使用细菌治疗癌症的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请根据美国法典第35编119(e)要求2013年1月2日提交的美国临时申请 61/748, 369的权益，其通过引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及包含革兰氏阴性细菌的组合物以及通过施用它们治疗癌症的方法。
【背景技术】
[0004] 在经历细菌感染的患者中观察到癌症消退的相关性并在至少早在1868年进行了 报道。报道活的减毒的沙门氏菌属生物体至具有实体瘤的动物的全身施用产生肿瘤治疗。 参见，如，美国专利第6, 685, 935 号以及Pawelek等人（Lancet Oncol. 4(9) :548-56,2003) 〇 另外，减毒的革兰氏阳性分支杆菌（BCG)的膀胱内（非全身）施用在美国批准用于治疗和 预防膀胱的原位癌（CIS)。
[0005] 针对某些营养缺陷型突变体，也已经报道使用活的革兰氏阴性沙门氏菌的肿瘤 治疗的改善。参见如，Hoffman等人，（Amino Acids 37:509-521，2009,美国专利公布 20090300779 (Zhao 等人）以及 Zhao 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 102 (3) : 775-760， 2005)〇
[0006] 已经制备在msbB基因座具有删除的沙门氏菌属，其在外膜中表达缺乏脂质A的末 端豆蔻酰化的LPS。用这些msbB-沙门氏菌属菌株处理的小鼠和猪中的TNFa诱导分别为 野生型细菌诱导的量的33%和14%。参见如，Low等人，Naturel7:37-41，1999以及美国专 利第7, 354, 592号（Bermudes等人）。已经报道此类活的生物体，包括菌株VNP20009的施 用抑制皮下植入的B16F10鼠黑素瘤以及人肿瘤异种移植物Lox、DLD-l、A549、WiDr、HTB177 和小鼠中生长的 MDA-MB-231 的生长（Luo 等人，Oncol. Res. 12(11-12) : 501-508, 2001)。也 已经报道沙门氏菌属菌株VNP20009在最大耐受剂量以及具有低-剂量节拍式方案两者处 改善化疗剂环磷酰胺的抗肿瘤效力（Jia等人，Int. J. Cancer 121 (3) : 666-674, 2007)。
[0007] 已经制备不能产生脂质A并且在外膜中缺乏LPS的革兰氏阴性细菌的条件突变 体，但也已经报道其对生物体有毒性。例如，3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo)的合成的突 变抑制或Kdo分子掺入脂质IVa的突变抑制防止脂质A和LPS合成并将LPS前体定位至革兰 氏阴性细菌的外膜。脂质IVaS缺乏糖基化的LPS前体。这些突变的激活导致细菌活力的丧 失（Rick 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA69 (12) : 3756-3760,1972, Belunis 等人，J. Biol. Chem. 270 (46) : 27646-27652,1995 以及 Taylor 等人，J. Biol. Chem. 275 (41) : 32141-32146， 2000)〇
[0008] 也可以通过使用外源加入的化合物抑制Kdo至脂质IVa的掺入、脂质A的合成以 及至外膜的定位。Goldman等人（J Bacteriol. 170(5):2185_91，1988)描述了抗菌剂，其 特异性抑制CTP: CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸胞苷酰转移酶活性，从而阻断2-酮3-脱 氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo)至革兰氏阴性生物体的脂质IVa的掺入。当LPS合成停止时， 发现结构上与脂质IVa类似的分子积聚并细菌生长停止。作者得出结论：将Kdo加入至LPS 前体脂质物质11为鼠伤寒沙门菌LT2和大肠杆菌（大肠杆菌）两者中脂质A-Kdo2形成的 主要途径。
