的结合所形成的复合物可以例如利用探针/rRNA复合物的标记抗体进行检测(参见例如=Hyldig-Nielsen的美国专利第5，612，458号)。通常，所选的rRNA靶标应能区分开样品中的细菌，并进而允许确定样品中的选定的革兰氏阳性细菌(或其它细菌)。使用针对细菌rRNA中的靶标的探针来区分(并进而确定)样品中的细菌已长期用于基于ISH和FISH的分析中(参见例如=Amarm, R.， "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization(焚光原位杂交的方法方面)，，，Bioscience Microflora, 19(2) :85-91(2000)和 Pernthaler et al.， "Fluorescence in situ Hybridization(FISH)with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes (利用靶向于rRNA的寡核苷酸探针的荧光原位杂交(FISH)) ”，Methods in Microbiology, 30 :207-226 (2001))。关于针对rRNA的PNA和LNA探针在FISH中的应用可参见:Cerqueira et al. ,"DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)(用于通过荧光原位杂交(FISH)快速鉴定微生物的 DNA 模拟物)”，Int. J. Mol. Sci.，9 :1944-1960(2008)。关于针对 rRNA 的 PNA 探针在确定血液样品中的葡萄球菌的应用可参见Forrest et al. ,"Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures (快速原位杂交检测对凝固酶阴性葡萄球菌阳性的血液培养物的影响)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy，58 :154-158 (2006)。本文所用的“第二针对rRNA的探针”是指能与rRNA分子中的不同(即第二)靶标选择性地结合的第二探针。第二 rRNA靶标可以与分析中所用的另一(第一)探针的靶标存在于相同细菌中，但是更通常，第二针对rRNA的探针将针对不同目的细菌中的靶标， 以便第二探针/rRNA复合物的形成和确定可用于确定样品中的第二(不同的)选定细菌。 所述第二选定细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。本文所用的“选定的革兰氏阳性细菌，，是指可以通过实施本文所述方法来确定的目的细菌(例如待通过实施本文所述方法来确定的革兰氏阳性细菌)。通常，选择所述革兰氏阳性细菌用于分析是因为所述细菌可能具有选定的性状。例如，选定的性状可以具有临床意义。选定的革兰氏阳性细菌可以是例如，特定种的、特定亚种的或特定属的细菌。选定的革兰氏阳性细菌还可以是例如，诸如凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)或革兰氏阳性球菌的公认群体。在一些实施方案中，选定的革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌，并且选定的性状是甲氧苯青霉素抗性。本文所用的“选定的性状”是指通过实施本文所述方法来确定的目的性状。在一些实施方案中，选定的性状是甲氧苯青霉素抗性。本文所用的“信号扩增”是针对于(直接或间接地)与探针相联的标签来讨论， 并且是指使用特定的检测方法将每种与探针相联的标签的信号增强至少两倍。信号扩增通常(但未必)涉及酶的使用。信号扩增的一些非限制性实例包括酪胺信号扩增(TSA， 也称为催化信使沉积(CARD))、酶标记的荧光(ELF-97-产品和信息可从Invitrogen， Carlsbad，CA 获取)、分支 DNA(bDNA)信号扩增(参见Collins et al.，“A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below lOOmolecules/ml (用于对低于100个分子/ml的核酸靶标进行定量的分支DNA信号扩增)”，Nucl. Acids Res. ,25(15) :2979-2984(1997)和 Zheng et al. ,"Direct mecA Detection from Blood Culture Bottles by Branched-DNA Signal Amplification(M 过分支DNA信号扩增从血液培养瓶进行直接的mecA检测)”，J. Clin. Microbiol.，37 (12) 4192-4193(1999)、以及滚环扩增(RCA-参见Maruyama et al. ,"Visualization and Enumeration of Bacteria Carrying a Specific Gene Sequence by In Situ Rolling Circle Amplification(通过原位滚环扩增对携带特定基因序列的细菌的观察和计数)”， Applied and Environmental Microbiology, 71 (12) :7933-7940 (2005 年 12 月)和 Smolin et al. , "Detection of Low-Copy-Number Genomic DNA Sequences in Individual Bacterial Cells by Using Peptide Nucleic Acid-Assisted Rolling-Circle Amplification and Fluorescence In Situ Hybridization(通过在滚环扩增和荧光原位杂交的辅助下，使用肽核酸对单个细菌细胞中的低拷贝数基因组DNA序列的检测)”， Applied and Environmental Microbiology,73(7) :2324-2328(2007))。本文所用的“染色的”表示细菌细胞直接或间接标记了标签以进行检测。例如，可以用一种或多种荧光标记的杂交探针对细菌进行染色，使得可以例如按US 6，664，045 (具体参见图3和实施例10第M-25栏中相关的讨论(US 6，664，045))中所述利用荧光显微镜来检测细菌细胞。US 6，664，045的图3的各图中可清楚观察到可以用可独立检测的标签(独立标签的组合)对样品的不同细菌进行染色，使得样品中不同类型的细菌例如呈现不同的颜色(或具有不同的可检测性质)。例如，具体参照US 6，664，045的图3，金黄色葡萄球菌的特征为(仅)红色染色、大肠杆菌的特征为绿色和红色染色、铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)的特征为(仅)绿色染色，鼠伤寒沙门菌(S. typimurium)的特征为蓝色染色。因此在US 6，664，045的图3中，使用不同的针对rRNA的标记探针确定了四种不同的细菌，其中用独特的标签或标签组合标记每种不同细菌的探针。本申请的图2和3也显示出包含独特的可独立检测的(荧光)染色的不同类型的细菌。本文所用的“靶标”或“选定的靶标”可互换使用，并且是指细菌中被设计的探针特异性结合的分子(或分子的一部分，例如选定的核酸序列)，例如rRNA、mRNA、染色体DNA、 质粒DNA和抗原。本文所用的“性状”是指可通过分析细菌的染色体DNA、mRNA和/或天然质粒DNA 来确定的所述细菌的任何特征或性质。一种这类性状的实例是甲氧苯青霉素抗性。所述性状依赖于mecA基因(即染色体DNA)的存在和所述基因的表达(例如通过从所述基因产生 mRNA)ο本文所用的“在适于探针与靶标结合的条件下”是指在这样的条件下，探针以特异性方式与其各自的靶标结合，使得探针与非靶标部分的非特异性结合被最小或消除。还应当理解，视具体情况“该(the)”可以被“所述(said)”替代(本说明书的上文和其它地方) 以表示/承认先前基础。本文所用的短语“可独特鉴别的”是指两个或更多个目的状态是可区别的情况。例如，在包含至少两种细菌的样品中，一种细菌可以包含红色荧光标记，而另一种细菌可以包含绿色荧光标记。因此，例如使用合适配备的显微镜，所述两种细菌是“可独特鉴别的”(即被独特染色)(参见例如上述US 6，664，045的图3)，因为可以使用显微镜区分两种细菌。细菌可以是由于其它原因而可独特鉴别，例如形态。例如，一种类型的细菌可以是杆状的，而另一种是球状的。在一些实施方案中，可以使用颜色和形态来区分/确定样品中可独特鉴别的细菌。本文所用的“全细胞”是指形态上可识别形式的细胞(例如细菌)。“全细胞”并非意图表示细胞包含其全部的初始组分，因为公知的是，当细胞被透化时，它们“泄露”细胞成分(参见Hoshino et al. , Applied and Environmental Microbiology, 74(16) 5068-5077(2008)的第 5074 页第 1 栏禾口 Maruyama et al. , Applied and Environmental Microbiology, 71 (12) :7933-7940 (2005 年 12 月)的第 7937 页第 1 栏)。这种“泄露”并非意图表示用已经发生泄露的细胞进行的分析就不是本文所讨论的全细胞分析。恰恰相反，“全细胞”意图表示基本完整的细胞，从而它们保留形态上可识别的形式。例如，球菌是球状的，而其它细菌可以是杆状的。本文所用的“细菌内(within bacteria) ” 或细菌内(within the bacteria)”是指全(完整)细菌的任何结构(包括多个结构)内，例如外膜、核膜、细胞壁、细胞质和/或细胞核。例如，样品的细菌内的一种或多种探针/rRNA复合物的形成可以指所述细菌的外膜内、核膜内、细胞壁内和/或细胞核内的一种或多种探针/rRNA复合物的形成。同样，探针/rRNA复合物可以在细胞质内形成，并且它们的存在可以用于从样品的其它细菌确定选定的革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌)(参见例如图3和实施例3中对图3的讨论)。然而，视具体情况，本文所用的“细菌内，，还意图包括与完整细菌的外表面接触的结构。例如，“细菌内”还意图包括，例如，与细菌外表面连接(例如由于与表面蛋白的结合) 的抗体探针，其中所述抗体探针例如可用于确定样品中选定的细菌。4.概述
应当理解，以下在该“概述”部分中所阐述的讨论可涉及本文所描述的多个发明实施方案中的一些或全部。核酸和核酸类似物的合成、修饰和标记核酸寡聚物(寡核苷酸和寡核糖核苷酸)合成是常规的。对核酸合成的详细描述，请参见 Gait, M. J. , "Oligonucleotide Synthesis :a Practical Approach (寡核苷酸合成实践方法)” IRL Press, Oxford England (1984) 0本领域技术人员应当意识到，标记的和未标记的寡核苷酸(DNA、RNA及其合成类似物)是容易得到的。可以用商购的设备和试剂合成它们，或者可以从定制寡核苷酸的商家购买它们。PNA合成和标记PNA的化学组装方法是公知的(参见美国专利第5，539，082号、第5，527，675号、 第 5，623，049 号、第 5，714，331 号、第 5，718，262 号、第 5，736，336 号、第 5，773，571 号、 第 5，766，855 号、第 5，786，461 号、第 5，837，459 号、第 5，891，625 号、第 5，972，610 号、第 5，986，053和第6，107，470号；通过引用将所有专利中涉及肽核酸合成、修饰和标记的信息并入本文。标记PNA的一些非限制性方法描述于美国专利第6，110，676号、W099/22018、 W099/2188UW099/49293和W099/37670中，其它方法在PNA合成领域内是公知的。用于肽核酸固相自动化学组装的化学品和设备是可以买到的。同样，标记的和未标记的PNA寡聚物可从定PNA 寡聚物的商家获得(#JAL :www. panagene. com/pna-oligomers. php、www. biosyn. com/pna_custom. aspx 或 www. crbdiscovery. com/pna/)。PNA合成禾口标记的其它信息可见于 Peter Ε. Nielsen, "Peptide Nucleic Acids (月太核酸)”，Taylor and Francis, (2004)中。因为PNA是聚酰胺，所以其具有C-末端(羧基末端)和N-末端(氨基末端)。为了设计适于与靶标反向平行(优选的方向)结合的杂交探针，PNA寡聚物的N-末端与等同 DNA或RNA寡核苷酸的5' _羟基末端是等同的。 嵌合体合成和标记/修饰嵌合体是包含不同单体类型子单元的寡聚物。通常，适合于所用单体类型的标记技术也可用于构建嵌合体(进行或不进行改动)。多种标记的和未标记的嵌合分子在科技文献中有报道或可从商业来源获得(参见US 6, 316, 230, www. biosyn. com/PNA_ Synthesis. aspx> W02001/027326> www. sigmaaldrich. com/life-science/custom-oligos/ dna-probes/product-lines/lna-probes. html)。因此,本领域技术人员可以制备标记的嵌合分子或者可以从易获取的来源购买它们。标签适用于标记本发明实践中的探针的标签(即可检测的部分或标记物)的非限制性实例包括发色团、荧光团、自旋标签、放射性同位素、酶、半抗原、化学发光化合物、量子点或以上两种或更多种的组合。半抗原的一些实例包括5(6)-羧基荧光素、2，4- 二硝基苯、地高辛和生物素。荧光染料(荧光团)的一些实例包括5 (6)-羧基荧光素(Flu)、6-((7_氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰基)氨基)己酸(Cou)、5 (和6)-羧基-X-若丹明(Rox)、青色素2 (Cy2)染料、青色素3(Cy3)染料、青色素3. 5(Cy3. 5)染料、青色素5(Cy5)染料、青色素5. 5 (Cy5. 5) 染料、青色素7(Cy7)染料、青色素9(Cy9)染料(青色素染料2、3、3. 5、5和5. 5可以NHS酯的形式从 GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ 购得)、JOE、Tamara 或 Alexa 染料系歹ll (Life Technologies, Carlsbad, CA)。酶的一些实例包括聚合酶(例如Taq聚合酶、Klenow PNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、 测序酶、DNA聚合酶1和phU9聚合酶)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)和大豆过氧化物酶(SBP)。放射性同位素的一些实例包括14C、32P、129I和"Tc。在一些实施方案中，自旋标签可用作标签。自旋标签是具有未配对的自旋电子的有机分子，所述未配对的自旋电子通常在氮原子上。例如，可以按照美国专利申请第 7，494，776号中所述用自旋标签标记探针。然后，所述标记的探针可以例如用于对细菌进行染色，以用于确定。可独立检测的标签/多元分析在一些实施方案中，进行多元方法(分析)。在多元分析中，可同时或相继检测多种目的状态。多元分析依赖于在完成分析期间或完成分析之后将样品成分或与之相关的数据分类的能力。(本文所用的)多元分析通常依赖于使用两种或更多种可独特鉴别的探针。在多元分析中，一种或多种不同的可独立检测的标签(通常每种不同的标签(或不同的标签组合)与不同的探针连接)用来独特地标记(即染色)两种或更多种不同的目的细菌。在一些情况下，两种(或更多种)独特的标签可针对相同的细菌，进而产生由于细菌中存在两种(或更多种)独特标签而导致的独特染色。区分每一种独特染色的细菌和/ 或对每一种独特染色的细菌进行定量的能力提供了使分析多元化的手段，因为与每种独特标记的(即染色的)细菌相关的数据可以与待确定的状态(例如选定的细菌或选定的性状)相关。在实施本文所述的方法中，独特地标记细菌是可能的，这使得可以确定样品的细菌的两种(或更多种)目的状态。例如，在一些实施方案的实施中，可以使用独特的标签来标记样品中的金黄色葡萄球菌以及使用独特的标签来标记样品中抗甲氧苯青霉素的细菌。 因此，通过分析样品，则能确定该样品是否含有1)金黄色葡萄球菌(非甲氧苯青霉素抗性的)；2)抗甲氧苯青霉素的非金黄色葡萄球菌(例如MR-CNS)；和/或3)抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，对于这三种状态，样品的特征可以是异质的或同质的。在一些实施方案中，可以估计、定量或鉴定每组中的细菌数量，以样品细菌的具体百分比表示。可以以很多方式使方法多元化，并且多元化仅受分析中可使用或检测的可独立检测的标签(或可独立检测的探针)的数量的限制。例如，一些分析可以被设计成检测并鉴定样品中数种(例如2种、3种、4种、5种、6种或更多种)不同细菌(在一些实施方案中，都为革兰氏阳性，并且在一些实施方案中，是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的混合物)的存在， 以及确定是否那些细菌的任意一种具有两种(或更多种)不同目的性状中的一种或两种。 例如，对于5种细菌和2种性状的多元分析需要至少7种(5+2)独特的标记探针(或7种独特的标签组合)和区分至少10种(5X》或多至20种(5X4)可能的不同类型的染色细菌的能力。结合本发明的实施方案的上下文，所述方法可以使用5种独特标记的针对rRNA 的探针来确定5种不同细菌的每一种并使用2种独特标记的针对mRNA的标记探针来确定每种不同的性状。
