[0037] 本发明还提供了一种监测其中施用BMP-6拮抗剂的治疗的方法，所述方法包括： 使来自已经施用了 BMP-6拮抗剂的人的生物样品与特异性结合BMP-6的抗体在适合于所述 抗体与人BMP-6结合的条件下接触；和定量与所述抗体结合的BMP-6,其中如在（b)中所定 量的血清BMP-6水平的量的变化指示BMP-6拮抗剂的功效。在具体的实施方案中，所述拮 抗剂是抗体。在另一个具体实施方案中，所述拮抗剂是小分子。
[0038] 本发明还提供了特异性结合人BMP-6的抗体，其中在一定浓度的包含 TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID N0:3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗体被竞争不与人 BMP-6特异性结合。
[0039] 本发明还提供了一种特异性结合TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID N0:3)的任何5个连 续氨基酸的抗体。在具体的实施方案中，所述抗体特异性地结合TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID N0:3)的6、7、8、9或10个连续氨基酸。
[0040] 在下面的发明详述和附图以及实施方案中，本发明和本发明的其他目的、特征和 优势将变得进一步显而易见。
【附图说明】
[0041] 图1A-1D显示DRAGON. Fc选择性地抑制BMP对铁调素表达的诱导的证据；
[0042] 图2A-2G显示在小鼠中施用DRAGON. Fc不影响铁调素表达或铁代谢的证据；
[0043] 图3A-3D显示特异性中和BMP-6的抗体在体内抑制肝脏铁调素表达和增加血清铁 和转铁蛋白饱和度的证据；
[0044] 图4A-4H显示Bmp6敲除小鼠显示减少的肝脏铁调素表达、增加的脾膜铁转运蛋白 表达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、增加的肝脏铁含量和减少的脾铁含量的证据；
[0045] 图5A-5C显示在小鼠中施用BMP-6增加铁调素 mRNA表达和减少血清铁的证据；
[0046] 图 6 是对 BMP-6 的 Western 印迹；
[0047] 图7是对HJV的Western印迹；
[0048] 图 8 是对 hBMP-6 的 Western 印迹。
【具体实施方式】
[0049] 本发明人已经出人意料地发现BMP-6是铁调素表达和铁代谢的重要调节物。与可 溶性血幼素（HJV. Fe)相比，同源的DRAGON. Fc融合蛋白在体外是对BMP-2和BMP-4产生 的铁调素启动子活化的较为有效的抑制剂，但是为BMP-6的不太有效的抑制剂。在体内， DRAGON. Fc对铁调素表达和铁代谢没有作用，而HJV. Fc或特异性中和BMP-6的抗体抑制铁 调素表达并增加血清铁。此外，Bmp6敲除小鼠具有类似遗传性血色素沉着病的表型，其具有 减少的铁调素表达、增加的膜铁转运蛋白表达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、减少的脾 铁储备和组织铁过载。本发明人显示在小鼠中施用BMP-6增加铁调素表达并减少血清铁。 总之，这些数据支持了 BMP-6作为体内铁调素表达和铁代谢的内源性调节物的关键作用。
[0050] 特异性中和BMP-6的抗体的施用导致增加的血清铁和转铁蛋白饱和度，表明对铁 调素表达和铁代谢的作用。通过siRNA或中和抗体抑制内源性BMP-6抑制血幼素-介导的 对铁调素表达的诱导。BMP-6可能是血幼素的配体。
[0051] 此外，发现添加外源性BMP-6增加铁调素表达并导致血清铁和血清转铁蛋白饱和 度的剂量依赖性减少。
[0052] pro-BMP-6的氨基酸序列显示在下表1中：
[0053]
[0054] BMP-6由表1中显示的pro-BMP-6序列的氨基酸297-428构成。BMP-6显示在下 表2中。
[0056] 除非另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域中普通技术 人员所普遍理解的含义。此外，除非另外上下文需要，单数术语应当包括复数，并且复数术 语应当包括单数术语。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质和寡核 苷酸或多核苷酸化学和杂交相关采用的命名法和技术是本领域中所公知和普遍使用的那 些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化（例如，电穿孔，脂质转染）。 根据生产厂商的说明书或如本领域中普遍实现的那样或如本文所述进行酶反应和纯化技 术。除非相反地具体指明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生 物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了说明的目的下面描述它们中的许多。参 见，例如，Sambrook,等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆：实验室指 南）（第二版，1989) ;Maniatis 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆： 实验室指南）（1982) ;DNA Cloning:A Practical Approach(DNA 克隆：实践方法），vol. I&II(D. Glover,编辑）；01igonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成）（Ν· Gait,编辑， 1984) ;Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交）（B.Hames&S. Higgins,编辑，1985); Transcription and Translation (转录和翻译）（B. Hames&S. Higgins,编辑，1984); Animal Cell Culture (动物细胞培养）（R.Freshney,编辑，1986) ;Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆实践指导）（1984)。
[0057] 与本文所述的分析化学、合成有机化学，以及医学和药物化学相关采用的命名法， 和实验室步骤和技术是本领域中所公知和普遍使用的那些。标准技术用于化学合成，化学 分析，药物制备，配制和递送，以及患者的治疗。
[0058] 下面的定义可用于理解本发明：
[0059] 如本文使用的术语"抗体"（Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例 如，双特异性抗体），和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性。术语"免疫球蛋白"(Ig) 在本文中与"抗体"互换使用。