[0009] 最近，已经制备在外膜中缺乏LPS，包括脂质A或6-酰基脂多糖但维持活力的 革兰氏阴性细菌的突变体。例如，美国专利公布2010/0272758报道了在3-脱氧-d-甘 露-辛-2-酮糖酸（Kdo)合成中存在缺陷的大肠杆菌K-12菌株KPM22。KPM22具有主要由 脂质IVa组成的外膜（OM)。通过存在促进由内膜至外膜的脂质IV^传输的次位抑制物实 现这些生物体的活力。报道该抑制物减轻内膜中脂质IVa积聚的毒性副作用并提供足量的 LPS前体以支持OM生物发生。通过该菌株产生的LPS前体缺乏内毒素活性，如通过在LPS 前体剂量为高达1 μ g/mL下不能诱导人单核细胞的TNF α分泌所确定。也参见，Mamat等 人（Mol Microbiol. 67(3): 633-48, 2008)。
[0010] 与感染和败血性休克相关的剂量限制性副作用显著地限制活细菌至癌症患 者的全身施用。该限制已经与野生型细菌相关（参见综述如，Wiemann和Starnes， Pharmac. Ther. 64:529-564,1994)，并且也已经与基因减毒的细菌相关，所述基因减毒 的细菌在肿瘤组织中选择性增殖并表达修饰的脂质A(参见如，Toso等人，J. Clin. Oncol. 20 (1) : 142-152, 2002)。这些限制已经导致使用加热杀死的细菌用于癌症治 疗。参见如，Havas 等人（Med. Oncol. &Tumour Pharmacother. 10 (4): 145-158,1993)， Ryoma 等人（Anticancer Res. 24:3295_3302,2004)，Maletzki 等人（Clin. Develop. Immunol. 2012:1-16,2012)，美国专利第 8,034, 359B2 号（Gunn)，欧洲专利第 EP 1，765, 391B1 号（Gunn)以及综述 Wiemann 和 Starnes (Pharmac. Ther. 64:529-564,1994) 〇 然而，非传染性、杀死的细菌仍诱导与LPS-来源的内毒素和其它细胞组分相关的显著剂量 限制性毒性，其为热原的并且可产生败血性休克的症状。因此，需要用细菌治疗癌症的进一 步改善。
【发明内容】
[0011] 本文提供了用于治疗被诊断为患有癌症的哺乳动物（如，人）中癌症的组合物和 方法，其通过向该哺乳动物施用一定数量的革兰氏阴性细菌进行，其中所述细菌（i)在哺 乳动物中为非活性或大体上非活性，（ii)内毒素活性和/或致热原性显著降低，并且（iii) 以足以抑制癌症生长或转移潜能的量施用。在一些实施方式中，在施用于哺乳动物前通过 用以下处理使革兰氏阴性细菌变成非活性或大体上非活性：（i)辐射，（ii)化学杀菌剂， (iii)使内毒素失活的抗生素（如，多粘菌素 B或多粘菌素 E)，或（iv)破坏KD02-脂质IVa生物合成的抗生素。可选地或除任何一种或多种上述处理之外，革兰氏阴性细菌还包括破 坏或部分破坏KD02-脂质IVa的生物合成或防止KD02-脂质IV 4的0-酰化的遗传缺陷。破 坏或部分破坏KD02-脂质1￥4的0-酰化的遗传缺陷包括，例如，在功能上破坏msbB和IpxM 基因座的缺陷。
[0012] 在本公开的一方面中，组合物包含内毒素活性和/或致热原性显著降低的大体上 非活性革兰氏阴性细菌和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方式中，通过用戊二醛处理 使革兰氏阴性细菌非活性。在另一实施方式中，通过用多粘菌素 B或多粘菌素 E处理降低 内毒素活性和/或致热原性。在另一实施方式中，通过用戊二醛处理降低内毒素活性和/ 或致热原性。
[0013] 在另一方面中，提供了治疗被诊断为患有癌症的哺乳动物的方法，其包括施用一 定数量的内毒素活性和/或致热原性显著降低的大体上非活性革兰氏阴性细菌，其中施用 的量足以抑制癌症的生长或转移。
[0014] 在另一方面中，本公开提供了用于治疗被诊断为患有癌症的哺乳动物（如，人）的 癌症的方法，其通过向该哺乳动物施用一定数量的革兰氏阴性细菌进行，其中所述细菌为 活的，可以为或可以不为减毒的且具有导致细菌外膜内的多糖显著丧失或全部丧失的遗传 缺陷并且其中施用的量足以抑制癌症的生长或转移潜能。
[0015] 在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向被诊断 为患有癌症的哺乳动物施用一定数量的具有导致细菌外膜内的脂多糖显著丧失的遗传缺 陷的活性或非活性革兰氏阴性细菌生物体，其中施用的量足以抑制癌症的生长。
[0016] 在一些实施方式中，遗传缺陷破坏或部分破坏KD02-脂质IVa的生物合成或防止 KD02-脂质IV^ O-酰化。