一些代表性的多元分析在实施例3中描述，并且参照图3可以看见代表性细菌的可独特鉴别的特性。全细胞分析本文所述的方法涉及全细胞分析。在完整或基本完整的细胞上进行全细胞分析。 全细胞分析的一些实例是原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)和免疫细胞化学(ICC)分析。在一些实施方案中，全细胞分析严格地说不是ISH、FISH或ICC分析。例如，全细胞分析可以涉及两种或更多种这些不同的分析形式的组合(参见=Goldbard et al.，美国专利第6，524，798 号，名禾尔为“High Efficiency Methods For Combined Immunocytochemistry And In-Situ Hybridization (用于联合免疫细胞化学和原位杂交的高效方法)”)。更具体而言，本发明的一些实施方案考虑联合使用寡聚物(杂交)探针和例如抗体探针。只要分析形式和/或所述分析中使用的成分相互不会不相容，本发明考虑联合全细胞分析形式的任何组合。如下文更详细地讨论，将分析联合起来可以为实施方法步骤中使用不同的类型探针的结合条件带来一定程度的协调。或者，还可以使用样品的再探测循环，其中一种探针类型的条件被固定，以便用所述类型探针完成再探测循环(第一循环实际上是探测循环)， 并用第二(不同的)类型探针进行新的再探测循环(参见Williams et al.，美国专利第 2005/0123959号对于使用相继的分析步骤进行全细胞分析的讨论-本文所用的“再探测循环”)。根据所用方法，可以在每个再探测循环之后、在一些再探测循环之后或者在所有再探测循环之后确定探针/靶标复合物。ISH 本文所用的“原位杂交(ISH) ”是指利用针对核酸靶标的杂交探针实施的方法。探针可以是核酸(例如RNA、DNA)、核酸类似物(例如LNA)、诸如PNA、吗啉代或PP的核酸模拟物或嵌合体(例如，DNA-RNA嵌合体、PNA-DNA嵌合体、PNA-RNA嵌合体、LNA-DNA嵌合体等)。最广泛使用的ISH方法是“荧光原位杂交”或“FISH”，其中探针包含一种或多种荧光标签。简单而言，传统的原位杂交分析通常包括以下步骤中的一步或多步(1)对细胞进行预杂交处理以增加靶标DNA或RNA的可及性(例如加热变性或碱变性和/或用细胞透化剂处理)；(2)降低非特异性结合的步骤(例如通过使用人类基因组DNA阻断重复序列的杂交能力，)；(3)包括使样品与不含杂交探针的杂交溶液接触的预杂交；(4) 一种或多种杂交探针与细菌中的核酸进行杂交；( 洗涤去除没有与其各自的靶标结合的探针；以及(6) 检测/确定探针/靶标复合物(例如通过确定染色的细菌)。这些步骤中的每一步所用的试剂和它们的使用条件都根据具体的应用而不同。可以使用能与细胞核酸序列杂交的各种可检测的或可检测地标记的探针(例如， mS标记的探针、荧光标记的探针、酶标记的探针)进行ISH。当使用荧光标记的探针时，该技术称为FISH。可直接(例如，通过使用共价连接的荧光标签)或间接(例如，通过配体-标记的抗配体体系)标记ISH探针。免疫细胞化学(ICC)本文所用的免疫细胞化学是指通过抗体探针(或抗体片段探针)与细菌内抗原的相互作用，使用抗体或抗体片段对样品的细菌进行染色。可以仅通过使用一抗而发生染色， 或者染色可以涉及使用(标记的)二抗。然而，为了避免任何不确定性，本发明不涉及使用
18针对细菌内蛋白抗原的一抗，其中所述蛋白抗原与选定的性状相关，并且其中确定所述抗体/抗原复合物是用于确定所选定的性状。本文所用的免疫细胞化学(如果使用)通常涉及确定样品中选定的细菌。因此， 抗体(或抗体片段)探针可以针对选定细菌特异性的抗原靶标。抗体探针可以是标记的 (即直接检测)，或者可以通过使用能与抗体探针/抗原靶标复合物结合的标记的二抗来确定由抗体探针与细菌内其各自的抗原靶标的结合而形成的抗体探针/抗原靶标复合物(即间接检测)。尽管如此，免疫细胞化学还可用于确定细菌内的性状。然而，关于性状的确定，抗体探针是针对于探针/靶标复合物，该探针/靶标复合物由针对染色体DNA、mRNA或天然质粒的探针与细菌内其各自的抗原靶标的结合所形成。因此，在这种情况下，免疫细胞化学用于与细菌性状相关的所述探针/靶标复合物的间接染色。无论靶标是什么，用至少一种可检测的部分标记至少一种抗体，使得当所述标记的抗体结合时，细菌被染色。此外，ICC可以与ISH或FISH法联合，从而按照本文所公开的方法确定选定的细菌和/或选定的性状。样品细菌无处不在。含有细菌的样品可以来自任何来源。样品的来源并非意图限制本文所公开的任何方法的实施。样品可以是环境样品，例如来自土壤或水的样品。样品可以来自诸如食品、饮料或化妆品的消费品。样品可以来自犯罪现场(例如为了法医分析)。样品可以来自战区或来自嫌疑恐怖分子攻击的地点(例如，为了检验致病菌，包括武器化细菌(例如炭疽芽孢杆菌 (B. anthracis)).样品可以来自临床来源。临床来源的样品可以来自诸如人、植物、鱼或动物的任何来源。(来自临床来源)临床样品的一些非限制性实例包括血液、脓、痰、脊髓液、 羊水、粪便、尿液、鼻拭样、喉拭样等。样品(包括临床样品)可以包括细菌培养物和亚培养物或其一部分。样品可以包括制备用于或部分制备用于特定分析的样品。例如，样品可以是已经固定和/或保存一段时间的样本。探针除非本文的表述或讨论做出明确限制，可用于选择期望的目的状态(例如选定的细菌或选定的性状)的任何探针均可用于实施本发明的实施方案，所述选择是基于所述探针与其各自靶标的选择性结合。在一些实施方案中，探针可以是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，探针可以是肽或蛋白。用于实施本发明实施方案的探针可以是核酸(例如DNA 或RNA)、核酸类似物(例如LNA)、核酸模拟物(例如PNA、PP或吗啉代)或嵌合体。在一些实施方案中，探针长度为10至20个核碱基子单元。本文中以“核碱基子单元长度”描述探针是因为只有核酸包含核苷酸，而所有这些不同的寡聚物类型的每个子单元都包含一个核碱基。可以通过重头合成或其它方法来制备本发明实施方案中所用的探针。应当理解，在生物学领域内存在很多用于检测特定细菌或性状的探针。因此，除非本文明确公开，探针的性质(为了本发明的目的)并非意图受限。在一些实施方案中，用于实施本发明的探针可以是未标记的，只要具有能有可利用的机制来确定由探针与其各自靶标的结合所形成的探针/靶标复合物。例如，可通过使用能与未标记的(一级)基于抗体的探针结合的第二可检测地标记的抗体来确定所述未标记的(一级)基于抗体的探针(参见例如US 6，524，798第3栏，第观_40行和US 7，455，985第12栏，第12-63行)。例如，所述未标记的(一级)基于抗体的探针可用于确定选定的革兰氏阳性细菌。因此，可以通过确定二抗的标签来确定所有分子结合所形成的复合物(即标记的二抗/ 一抗/靶标复合物)(并因此确定选定的细菌)。可以通过使用标记的分子来相似地确定其它类型的未标记的探针，所述标记的分子与所述未标记的探针选择性结合或者与所述未标记的探针与其各自的靶标的结合所形成的复合物选择性结合 (参见例如=Hyldig-Nielsen的美国专利第5，612，458号，其讨论了抗PNA-DNA复合物的抗体的引用等)。在一些实施方案中，可用至少一种可检测的部分(即至少一种标签)标记探针。在一些实施方案中，每种探针仅包含一种标签。在一些实施方案中，用来确定选定的性状(例如甲氧苯青霉素抗性)的探针仅包含一种标签。在一些实施方案中，使用探针混合物(例如针对mRNA的探针混合物)，其中每种探针包含单一标签或两种标签(即单标记探针和/或双标记探针的混合物)。在一些实施方案中，每种探针可以包含多种标签(例如2种标签、 3种标签、4种标签、5种标签、6种标签等)。在一些实施方案中，一种或多种探针可以包含单一标签，以及一种或多种探针可以包含多种标签。在一些实施方案中，一种或多种探针可以是未标记的，并且一种或多种探针可以包含一种或多种标签。在一些实施方案中，可直接确定标签。在一些实施方案中，可间接确定标签。在一些实施方案中，可直接确定一些标签，可间接确定一些标签。直接确定标签涉及在不使用另一种分子/化合物的条件下确定所述标签的性质。 例如，确定荧光标签可以涉及使用荧光显微镜、使用载玻片扫描仪或使用流式细胞仪来观察经处理的样品。因为在显微镜、扫描仪或细胞仪中所观察/所检测到的是标签自身的荧光，所以这种确定被认为是直接的。相比较而言，间接确定涉及使用能识别标记探针的标签的辅助分子/化合物，从而以确定标记探针的标签的替代方式来确定所述辅助分子/化合物(或其上的标签)。例如，标签可以是半抗原，例如地高辛。下文第8部分列举的数篇参考文献描述了确定地高辛的间接方法。通常，这些方法涉及使用偶联了第二标签(例如，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的酶或者诸如荧光素的荧光团)的抗地高辛分子(抗体)。因为所确定的是辅助分子(即抗地高辛分子)的第二标签的性质，所以这是间接确定方法的特征。在实践中，本发明实施方案中所用的一些探针被选择为能确定样品中选定的细菌。我们将这些探针称为“针对细菌的”探针。“针对细菌的”是指能特异性发现细菌内、选定的细菌内或选定的革兰氏阳性细菌内的靶标的探针。此外，所述针对细菌的探针被认为 “能确定样品中选定的细菌”，因为所述针对细菌的探针与细菌内的靶标选择性结合，使得可以基于探针/靶标复合物的形成来确定所述选定的细菌(例如通过荧光显微镜或流式细胞仪)。因此，所述针对细菌的探针用于确定所述样品中所述选定的细菌。在一些实施方案中，选定的细菌是选定的革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌)，并且所述针对细菌的探针被认为“能确定样品中选定的革兰氏阳性细菌”，或者更具体地对于金黄色葡萄球菌来说，“能确定样品中的金黄色葡萄球菌”。在一些实施方案中，还可以选择其它选定的细菌(视具体情况，包括一种或多种革兰氏阴性细菌)进行确定。在这种情况下，对于每种待通过实施本方法来确定的其它选定的细菌来说，样品还与一种或多种其它针对细菌的探针接触。通常，通过使用多元分析来实现样品中多种选定的细菌的确定， 其中用独特的染色、染色组合和/或染色与细胞形态的独特组合对每种不同类型的细菌进行染色。选择用于确定选定细菌的探针(即针对细菌的探针)可以是针对rRNA的探针。所述针对rRNA的探针与选定细菌的rRNA中的靶标特异性地结合。然而，针对细菌的探针不需要是针对rRNA的。相反，它们可以是例如针对mRNA的。“针对mRNA的，，是指能与mRNA 中的靶标特异性地结合的探针。针对细菌的探针还可以针对所述细菌特异性的其它调节性 RNA (例如小 RNA (sRNA)或反义 RNA (aRNA))。此外，针对细菌的探针不需要是杂交探针。例如，针对细菌的探针可以是例如基于抗体的(参见例如=US 6，231,857和US 7，455，985)，因为已知抗体可以用来将一种细菌与另一种细菌或其它细菌区别开来。选择用于确定选定的性状的探针是针对以下靶标样品中可能存在的细菌的1) 染色体DNA内的靶标；2)mRNA内的靶标；和/或3)天然质粒内的靶标，其中所述靶标与选定的性状相关。因此，基于靶标的性质，所述探针被认为是“针对染色体DNA的、针对mRNA 的和/或针对天然质粒的”。此外，所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针被认为“能确定与选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸”，因为所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针与所述选定的性状相关的各自的靶标选择性地结合。因此，所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针用于确定所述样品的细菌中的选定的性状。在一些实施方案中，所选定的性状是甲氧苯青霉素抗性。然而，应当理解，所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针不是针对[结合]与性状相关的靶标蛋白。相反，所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和 /或针对天然质粒的探针的靶标通常位于染色体DNA、mRNA和/或天然质粒的DNA的核酸序列内。从以上的论述可以推断，用来确定选定性状的探针并不需要针对1)染色体DNA、 2)mRNA和幻天然质粒的全部。相反，用来确定选定性状的探针可以仅针对1)染色体DNA、 2)mRNA和幻天然质粒中的一种、两种或更多种的任意组合。例如，在一些实施方案中，用来确定选定性状的探针是针对染色体DNA和/或针对mRNA的。在一些实施方案中，用来确定选定性状的探针是针对mRNA的。此外，在一些实施方案中，可以以多元方式实施本文所述的方法，进而可以确定单一样品的细菌的多种性状(例如2种性状、3种性状、4种性状等)。对于不同性状的探针并不需要都针对相同的靶标类型。尽管允许对于不同性状的探针针对相同的靶标类型(例如 1)染色体DNA、2)mRNA或3)天然质粒中的一种)，但是也允许对于不同性状的探针针对不同的靶标类型。还允许在同一分析中，对于不同性状的一些探针针对相同的靶标类型，且对于不同性状的一些探针针对不同的靶标类型。