[0060] "分离的抗体"是已经与其天然环境的组分分开和/或从其天然环境的组分中回收 的一种抗体。其天然环境的污染组分是将干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以 包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体：（1)如通过Lowry 法测定，被纯化至大于95重量％抗体，和最优选大于99重量％ ; (2)通过利用自旋杯序列 分析仪（spinning cup sequenator)被纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15 个残基的程度；或（3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染通过SDS-PAGE被 纯化至均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在抗体的天然环境的至少 一个组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0061] 基本的四链抗体单元是由两个相同的轻（L)链和两个相同的重（H)链构成的异四 聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元以及称为J链的附加多肽组成，并且因 此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成多价集合体，所述集合体包含 2-5个基本的4链单元以及J链。在IgG的情况下，4链单元通常为约150, 000道尔顿。每 个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，取决 于H链的同种型。每个H和L链还具有规则地间隔开的链内二硫桥。每个H链在N末端处 具有可变结构域（V h)，紧接着对于每个α和γ链是三个恒定结构域（Ch)，对于μ和ε同 种型是4个Ch结构域。每个L链在N末端处具有可变结构域（V J，紧接着在其另一端是恒 定结构域（Q)。'与Vh对齐，且q与重链的第一个恒定结构域（ChI)对齐。认为特定氨基 酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。％和V l的配对一起形成单个抗原结合位 点。对于不同类型抗体的结构和性质，参见，例如，Basic and Clinical Immunology(基础 和临床免疫学），第 8 版，Daniel P.Stites, Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow (编辑）， Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994, 71 页，和第 6 章。
[0062] 基于其恒定结构域（Q)的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可以被指 定为两种显然不同的类型中的一种，称为kappa〇 )和Iambda(A)。取决于其重链（Ch) 的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定为不同的类型或同种型。存在5种类 型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被指定为alpha(a)、delta(S)、 epsilon( ε )、gamma( γ )和mu( μ )的重链。基于(^序列和功能的相对微小差异，γ和α 类进一步分成为亚类，例如，人表达下列的亚类：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。
[0063] 术语"可变的"是指在抗体之间V结构域的某些区段的序列广泛地不同的事实。 V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结 构域的110个氨基酸范围内并不均匀地分布。事实上，V区由相对不变的称为构架区（FR) 的15-30个氨基酸的序列段（stretch)构成，所述序列段被称为"超变区"的具有高可变 性的较短区域分隔，每个超变区的长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的每个可变结 构域包含4个FR，主要采取β -折叠构型，它们通过三个超变区连接，形成连接β -折叠 结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的超变区通过FR相 互靠近地结合在一起，并且和来自其他链的超变区一起，对抗体的抗原结合位点的形成作 出贡献（参见 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学 感兴趣的蛋白质的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效 应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。
[0064] 当在本文中使用时术语"超变区"是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残 基。超变区通常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基（例如，八中大约残 基 24-34 (LI) ,50-56 (L2)和 89-97 (L3)周围，和 Vh中大约 1-35 (HI) ,50-65 (H2)和 95-102 (H3)周围；Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免 疫学感兴趣的蛋白质的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991))和/或来自"超变环"的那些残基（例如，Vl中残 基 26-32 (LI) ,50-52 (L2)和 91-96 (L3)，和 Vh中 26-32 (HI) ,53-55 (H2)和 96-101 (H3); Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。
[0065] 如本文使用的术语"单克隆抗体"是指从基本上均一的抗体的群体获得的抗体， 即，构成该群体的各个抗体除了可以微量存在的可能天然存在的突变以外是相同的。单克 隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇（表位）的不 同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特 异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以合成而不会被其他抗体污染。修饰语"单克隆" 不应被解释为需要通过任何特定的方法来制备抗体。例如，可用于本发明中的单克隆抗体 可以通过首先由Kohler等，Nature, 256:495 (1975)所述的杂交瘤方法学来制备，或可以使 用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备（参见，美国专利号4, 816, 567)。"单 克隆抗体"也可以使用例如 Clackson 等，Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks 等，上1\1〇1· Biol，222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0066] 本文中的单克隆抗体包括"嵌合"抗体，其中一部分重链和/或轻链与来源于特 定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与 来源于另一种物种或属于另一种抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此 类抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性（参见美国专利号4, 816, 567 ;和Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本发明提供了来源于人抗体的可变 结构域抗原结合序列。