(SEQ ID NO: 1)也与HLA-A26分子结合，虽然水平较低（图2)。
[0063] Lck-90和Lck-449肽与HLA-A3轺塑等位基闵的结合能力 数据表明 Lck-90 (SEQ ID NO: 19)和 Lck-449 (SEQ ID NO: 17)肽结合 HLA-A3 超型 等位基因的能力如下，正如专利文献9中所公开的一样。
[0064] 对于Lck-90和Lck-449肽已经证实的是，在HLA-A3阳性前列腺癌患者血浆中 非常频繁地观察到肽反应性IgG。同样，由得自HLA-A3超型等位基因阳性前列腺癌患者 的PBMC诱导Lck-90和Lck-449肽特异性CTL的能力通过上述方法得到证实。Lck-90和 Lck-449肽分别诱导与以下相应肽的反应性CTL :得自7名HLA-All阳性癌患者中的5名和 2名患者、5名HLA-A31阳性癌患者中的3名和3名患者、以及5名HLA-A33阳性癌患者的 2名和3名患者的PBMC的相应肽。
[0065] 得自HLA-A3超型等位基因阳性前列腺癌患者的PBMC在体外用Lck-90 (SEQ ID NO: 19)或Lck-449 (SEQ ID NO: 17)肽刺激以检测肽反应性CTL是否因此诱导针对癌 细胞的细胞毒活性。比起针对HLA-A11阴性COLO 201细胞和阴性对照即得自HLA-A11 阳性健康供体的PHA刺激的幼稚T细胞母细胞，得自HLA-All阳性患者分别用Lck-90和 Lck-449肽刺激的PBMC具有较高水平的针对HLA-A11阳性SQ-1细胞的细胞毒活性。同 样，观察到这些肽能够从得自HLA-A31阳性患者和HLA-A33阳性患者的PBMC中诱导LC-I (HLA-A31+/-A33+)反应性CTL。比起C0L0 201细胞或幼稚T-细胞，每种肽的特异性CTL都 具有针对LC-I细胞较强的细胞毒活性。因此，研宄表明在体外用Lck-90和Lck-449肽刺 激的PBMC以HLA-A11、HLA-A31和HLA-A33限制性方式对癌细胞发挥细胞毒活性。
[0066] 细朐毒活件的测宙 得自具有各种HLA类型的癌症患者的PBMC用肽刺激以检测肽诱导针对各HLA类型的 CTL的活性。使用各具有与每名患者HLA类型相应的HLA类型的癌细胞系作为靶细胞，通过 标准6小时51Cr释放测定法测定针对靶细胞的细胞毒活性。
[0067] 用于该测定法的靶细胞是下列癌细胞系：PC93 (A68)、KE4 (A24/A26)、KE5 (A1101/)、PC93-A24 (A24/A68)、PC93-A33 (A33/A68)、PC93-A31 (A31/A68)、C0L0 201 (A0101/0201)、ll-18 (A0201/A2402)、TSU-PR (All)、LC-I (A3101/A3303)、Panc-I (A0201/A1101)、LC-1 (A3101/A3303)、LC65A (1101/2402)、LNCap-All (A11/A0101/0201)、 KNS42 (A2402/2601)、LNCap-A24 (A24/A0101/0201)和 LNCap-A31 (A31/A0101/0201)。 使用 QG56 (A2601)、PC93 (A68)、LNCap (A0101/0201)、LC-I (A3101/A3303)、COLO 201 (A0101/0201)、C0L0 320 (A2402/)和K562作为阴性对照。括号内表示各个细胞系的HLA 类型。有关上述方面，意思是指PC93 (WT)表达HLA-A68,且例如当靶细胞表示为PC93-A24 时，是指导入HLA-A24编码基因所产生的稳定转染细胞。所有肿瘤细胞系都在含有10% FCS 的RPMI 1640 (Invitrogen)中培养。在表示结果的表5中，HLA仅表示转染细胞，" (WT) " 则表示非转染细胞。
[0068] 在表示结果的表5中，按照同样方法，使用HLA类型不同于从中得到PBMC的癌症 患者的HLA类型的肿瘤细胞系作为阴性对照靶细胞，检测由肽激活的PBMC介导的细胞毒活 性，当观察到比起针对阴性对照靶细胞的细胞毒活性，针对HLA配型靶细胞的细胞毒活性 有统计显著性时，则认为发生了所述HLA类型的HLA限制性细胞毒活性的诱导，用" + "标注。 表5表示用于试验的HLA配型靶细胞和对照靶细胞。当各类细胞未记录在该表中，并标注 为" + "，它是指用于诱导指定HLA类型的HLA限制性CTL的肽活性是已知的。