事实上，对于不同靶标类型的探针的任何可能组合都是允许的。针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针可以是核酸、核酸类似物、核酸模拟物或嵌合体。针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针可以是未标记的。可以按前文所述确定用未标记的探针形成的探针/靶标复合物。然而，针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针通常标记有一种或多种标签。 在一些实施方案中，每种针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针仅包含一种标签。在一些实施方案中，每种针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的探针可以包含多种标签。在同一分析中将单一标记的探针与多重标记的探针混合起来也是允许的。正如之前已经数次提到的，可以以多元方式实施本文所述的方法，进而例如1) 确定单个样品中两种或更多种选定的细菌；幻确定单个样品中两种或更多种选定的性状； 或3)确定单个样品中两种或更多种选定的细菌和两种或更多种选定的性状。通常，通过将样品与确定其它选定细菌和/或选定性状所需的其它探针接触来进行这类多元分析。在一些实施方案中，所述接触可以同时进行，以便在一个过程结束时可以确定所有不同的细菌和/或性状。对于该实施方案，可独立地检测针对每种不同的选定细菌和/或不同的选定性状的探针。通常，用于实施本方法的多种探针的标签被选择为能产生基于细菌和/或性状类型的不同染色的细菌。然而在一些情况下，可以具有一些相同染色的细菌，因而基于细菌的形态(可能与染色的确定联合)来确定一种或多种选定的细菌和/或性状。除了具有不同(可独立检测的)标签(独特染色的细菌)的多元分析之外，还可以通过使用再探测循环方法来获得多元结果(参见=Williams et al.的公开的美国专利申请第2005/0123959号)。在再探测循环方法中，获取一个结果，然后对样品进行再分析， 用于确定第二个、第三个、第四个、第五个结果等。通常，在再探测循环方法中，在处理样品之前去除(清除)先前的结果以获得下一结果。就本文所公开的方法而言，可以通过再探测循环方法而使用相同的标签类型(例如荧光素)来确定两种或更多种选定的细菌和/或两种或更多种选定的性状。在一些实施方案中，可以在同一再探测循环中确定选定的细菌和选定的性状。在一些实施方案中，可以在不同的再探测循环中确定选定的细菌和选定的性状。通常，通过选择在特定的再探测循环期间施加于样品的探针，本领域技术人员可以选择在所述再探测循环中将确定哪种选定的细菌和/或选定的性状。靶标通常，靶标可以是细菌(或酵母)内存在的、在全细胞分析过程中可用各自的探针进行确定的任何靶标分子(或其一部分)。靶标的一些非限制性实例包括存在于细菌的任何核酸内的核酸序列(例如rRNA、mRNA、染色体DNA或质粒DNA内的选定序列)、抗原、抗体、蛋白、肽和/或激素。在一些实施方案中，利用以下来实施本文所公开的方法1)能确定样品中可能存在的选定革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针；以及幻能确定与样品的细菌中可能存在的选定性状相关的染色体DNA、mRNA和/或天然质粒的针对性状的探针(该性状可以存在于所述选定的革兰氏阳性细菌中也可以不存在于所述选定的革兰氏阳性细菌中)。然而，为了避免不确定性，本发明并不涉及使用用于确定性状的蛋白靶标。应当理解，本文所公开的方法可用于确定其它靶标(例如通过多元法或再探测循环)，所述其它靶标可能是样品的目的靶标并且可能在本文所公开的方法的实施过程中确定。例如，通过将样品与一种或多种针对其它靶标的其它探针接触，可以从所述样品获取其它信息，样品的细菌(或酵母)中其它靶标的存在指示另一种目的状态(例如用于正确诊断患者的另一种临床目的状态)。所述其它目的状态可以是样品中另一种细菌的存在(该细菌可以是革兰氏阳性或者革兰氏阴性)。所述其它目的状态可以是样品中酵母的存在。 所述其它目的状态可以是样品的选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌中的质粒的存在。 所述其它目的状态可以是样品的细菌(包括选定的革兰氏阳性细菌)中其它性状的存在。 本文所公开的方法可以与用于多个靶标的多种探针联合使用。因此，可以基于对靶标(和每种靶标各自的探针)的合适选择，通过实施本文所公开的方法来确定一种或多种其它目的状态，可以包括，例如确定1)其它细菌、幻质粒、幻酵母、4)性状或幻以上两种或更多种的任何可能的组合。使用常规的实验和可商购的材料和/或信息，本领域技术人员能设计选定的合适靶标(并设计对所述合适靶标的合适的探针)。例如，ISH常用于确定选定的细菌(参见Amann, R. , "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization (荧光原位杂交的方法方面)”，Bioscience Microflora, 19(2) 85-91 (2000)禾口 Pernthaler et al. , "Fluorescence in situ Hybridization(FISH)with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes (利用靴向于rRNA的寡核苷酸探针的荧光原位杂交(FISH)) "Methods in Microbiology，30 :207-2 Q001))，包括金黄色葡萄球菌(参见美国专利第6，664，045号图3和美国专利申请第2008/0008994号；Cerqueira et al.， "DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization(FISH)(用于通过荧光原位杂交(FISH)快速鉴定微生物的DNA模拟物)，，，Int. J. MoUci.，9 :1944-196(K2008)；和 Forrest et al. ,"Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-阴j"生 staphylococci positive blood cultures (快速原位杂交检测对凝固酶阴性葡萄球菌阳性的血液培养物的影响)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58 : 1M-158 Q006))。如之前所指出的(参见上文中标题为“探针”的部分)，这类确定的靶标可以是例如rRNA。然而，这并非是意图限制，因为用于选择细菌的靶标可以是例如表面抗原(参见US 7，455，985)。形成探针/靶标复合物通过确定样品的细菌内适当的探针/靶标复合物的形成来确定选定的细菌(例如选定的革兰氏阳性细菌)和选定的性状。简单而言，通过将样品与探针接触，适当的探针/ 靶标复合物将在样品的细菌内形成，所述探针是根据其对各自的靶标的亲和力选择的，所述靶标已知与选定的细菌和/或性状相关(和对选定的细菌和/或性状是特异性的)。通过探针及其各自的靶标的性质来确定探针/靶标复合物的性质。需考虑不同类型的探针/靶标复合物。例如，用于确定细菌的杂交探针可以是针对rRNA的或针对mRNA 的。因此，通过探针与其靶标的结合而形成的每种复合物分别是探针/rRNA复合物或探针 /mRNA复合物。同样，用于确定性状的杂交探针可以是针对染色体DNA的、针对mRNA的或针对天然质粒的。因此，通过探针与其各自靶标的结合而形成的每种复合物分别是探针/染色体 DNA复合物、探针/mRNA复合物或探针/质粒复合物。就抗体探针而言，抗体与其抗原靶标的结合产生抗体/抗原复合物。本领域技术人员应当意识到，细菌中的探针/靶标复合物是在合适的结合条件 (或更准确地称为杂交探针的“合适的杂交条件”)下形成的。每种探针/靶标复合物的合适的结合条件是根据探针和靶标的性质而确定的。可以这样说，合适的结合条件反映了探针与其各自靶标的相互作用是特异性的的条件。而且，本领域技术人员可以确定形成多种探针/靶标复合物的合适的结合条件。实际上，用于各种分析形式中的多种杂交缓冲液 (参见例如为原位杂交程序进行优化的即用型杂交溶液，例如厕.sigmaaldrich. com/ catalog/ProductDetail. do ？ N4 = H7782 | SIGMA&N5 = SEARCH_C0NCAT_PN01 BRAND_KEY&F =SPEC)和/或结合缓冲液(参见例如如以下所描述的从Thermc^cientific购买的即用型抗体结合缓冲液:WWW. piercenet. comProducts/Browse. cfm ？ fldID = 01010401&WT. mc_id = go_AbPur_Bind_pf&gclid = CNyJ-4uxgJoCFdxM5QodlVt5Fw)是可以购买到的。应当理解，结合条件不需要进行完全优化，只要该条件适合于探针与其各自靶标的特异性结合，使得分析能产生准确且可重复的结果。此外，如果在同一接触步骤中使用不同类型的探针(例如杂交探针和基于抗体的探针)，那么结合条件应当适合于每种类型探针与其各自靶标的结合。对于该问题的更为详细的论述，参见下文中标题为“协调全细胞分析中的结合条件”的部分。确定探针/靶标复合物探针/靶标复合物一旦形成就可以进行确定。可以使用与每种不同的(或不同类型的)探针/靶标复合物相关的标签来确定探针/靶标复合物。在一些实施方案中，与不同的(或不同类型的)探针/靶标复合物相关的所有标签是相同的。在一些实施方案中， 不同的标签(或标签的组合)与每种不同的(或不同类型的)探针/靶标复合物相关。在一些实施方案中，利用与不同的(或不同类型的)探针/靶标复合物中的一些相关(例如针对细菌的探针，其中细胞形态可用于区别细菌种类)的相同标签和与不同的(或不同类型的)探针/靶标复合物中的另外一些相关的(例如用于确定不同性状的探针)不同标签的混合物。可以直接或间接确定探针/靶标复合物。“直接地”表示探针/靶标复合物的探针包含连接的标签，该标签是基于其自身的性质而确定的(参见上文中标题为“探针”的部分中的涉及直接和间接确定标签的论述)。“间接地”表示使用第二组合物(例如标记的抗体)来确定探针/靶标复合物，所述第二组合物包含标签并且能与所述探针/靶标复合物 (或与探针/靶标复合物连接的标签)结合(或相互作用)，其中所述标签的确定(Id.)指示探针/靶标复合物。无论怎样，确定标签与确定探针/靶标复合物相关。在全细胞分析中，在一些实施方案中，可以通过检查细胞(即细菌)的染色情况来确定探针/靶标复合物。简单而言，不管标记是直接的还是间接的，细胞都被染色，因为与探针/靶标复合物(直接地或间接地)相联的标签被摄入完整的细胞(即细菌)内(或至少在细胞表面上)。如上文所指出的，对于不同的细菌和/或性状，可以使用独特的标签和 /或独特的标签组合。因此，能确定样品中染色细菌的任何方法都可以用来确定选定的细菌和/或选定的性状。例如，可以基于显微镜下的视觉观察来确定选定的细菌和/或性状。在一些实施方案中，该过程可以是自动化的，以便可以使用计算机和算法来确定结果。在一些实施方案中，可以使用载玻片扫描仪来确定选定的细菌和/或性状。同样， 载玻片扫描仪可以是自动化的，以便可以使用计算机和算法来确定结果。在一些实施方案中，可以使用流式细胞仪来确定选定的细菌和/或性状。同样，流
24式细胞仪可以是自动化的，以便可以使用计算机和算法来确定结果。此外，适于确定染色细胞的任何其它装置或方法均可以用来确定用本文所公开的创造性的方法所形成的探针/靶标复合物。细胞形态本发明的优势在于多种细菌类型具有独特的形态。除了用于标记细菌的标签(例如染色)之外，细胞的形态也可以用来确认细菌种类或可能例如在多元分析中引进二级区分。例如，杆菌多为杆状，而链球菌多为球状(参见www.en.wikipedia.org/wiki/ Bacterial_cell_structure#Cell_morphology 禾口 www.en.wikipedia.org/wiki/File Bacterial_morphology_diagram. svg)。在一些分析中，例如，确定黄色染色的杆状细胞可以确认样品中选定的革兰氏阳性细菌的存在、位置和/或数量。在这种情况下，细菌的形状用于，例如，区别分析中的信号(选定的革兰氏阳性细菌)和噪声(其它细菌)。在一些(例如多元)分析中，例如，可以使用多种细胞类型，其中至少两种不同形态的细菌染上例如黄色标记。在这种情况下，可以基于例如是否被染成黄色和形状是杆状还是球状来确定所述两种选定细菌的存在、位置和/或数量。当然，还可以使用具有其它已知且可区别的形态的细菌来进一步开发利用该方法的分析(进一步多元化)。与形态相关(但未必是严格意义上细胞形态的实例)的是，在一些实施方案中，染色过程的特征还可以用来确认或确定结果。例如，如果抗体探针与表面抗原相互作用，从而将细菌表面染色(例如使用基于抗体的针对细菌的探针)，并且第二独特标记的针对靶标的探针(例如针对mRNA的探针)与细菌内(例如细胞质内)的靶标相互作用，从而将细菌内染色，则可以产生独特的染色模式。例如，如果抗体探针是红色的且靶标探针是绿色的， 则当用显微镜观察时，细菌将会呈现出红色的覆盖(或环)包围绿色的主体。因此，基于它们是否表现出该特定的染色模式来确认或确定样品的细菌。从上述可明显看出，细胞形态(和染色模式)是本发明特征，并且可用来确定选定的革兰氏阳性细菌或在本文所公开的任何方法中待确定的其它选定的细菌。相比较而言， 在无细胞分析中无法应用细胞形态，因为细菌遭到破坏。性状如上文定义的，性状(为本发明的目的)是指可通过分析细菌的染色体DNA、mRNA 和/或天然质粒来确定的所述细菌的任何特性或属性。“选定的性状”是在具体分析中选择进行确定的性状。可将分析设计成用于确定多种选定的性状。因为性状是基于细菌的遗传组成，所以细菌被认为是具有性状(即特性或属性)， 不管所述细菌是否表达(例如表现出)该性状(即所述性状是固有属性)。因此，性状的具有与性状的表达的不同之处在于细菌可以具有性状，但是不表现出与所述性状相关的特性或性质，因为表达是指当细菌表现出与所述性状相关的特性或属性(即表型)时。因而应当清楚，如果细菌表现出性状，则其具有该性状(即含有表现所述形状所需的遗传物质)， 但是细菌也可以具有性状而不表现出该性状。可以使用本文所公开的方法来确定很多细菌性状。可确定的性状的一些非限制性实例包括1)抗生素抗性、幻毒素产生和/或幻毒力。在一些实施方案中，可以分别使用细菌的DmecA基因或vanA或vanB基因、2) tcbD基因和/或3) IukF和IukS基因中的靶标确定性状的实例。因为性状与染色体DNA、mRNA和天然质粒相关，所以选定的细菌中一些性状的靶标分子产生的拷贝数可以非常低。在革兰氏阳性细菌相关的科技文献中，通常通过联合使用包含多种标签的探针和间接标签的信号扩增来解决这一问题(参见例如Hahn et al.，Applied and Environmental Microbiology,59 (8) :2753-2757 的第 2754 页 M 2 ^ ；Wagner et al. , “ In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria (对利斯塔氏菌属中的毒力因子mRNA和16S rRNA的原位检测)”， FEMS Microbiol. Lett. , 160(1) 159-168 (Mar. 1998)；和 Honerlage et al. ,"Detection of mRNA of nprM in Bacillus meqaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridiZati0n(通过全细胞杂交检测土壤中生长的巨大芽孢杆菌ATTC 14581中的nprM mRNA)”，Arch. Microbiol.