因此，本文中主要感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结 合序列（例如，CDR)且含有来源于非人抗体的一个或多个序列（例如，FR或C区序列）的 抗体。另外，本文主要感兴趣的嵌合抗体包括包含一种抗体类型或亚类的人可变结构域抗 原结合序列和来源于另一抗体类型或亚类的另一序列（例如，FR或C区序列）的那些。本 文感兴趣的嵌合抗体还包括含有与本文所述的那些相关的或来自不同物种（诸如非人灵 长类动物（例如，旧大陆猴（Old World Monkey),猿等））的可变结构域抗原结合序列的那 些。嵌合抗体还包括灵长类动物源化抗体和人源化抗体。
[0067] 此外，嵌合抗体可以包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可以作 出这些修饰作用以进一步改善抗体性能。对于更多的细节，参见Jones等，Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332:323-329(1988);和 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)〇
[0068] 〃人源化抗体〃通常被认为是人抗体，其具有一个或多个引入其中的 来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为"输入"残基，其 典型地取自"输入"可变结构域。人源化传统地根据Winter及其同事（Jones 等，Nature, 321:522-525(1986) ;Reichmann 等，Nature, 332:323-327(1988) ;Verhoeyen 等，Science，239:1534-1536 (1988))的方法进行，该方法通过用输入超变区序列代替人抗 体的相应序列来进行。因此，这种"人源化"抗体是嵌合抗体（美国专利号4, 816, 567)，其 中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列替代。
[0069] "人抗体"是仅含有存在于由人天然产生的抗体中的序列的抗体。然而，如本文所 使用，人抗体可以包含不存在于天然存在的人抗体中的残基或修饰作用，包括本文所述的 那些修饰作用和变体序列。典型地作出这些以进一步改善或增强抗体性能。
[0070] "完整"抗体是包含抗原结合位点以及Q和至少重链恒定结构域C H1、Ch 2和Ch 3 的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域（例如，人天然序列恒定结构域）或其氨 基酸变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应器功能。
[0071] "抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗 体片段的实例包括？ &13^&13'^(&13'）2和？ ￥片段；双抗体；线性抗体（参见美国专利号 5, 641，870 ;Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]);单链抗体分子；和由抗体 片段形成的多特异性抗体。
[0072] 短语抗体的"功能性片段或类似物"是具有在性质上与全长抗体一样的生物活性 的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物可以以下列的方式结合IgE免疫球蛋 白，从而防止或基本上减少此类分子具有结合高亲和性受体Fc ε RI的能力的能力。
[0073] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，和残留 的"Fc"片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结 构域（V h)，和一条重链的第一个恒定结构域（CH 1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是 单价的，即，其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab'） 2片段， 其大概对应于两个二硫键连接的Fab片段，其具有二价抗原结合活性，并且仍能够交联抗 原。Fab'片段与Fab片段的区别在于其在C hI结构域的羧基末端处具有额外的几个残基， 包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。在本文中Fab'-SH是Fab'的名称，其中恒定 结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离的硫醇基。F(ab'） 2抗体片段初始地作为成对 的Fab'片段产生，在它们之间具有铰链半胱氨酸。还已知有抗体片段的其他化学偶合。
[0074] "Fc"片段包含通过二硫键结合在一起的两个H链的羧基末端。抗体的效应器功能 由Fc区中的序列决定，该区也是被在某些类型细胞上发现的Fc受体（FcR)识别的部分。
[0075] "Fv"是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和抗原结合位点。此片段由一个 重链和一个轻链可变区结构域以紧密、非共价方式缔合的二聚体组成。由这两种结构域的 折叠产生6个超变环（各3个环来自H链和L链），它们贡献用于抗原结合的氨基酸残基并 且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域（或Fv的一半，其仅包含对抗 原特异的三个CDR)就具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性比整个结合位点低。
[0076] "单链Fv"也缩写为"sFv"或"scFv"，其是包含连接至单条多肽链中的V#P Vl 抗体结构域。优选地，sFv多肽进一步包含VjPV j吉构域之间的多肽接头，使sFv能够 形成用于结合抗原的所需结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学），第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编 辑，Springer-Verlag, New York, 269-315 页（1994) ;Borrebaeck 1995，见下。
[0077] 术语"双抗体（diabody) "是指通过如下方法制备的小抗体片段，即用V j吉 构域之间的短接头（约5-10个残基）构建sFv片段（参见前面的段落），使得实现V结构 域的链间而非链内配对，产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗 体是两个"交换（crossover) "sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VjP V 结构域存在于 不同的多肽链上。双抗体更充分地描述在，