ID NO: 37)用作结合HLA-A26型的对照肽，HIV衍生的肽（RLRDLLLIVTR) (SEQ ID NO: 38)用作结 合HLA-A3超型等位基因分子的对照肽。使用二甲亚砜使剂量为10 μ g/ml的肽完全溶解。
[0046] HLA-A3超型中所包括的5个HLA-A等位基因有共同的结合基序，但是HLA-A3 或HLA-A68. 1阳性的日本人个体十分罕见。因此，在本研宄中，检测了肽结合HLA-A11、 HLA-A31和HLA-A33分子的能力。
[0047] 患者（PT) 本研宄包括其 HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26、HLA-A11、HLA-A31 和 HLA-A33 中的任一种 HLA呈阳性的癌症患者。
[0048] 健康供体（HD) 健康供体包括了 HLA-A2阳性患者、HLA-A24阳性患者、HLA-A26阳性患者、HLA-All阳 性患者、HLA-A31阳性患者和HLA-A33阳性患者。
[0049] 由其采集PBMC的全部患者和健康供体都未感染HIV。从患者/健康供体中采集20 毫升外周血，通过菲可（Ficoll)-康锐（Conray)梯度离心制备PBMC。将全部样品在低温 下保存，直到用于实验。使用下列抗体通过流式细胞术证实了 HLA-A2、HLA-A24、HLA-A11、 HLA-A31和HLA-A33分子在PBMC中的表达：抗HLA-A24单克隆抗体（mAb)、抗HLA-A2 mAb、抗 HLA-A26 mAb、抗HLA-All mAb、抗 HLA-A31 mAb、抗HLA-A33 mAb (所有均获自 One Lambda， CA，USA);以及FITC缀合的抗小鼠免疫球蛋白G (IgG) mAb。
[0050] 细朐系 表达 HLA-A2 的 T2 细胞获自 ATCC (CRL-1992)。C1R-A24、C1R-A26、C1R-A11、C1R-A31 和 C1R-A33 是 ClR 亲本细胞系分别用 HLA-A24、HLA-A26、HLA-A11、HLA-A31 和 HLA-A33 基 因转染以表达相应 HLA 分子的细胞（Takedatsu 等，Clin Cancer Res 2004 ;10:111220)〇 ClR亲本细胞是人B淋巴母细胞（HMy2. CIR :人B淋巴母细胞；ATCC CRL-1993)，并属于用 γ射线照射HMy. 2 B类淋巴母细胞细胞系，通过抗体和补体选择表达MHC I类-04并缺乏 HLA I-A 类和 HLA I-B 类的细胞所得到的细胞系（Storkus WJ, Alexander J, Payne JA, Dawson JR和 Cresswell P, Procnatl acad sci USA, 86:2361-2364， 1989)〇
[0051] RMA-S-A2601是通过将HLA-A2601基因导入RMA-S细胞后所产生的稳定转染细胞 (RM-S细胞是一种作为变异体RMA细胞分离出来、显示MHC I类分子在细胞膜上低表达的 细胞：Karre K, Ljunggren H-G, Piontek G和Kiessling R. 1986, Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggest alternative immune defence strategy (H-2-缺陷型淋巴瘤变异体的选择性排斥表明替代免疫防御策略），Nature (Lond) 319: 675) 〇
[0052] PC-93是前列腺肉瘤细胞系，为HLA-Al 1阴性。TSU-PR是前列腺癌细胞系，为 HLA-All阳性。SQ-I是肺癌细胞系，为HLA-All阴性。C0L0-201是结肠癌细胞系，为HLA-All 阳性。LC-I是肺癌细胞系，为HLA-A31/HLA-A33阳性。将所有这些肿瘤细胞系在含有10% FCS 的 RPMI 1640 (Invitrogen)中进行培养。