，163 :235-241(1995)关于革兰氏阴性细菌的分析也可参见 Coleman et al. , J. Microbiological Methods，71 :246-255(2007))。 $ Coleman et al.中，使用包含单标签的针对mRNA的探针，只要所述标签是近红外线荧光染料并利用长的照相曝光时间)。但是，本申请人发现，在全细胞分析形式中，仅使用单标记的探针(其中所述标签不是近红外线荧光染料)而不用扩增技术(例如信号扩增或核酸扩增)就可能确定性状，所述性状例如与革兰氏阳性细菌中低拷贝数mRNA靶标的确定相关。在一些情况下，通过在进行全细胞分析之前诱导(活)细菌中相关mRNA的产生来实现这点(更多细节请参见下文标题“诱导mRNA产生”下的内容)。特异性如上文指出的，探针/靶标复合物在允许特异性结合的条件下形成。杂交的特异性(即对杂交探针与核酸靶标的序列特异性结合)是与严紧性和/或封闭策略相关的多种因子的函数。结合的特异性还适用于抗体结合或任何其它类型的配体-配体对中成员的结合。与杂交特异性类似，抗体与抗原结合(或配体对中一个成员与另一个成员的结合)的特异性也是条件依赖性的。原则上，选择的条件能优化特异性，以便最小化或消除非特异性结合。然而，应当理解，结合的特异性是一个相对的术语，其还取决于多种因素，包括形成结合复合物的组分的性质(例如亲和力)。以下是对各种条件/考虑因素的非限制性的讨论。仅用常规的实验并联合本文所提供的公开内容，本领域技术人员能获得合适的条件，而使得具体探针与其各自靶标的结合(或杂交)是特异性的(使得本方法的实施能产生准确且可重复的结果)。在很多情况下，可以使用商购的缓冲液来实现这点。封闭探针在杂交反应中，封闭探针(由核酸、核酸类似物、核酸模拟物或嵌合体制成)可用来抑制探针与非靶标的结合，进而提高探针/靶标复合物形成的特异性。特别有效的封闭探针是PNA寡聚物(参见Coull et al.，美国专利第6，110，676号，通过引用并入本文，以及 Fiandaca et al. "PNA Blocker Probes Enhance Specificity In Probe Assays (PNA封闭探针提高探针分析中的特异性)”，Peptide Nucleic Acids protocols and Applications, pp. 129-141, Horizon Scientific Press, ffymondham,UK,1999)).杂交条件/严紧性本领域技术人员应该意识到，常用于限制或控制杂交严紧性的因素包括甲酰胺浓度(或其它化学变性剂)、盐浓度(即离子强度)、杂交温度、去垢剂浓度、PH和是否存在促溶剂。封闭探针(参考上文对封闭探针的讨论部分)也可以作为一种手段来使辨别力高于仅利用严紧性因素的优化可能达到的极限。通常通过公知技术来确定形成探针/靶标复合物的最佳严紧性，即，固定几种上述严紧性因素，然后确定改变单一严紧性因素的影响。可以调整同一严紧性因素，从而控制核酸模拟物、核酸类似物或嵌合体与核酸靶标(例如rRNA、mRNA或染色体DNA内的序列)的杂交严紧性，但是对于这些修饰的寡聚物(例如 PNA)中的一些而言，杂交可以完全不依赖于离子强度。可以通过实验确定分析的最佳或合适的严紧性，其中检验每个严紧性因素直到达到所需的辨别力。然而，最佳的严紧性不是必须的。恰恰相反，所需要的是能在分析中将探针与非各自靶标的对象的非特异性结合最小化至获得准确且可重复的结果所必需的程度。在下文所提供的实施例中，使用杂交缓冲液进行杂交。如同所指出的，各种杂交缓冲液都可以购买到。这种缓冲液与温度控制的联合通常能提供合适的杂交条件。能否快速得到结果是重要的因素，对于临床样品尤其如此。以下实施例中进行的杂交反应与Hahn et al.、Wagner et al.和H0nerlage et al.等中的杂交反应的显著不同之处在于杂交反应进行了 2小时内而不是5-16小时(对于针对mRNA的探针而言)。合适的抗体结合条件合适的抗体结合条件包括适于抗体与其抗原特异性结合的条件。影响抗体与其抗原特异性结合(或配体-配体复合物中配体的结合)的因素与上面提到的那些影响杂交的因素基本类似，并且可以以相似的方式进行优化。各种抗体的合适的抗体结合条件是本领域技术人员已知的。对于那些非已知的条件，可以确定它们。如上文所指出的，合适的结合缓冲液也是可购买到的。因此，在进行或不进行其它常规实验的条件下，利用本文所提供的公开内容，本领域技术人员可以确定合适的抗体结合条件。借助本领域技术人员的其它通用指导，制备和使用抗体的方法可在很多参考文献中找到，包括Molecular Probes Of The Nervous System, Volume 1,"Selected Methods For Antibody and Nucleic Acid Probes (选择用于抗体和核酸探针的方法)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 S. Hockfield et al。协调全细胞分析中的结合条件当实施本文所公开的方法时，本领域技术人员会发现协调杂交条件、抗体结合条件和其它分析条件(例如配体-配体结合的条件)是有用的。例如，在一些实施方案中， 用一种或多种杂交探针对细胞进行染色可以与抗体结合事件同时进行、在抗体结合事件之前进行或在抗体结合事件之后进行。因为同一变量(PH、盐浓度等)的调整是常常涉及的， 所以仅需借助于常规的实验，本领域技术人员就能容易地协调条件，使得分析能产生满意的结果。关于单一分析中协调使用抗体探针和杂交探针的条件的一些问题和相关解决办法的讨论可见于 Goldbard et al. (US 6, 524, 798)禾口 A^mus et al. ,"Improved In Situ Tracking of Rhizosphere Bacteria Using Dual Staining with Fluorescence-Labeled Antibodies and rRNA-Targeted Oligonucleotides (使用焚光标记抗体和靴向于 rRNA 的寡核苷酸的双重染色提高对根际细菌的原位追踪)”，Microb. Ecol. ,33 =32-40(1997)中。 另外值得注意的是，使用非核酸探针，优选使用PNA探针，可以简化协调过程，因为PNA探针能在宽泛的条件范围下与互补核酸结合(与核酸/核酸相互作用相比)，从而允许技术人员将条件调整为更接近适于抗体-抗原结合和/或其它配体-配体结合的条件。无RNA酶试剂RNA酶是自然界中能降解RNA的酶。细菌含有RNA酶。在细菌死亡(例如通过固定)之后，这些RNA酶可以长时间地保持活性。当用于确定选定的细菌或选定的性状的靶标是RNA分子时，全细胞分析中检测的细菌中的残留RNA酶活性能活跃地降解所述靶标分子。如果靶标分子是低拷贝数的分子，那么对所述靶标分子的任何破坏都会显著降低分析的信号。可购买到多种使RNA酶灭活的试剂。这些试剂通常被称为RNA酶抑制剂。其中一种可购买到的RNA酶抑制剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，来自Thermo Scientific, Rockford, II，产品号 77720)。可使用RNA酶抑制剂来处理样品，使细菌细胞中的RNA酶活性被抑制，从而预先阻止了 RNA靶标的降解。RNA酶抑制剂可被添加到实施本发明所用的任何试剂、混合物、制剂和/或溶液中，从而抑制所述试剂、混合物、制剂和/或溶液中的RNA酶活性，并在细菌与所述试剂、混合物、制剂和/或溶液接触时进一步抑制细菌中靶标分子的任何降解。所述试剂被认为是无RNA酶的。然而，应当理解，使用RNA酶抑制剂并非是实施所公开的方法的绝对必要的条件。诱导mRNA产生文献已经指出，如果细菌内的mRNA是靶标，则其不易被确定(参见例如=C0Ieman et al. , "mRNA-targeted fluorescent in-situ hybridization (FISH)of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification(对不用模板扩增或酪胺信号放大的革兰氏阴性细菌进行的靶向于mRNA的荧光原位杂交 (FISH))，，，J. Microbiological Methods, 71 :246-255 (2007))) 这似乎在一定程度上是由于细菌内的低拷贝数以及mRNA固有的不稳定性。增加靶标mRNA分子拷贝数的一个方法是诱导活细菌中mRNA的产生。因此，在一些实施方案中，在用针对mRNA的探针处理活细菌之前，用mRNA诱导剂处理所述活细菌一段时间来诱导所述细菌内mRNA的产生。可以在固定细菌之前进行mRNA 诱导剂的处理。mRNA诱导剂的处理可以与其它方法(例如使用无RNA酶的试剂)联合，以便在按照本文所公开的方法确定细菌和/或性状之前，细菌中的mRNA靶标基本不会降解。 应当理解，在一些情况下，(即使不诱导)细菌会产生足够的可检测的mRNA。因此，mRNA诱导并非是实施所公开的方法的绝对必要的条件。mRNA 稳定化还可以使用mRNA稳定剂来稳定细胞mRNA。因此，mRNA稳定剂可用于实施本文所公开的方法。mRNA稳定剂与mRNA诱导剂的不同之处在于mRNA稳定剂保护细胞中存在的 mRNA,而mRNA诱导剂致使活细胞产生更多的mRNA。然而应当理解，这些作用并不是互相排斥的。也就是说，一种试剂可能既是mRNA诱导剂又是mRNA稳定剂。例如，某些抗生素可以既是mRNA诱导剂又是mRNA稳定剂。然而，应当理解，使用mRNA稳定剂不是实施所公开的方法的绝对必要的条件。固定细菌可以利用固定的细菌进行全细胞分析。固定细菌是处理细菌细胞从而保存和/或制备用于显微镜分析的细菌细胞的过程。固定的细菌在分析之前可保存一段时间。常用的固定剂是多聚甲醛。其它常用的固定剂包括乙二醛、戊二醛、锌盐、加热、醇 (甲醇和乙醇)、酸性溶液和以上中任何两种或更多种的组合。在一些实施方案中，可以通过将样品与固定剂接触来实施本文所公开的方法。用于固定细胞的常用过程被称为火焰固定，该过程可以(或者也可以不)伴随细菌与试剂的接触。因此，利用可以(或可以不)包括样品与试剂的接触的固定步骤可以实施本文所公开的方法。任何固定剂均可以包含并非与固定严格相关的其它组分。例如，在一些实施方案中，可以向固定剂添加一种或多种探针。按照这样的方式，可以同时进行固定和探针/靶标的形成。试剂的任何组合都是允许的，只要所述组合能像各种试剂在未组合时一样实现预期目的。透化细菌通过细菌的透化过程，细胞膜/细胞壁被改变，使得进行分析所需的试剂能穿入 (和穿出)所述细菌。细胞透化不同于固定，并且对于很多细菌种类而言，不需要进行细胞透化。细胞透化剂的一些非限制性实例包括含有一种或多种酶的溶液/制剂，所述酶例如溶葡萄球菌素、溶菌酶和蛋白酶(例如蛋白酶K和/或无色肽酶)。为了透化细菌，可以将所述酶与样品接触，并由此部分消化细胞膜和/或细胞壁。在一些实施方案中，细胞透化剂是化学品、化学品与酶的混合物或用化学品和酶以任何顺序相继进行的处理。因此，在一些实施方案中，可以将革兰氏阳性细菌(例如葡萄球菌)与细胞透化剂接触，从而允许正常情况下被细菌排斥(或缓慢穿入细菌)的试剂更自由地穿入细菌， 并进而便于本文所描述的全细胞分析。透化的程度取决于为了实施特定的分析而必须穿入细胞的试剂的性质。通常，随着必须穿过细胞膜/细胞壁的分子的大小增加，必须进行更高程度的透化。太低的细胞穿透性可能会导致假阴性或假阳性结果(参见=Pernthaler et al. ,"Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria (对环境细菌中的mRNA和rRNA同时进行荧光原位杂交)”， Applied and Environmental Microbiology, 70(9) :5426-5433(2004 ^ 9 ^ ), H 5429 M 第2栏)。然而，细胞透化剂的过度处理可能会导致细菌细胞的破坏(参见=Furukawa et al.，Microbes Environ.第231页第1_2栏)。在下文第8部分列举的几篇参考文献中讨论了透化细菌细胞的各种方案。利用常规的实验与本文所提供的公开内容的联合，技术人员能确定任何特定分析中透化细菌的合适条件。洗涤在全细胞分析中，通常在方法的一步或多步(或子步骤)之间进行洗涤步骤，以去除在前面的步骤(或子步骤)中施加于样品的一种或多种成分(或过量的成分)，从而准备用于下一方法步骤(或子步骤)的样品。洗涤试剂通常是包含盐和/或去垢剂的缓冲溶液。在实践中，洗涤试剂常被称为洗涤缓冲液或洗涤溶液。多种洗涤试剂都可以购买到。通常在样品与探针接触之后进行洗涤步骤，以便未与其各自靶标选择性结合的过量探针被洗掉。然而，也有关于不用洗涤的基于ISH分析的报道(参见美国专利第 6，905，824号)。是否需要洗涤步骤在一定程度上取决于分析中所用的固定剂以及探针的性质和进行确定的方式。
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扩增技术本文所用的“扩增技术”是指通过增加分析中可被确定的靶标分子的数量或者通过增加来自标签的信号输出来提高检测方法的方法/技术。这些特定的扩增技术因而分别被称为靶标扩增或信号扩增。靶标扩增如同所指出的，在靶标扩增中，靶标分子的数量增加。常用靶标扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)，其中例如通过使用引物对、热稳定聚合酶、三磷酸核苷酸以及使靶标分子 (及其拷贝)变性和退火的热循环过程使靶标核酸(或其一部分)以指数方式复制。靶标扩增方法的其它非限制性实例包括连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和转录介导扩增(TMA)。信号扩增在一些实施方案中，用标签的信号扩增来提高方法的检测限。简单而言，当细胞 (即细菌)具有低拷贝数的特定靶标并因而得到各自探针/靶标复合物的数量较少时，通常会使用信号扩增。尤其是当确定(例如选定细菌或性状的确定)是基于细菌染色时，如果细菌中探针/靶标复合物的数量太低，可能不会产生足够的信号。然而，如果与探针/靶标复合物相联的单标签的信号可被增加或扩增多倍，则即便是细菌细胞中靶标的拷贝数低， 也能进行确定。有几种可利用的信号扩增技术。信号扩增可应用于直接标记技术和间接标记技术。信号扩增的一些非限制性实例包括酪胺信号扩增(TSA，也被称为催化信使沉积(CARD))、酶标记荧光(ELF-97，产品和信息可获自Invitrogen, Carlsbad, CA)、分支 DNA(bDNA)信号扩增和滚环扩增(RCA)。使用这些信号扩增技术来检测细菌中低拷贝数靶标的具体方法在下文第8部分列举的数篇参考文献中有更详细的论述。5.本发明的各实施方案应当理解，步骤的顺序或进行某些操作的顺序并不重要，只要本发明仍然是可实施的或者除非另行规定。而且，在一些实施方案中，两个或多个步骤或操作可以同时进行， 只要本发明仍然是可实施的或者除非另行规定。本发明尤其涉及确定样品的细菌中选定的革兰氏阳性细菌和选定的性状的方法。 所述性状可见于样品的任何细菌中，包括选定的革兰氏阳性细菌。可以确定样品的革兰氏阴性细菌中的所述性状。然而通常，所选定的性状通常与所选定的革兰氏阳性细菌有关的性状(但是所述性状也可见于革兰氏阴性细菌中)。同样，应当理解，本文所描述的方法并不限于确定每种样品的一种选定的细菌和一种选定的性状。