[0017] 在一些实施方式中，癌症为实体瘤。
[0018] 在其它实施方式中，向哺乳动物进一步施用化疗剂，包括，例如，环磷酰胺。在其它 实施方式中，向哺乳动物进一步施用抑制免疫功能的受体的诘抗剂或受体激动剂，包括，例 如，抑制T细胞受体或T细胞受体配体（如，CTLA-4、PD-1、I3D-Ll和TO-L2)的功能。
[0019] 在其它实施方式中，向哺乳动物进一步施用刺激免疫功能的受体的激动剂，包括， 例如，刺激T细胞受体的激动剂。合适的受体靶标包括，例如，GITR、4-1BB、⑶40和0X40。
[0020] 在其它实施方式中，向哺乳动物进一步施用刺激免疫功能的细胞因子，包括，例 如，干扰素 α、干扰素 β、干扰素 γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-2和白 细胞介素-12。
[0021] 在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌为沙门氏菌或埃希氏菌。
[0022] 在另一实施方式中，本公开提供了通过用多粘菌素 B和戊二醛处理细菌来杀伤并 降低革兰氏阴性细菌的内毒素活性和/或致热原性的方法。在一个实施方式中，活力降至 0 %并且内毒素活性或致热原性降低约90 %或96 %。
【附图说明】
[0023] 图1和图2示出大肠杆菌与多粘菌素 B(PMB)的温育降低了细菌细胞相关的内毒 素活性和细胞活力的水平。这在实施例2中进一步描述。
[0024] 图3和图4示出大肠杆菌与戊二醛（GA)的温育降低了细菌细胞相关的内毒素活 性和细胞活力的水平，如在实施例3中进一步描述。
[0025] 图5描绘了未处理的（图5A)、用1，000 μ g/mL PMB处理的（图5B)、用1 % GA处 理的（图5C)或用PMB和GA两者处理的（图5D)大肠杆菌的透射电子显微镜图，其说明了 在所有处理之后细菌保持完整，如在实施例4中进一步描述。
[0026] 图6描绘了显示PMB+GA-处理的大肠杆菌对小鼠中皮下鼠 B16F10黑素瘤的生长 的剂量依赖效应的图，如在实施例7中进一步描述。
[0027] 图7示出未处理的和1 % GA-处理的大肠杆菌对小鼠中皮下鼠 B16F10黑素瘤的生 长的剂量依赖效应的图，如在实施例8中进一步描述。
[0028] 图8A和图8B阐明示出在不含和含有节拍性环磷酰胺（图8A)或抗-鼠 CTLA-4 抗体（图8B)的情况下PMB+GA-处理的大肠杆菌对小鼠中皮下CT26鼠结直肠癌的生长的 剂量依赖效应的图，如在实施例9中进一步描述。
【具体实施方式】
[0029] 本文提供了包含非活性革兰氏阴性细菌生物体并且内毒素和/或热原活性显著 降低的组合物以及治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的哺乳动物施用一定数量的 内毒素或热原活性显著降低的非活性革兰氏阴性细菌生物体，其中施用的量足以抑制癌症 的生长或转移。
[0030] 负责细菌介导的抗肿瘤活性的可能机制包括活细菌生物体在肿瘤组织中的选择 性增殖以及宿主免疫响应的刺激，特别是经由LPS(内毒素）-介导的来自宿主单核细胞的 杀肿瘤细胞因子释放的诱导。然而，可以认为，活细菌的增殖以及LPS (内毒素）-介导的细 胞因子的诱导（甚至用通过msbB突变而减毒的LPS)负责与用活细菌治疗哺乳动物相关的 剂量限制性毒性。Toso等人（J. Clin. Oncol. 20(1) : 142-152, 2002)用活的msbB-减毒的沙 门氏菌治疗癌症患者并且剂量限制性毒性包括菌血症和与细胞因子释放相关的副作用。细 菌在肿瘤组织中的增殖低于小鼠中见到的人肿瘤异种移植模型并且对细胞因子-介导的 毒性的敏感性高于小鼠中见到的人肿瘤异种移植模型。可以认为，活细菌的全身性增殖和 /或由缺乏一个仲酰基链的LPS部分介导的细胞因子相关的毒性可以防止将安全且有效剂 量的活的、减毒的革兰氏阴性细菌施用于除小鼠之外的一些哺乳动物（诸如人），已知所述 小鼠相对而目耐细菌感染以及细胞因子诱导的相关败血症后果。
[0031] 尽管不希望受理论束缚，但可以认为，可将具有大体上降低的内毒素活性和/或 致热原性的杀死的或非活性革兰氏阴性生物体以与使用活的或活性生物体相比毒性较低 且治疗癌症更有效的量施用于癌症患者，所述活的或活性生物体以从业者不能控制的或增 殖不足以产生治疗效果或增殖太多的可变方式在每名患者的正常组织和肿瘤组织中