[0069] 对于作为HCV衍生肽的C35-44 (SEQ ID NO: 25)的肽特异性CTL活性，按照常规 方法，使用用C35-44肽刺激得自HCV感染患者的PBMC所得到的细胞，并使用用各相应HLA 基因稳定转染并用C35-44经脉冲处理过的ClR细胞作为HLA配型靶细胞，ClR (WT)作为 阴性对照靶细胞，在铬释放反应中测定该肽的活性。
[0070] 在圆底96孔板中，将2, 000个细胞/孔的51Cr标记的靶细胞与效应细胞（效应细 胞与靶细胞之比为40) -起培养。在临测定细胞毒活性实验之前，使用CD8阳性分离试剂 盒（Dynal，Oslo, Norway)，从肽激活的PBMC中分离出CD8阳性T细胞，所获得的细胞用作 效应细胞。将从实验中得到的c. p. m.减去自发释放的c. p. m.，计算得到特异性51Cr释放。 从不存在效应细胞培养的样品上清液中测定自发释放，随后样品用1%曲通X (Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)培养以测定总释放。
[0071] 分别在使用针对HLA I类和CD8的单克隆抗体的特异性抑制实验以及在使用未标 记革巴细胞的未标记革巴标抑制实验（cold-target suppression experiment)中，鉴定出经 诱导的HLA限制性CTL的HLA类型和肽特异性。这些实验按一式三份进行，当与阴性对照 相比时，观察到用抗体或未标记靶标（未用同位素标记的靶细胞）的抑制为显著水平（P〈 0.05)时，视为阳性，用" + "表示。
[0072] 结果 HLA-A2结合肽 实验表明，C35-44 (SEQ ID NO: 25)具有诱导 HLA-A2402、HLA-A2601、HLA-A3101、 HLA-A3303 和 HLA-A1101 的 HLA 限制性 CTL 的能力。
[0073] 实验表明，CypB-129 (SEQ ID NO: 15)、Lck-422 (SEQ ID NO: 16)、SART3-302 (SEQ ID NO: 9)、UBE-43 (SEQ ID NO: 13)和 WHSC2-103 (SEQ ID NO: 13)具有诱导 HLA-A3101的HLA限制性CTL的能力。
[0074] 实验表明，HNRPL-5Ol (SEQ ID NO: 14)和 ppMAPkkk-4：32 (SEQ ID NO: 11)具有 诱导HLA-2601的HLA限制性CTL的能力。
[0075] HLA-A24 结合肽 实验证实，SART3-109 具有诱导 HLA-A3101、HLA-A3303 和 HLA-A1101 的 HLA 限制性 CTL的能力，Lck208具有诱导HLA-A1101的HLA限制性CTL的能力，EGRF-800具有诱导 HLA-A0201的HLA限制性CTL的能力，SART2-93具有诱导HLA-A0201和A0207的HLA限制 性CTL的能力。
[0076] HLA-A3 结合肽 实验表明，PAP-155具有诱导HLA-A0201和HLA-A2402的HLA限制性CTL的能力、 β -tubline-309和Lck-90具有诱导HLA-A2402的HLA限制性CTL的能力。这些结果概括 于表5中。
[0077] 根据上述结果可以理解，本发明所具体描述的如SEQ ID NO: 1-27所示的肽可以 在两个以上选自以下患者群的患者体内诱导HLA特异性CTL :HLA-A2阳性患者群、HLA-A24 阳性患者群、HLA-A26阳性患者群和HLA-A3超型阳性患者群，因此适用于对这类患者进行 治疗或预防。本发明如SEQ ID NO: 1-24和SEQ ID NO: 26-27所示的肽特别适合用作癌 症肽疫苗的活性成分，本发明如SEQ ID NO: 25所示的肽适用于治疗或预防丙型肝炎病毒 相关疾病。
【主权项】