恰恰相反，所述方法可用来确定样品中的多种细菌和/或与样品的细菌有关的多种性状。在一些实施方案中，用多元分析确定所述多种细菌和/或多种性状。所述多元分析可以涉及使用细菌的差异性染色，从而所述细菌表现出的不同染色可用来确定细菌类型和/或性状。因此，在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括a)将样品与i)能确定样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针和ii)能确定与选定的性状相关的染色体DNA、 mRNA和/或质粒核酸的针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针接触，其中所述样品中的选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可具有所述选定的性状。通常情况是怀疑样品包含一种或多种革兰氏阳性细菌。应当理解，所述样品与子步骤i)和 )中的所述组分的接触可以以任何顺序来实施，或者所述接触可以同时发生，所述接触的顺序并非意图成为限制。所述方法还包括b)确定样品中一种或多种选定的革兰氏阳性细菌；和C)确定样品中具有选定性状的细菌。i)所述方法在全细胞(即完整的细胞)上实施；ii)步骤(b)和(C)以任意顺序或同时进行(即实施)；并且iii)针对染色体DNA的、 针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种都包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记探针或双标记探针)。在一些实施方案中，重点是确定样品中具有选定性状的细菌。因此，在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括将含有细菌的样品与能确定与选定的性状相关的染色体DNA、 mRNA和/或质粒核酸的针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针接触，其中所述样品中选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可具有所述选定的性状。所述方法还包括确定所述样品中具有所述选定性状的细菌，其中i)所述方法在全细胞上实施； 并且ii)所述针对染色体DNA的、针对mRNA-和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种都包含单一标签或两种标签。所述方法还包括将样品与能确定所述样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针接触，并确定所述样品中一种或多种所述选定的革兰氏阳性细菌。按照这些不同的方法，选定的革兰氏阳性细菌和/或选定的性状的确定分别涉及确定针对细菌的探针和针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针的探针/靶标复合物的形成。在合适的结合条件下(或视具体情况为合适的杂交条件)完成探针/靶标复合物的形成。在一些实施方案中，由于细菌染色的性质，各自的探针/靶标复合物的形成是明显的。因此，对于这些实施方案，通过分析个体细菌的染色可以确定选定的细菌和/或选定的性状。例如，可以用显微镜、载玻片扫描仪或流式细胞仪来监测(确定) 个体细菌的染色。可以在不使用扩增技术(例如与针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针连接的标签的信号扩增或诸如原位PCR的靶标扩增技术)的条件下实施这些方法。可以在不将样品与细胞透化剂接触的条件下实施这些方法。在一些实施方案中， (与针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每种连接的)所述单标签包含最大发射小于650nm的荧光标签。在一些实施方案中，可以仅用针对mRNA的探针实施这些方法，其中所述探针能确定选定的性状。在一些实施方案中，仅使用单一针对mRNA的探针来确定性状，或者使用单一针对mRNA的探针来确定每一种目的性状(即每种性状一种探针，从而如果有三种目的性状，则使用三种探针)。在一些实施方案中，可以用针对mRNA的标记探针的混合物实施这些方法。在一些实施方案中，每种针对mRNA的探针都包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，所述标签是最大发射小于650nm 的荧光标签。在一些实施方案中，每种针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针都包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，在没有对所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针的标签进行信号扩增的条件下实施所述方法。在一些实施方案中，每种针对染色体 DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针都包含单一标签，并且在没有对所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针的所述单一标签进行信号扩增的条件下实施所述方法。在一些实施方案中，针对细菌的探针是基于抗体的。因此，每种探针的靶标是存在于选定的革兰氏阳性细菌的表面上或内部的抗原。在一些实施方案中，针对细菌的探针是针对rRNA的。因此，每种探针的靶标是存在于选定的革兰氏阳性细菌的rRNA内的核碱基序列。在一些实施方案中，针对细菌的探针是针对mRNA的。在一些实施方案中，针对细菌的探针是针对调节性RNA的(例如sRNA或aRNA)。因此，每种探针的靶标分别是mRNA或调节性RNA(例如sRNA或aRNA)的(或内部的)核碱基序列。在一些实施方案中，针对细菌的探针是用标签标记的。在一些实施方案中，每种针对细菌的探针是用单一标签或两种标签标记的(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，所述标签是发荧光的，并且最大发射小于650nm。在一些实施方案中，所述标签中的一种或多种是发荧光的，并且最大发射为650nm或更高。在一些实施方案中，上文所述第一种方法的实施还包括根据步骤(b)和(C)中的分析来确定样品中也具有选定性状的任何选定的革兰氏阳性细菌。“步骤(b)和(C)的分析”是指分析步骤(b)和(c)中所做的确定，在这种情况下，通过运用推理，所述确定可以引导技术人员识别出样品中哪种选定的革兰氏阳性细菌也具有所述选定的性状。应当理解，并非样品中的所有选定的革兰氏阳性细菌都具有选定的性状(实际上可能选定的革兰氏阳性细菌都不具有选定的性状)。例如，样品可以是混合群体，因此既包含具有选定性状的选定革兰氏阳性细菌也包含不具有选定性状的选定革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，所有或几乎所有选定的革兰氏阳性细菌具有选定的性状。在一些实施方案中，可以在利用或不利用各种其它步骤和/或试剂的条件下实施这些方法。例如，可以通过将样品与一种或多种洗涤试剂接触来进行一个或多个洗涤步骤。 在一些实施方案中，将样品与固定剂接触。在一些实施方案中，将样品与细胞透化剂接触。 在一些实施方案中，将样品与mRNA诱导剂接触。在一些实施方案中，mRNA诱导剂可以诱导与选定的性状相关的非表面蛋白的产生，所述非表面蛋白能提高所述选定性状的分析的灵敏度和和/或准确性。应当理解，在一些实施方案中，可以将两种或更多种上述试剂应用于同一样品，每种试剂与样品接触一次或多次。可以以任何顺序(或同时)进行样品与各种试剂的接触，只要能允许准确确定选定的细菌和/或性状。在一些实施方案中，可以以无RNA酶的分析形式进行这些方法。通常，这涉及用抑制RNA酶活性的试剂处理用来与样品接触的所有试剂。同样，样品本身可以与抑制RNA酶活性的相同或不同的试剂接触。在一些实施方案中，省略了一个或多个常用步骤。例如，在杂交分析中，在将样品与杂交探针接触之前通常进行预杂交步骤。在本发明中使用一种或多种杂交探针的一些实施方案中，所述方法在没有预杂交步骤的条件下进行。当使用抗体探针时，在将样品与所述抗体探针接触之前通常进行(或不进行)封闭步骤，但是该步骤可以省略。在一些实施方案中，省略了细胞透化步骤。在一些实施方案中，省略了洗涤步骤。实际上，任何常用步骤都可以省略，只要省略后不会导致所述方法不能产生准确的结果。在一些实施方案中，所有探针都是标记的。在一些实施方案中，所有的标签都是荧光标签。在一些实施方案中，可以以原位杂交(ISH)分析的形式进行这些方法，因为所有的探针都是杂交探针(即它们与其各自的靶标杂交)。在一些实施方案中，所有的探针都是杂交探针，并且所有的标签都是荧光标签。在这种情况下，所述方法是荧光原位杂交(FISH) 分析的形式。在一些实施方案中，所述选定的性状可以与1)抗生素抗性、幻毒素产生和/或3) 毒力相关。例如，所述选定的性状可以分别与细菌的l)mecA基因或vanA或vanB基因、2) tcdB基因和/或;3)lukF和IukS基因的存在相关。因此，可以通过分别确定选定的革兰氏阳性细菌(或样品的其它细菌)中DmecA基因或vanA或vanB基因、2)tcdB基因和/或 3) IukF和IukS基因的存在来确定选定的性状。在一些实施方案中，可以确定多种选定的革兰氏阳性细菌和/或选定的性状。在一些实施方案中，可以通过多元化来实现这点。在一些实施方案中，可以通过对样品进行再探测循环来实现这点。在一些实施方案中，可以通过多元化和对样品进行再探测循环来实现这点。因此，在一些实施方案中，这些方法还包括将样品与以下接触1)能确定样品中第二选定的革兰氏阳性细菌的第二针对细菌的探针；和/或幻能确定与第二选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸的第二针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针，所述样品的任何细菌(包括(第一)选定的革兰氏阳性细菌和/或第二选定的革兰氏阳性细菌)可具有所述第二选定的性状。在一些实施方案中，更具体而言，本发明涉及确定样品中的一种或多种抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNQ和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。如在上文的“引言”中提出的，特别是能有效确定临床样品中的抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)以及任选的其它抗甲氧苯青霉素的细菌(例如抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA))在很多病患医疗领域内是至关重要的。因此，在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括a)将样品与i)能确定样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的探针和ii)能确定样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性的针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针接触。通常的情况是怀疑样品包含一种或多种抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)。应当理解，所述的样品与步骤a)中所述组分的接触，即子步骤i)和ii)，可以以任何顺序来实施，或者所述接触可以同时发生，所述接触的顺序并非意图成为限制。所述方法还包括b)确定样品中的一种或多种金黄色葡萄球菌(即选定的革兰氏阳性细菌)；以及c)确定样品中具有甲氧苯青霉素抗性(即性状)的一种或多种细菌。可以通过确定在合适的结合条件(或者视具体情况为合适的杂交条件) 下，探针与细菌中其各自靶标之间探针/靶标复合物的形成来做出所述确定。所述方法i)在全细胞(即完整的细胞)上实施，并且ii)步骤(b)和(C)以任意顺序进行或同时进行。每种针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针包含单一标签或双重标签(即每种探针都是单标记的探针或双标记的探针)不是所述方法的必要条件(但是可以是任选的限制)。在一些实施方案中，重点在于确定样品中具有选定性状(即甲氧苯青霉素抗性) 的细菌。因此，在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括将样品与能确定样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性的针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针接触，并确定所述样品中具有甲氧苯青霉素抗性的一种或多种细菌，其中，所述方法在全细胞上实施。所述细菌可以是革兰氏阳性细菌。所述方法还可以包括将样品与能确定样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的探针接触，并确定所述样品中的一种或多种金黄色葡萄球菌。可以在没有对与针对染色体DNA-和/或针对mRNA的标记探针连接的标签进行信号扩增的条件下实施这些方法。然而，如果针对染色体DNA-和/或针对mRNA的标记探针的每一种都包含单一标签或两种标签，则所述标签可以是发荧光的，并且最大发射可以小于、等于或大于650nm。在一些实施方案中，可以在不使用任何扩增技术的条件下实施这些方法。在一些实施方案中，可以在不将样品与细胞透化剂接触的条件下实施这些方法。在一些实施方案中，可以仅用针对mRNA的探针实施这些方法，其中所述探针能确定与甲氧苯青霉素抗性相关的mRNA。在一些实施方案中，仅使用一种针对mRNA的探针来确定甲氧苯青霉素抗性。在一些实施方案中，使用两种或更多种针对mRNA的探针来确定甲氧苯青霉素抗性(即针对mRNA的探针的混合物，该探针的每种都可以用一种或两种标签进行标记)。在一些实施方案中，每种针对mRNA的探针包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，所述标签是发荧光的，并且最大发射小于、等于或大于650nm。在一些实施方案中，每种针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，可以在没有对所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的标签进行信号扩增的条件下实施这些方法。在一些实施方案中，每种针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针包含单一标签或两种标签(即每种探针是单标记的探针或双标记的探针)，并且在没有对所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的单一标签进行信号扩增的条件下实施所述方法。在一些实施方案中，每种针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针包含一种或多种标签，并且在没有对所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的标签进行(直接或间接的)信号扩增的条件下实施这些方法。