[0053] PBMC中肽反应件CTL的诱导 对以前报告的方法略作修改以检出肽反应性CTL (Hida N，Maeda Y，Katagiri K， Takasu H, Harada M, Itoh K. , Cancer Tmmunol Immunother 2002; 51:219-28)。将按常 规方法由各个患者（PT)和健康供体（HD)中获得的PBMC在体外用相应的肽或对照肽刺激。 将所得的肽刺激的PBMC与经肽（与用于刺激PBMC的肽相同）脉冲处理过的T2、C1R-A24、 C1R-A26、C1R-A11、C1R-A31或C1R-A33细胞共培养后，测定所产生的用作CTL诱导标志的 IFN-γ的量。
[0054] 具体地讲，在U型底96孔微量培养板（Nunc，Roskilde，Denmark)中的200 μ 1培 养基中，按一组4孔将PBMC (I X IO5个细胞/孔）与肽的每一种（10 μ 1/ml) -起孵育。 培养基由 45% RPMI 1640、45% AM-V 培养基（Gibc〇-BRL，Gaithersburg，MD)、10% FCS、100 U/ml白介素-2 (IL-2)和0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液（Gibco-BRL)组成。每3天取出 一半培养基后，用含有相应肽（10 μ g/ml)的新鲜培养基替换。培养后第15天，将一半培 养细胞与经相应肽脉冲处理过的T2、C1R-A24、C1R-A26、C1R-A11、C1R-A31或C1R-A33细胞 相混合，另一半与经相应对照肽脉冲处理过的T2、C1R-A24、C1R-A26、C1R-A11、C1R-A31或 C1R-A33细胞相混合。将各种混合的培养物再孵育18小时。然后，收集上清液，通过酶联免 疫吸附测定法（ELISA)测定上清液中干扰素（IFN)-Y的水平。与经相应对照肽脉冲处理 过的细胞相比，当在响应经相应肽脉冲处理过的细胞时P值小于〇. 05且产生超过50 pg/ml 的IFN-γ时，肽反应性CTL的诱导被认定为阳性。
[0055] 细朐毒活件的测宙 通过标准6小时51Cr释放测定法测定了肽刺激的PBMC针对HLA-Al 1阳性细胞系TSU-PR 和HLA-All阴性细胞系PC93的细胞毒活性。使用衍生自HLA-All阳性健康供体的植物凝 集素（PHA)激活的T细胞作为阴性对照细胞。在圆底96孔板中，按效应细胞与靶细胞的规 定比率，将2, 000个细胞/孔的51Cr标记的靶细胞与效应细胞一起培养。在临测定细胞毒 活性实验之前，使用⑶8阳性分离试剂盒（Dynal，Oslo, Norway)，从肽刺激的PBMC中分离 出CD8阳性T细胞，所获得的细胞用作效应细胞。将从实验中得到的c. p. m.减去自发释放 的c. p. m.，计算得到特异性51Cr释放。从不存在效应细胞培养的样品上清液中测定自发释 放，随后样品用 1% 曲通X (Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)培养以测定总 释放。
[0056] 肽与HLA-A26分子的结合试骑 将用HLA-A2601基因转染的RMA-S细胞（RMA-S-A2601)在26°C下培养20小时，接着与 浓度为〇. 1-100 μ M的各种肽及人β 2-微球蛋白一起在26°C下培养2小时，然后在37°C 下再培养3小时。细胞用PBS洗涤后，向细胞中加入最适浓度的抗人MHC I类抗体或HLA 类型特异性抗体后，放置在冰中30分钟。细胞用PBS洗涤2次，然后加入Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG，使之在冰中静置30分钟。使用流式细胞仪进行了测量，并对荧光强 度进行了比较。
[0057] 肽是否能够诱导多种HLA类塑的HLA限制件CTL的检测 从过去已鉴定的癌症肽疫苗的候选肽中，在总共34种肽中选出与HLA-A2、HLA-A24和 HLA-A3超型结合的肽（分别为9种、13种和10种肽），并检测这些肽诱导其类型不同于被 最初证实每种肽与之结合的HLA的HLA限制性CTL的能力。得自具有不同HLA类型的患者 的外周血用相应的肽刺激，通过使用经肽脉冲处理过的细胞（相当于通过转染每个类型的 HLA基因所产生的ClR转染细胞）作为靶标，来测定诱导CTL的能力。