1. 一种或多种肽在制备用于在HLA-A3超型阳性患者群中治疗或预防癌症的细胞毒 性T淋巴细胞（CTL)诱导剂组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自SART3-302(SEQ IDNO: 9)、Lck-246(SEQIDNO: 10)、ppMAPkkk-432(SEQIDNO:ll)、UBE-43(SEQID NO: 13)、HNRPL-501(SEQIDNO: 14)、CypB-129(SEQIDNO: 15)、和Lck-422(SEQID NO: 16)。2. -种或多种肽在制备用于在HLA-A24阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱导剂 组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自UBE-43(SEQIDNO: 13)、HNRPL-501(SEQ IDNO: 14)、和CypB-129(SEQIDNO: 15)。3. -种或多种肽在制备用于在HLA-A26阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱 导剂组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自PpMAPkkk-432(SEQIDNO: 11)和 HNRPL-501(SEQIDNO: 14)〇4. 一种或多种肽在制备用于在HLA-A3超型阳性患者群中治疗或预防癌症的细胞毒 性T淋巴细胞（CTL)诱导剂组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自EGFR-800(SEQ IDNO:l)、Lck-208(SEQIDNO: 2)、SART2-93(SEQIDNO: 7)、和SART3-109(SEQID NO: 8)。5. -种或多种肽在制备用于在HLA-A2阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱导剂组 合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自EGFR-800(SEQIDNO:l)、Lck-488(SEQID NO: 3)、SART2-93(SEQIDNO: 7)、和SART3-109(SEQIDNO: 8)。6. -种或多种肽在制备用于在HLA-A26阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱导 剂组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自EGFR-800(SEQIDNO: 1)和SART3-109 (SEQIDNO: 8)。7. -种或多种肽在制备用于在HLA-A24阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱导 剂组合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自0-微管蛋白5-154(SEQIDNO: 18)、 Lck-90(SEQIDNO: 19)、IEXl-47(SEQIDNO: 22)、PAP-155(SEQIDNO: 26)、和 0 -tubuline-309(SEQIDNO: 27)〇8. -种或多种肽在制备用于在HLA-A2阳性患者群中治疗或预防癌症的CTL诱导剂组 合物中的用途，其中所述一种或多种肽选自Lck-90(SEQIDNO: 19)、SART3-511(SEQID NO: 23)、和PAP-155(SEQIDNO: 26)。
【专利摘要】本发明提供了CTL诱导剂组合物，所述组合物包含选自序列表中如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 27所示的肽中的至少一种肽，并且可用于在两个以上选自以下的患者群中治疗或预防癌症或丙型肝炎病毒相关疾病：HLA-A2阳性患者群、HLA-A24阳性患者群、HLA-A26阳性患者群和HLA-A3超型阳性患者群。
【IPC分类】A61P1/16, A61K39/00, A61P35/00, A61P31/14, A61K38/00
【公开号】CN104922650
【申请号】CN201510354406
【发明人】伊东恭悟, 七条茂树, 山田亮
【申请人】株式会社绿多肽
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2008年9月12日
【公告号】CA2697896A1, CN101854945A, CN101854945B, EP2196209A1, EP2196209A4, EP2801367A1, US9102715, US20100278851, US20150343041, WO2009038026A1