在一些实施方案中，针对细菌的探针是基于抗体的。因此，每种探针的靶标是存在于选定的革兰氏阳性细菌的表面上或内部的抗原。在一些实施方案中，针对细菌的探针是针对rRNA的。因此，每种探针的靶标是存在于选定的革兰氏阳性细菌的rRNA内的核碱基序列。适用于确定临床样品中的金黄色葡萄球菌的针对rRNA的探针是可购买到的，并且描述其用途的研究在Rarest et al. , “Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures (快速原位杂交检测对凝固酶阴性葡萄球菌阳性的血液培养物的影响)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58 :154-158(2006) 中进行了论述。在一些实施方案中，针对细菌的探针是针对mRNA的或针对其它调节性 RNA (例如sRNA或aRNA)。因此，每种探针的靶标分别是mRNA或调节性RNA (例如sRNA或 aRNA)的(或其内部的)核碱基序列。在一些实施方案中，针对细菌的探针是用标签标记的。在一些实施方案中，每种针对细菌的探针是用单一标签或两种标签标记的(即每种探针都是单标记的探针或双标记的探针)。在一些实施方案中，所述标签是发荧光的，并且最大发射小于650nm。在一些实施方案中，所述标签的一种或多种是发荧光的，并且最大发射为650nm或更高。在一些实施方案中，特别涉及甲氧苯青霉素抗性确定的第一种公开方法的实施还包括根据步骤(b)和(c)的分析来确定样品中的任何抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌。 “步骤(b)和(c)的分析”是指分析步骤(b)和(c)中所做的确定，在这种情况下，通过运用推理，所述确定可以引导技术人员识别出样品中哪些金黄色葡萄球菌是抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)。应当理解，在一些样品中，并不是样品中所有的金黄色葡萄球菌都具有甲氧苯青霉素抗性。例如，样品可以是混合群体，并且因而包含抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌 (MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNQ和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。如同GrSbneret al.在第1691页第1栏所指出的，BD GeneOhm StaphSR分析无法区别包含MRSA和MSSA混合群体的样品。而这正是本发明的优点，因为可以确定个体细菌的类型和性状，利用本文所公开的全细胞方法可以正确地表征混合群体 (参见例如实施例10)。在一些实施方案中，样品中所有或几乎所有的细菌都是抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)。在一些实施方案中，样品中的细菌都不是抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)，在这种情况下，可以改变患者(样品来源)的治疗方案，以降低住院费用(还参见 Forrest et al.)。在一些实施方案中，可以在利用或不利用各种其它步骤和/或试剂的条件下实施这些方法。例如，通过将样品与一种或多种洗涤试剂接触可能进行一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，将样品与固定剂接触。在一些实施方案中，将样品与细胞透化剂接触。在一些实施方案中，将样品与mRNA诱导剂接触。在一些实施方案中，mRNA诱导剂可以诱导与选定的性状相关的非表面蛋白的产生，所述非表面蛋白能提高所述选定性状的分析的灵敏度和和/或准确性。应当理解，在一些实施方案中，可以将两种或更多种上述试剂应用于同一样品，每种试剂与样品接触一次或多次。可以以任何顺序(或同时)进行样品与各种试剂的接触，只要允许准确确定选定的细菌和/或性状。在一些实施方案中，可以以无RNA酶的分析形式进行这些方法。通常，这涉及用抑制RNA酶活性的试剂处理用来与样品接触的所有试剂。同样，样品本身也可以与抑制RNA 酶活性的相同或不同的试剂接触。在一些实施方案中，省略了一个或多个常用步骤。例如，在杂交分析中，在将样品与杂交探针接触之前通常进行预杂交步骤。在本发明中使用一种或多种杂交探针的一些实施方案中，所述方法在没有预杂交步骤的条件下进行。当使用抗体探针时，在将样品与所述抗体探针接触之前通常进行(或不进行)封闭步骤，但是该步骤可以省略。在一些实施方案中，省略了细胞透化步骤。在一些实施方案中，省略了洗涤步骤。实际上，任何常用步骤都可以省略，只要省略后不会导致所述方法不能产生准确的结果。在一些实施方案中，所有探针都是标记的。在一些实施方案中，所有的标签都是荧光标签。在一些实施方案中，可以以原位杂交(ISH)分析的形式进行这些方法，因为所有的探针都是杂交探针(即它们与其各自的靶标杂交)。在一些实施方案中，所有的探针都是杂交探针，并且所有的标签都是荧光标签。在这种情况下，所述方法是荧光原位杂交(FISH) 分析的形式。
在一些实施方案中，特别涉及甲氧苯青霉素抗性确定的第一种公开方法的实施还包括α)将样品与能确定所述样品中的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的第二针对细菌的探针接触，其中所述第二针对细菌的探针可独立于与能鉴定所述样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的标记探针进行检测；β)确定所述样品中的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)(例如， 常见的皮肤细菌表皮葡萄球菌(S.印idermidis)，其是一种不同于金黄色葡萄球菌的葡萄球菌)；以及X)根据步骤(β)和(c)及任选的步骤(b)的分析，确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)。“步骤(β)和(c)及任选的步骤(b)的分析”是指分析步骤(β)和(c)及任选的步骤(b)所做的确定，在这种情况下，通过运用推理，所述确定可以引导技术人员识别出样品中哪些细菌是抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)。在一些实施方案中，在同一样品中确定抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA) 和抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)。在一些实施方案中，在同一样品中确定抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌 (MR-CNS)或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。在一些实施方案中，确定样品中抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌 (MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的混合群体(参见实施例 10)。在一些实施方案中，该确定可以同时进行。(以多元形式进行的)这类分析的一个实例可见实施例3。利用图3(如实施例3中论述)中的图像对细菌和性状的确定可以是自动化的，这对本领域技术人员而言应当是显而易见的。在一些实施方案中，所述方法还包括根据步骤(b)、(β)、(C)和(X)的分析，将样品表征为对抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)和/或抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)是异质的还是同质的。“步骤(b)、(β)、(c)和(χ)的分析”是指分析步骤(b)、(β)、(C)和(χ)中所做的确定，在这种情况下，通过运用推理，所述确定可以引导技术人员识别出样品中抗甲氧苯青霉素的细菌对于甲氧苯青霉素抗性性状而言是异质的还是同质的。在实践中，可以通过确定样品中选定细菌所表现出的染色量(例如强度)，而在选定性状的发面与样品中其它选定的细菌进行比较。如果不同选定的细菌在选定性状方面的染色强度基本相同，则样品的不同细菌中性状的表达是同质的。然而，如果样品的不同细菌之间各选定的细菌相对于选定性状方面的染色强度不同，则样品的不同细菌中性状的表达是异质的。此外，在一些实施方案中，确定样品对于MRSA而言是异质的还是同质的需要(或者至少可优选地)参考其它测试，例如，样品的细菌在不同培养基中培养时的生长，其中每种不同的培养基包含不同浓度的抗生素。以这种方式，可以基于培养基中不同抗生素水平时的集落数而确定样品的选定细菌表现出不同水平的甲氧苯青霉素抗性性状的表达。在一些实施方案中，这些方法还可以包括将所述样品与mRNA诱导剂接触。在一些实施方案中，这些方法还可以包括用RNA酶抑制剂处理所述样品。在一些实施方案中，不进行预杂交步骤。在一些实施方案中，所有的标签都是荧光标签，且所述方法是荧光原位杂交 (FISH)分析。在一些实施方案中，直接确定所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的标签。在一些实施方案中，针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针是PNA。在一些实施方案中，针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的长度为10至20个核碱基子单元。在一些实施方案中，使用信号扩增来直接或间接对所述针对染色体DNA和/或针对 mRNA的标记探针的标签的信号进行扩增。申请人:惊奇地发现，在不进行细胞透化步骤的情况下就可以实施本文所公开的各种方法。因此，在一些实施方案中，本发明涉及的方法包括a)将样品与以下接触i)能确定所述样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针和ii)能确定与选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸的针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针，所述样品中所述选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可具有所述选定的性状。所述方法还包括b)确定所述样品中一种或多种所述选定的革兰氏阳性细菌，以及 c)确定所述样品中具有所述选定性状的细菌；其中，i)所述方法在全细胞上实施；ii)步骤 (b)和(c)以任意顺序进行或同时进行；以及iii)在不用细胞透化剂处理样品的情况下实施所述方法。在一些实施方案中，在不进行任何信号扩增的情况下实施所述方法。在一些实施方案中，针对细菌的探针和针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种包含单一标签或两种标签，并且通过直接检测所述标签进行所述确定。在一些实施方案中，可以实施所述方法来确定金黄色葡萄球菌和甲氧苯青霉素抗性。因此，步骤(a)更具体涉及a)将样品与以下接触i)能确定所述样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的探针和ii)能确定所述样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性的针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针。同样地，步骤(b)和(c)更具体涉及b)确定所述样品中的一种或多种金黄色葡萄球菌；以及c)确定所述样品中具有甲氧苯青霉素抗性的一种或多种细菌。在一些实施方案中，所述方法集中于确定样品中细菌的性状。因此，在一些实施方案中，所述方法包括将含有细菌的样品与能确定与选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/ 或质粒核酸的针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针接触，所述样品中选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可具有所述选定的性状；以及确定所述样品中具有所述选定性状的细菌，其中，i)所述方法在全细胞上实施；以及ii)在没有用细胞透化剂处理样品的情况下实施所述方法。本发明的实施方案还涉及用于确定选定的性状和/或选定的革兰氏阳性细菌的探针混合物、组合物和/或制剂。在一些实施方案中，所述混合物中每种所述针对mRNA的探针是单标记的探针或双标记的探针。例如，在一些实施方案中，本发明涉及包含两种或更多种针对mRNA的探针的混合物、组合物和/或制剂，所述针对mRNA的探针能确定已知存在于样品的选定细菌中、选定的革兰氏阳性细菌中和/或其它细菌中的选定性状。所述针对 mRNA的探针能与所述细菌的mRNA分子内与所述选定的性状相关的靶标特异性地结合。所述混合物还可以包含一种或多种针对细菌的探针(例如能确定样品中的选定细菌的针对 rRNA的针对细菌的探针)。针对mRNA的探针和/或针对细菌的探针可以是PNA探针。所述混合物、组合物和/或制剂可以例如用在本文所公开的方法的杂交(接触)步骤中，使得样品与所述混合物、组合物或制剂的接触产生能被确定的探针/靶标复合物，从而视具体情况能指示细菌的类型和性状。