[0058] 在HLA-A24结合肽中，首先用如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 8所示的肽检查了交 叉反应性。EGFR-800 (SEQ ID NO: 1)诱导 HLA-All 的 HLA 限制性 CTL，Lck-488 (SEQ ID NO: 3)诱导 HLA-A2 的 HLA 限制性 CTL，SART2-93 (SEQIDN0: 7)诱导 HLA-A2 和 HLA-All 的 HLA 限制性 CTL，以及 SART3-109 (SEQ ID NO: 8)诱导 HLA-A2、HLA-All 和 HLA-A31 的 HLA限制性CTL (表2)。该表中，数字表示IFN-γ水平（ng/ml)，其中水平等于或大于50 ng/ml视为显著。空白项表示未进行实验，减号（-)表示IFN-γ的水平在检出限以下。
[0059] 表 2 表 2 :HLA-A24 结合肽诱导 HLA-A2、HLA-A11、HLA-A31 或 HLA-A33 的 HLA 限制性 CTL 的 能力
同样，在HLA-A2结合肽中，用如SEQ ID NO: 9~SEQ ID NO: 16所示的肽检查了交叉 反应性。发现 CypB-128 (SEQ ID NO: 15)能够诱导 HLA-A24 的 HLA 限制性 CTL，Lck-246 (SEQ ID NO: 10)能够诱导 HLA-All 和 HLA-31 的 HLA 限制性 CTL，Lck-422 (SEQ ID NO: 16)能够诱导 HLA-A31 的 HLA 限制性 CTL，ppMAPkkk (SEQ ID NO: 11)能够诱导 HLA-Il 和 HLA-A31 的 HLA 限制性 CTL，WHSC2-103 (SEQ IDNO: 12)能够诱导 HLA-A24 和 HLA-A31 的 HLA 限制性 CTL，UBE-43 (SEQ IDN0: 13)能够诱导 HLA-A24 和 HLA-A31 的 HLA 限制性 CTL， 以及 HNRPL-501 (SEQ ID NO: 14)能够诱导 HLA-A24 和 HLA-All 的 HLA 限制性 CTL (表 3)。该表中，数字表示IFN-γ水平（ng/ml)，其中水平等于或大于50 ng/ml视为显著。
[0060] 表 3 表3 :HLA-A2结合肽诱导HLA-A24、HLA-All或HLA-A31的HLA限制性CTL的能力
另外，在HLA-A3超型结合肽中，用如SEQ ID NO: 17~SEQ ID NO: 27所示的肽检查 了交叉反应性。发现β-微管蛋白5-154 (SEQ ID NO: 18)能够诱导A24的HLA限制性 CTL，Lck-90 (SEQ ID NO: 19)能够诱导 A2 的 HLA 限制性 CTL，IEXl-47 (SEQ ID NO: 22) 能够诱导A24的HLA限制性CTL，以及SART3-511 (SEQ ID NO: 23)能够诱导A2的HLA限 制性CTL (表4)。该表中，数字表示IFN-γ水平（ng/ml)，其中水平等于或大于50 ng/ml 视为显著。
[0061] 表 4 表4 :HLA-A3结合肽诱导HLA-A2或HLA-A24
的HLA限制性CTL的能力 不同的HLA-A3-轺塑限制件细朐毒活件 SART3-109 (SEQ ID NO: 8)，一种已知结合HLA-24的肽，用来刺激得自HLA-All阳性 前列腺癌患者的PBMC以诱导CTL。所得CTL的细胞毒活性在铬释放反应中得到证实。至 于针对HLA-All阳性细胞系TSU-PR的细胞毒活性，与HLA-All阴性细胞系PC93以及得自 HLA-Al 1阳性健康供体的PHA刺激的淋巴母细胞相比，针对TSU-PR细胞系的铬释放速率显 著较高（图1)。
[0062] 肽与HLA-A26的结合试骀 对结合RMA-S-A2601的各种肽的能力进行了检测。将肽溶于DMSO后使用。仅DMSO用作 阴性对照。从这些实验结果来看，显示出能够诱导HLA-A24限制性的CTL的SART3-109 (SEQ ID NO: 8)也与属于完全不同HLA超型的HLA-A26结合。同样，研宄表明同样是HLA-A24限 制性的EGFR-800