6.本发明实施方案的其它优点本发明的一些实施方案的优点是可以利用全细胞分析形式来有效确定单一样品中的选定的革兰氏阳性细菌和细菌中的选定的性状(无论选定的性状与选定的革兰氏阳性细菌是否相关)。通过利用全细胞分析形式，尤其能够1)保持细胞形态的信息并进而确认诸如细菌种类的信息(即确认所确定的选定细菌具有预期的细胞形态)；幻确定样品是否包含目的细菌的混合群体，3)确定样品对于选定的细菌或选定的性状是异质的还是同质的；和/或4)对样品中各种类型的细菌进行定量(绝对定量或相对于样品中的其它细菌进行定量)。例如，可以基于分析中待确定的特征而对细菌进行差异性染色，从而在多元形式中实现以上情况。所述方法还允许确定步骤的自动化(包括多元实施模式的自动化)，从而通过运行算法来获得结果。申请人:已经证实，在一些实施方案中，利用单标记的探针和/或双标记的探针(该探针可以是通过从头合成方法产生的短探针(长度为10-20个子单元))而不利用1)酶处理的细胞透化、幻扩增技术(例如信号扩增或靶标扩增)和/或幻最大发射至少为650nm 的荧光标签就能确定完整革兰氏阳性细菌中的mRNA。在一些实施方案中，针对mRNA的探针的混合物可用来增强信号，其中预计细菌中的mRNA靶标的数量非常低。另外的优点是，在一些实施方案中，可以利用通过从头合成制备的短探针(与通过酶学方法制备的转录物探针相比)来确定细菌中的mRNA靶标。此外，在一些实施方案中，与下文列出的多篇参考文献所述的5-16小时相比，可以将探针杂交步骤缩短至少于2 小时。实际上，科技文献已经承认在革兰氏阳性细菌中检测mRNA的难度(参见上文“引言”部分中以下文章的相关论述Hahn et al. ,"Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes (通过利用地高辛标记的探针的全细胞杂交检测链霉菌细胞中的mRNA) ”，Applied and Environmental Microbiology,59(8) :2753-2757 (Aug. 1993) ；Wagner et al. ,"In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria(对利斯塔氏菌属中的毒力因子 mRNA 和 16S rRNA 的原位检测)”，FEMS Microbiol. Lett.，160(1) 159-168 (Mar. 1998)；禾口 Honerlage et al. ,"Detection of mRNA of nprM in Bacillus megaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization(通过全细胞杂交检测土壤中生长的巨大芽孢杆菌 ATTC 14581 中的 nprM mRNA) Arch. Microbiol.，163 :235-241 (1995)) 尽管所述文献涵盖了关于对革兰氏阳性细菌进行全细胞分析的普遍难题的多篇报道(以及尽管确定抗甲氧苯青霉素的细菌(例如MRSA)具有临床意义)，但是似乎还没有任何用于确定MRSA和/或MR-CNS的全细胞分析的实例。其原因可能在于，在完整的金黄色葡萄球菌中确定甲氧苯青霉素抗性性状的证据是非常难的。尽管如此，本发明的优点是能在全细胞分析形式中，利用针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针(与用于选定细菌的探针联合)确定样品中选定的革兰氏阳性细菌(视具体情况包括MRSA和MR-CNS)中的甲氧苯青霉素抗性性状。考虑到具有MRSA的患者在医院中的传播和治疗，本方法作为临床分析可以发挥很大的功效。全细胞分析形式的优点是能基于对样品的肉眼检查分析而确定样品中细菌的异质性/同质性。因此，本发明的优点是能通过实施本文所公开的方法而确定样品中细菌性状的异质性/同质性。对于其在患者医疗方面的临床意义而言，本优点在确定样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性的异质性/同质性方面被证实是特别有用的。
7.实施例根据以下的实施例可以进一步理解本发明的各个方面，这些实施例不应当解释为以任何方式限制本说明书的范围。实施例1 :MRSA的确定除非另外指出，所有的步骤都在室温(RT)下进行。杂交缓冲液(HB)、洗涤缓冲液 (WB)、多聚甲醛(PAF)、无RNA酶的透化溶液(PS)、封片剂(MM)的组成以及对各种细菌菌株 (例如金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌菌株)、在实施例1-4中所用的PNA探针和荧光显微镜(FM)的描述提供在附录I (下文)中。细胞生长、固定和透化将金黄色葡萄球菌接种于胰酶大豆肉汤(TSB)中，并于37°C过夜生长(16小时)。 然后用0. 5 μ g/mL苯唑西林在用TSB稀释(10倍)的过夜培养物中诱导MecA mRNA产生。 将苯唑西林诱导的细胞在无菌的2%葡萄糖溶液中稀释(20倍)，并通过细胞离心使其沉降于玻璃载玻片上。将沉降的细胞用10%多聚甲醛(PAF)固定30分钟(min)。然后，用含有0. IM甘氨酸的磷酸盐缓冲溶液(PBS，IOmM磷酸盐，pH = 7. 4，0.9% NaCl)将自由醛基封闭30分钟。然后用含有0.05%吐温20 (PBS-吐温)的PBS漂洗载玻片，并风干。然后将 0. 075mL无RNA酶的透化溶液(PS)加到沉积的细胞上，并孵育30分钟。孵育之后，用70% 的甲醇漂洗细胞，并风干。荧光原位杂交和荧光显微镜然后将25 μ L含有PNA探针(探针浓度参见下文)的杂交缓冲液(HB)加到载玻片上，并盖上盖玻片。然后使细胞在杂交室内于55°C下杂交2小时。杂交之后，在55°C下用洗涤缓冲液(WB)将载玻片洗涤30分钟。将一滴含有1 μ g/mL 4'-6- 二脒-2-苯基吲哚 (DAPI)的封片剂(MM)和一个盖玻片加到干燥的样本上，然后利用FM检验沉降在载玻片的细胞。探针浓度1) 5种荧光素标记的PNA探针的混合物(探针1、2、3、4和5 (参见以下的表1)，浓度分别为220、观0、120、95和79碰)。探针的总浓度是794nM。(载玻片A和C)2)单一荧光素标记的、大肠杆菌特异性的、针对rRNA的探针(探针6，浓度为 750nM)。其用作对照探针。(载玻片B)3)单一荧光素标记的PNA探针(探针2，浓度为750nM)。(载玻片D)4)单一荧光素标记的PNA探针(探针2，浓度为300nM)混合生物素标记的*PNA探针(探针7，浓度为5000nM)。对照实验中使用16. 6倍过量的未标记探针，以证明杂交的特异性。(载玻片E)*在这种情况下，探针被附带地标记上生物素。因为所述分析是以FISH分析的形式来进行，并且生物素是不发荧光的，所以该探针未标记探针的功能等同物。从FM分析获取的图像提供在

图1中，该图含有从5个载玻片(载玻片A_E)获取的图像。载玻片中一些(但不是所有)可见的集落被圆圈圈住(参见载玻片C和D的被圆圈圈住的部分)。当提供的图是黑白版本而不是彩色版本时，这应当有助于对载玻片的分析。在图1中进行检查的每个载玻片的条件如下A)MSSA 29213，用 5 种 PNA 探针(探针 1-5)探测；B) MRSA 43300，用针对大肠杆菌的探针(探针6)探针；OMRSA 43300，用 5 种 PNA 探针(探针 1-5)探测；D) MRSA 43300，用单一 PNA 探针(探针 2)探测；E)MRSA 43300，在16. 6倍过量的生物素标记的探针2 (即探针7)存在下，用单一 PNA探针(探针2)探测。结果参照图1来讨论本实施例的结果。在载玻片C和D中观察到绿色荧光细菌。该结果符合用一种PNA探针(载玻片D)或多种PNA探针(载玻片C)处理的(接触的)MRSA细菌的存在。在载玻片A中没有观察到细菌，其中葡萄球菌的细菌菌株(MSSA)不含有MecA基因(载玻片A)。用针对rRNA靶标的探针处理的MRSA细菌没有观察到信号，已知所述rRNA 靶标与大肠杆菌相关(载玻片B)。用标记的针对mRNA的探针(探针2、和远远过量的生物素标记(在功能上为未标记的)的相同探针(探针7)处理的MRSA细菌没有观察到信号 (参见载玻片E)。实施例2 金黄色葡萄球菌的PNA FISH除了以下指出的之外，细胞生长、固定和细胞透化按照实施例1中所描述的进行。荧光原位杂交和荧光显微镜将25yL HB加到载玻片上，并盖上盖玻片，所述HB含有一种四甲基罗丹明 (TAMRA)-标记的、金黄色葡萄球菌特异性的、针对rRNA的探针(探针8，浓度为500nM)以及5种荧光素标记的PNA探针(探针1-5，浓度如实施例1所述)。其余步骤按实施例1中所述进行。从FM分析获取的图像提供在图2的载玻片A1、A2、B1和B2中。载玻片中一些 (但不是所有)可见的集落用圆圈(载玻片A)或方框(载玻片B)圈住。当提供的图是黑白版本而不是彩色版本时，这应当有助于对载玻片的分析。在图像A-I和A-2中，相同的集落被圈在一起以简化比较。在图2中进行检查的每个载玻片的条件如下A-DMRSA 43300，双带滤光片B-DMSSA四213，双带滤光片A-2) MRSA 43300，FITC 滤光片B-2) MSSA 四213，FITC 滤光片结果参照图2来讨论本实施例的结果。根据TAMRA标记的探针8与其rRNA靶标的杂交，载玻片A-I和B-I中红色荧光染色的细菌证实金黄色葡萄球菌的存在。该结果是预期到的，因为MRSA和MSSA都是葡萄球菌。根据探针1-5与其各自靶标的杂交，载玻片A-2中绿色荧光染色的细菌提示MRSA的存在。A-I和A-2中的图像来自同一载玻片(使用不同的滤光片设置，即红色或绿色)，并且几乎来自该载玻片的同一截面，这可以通过可见集落的排列看出。载玻片B-2中绿色荧光染色的细菌的缺少表明该细菌不具有甲氧苯青霉素抗性。该(阴性)结果符合该分析中所用的MSSA细菌的性质，MSSA细菌不具有甲氧苯青霉素抗性。图像B-I和B-2是利用不同的滤光片设置(分别为红色或绿色)观察的同一载玻
40片的不同截面。实施例3 通过PNA FISH对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的同时双重(多元) 确定在本实施例中，制备MRSA 43300和MRSE 51625的混合物，并按下文所述用三种荧光滤光片进行检查。金黄色葡萄球菌细胞的生长和苯唑西林诱导按照实施例1所述进行。 但是，不用苯唑西林诱导表皮葡萄球菌细胞，因为这些细胞mRNA中的MecA mRNA是组成型表达。表皮葡萄球菌的生长基本按照实施例1中对金黄色葡萄球菌的描述。MRSA 43300和 MRSE 51625的细胞固定和透化按照实施例1所述进行。荧光原位杂交和荧光显微镜将杂交缓冲液加到具有MRSA 43300和MRSE 51625混合物的载玻片上，并盖上盖玻片，所述杂交缓冲液含有5种荧光素标记的PNA探针(探针1-5，浓度如实施例1所描述)、一种TAMRA标记的、金黄色葡萄球菌特异性的、针对rRNA的探针(探针8，浓度如实施例2所描述)和一种I^acific Blue标记的、表皮葡萄球菌特异性的、针对rRNA的探针(探针9，浓度为500nM)。其余步骤按实施例1中所述进行。从FM分析获取的图像提供在图3 的图像A-C中。这些图像是载玻片的同一截面。在每种情况下，仅改变荧光滤光片。这是多元分析的实例，因为独立确定了两种不同的选定细菌，并且还确定了单一样品中细菌的一种性状(甲氧苯青霉素抗性)。在这些图像中，视情况而定，一些(但未必是全部)可见的集落用圆圈(MRSA细菌)或方框(MRSE)圈住。当提供的图是黑白版本而不是彩色版本时，这应当有助于对载玻片的分析。在图像A中，MRSA细菌(圆圈内的)是橙色的，而MRSE细菌(方框内的)是绿色的。在图像B中，看不到MRSA细菌，而MRSE细菌(方框内的)是蓝色的。在图像C中， MRSA (圆圈内的)和MRSE细菌(方框内的)都是绿色的。结果参照图3来讨论本实施例的结果。在图像A(双带滤光片)中，可观察到橙色染色的细菌和绿色染色的细菌。在该图像中，MRSA由于探针1-5 (Flu标记的探针1-5)的绿色荧光和探针8 (TAMRA标记的、针对rRNA的、金黄色葡萄球菌特异性探针)的红色荧光的组合而呈现橙色。MRSE细菌只是绿色，因为它们不是金黄色葡萄球菌(即无TAMRA信号)。该图像(与图像C组合)提示，所有可见的细菌都是抗甲氧苯青霉素的。在图像B中，使用DAPI (蓝色)滤光片。在该图像中可观察到蓝色染色的MRSE细菌，探针9是用I^cific Blue标记的并且探测表皮葡萄球菌的rRNA靶标。在图像C中，使用FITC(绿色)滤光片。在该图像中，MRSA和MRSE细菌都呈现为绿色荧光染色。两种细菌都是绿色染色。如上文指出，图像A-C来自同一样品并且是大致相同的视野。因此，可以比较每幅图像中的细菌来直接确定它们在另一幅图像中是否能观察到。这允许根据简单的观察分析就能容易(并且有可能是自动化)地确定细菌及其性状。实施例4 利用PNA FISH和酪胺信号扩增(TSA)来增强对MRSA的确定荧光原位杂交和荧光显微镜MRSA 33591细胞的生长和苯唑西林诱导按实施例1所述进行。细胞固定和透化也按实施例1所述进行，但是在杂交之前，用75 μ L的TE缓冲液(Tris-HCl IOOmM, EDTA、IOmM, pH 8. 0)在80°C下处理载玻片5分钟。关于杂交，将25 μ L含有5种生物素标记的 PNA探针(探针11、12、13、14和15 (每种探针的浓度为ΙΟΟηΜ，总浓度为500ηΜ)的HB**加到一个载玻片上。在对照实验中，用一种生物素标记的、白色念珠菌(C. albicans)特异性的、针对rRNA的探针(探针10，浓度为500nM)来探测另一个载玻片。杂交和洗涤按实施例1所述进行。然后用从Molecular Probes (TSA Kit #25，Eugene, OR)购买的试剂按照生厂商的操作流程处理载玻片。具体而言，首先将载玻片上沉降的细胞与0. 075mL的封闭缓冲液(BB)孵育30分钟，然后与0. ImL稀释于BB中的链霉亲和素-HRP孵育30分钟。用 PBS-吐温洗涤(3 X 5分钟洗涤)之后，将细胞与0. 075mLAlexaFluor 594-标记的酪胺溶液孵育10分钟，并再次洗涤(3X5分钟洗涤)。然后将一滴MM和盖玻片加到风干的载玻片上，并通过FM来检查细胞。在图4中进行检查的每个载玻片的具体条件如下A) MRSA 33591，用1种针对rRNA的、白色念珠菌特异性的、生物素标记的PNA探针 (探针10)B)MRSA 33591，用5种生物素标记的PNA探针(探针11-15)"仅针对本实施例而言，将来自面包酵母的SigmaP/N R5636 (Iml)核糖核酸和 Trevigen, P/N 9600-5-D小牛胸腺DNA稀释(20 X)在杂交缓冲液中。结果参照图4来讨论本实施例的结果。图像中的一些(而不是全部)可见集落用圆圈 (图像B)圈住。当提供的图是黑白版本而不是彩色版本时，这应当有助于对载玻片的分析。图像B中强红色荧光染色的细菌证实使用探针11-15可以间接确定偶联有信号扩增的生物素标签。图像A中的样品是对照，其利用该样品中不存在的细菌的针对rRNA的探针。因此，图像A中观察不到细菌(与图像B的结果相比)表明MecA检测是特异性的， 并且正确扩增了信号。附录I细菌菌株的描述金黄色葡萄球菌ATCC 43300 (MRSA 43300)，抗甲氧苯青霉素的菌株；金黄色葡萄球菌ATCC 29213 (MSSA 29213)，甲氧苯青霉素敏感性菌株；表皮葡萄球菌ATCC 51625 (MRSE 51625)，抗甲氧苯青霉素的菌株；金黄色葡萄球菌ATCC 33591 (MRSA 33591)，抗甲氧苯青霉素的菌株。[ATCC 表示美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collections)，它是多禾中生物体的来源-参见查看 www. atcc. org/CulturesandProducts/Microbiology/ BacteriaandPhages/tabid/176/Default. aspx]缓冲液/溶液的组成杂交缓冲液(HB):50mM Tris-HCl pH = 7. 6 ；0. 1% (w/v)焦磷酸钠；IOmM NaCl ； 5mM 乙二胺四乙酸 EDTA)，10%硫酸葡聚糖 MW 500, 000 ；0. 2% (w/v)Ficoll 400K ；30% 甲酰胺；(v/v) Triton X-100 ；0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮MW 360 000 ；用水补足至 100%。洗涤缓冲液(WB):5mM Tris-HCl pH = 10. 0 ； 15mM NaCl ；0. 1 % (v/v)Triton X-100 ；用水补足至100%。无RNA 酶的透化溶液(PS) :50mM Tris-HCl pH = 7. 6 ；5mM MgS04 ；0. lmg/ml 溶葡萄球菌素；5mM TCEP (来自 Thermo Scientific，Rockford，II，产品号 77720)。溶液为新鲜制备。使用前，将溶液于65°C加热15分钟，并冷却至室温。10%多聚甲醛(PAF)将5g多聚甲醛分散于25ml去离子水中。添加^iil 2M的 NaOH之后，将溶液于55°C孵育，直到所有多聚甲醛粉末都溶解(偶尔手动搅拌)。然后通过添加 IOml 的 10XPBS 浓缩物(Sigma-Aldrich，Louis 的产品，Μ0，Ρ/Ν P7059)将溶液制成1 XPBS，并且量足够使总体积达到50ml。用2M HCl将溶液的pH调至3. 5。封闭缓冲液(BB)由Molecular Probes, Eugene, OR 的 TSA Kit#25 提供。封片剂(MM)=AdvanDx, Inc.，Woburn, MA ；产品号 CP 0023。PNA 探针PNA探针获自Panagene，Daejeon, Korea。所有的探针(除了探针7)都包含单一标签(参见表1的标签类型)。表1列举了使用的PNA探针的特征。通过化学重头合成的方法(不是通过转录)制备所有PNA探针(包括本文所公开的其它表格中列举的其它PNA 探针)。表 权利要求
1.方法，包括a)将包含细菌的样品与针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针接触，所述标记探针能确定与选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸，所述样品中选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可以具有所述选定的性状。b)确定所述样品中具有所述选定性状的细菌；其中，i)所述方法在全细胞上实施，并且ii)所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种都用单一标签或两种标签进行标记。
2.如权利要求1所述的方法，还包括将所述样品与能确定所述样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针接触，并确定所述样品中一种或多种所述选定的革兰氏阳性细菌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中仅用针对mRNA的标记探针实施步骤(a)。
4.如权利要求3所述的方法，其中用针对mRNA的标记探针的混合物实施所述方法。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中在不对所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和 /或针对天然质粒的标记探针的标签进行信号扩增的条件下实施所述方法。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是针对rRNA的。
7.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是基于抗体的。
8.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是针对mRNA的。
9.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是用标签标记的。
10.如权利要求9所述的方法，其中每种针对细菌的探针都是用单一标签或两种标签标记的。
11.如权利要求2-10中任一项所述的方法，还包括确定所述样品中也具有所述选定性状的选定革兰氏阳性细菌。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括在进行步骤(a)之前，将所述样品与 mRNA诱导剂接触。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所有的标签都是荧光标签，并且所述方法是荧光原位杂交(FISH)分析。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中不进行预杂交步骤。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括在进行步骤(a)之前，用RNA酶抑制剂处理所述样品。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述选定的性状与1)抗生素抗性、2) 毒素产生和/或幻毒力相关。
17.如权利要求16所述的方法，其中通过确定分别具有以下基因的细菌来确定所述选定的性状=DmecA基因或vanA或vanB基因、2) tcdB基因和/或3) IukF或IukS基因。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在不将所述样品与细胞透化剂接触的条件下实施所述方法。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述样品与以下接触1)能确定所述样品中第二选定的革兰氏阳性细菌的第二针对细菌的探针，和/或2)能确定与第二选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸的第二针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针，所述第二选定的性状可存在于所述样品的任何细菌内。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中直接确定所述针对染色体DNA的、针对 mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针的标签。
21.如权利要求1-2和5-20中任一项所述的方法，其中所述针对染色体DNA的、针对 mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针是PNA。
22.如权利要求1-2和5-21中任一项所述的方法，其中所述针对染色体DNA的、针对 mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针的长度为10至20个核碱基子单元。
23.方法，包括a)将样品与以下接触i)能确定所述样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的探针，和 )能确定所述样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性的针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针；b)确定所述样品中的一种或多种金黄色葡萄球菌；以及c)确定所述样品中具有甲氧苯青霉素抗性的一种或多种细菌；其中，i)所述方法在全细胞上实施，并且ii)步骤(b)和(c)以任意顺序进行或同时进行。
24.如权利要求23所述的方法，其中仅用能确定与甲氧苯青霉素抗性相关的mRNA的针对mRNA的标记探针实施步骤a-ii)。
25.如权利要求M所述的方法，其中用针对mRNA的标记探针的混合物实施所述方法。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针中的每一种都是用单一标签或两种标签标记的。
27.如权利要求23或沈所述的方法，其中在不对所述针对染色体DNA的和/或mRNA 的标记探针的任何标签进行信号扩增的条件下实施所述方法。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是针对rRNA的。
29.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是基于抗体的。
30.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是针对mRNA的。
31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中所述针对细菌的探针是用标签标记的。
32.如权利要求31所述的方法，其中每种针对细菌的探针都是用单一标签或两种标签标记的。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法，还包括根据步骤(b)和(c)中所做的确定，确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中在不将所述样品与细胞透化剂接触的条件下实施所述方法。
35.如权利要求23-34中任一项所述的方法，还包括α)将所述样品与能确定所述样品中的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的第二针对细菌的探针接触，其中所述第二针对细菌的探针可独立于能鉴定所述样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的标记探针而进行检测；β)确定所述样品中的一种或多种凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)；以及X)任选地，根据步骤(β)和(c)及任选的步骤(b)中所做的确定，确定所述样品中抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNQ，如果存在该细菌的话。
36.如权利要求35所述的方法，其中确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)。
37.如权利要求36所述的方法，其中同时确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)。
38.如权利要求23-37中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述样品表征为包含抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌 (MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的混合群体。
39.如权利要求23-38中任一项所述的方法，还包括在进行步骤(a)之前，将所述样品与mRNA诱导剂接触。
40.如权利要求23-39中任一项所述的方法，其中所有的标签都是荧光标签，并且所述方法是荧光原位杂交(FISH)分析。
41.如权利要求23-40中任一项所述的方法，其中不进行预杂交步骤。
42.如权利要求23-41中任一项所述的方法，还包括在进行步骤a-ii)之前，用RNA酶抑制剂处理所述样品。
43.如权利要求23和沈-42中任一项所述的方法，其中直接确定所述针对染色体DNA 和/或针对mRNA的标记探针的标签。
44.如权利要求23和沈-43中任一项所述的方法，其中所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针是PNA。
45.如权利要求23和沈-44中任一项所述的方法，其中所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的长度为10至20个核碱基子单元。
46.如权利要求23和沈-45中任一项所述的方法，其中使用信号扩增来直接地或间接地扩增所述针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针的标签的信号。
47.方法，包括a)将包含细菌的样品与针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针接触，所述标记探针能确定与选定的性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸，所述样品中选定的革兰氏阳性细菌和/或其它细菌可以具有所述选定的性状；以及b)确定所述样品中具有所述选定性状的细菌；其中，i)所述方法在全细胞上实施，并且ii)在不用细胞透化剂处理所述样品的条件下实施所述方法。
48.如权利要求47所述的方法，还包括将所述样品与能确定所述样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针接触，并确定所述样品中一种或多种所述选定的革兰氏阳性细菌。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中在不进行任何信号扩增的条件下实施所述方法。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述针对细菌的探针和所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种都用单一标签或两种标签标记，并且通过直接检测所述标签来进行所述确定。
51.包含能确定已知存在于细菌中的选定性状的针对mRNA的探针的混合物。
52.如权利要求51所述的混合物，其中所述混合物中针对mRNA的探针中的一种或多种是PNA探针。
53.如权利要求51所述的混合物，其中每种所述针对mRNA的探针与所述细菌的mRNA 分子内的靶标特异性结合，所述靶标与所述选定的性状相关。
54.如权利要求51所述的混合物，其中所述混合物中的每种所述针对mRNA的探针是单标记的探针或双标记的探针。
55.方法，包括a)将样品与针对染色体DNA和/或针对mRNA的标记探针接触，所述标记探针能确定所述样品中细菌的甲氧苯青霉素抗性；以及b)确定所述样品中具有甲氧苯青霉素抗性的一种或多种细菌；其中，所述方法在全细胞上实施。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述方法还包括将样品与能确定所述样品中的金黄色葡萄球菌的针对细菌的探针接触，并确定所述样品中的一种或多种金黄色葡萄球菌。
58.方法，包括a)将样品与以下接触i)能确定所述样品中选定的革兰氏阳性细菌的针对细菌的探针，和 )能确定与选定性状相关的染色体DNA、mRNA和/或质粒核酸的针对染色体DNA的、 针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针，所述样品中所述选定的革兰氏阳性细菌和/ 或其它细菌可以具有所述选定的性状；b)确定所述样品中的一种或多种革兰氏阳性细菌；以及c)确定所述样品中具有所述选定性状的细菌；其中，i)所述方法在全细胞上实施， )步骤(b)和(c)以任意顺序进行或同时进行，并且 iii)所述针对染色体DNA的、针对mRNA的和/或针对天然质粒的标记探针中的每一种包含单一标签或两种标签。
全文摘要
本申请涉及革兰氏阳性细菌全细胞分析的方法。所述方法能确定样品(例如，临床样品)是否包含一种或多种选定的革兰氏阳性细菌，以及确定例如所述样品中所述选定的革兰氏阳性细菌是否都不具有所选的目的性状、或部分细菌具有所选的目的性状或所有细菌都具有所选的目的性状，或者所述样品中可能存在的其它细菌具有所选的目的性状。在一些实施方案中，所述方法可用于确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素(选定的性状)的金黄色葡萄球菌(选定的革兰氏阳性细菌)、凝固酶阴性葡萄球菌(另一种选定的革兰氏阳性细菌)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。例如，可以通过原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、免疫细胞化学(ICC)或以上两种或更多种的任意组合进行全细胞分析。
文档编号C12Q1/68GK102439178SQ201080022002
公开日2012年5月2日 申请日期2010年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者何恩瑞克·斯戴恩德, 利萨·L·科利马斯, 安妮·K·I·拉斯缪森, 詹·纯诺夫斯凯 申请人:阿德万德克斯公司